TWI794253B

TWI794253B - 吡咯并嘧啶及吡咯并吡啶衍生物

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Publication number: TWI794253B
Application number: TW107124084A
Authority: TW
Inventors: 大衛阿曼提尼; 米蘭梅斯克; 高登薩克斯提; 譚加波利亞克; 伊內斯武亞斯諾維科; 丁科齊赫爾; 大衛維提; 卡爾理查吉布森
Original assignee: 比利時商葛萊伯格有限公司
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2023-03-01
Also published as: US11136325B2; IL271910A; AU2018300218B2; RU2020106289A; BR112020000578A2; MX2020000005A; GB201711234D0; SG11202000168UA; JP2020530833A; IL271910B1; CN111094283A; UY37809A; IL271910B2; US20200165259A1; PH12019502823A1; RU2020106289A3; EP3652173A1; US20220169653A1; AU2018300218A1; WO2019012284A1

Abstract

本發明係關於根據式I之吡咯并嘧啶化合物及其在預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、I型糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病中之用途。在一特定態樣中，本發明化合物為ASK抑制劑，特定言之ASK1抑制劑。本發明亦提供用於產生本發明化合物的方法，包含本發明化合物之醫藥組合物，該等化合物在預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、I型糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病中之用途。

Description

吡咯并嘧啶及吡咯并吡啶衍生物

本發明係關於吡咯并嘧啶化合物及其在預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病中之用途。在一特定態樣中，本發明化合物為ASK抑制劑，特定言之ASK1抑制劑。本發明亦提供用於產生本發明化合物的方法，包含本發明化合物之醫藥組合物，該等化合物在預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病中之用途。

細胞凋亡信號調節激酶(ASK1)為誘發對應激刺激之反應的有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導路徑上之普遍表現Ser/Thr激酶，該等應激刺激包括諸如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)及脂多醣(LPS)之促炎性分子、內質應激、氧化應激、遺傳毒性應激、自由基、Fas配位體及鈣超載(Takeda K等人(2008) Annu Rev Pharacol Toxicol 248 第199-225頁; Nagai H等人(2007) J Biochem Mol Biol 40 第1-6頁)。

ASK1為經由MAP激酶激酶(MKK)進行信號傳導之數個MAP激酶激酶激酶(MAP3K)中之一者。在ASK1信號傳導之情況下，MKK3及MKK6活化p38路徑且MKK4及MKK7活化JNK路徑(Davis RJ (2000) Cell 103 第239-252頁; Ichijo H等人(1997) Science 275 第90-94頁)。因此，ASK1抑制劑具有抑制經由p38及JNK兩者之信號傳導路徑的潛力。

可溶性TNF受體之用途：Fc融合蛋白恩博(Enbrel) (依那西普(etanercept))經展示在發炎性疼痛之臨床中且亦在神經痛之臨床前模型中有效(Hao S等人(2007) Gene Therapy 14 第1010-1016頁)，從而暗示TNF-α為疼痛反應之關鍵介體。IL-6為TNF-α信號傳導之關鍵下游介體且有臨床證據支援抗IL-6療法作為用於類風濕性關節炎之有效治療性方法(Roche於2008年5月公佈安挺樂/托珠單抗之陽性III期結果)。

不具有功能性ASK1之數個細胞(自ASK1基因剔除小鼠分離，或在基因沉默後)對TNF-α誘發之細胞凋亡具有抗性(Tobiume K等人(2001) EMBO Rep 2 第222-228頁)。因此，ASK1在TNF-α路徑中為關鍵的且支援經由ASK1抑制破壞TNF-α信號傳導路徑將產生有益下游效應(諸如疼痛減輕)的假設。存在p38及/或JNK之活化與促炎性介體之產生及後續疼痛反應有關的強有力證據(Ji R-R及Suter MR (2007) Molecular Pain 3 第33-41頁; Cheng HT等人(2008) Neuroscience 155 第948-958頁; Ji R-R及Gao Y-J (2008) Neurosci Lett 437 第180-183頁)。由於ASK1活化可引起p38及JNK兩者之活化，ASK1之抑制具有比僅p38抑制劑更強的潛力，且由於信號級聯更高，其可限制非所需不利因素之可能性。

纖維化為一種傷口癒合過程，其中存在胞外基質(ECM)之過量沈積。ECM由膠原蛋白、非膠原蛋白糖蛋白、基質結合生長因子、葡糖胺聚糖、蛋白聚醣及基質細胞蛋白構成，其提供正常組織及纖維化組織兩者之支架。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)為發達國家慢性肝病之最常見病因(Younossi ZM等人, Clin Gastroenterol Hepatol 2011; 9: 524-30及Cohen JC等人, Science, 2011; 332: 1519-23)。其可大致分為兩個類別：非酒精性脂肪肝(或單純的脂肪變性)及非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。儘管先前認為脂肪變性大部分為非進展型的而NASH為進展型NAFLD，但來自一系列生檢研究之最新證據表明患有脂肪變性或NASH之患者之後疾病進展為晚期纖維化及肝硬化之風險增大(Singh S等人, Clin Gastroenterol Hepatol 2015; 13: 643-54及McPherson S等人, J Hepatol 2015; 62: 1148-55)。

已知氧化應激在NASH中之肝星形細胞(HSC)之活化中起主要作用(Bian Z, & Ma X. Front Physiol 2012; 3: 248及Koek GH等人, Clin Chim Acta 2011; 412: 1297-305)，且抗氧化劑不僅對肝細胞損傷起到預防作用，且亦可直接地有助於減少纖維生成(Serviddio G等人, Free Radic Biol Med 2013; 65: 952-68)，此作用由，影響細胞抗氧化劑防禦效力之變體影響NAFLD纖維化之風險的基因相關研究支援(Al-Serri A等人, J Hepatol 2012; 56: 448-54)。

細胞凋亡信號調節激酶1 (ASK1)為藉由包括高血糖症、TGF-β及ROS的各種刺激活化之激酶(Karnik S, Charlton MR, Li L等人, The Liver Meeting 2015, San Francisco, CA, 11月13日至17日, American Association for the Study of Liver Diseases, 2015)。ASK1藉由活化p38及JNK1途徑誘發細胞凋亡、纖維化及代謝功能不全。ASK1路徑經展示在人類NASH肝臟生檢中經活化(Karnik S, The Liver Meeting 2014, Boston, Massachusetts, 11月7日至11日, American Association for the Study of Liver Diseases, 2014)。此外，在六個月NASH人類臨床研究中，ASK1抑制劑塞隆瑟替布(selonsertib)經展示使得肝纖維化分期縮短、肝硬化進展減慢、肝硬度及肝脂肪含量降低(Loomba等人, The liver meeting 2016, Boston, Massachusetts, 11月11日至15日, American Association for the Study of Liver Diseases, 2016)。

WO 2008/016131揭示用於治療糖尿病及發炎性疾病之稠合雜環ASK1抑制劑。WO 2004/048565描述具有ASK1活性的可適用於治療癌症及退化性疾病之新穎的肽。WO 2009/123986及WO 2009/027283兩者描述ASK1抑制劑。WO 2008/075172揭示作為h-PGDS抑制劑之菸鹼醯胺衍生物及其用於治療前列腺素D2介導之疾病的用途。WO 2001/39777揭示對腺苷A₁ 、A_2a 及A₃ 受體具有特異性之化合物。EP 2058309揭示稠合雜環化合物。

本發明描述一系列吡咯并嘧啶衍生物，其為ASK1激酶之抑制劑且其可適用於預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病。

本發明係基於可適用於預防及/或治療疼痛及/或纖維化疾病之新穎吡咯并嘧啶及吡咯并吡啶化合物之鑑別。在一特定態樣中，本發明化合物為ASK抑制劑，特定言之ASK1抑制劑。本發明亦提供用於產生此等化合物的方法，包含此等化合物之醫藥組合物，及該等化合物在預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病中之用途。

因此，在本發明之一第一態樣中，提供具有式I之本發明化合物：

其中 R¹ 為H、CH₃ 、F或Cl； X為N、CH或C-CN；且 R² 為CH₃ 或鹵素。

在一特定態樣中，本發明化合物可展現對ASK激酶家族，特定言之對ASK1之選擇性。在另一特定態樣中，本發明化合物可展示對其他激酶酶類，特定言之JAK2的低活性。此類選擇性可產生改良的藥物安全性及/或降低脫靶相關風險。

在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明化合物及醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑。在一特定態樣中，醫藥組合物可另外包含適於與本發明化合物組合之其他治療活性成分。在一更特定態樣中，其他治療活性成分為用於預防及/或治療疼痛及/或纖維化疾病之藥劑。

此外，適用於本文所揭示之醫藥組合物及治療方法的本發明化合物在製備及使用時為醫藥學上可接受的。

在本發明之另一態樣中，本發明提供一種治療罹患選自本文中所列出之彼等中之病況且尤其疼痛及/或纖維化疾病的哺乳動物，特定言之人類的方法，該方法包含投與如本文中所描述之有效量的醫藥組合物或本發明化合物。

本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之化合物及用於藥品中之適合的醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑。在一特定態樣中，醫藥組合物係用於預防及/或治療疼痛及/或纖維化疾病。

在一特定態樣中，提供用於預防及/或治療疼痛的本發明化合物。

在額外態樣中，本發明提供使用本文隨後揭示之代表性合成方案及途徑合成本發明化合物的方法。

熟習此項技術者考慮隨後之實施方式將顯而易知其他目標及優勢。

應瞭解，本發明化合物可經代謝以產生生物活性代謝物。

定義

以下術語意欲具有下文提供之意義且適用於理解本發明之描述及預期範疇。

當描述可包括化合物、含有此類化合物之醫藥組合物及使用此類化合物及組合物之方法的本發明時，除非另外指明，否則以下術語(若存在)具有以下含義。應理解，當在本文中描述時，下文定義之任何部分可經多種取代基取代，且各別定義欲將該等經取代部分包括在其下文所陳述之範疇內。除非另行說明，否則術語「經取代」應如下文所陳述定義。應進一步理解，術語「基團(group)」及「基(radical)」在本文中使用時可被視為可互換的。

冠詞『一(a/an)』在本文中用於指代一種或多於一種(即至少一種)該冠詞之語法對象。藉助於實例，「一類似物」意謂一個類似物或超過一個類似物。

『胺基』係指基團-NH₂ 。

『鹵基』或『鹵素』係指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)及碘(I)。特定鹵基為氟或氯。

『醫藥學上可接受的』意謂聯邦政府或州政府之監管機構或除美國之外的國家的相應機構批准或可批准，或列於用於動物，且更特定言之人類的美國藥典(U.S. Pharmacopoeia)或其他公認藥典中。

『醫藥學上可接受之鹽』係指醫藥學上可接受且具有母體化合物之所要藥理學活性之本發明化合物之鹽。特定言之，此類鹽無毒，可為無機酸加成鹽或有機酸加成鹽及鹼加成鹽。特定言之，此類鹽包括：(1)用諸如以下之無機酸形成之酸加成鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物；或用諸如以下之有機酸形成之酸加成鹽：乙酸、丙酸、己酸、環戊丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡糖庚酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、黏康酸及其類似物；或(2)當母體化合物中存在之酸性質子經金屬離子(例如，鹼金屬離子、鹼土金屬離子或鋁離子)置換；或與有機鹼(諸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺及其類似物)配位時形成之鹽。鹽進一步包括(僅藉助於實例)鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽、四烷基銨鹽及其類似物；且當化合物含有鹼性官能基時，進一步包括無毒有機酸或無機酸之鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、乙二酸鹽及其類似物。術語『醫藥學上可接受之陽離子』係指酸性官能基之可接受的陽離子相對離子。該等陽離子由鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨陽離子及其類似物例示。

『醫藥學上可接受之媒劑』係指與本發明化合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。

『前藥』係指具有可裂解之基團且藉由溶劑分解或在生理條件下變成在活體內具有醫藥活性之本發明化合物的化合物，包括本發明化合物之衍生物。此類實例包括(但不限於)膽鹼酯衍生物及其類似物、N-烷基嗎啉酯及其類似物。

『溶劑合物』係指通常藉由溶劑分解反應與溶劑締合之化合物的形式。此物理締合包括氫鍵結。習知溶劑包括水、EtOH、乙酸及其類似物。本發明化合物可例如以結晶形式製備且可溶劑化或水合。適合溶劑合物包括醫藥學上可接受之溶劑合物，諸如水合物，且進一步包括化學計量溶劑合物與非化學計量溶劑合物兩者。在某些情況下，溶劑合物將能夠分離，例如當一或多個溶劑分子併入結晶固體之晶格中時。『溶劑合物』涵蓋溶液相與可分離溶劑合物兩者。代表性溶劑合物包括水合物、乙醇化物及甲醇化物。

『個體』包括人類。術語『人類』、『患者』及『個體』在本文中可互換地使用。

『有效量』意謂當向個體投與以供治療疾病時足以實現對疾病之此治療的本發明化合物之量。『有效量』可視化合物、疾病及其嚴重度及待治療之個體之年齡、體重等而變化。

『預防(preventing或prevention)』係指減小獲得或罹患疾病或病症之風險(亦即在該疾病發作之前，使該疾病之臨床症狀中之至少一者不在可能暴露於致病劑或易患該疾病之個體體內出現)。

術語『預防(prophylaxis)』與『預防(prevention)』相關，且係指目的為預防而非治療或治癒疾病之措施或程序。預防性措施之非限制性實例可包括投與疫苗；向處於歸因於(例如)不移動性之血栓症的風險下的住院患者投與低分子量肝素；及在訪問瘧疾為地方性的或感染瘧疾之風險較高的地理區域之前投與抗瘧疾劑，諸如氯奎。

在一個實施例中，「治療(treating或treatment)」任何疾病或病症係指改善疾病或病症(亦即遏制疾病或降低其至少一個臨床症狀之表現、程度或嚴重度)。在另一實施例中，『治療(treating或treatment)』係指改善至少一個不可由個體辨別之身體參數。在又一實施例中，『治療(treating或treatment)』係指以物理方式(例如，穩定可辨別的症狀)、以生理方式(例如，穩定生理參數)或以兩種方式調節疾病或病症。在另一實施例中，「治療(treating或treatment)」係關於減緩疾病進展。

如本文中所使用，術語『疼痛』係指：發炎性疼痛，特定而言包括疾病修飾及關節結構保護之特性的慢性關節疼痛，例如類風濕性關節炎、骨關節炎、類風濕性脊椎炎、痛風性關節炎(痛風)及幼年期關節炎；肌肉骨骼痛；下背及頸痛；扭傷及拉傷；神經痛；交感神經持續疼痛；肌炎；與癌症及肌肉纖維疼痛相關聯之疼痛；與偏頭痛相關聯之疼痛；與流感或其他病毒感染(諸如感冒)相關聯之疼痛；風濕熱；與腸道機能失調症(諸如非潰瘍消化不良、非心胸疼痛及大腸急躁症)相關聯之疼痛；與心肌缺血相關聯之疼痛；術後疼痛；頭痛；牙痛；以及痛經。更特定言之，術語係指慢性關節疼痛。更特定言之，術語係指類風濕性關節炎、骨關節炎及痛風性關節炎(痛風)。

如本文中所使用，術語「心血管疾病」係指影響心臟或血管或兩者之疾病。特定而言，心血管疾病包括：心律不整(心房或心室或兩者)；動脈粥樣硬化及其後遺症；絞痛；心律紊亂；心肌缺血；心肌梗塞；心肌或血管動脈瘤；脈管炎、中風；四肢、器官或組織之周邊阻塞性動脈病；大腦、心臟、腎臟或其他器官或組織之局部缺血後的再灌注損傷；與動脈壓之顯著下降相關聯之休克狀態(例如，內毒素、手術、創傷休克或敗血性休克)；肺動脈高血壓(PAH)、高血壓、心臟瓣膜病、心臟衰竭、血壓異常；休克；血管收縮(包括與偏頭痛相關聯之血管收縮)；血管異常、曲張療法、受限於單個器官或組織之功能不全、功能性或有機靜脈功能不全；心肥大、心室纖維化及心肌重塑。更特定言之，術語係指動脈粥樣硬化、肺動脈高血壓、心臟衰竭、急性冠狀動脈症候群、心肥大、心室纖維化及心肌重塑。

如本文中所使用，除非上下文另外規定，否則術語『神經痛』或『涉及神經痛之症候群』包括中樞神經痛及周邊神經痛兩者，該等術語包括：糖尿病神經病變；坐骨神經痛；非特異性下背痛；多發性硬化症疼痛；肌肉纖維疼痛；HIV相關之神經病變；疱疹後神經痛；三叉神經痛；以及由實體外傷、切除術、癌症、毒素、化學療法誘發之神經病變或慢性發炎性病況產生之疼痛。神經痛之症狀包括自發性閃痛及刺痛，或持續灼燒痛。另外，包括與以下相關聯之疼痛：一般非疼痛感覺，諸如「發麻(pins and needles)」(感覺異常及感覺遲鈍)；對觸摸之敏感度提高(感覺過敏)；在無害刺激之後的疼痛感覺(動態、靜態或熱感覺異常)；對有害刺激之敏感度提高(熱、冷或機械性痛覺過敏)；在去除刺激之後繼續有疼痛感覺(痛覺過度)；或缺乏選擇性感覺路徑或選擇性感覺路徑有缺陷(痛覺減退)。

如本文中所使用，術語『發炎性病況』係指包括以下之病況之群：類風濕性關節炎、骨關節炎、幼年特發性關節炎、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎、皮膚病況(例如，曬傷、灼傷、濕疹、皮膚炎、牛皮癬)、眼科疾病(例如，青光眼、視網膜炎、視網膜病、葡萄膜炎及眼睛組織之急性損傷(例如，結膜炎))、肺病症(例如，過敏性呼吸道疾病(例如，哮喘、鼻炎)、慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、肺氣腫、呼吸窘迫症候群、養鴿者病及農夫肺)、胃腸道病症(例如，發炎性腸病，諸如克隆氏症(Crohn's disease)或潰瘍性結腸炎、口瘡潰瘍、異位性胃炎、痘症狀胃炎(gastritis varialoforme)、腹腔病、局部性迴腸炎、大腸急躁症、胃食道逆流疾病、腹瀉及/或便秘)、內毒素驅動疾病狀態(例如，繞通手術之後的併發症或促成例如慢性心衰竭之慢性內毒素病狀)、器官移植及具有發炎性組分之其他病況，諸如血管疾病、脂肪變性肝炎、偏頭痛、結節性動脈外膜炎(periarteritis nodosa)、甲狀腺炎、再生不良性貧血、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、硬皮病、重症肌無力、多發性硬化症、結節病、腎病症候群、白塞症候群(Bechet's syndrome)、多發性肌炎、齒齦炎、心肌缺血、發熱、全身性紅斑性狼瘡症、多發性肌炎、腱炎、滑囊炎及休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)。特定言之，該術語係指類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性氣管疾病(例如，哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)及發炎性腸病。更特定言之，術語係指類風濕性關節炎、骨關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)及發炎性腸病。

如本文中所使用，術語『哮喘』係指以與任何病因(內因、外因或兩者；過敏性或非過敏性)之氣道狹窄相關聯的肺氣流變化為特徵的任何肺部病症。術語哮喘可與一或多個形容詞一起使用以指示病因。

如本文中所使用，術語『神經退化性疾病』係指由神經退化產生之病況或包括神經退化之病況，包括：癡呆症，特定言之退化性癡呆症(包括老年癡呆症、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、匹克症(Pick's disease)、亨丁頓舞蹈症(Huntingdon's chorea)、帕金森氏病(Parkinson's disease)及庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、ALS及運動神經元疾病)、血管性癡呆(包括多梗塞性癡呆)以及與顱內佔位病變相關聯之癡呆症；外傷；感染及相關病況(包括HIV感染)；周邊神經病變、多發性硬化症、視網膜病、青光眼、黃斑變性、大腦缺血及創傷性腦損傷以及與衰老相關聯之輕度認知障礙，特定言之年齡相關記憶障礙。

如本文中所使用，『糖尿病之併發症』係指與I型或II型糖尿病相關聯之病況，此等病況包括與血管或微血管變化相關之彼等，例如糖尿病性視網膜病變、糖尿病微血管病、糖尿病腎病變(亦稱為糖尿病腎病(DKD))、黃斑變性、青光眼、腎病症候群、糖尿病心肌病、再生不良性貧血、葡萄膜炎、川崎病(Kawasaki disease)及類肉瘤病；以及可能與糖尿病或肥胖症相關之脂肪代謝病症(例如肝脂肪變性)。更特定言之，術語係指糖尿病性視網膜病變、糖尿病微血管病、糖尿病腎病變及肝脂肪變性。

如本文中所使用，術語『癌症』係指皮膚或身體器官中細胞之惡性或良性生長，該等器官例如(但不限於)乳房、前列腺、肺、腎臟、胰腺、胃或腸。癌症往往會浸潤至相鄰組織中且擴散(轉移)至遠處器官，例如至骨骼、肝臟、肺或腦。如本文中所使用，術語癌症包括轉移性腫瘤細胞類型(諸如(但不限於)黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及肥胖細胞瘤)及組織癌瘤類型(諸如(但不限於)結腸直腸癌、前列腺癌、小細胞肺癌及非小細胞肺癌、乳癌、胰臟癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、原發性肝癌、卵巢癌、前列腺癌及子宮平滑肌肉瘤)。特定而言，術語『癌症』係指急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myeloidleukemia)、腎上腺皮質癌、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、非典型畸胎樣/橫紋肌樣瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤及惡性纖維組織細胞瘤)、腦幹神經膠質瘤、腦瘤、腦及脊髓腫瘤、乳癌、支氣管腫瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、子宮頸癌、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)、結腸癌、結腸直腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneous T -Cell lymphoma)、胚胎腫瘤、子宮內膜癌、室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤族腫瘤(ewing sarcoma family of tumors)、眼癌、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、膽囊癌、胃(gastric/stomach)癌、胃腸道類癌瘤、胃腸道基質腫瘤(GIST)、胃腸道基質細胞瘤、生殖細胞瘤、神經膠質瘤、毛細胞白血病(hairy cell leukemia)、頭頸癌、肝細胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)、下咽癌、眼內黑素瘤、胰島細胞瘤(內分泌胰臟)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎癌、蘭格罕細胞組織球增生症(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、白血病、急性淋巴母細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)、毛細胞白血病(hairy cell leukemia)、肝癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、神經管胚細胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、間皮瘤、口腔癌(mouth cancer)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)、骨髓白血病、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、口腔癌(oral cancer)、口咽癌、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、卵巢低度惡性潛能腫瘤(ovarian low malignant potential tumor)、胰臟癌、乳頭狀瘤症、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽癌、中等分化之松果體實質瘤、松果體母細胞瘤及大腦鐮原始神經外胚層腫瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)、垂體瘤、漿細胞贅瘤/多發性骨髓瘤、胸膜肺母細胞瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞(腎)癌、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(sarcoma)、尤文氏肉瘤族腫瘤(Ewing sarcoma family of tumors)、肉瘤(sarcoma)、卡波西肉瘤(kaposi)、塞紮里症候群(Sezary syndrome)、皮膚癌、小細胞肺癌(small cell Lung cancer)、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃(stomach/gastric)癌、大腦鐮原始神經外胚層腫瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤及胸腺癌、甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)及威爾姆斯腫瘤(Wilms tumor)。在另一特定實施例中，術語癌症係指胰臟癌、肝癌、肝細胞癌(HCC)、乳癌或結腸癌。特定言之，其係指肝細胞癌、黑素瘤、胃癌、脂肪肉瘤及由氧化應激引起之癌症，例如脊髓型頸椎病。

如本文所用，術語『纖維化疾病』係指如下疾病，其以因胞外基質之過量產生、沈積及收縮所致之過度結疤為特徵，且與細胞及/或纖維結合蛋白及/或膠原蛋白之異常積聚及/或增加之纖維母細胞募集相關聯，且包括(但不限於)個別器官或組織之纖維化，該等器官或組織諸如心臟、腎臟、肝臟、關節、肺、胸膜組織、腹膜組織、皮膚、角膜、視網膜、肌肉骨胳及消化道。特定言之，術語纖維化疾病係指特發性肺纖維化(IPF)；囊腫性纖維化、不同病源學之其他彌漫性實質性肺病，包括醫原性藥物誘發纖維化、職業及/或環境誘發之纖維化、肉芽腫病(類肉瘤病、過敏性肺炎)、膠原血管病、肺泡蛋白沈積症、蘭格罕細胞肉芽腫、肺淋巴管平滑肌增生症、遺傳疾病(哈布二氏症候群(Hermansky Pudlak syndrome)、結節性硬化症、神經纖維瘤、代謝儲積病症、家族間質性肺病)；輻射誘發之纖維化；慢性阻塞性肺病(COPD)；硬皮病；博萊黴素誘發之肺纖維化；慢性哮喘；矽肺病；石棉誘發之肺纖維化；急性呼吸窘迫症候群(ARDS)；腎臟纖維化；小管間質性纖維化；腎絲球腎炎；局灶節段性腎絲球硬化症；IgA腎病變；高血壓；亞伯氏症候群(Alport syndrome)；腸纖維化；肝纖維化；肝硬化；酒精誘發之肝纖維化；毒性/藥物誘發之肝纖維化；血色素沈著症；非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)；膽管道損傷；原發性膽汁性肝硬化；感染誘發之肝纖維化；病毒誘發之肝纖維化；以及自體免疫性肝炎；角膜瘢痕；肥厚性瘢痕；杜普伊特倫氏病(Dupuytren's disease)、瘢痕瘤、皮膚纖維化；皮膚硬皮病；全身性硬化症、脊髓損傷/纖維化；骨髓纖維化；血管再狹窄；動脈粥樣硬化；動脈硬化；韋格納氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)；佩洛尼氏病(Peyronie's disease)或慢性淋巴細胞病。在一特定實施例中，纖維化疾病為個別器官或組織之纖維化，諸如肝纖維化、肺纖維化或腎臟纖維化。在一特定實施例中，纖維化疾病係選自特發性肺纖維化(IPF)、糖尿病腎病(DKD)及非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。

『本發明之化合物』及等效表述意欲涵蓋如本文所描述之式(e)化合物，若上下文允許，則該表述包括醫藥學上可接受之鹽及溶劑合物(例如水合物)，及醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。類似地，提及中間物，無論是否主張其本身，若上下文允許，則其均意欲涵蓋其鹽及溶劑合物。

當本文中提及範圍時，例如(但不限於) C_1-8 烷基，範圍之引用應視為表示該範圍之各成員。

本發明化合物之其他衍生物在其酸及酸衍生物形式下皆具有活性，但在酸敏感形式下通常提供在哺乳動物生物體中之溶解度、組織相容性或延緩釋放之優勢。

如本文所用，術語『同位素變體』係指化合物在一或多個構成此類化合物之原子處含有非天然比例之同位素。舉例而言，化合物之『同位素變體』可含有一或多個非放射性同位素，諸如氘(² H或D)、碳-13(¹³ C)、氮(¹⁵ N)或其類似物。應理解，在進行此類同位素取代之化合物中，以下原子(若存在)可變化以使得(例如)任何氫可為² H/D，任何碳可為¹³ C，或任何氮可為¹⁵ N，且該等原子之存在及位置可在此項技術之技術內判定。同樣，在例如所得化合物可用於藥物及/或受質組織分佈研究之情形中，本發明可包括具有放射性同位素之同位素變體之製備。放射性同位素氚(亦即³ H)及碳-14 (亦即¹⁴ C)由於其容易併入及現成偵測手段而尤其適用於此目的。此外，可製備經諸如¹¹ C、¹⁸ F、¹⁵ O及¹³ N之正電子發射同位素取代之化合物，且該等化合物將適用於正電子發射斷層攝影術(Positron Emission Topography；PET)研究以用於檢查受質受體佔有率。

除非另外指明，否則本說明書及申請專利範圍中之特定化合物的描述或命名意欲包括個別對映異構體及其混合物(外消旋或其他)兩者。用於判定立體化學及分離立體異構體之方法為此項技術中所熟知。

應瞭解，本發明化合物可經代謝以產生生物活性代謝物。

本發明係基於可適用於預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病之新穎的吡咯并嘧啶及吡咯并吡啶化合物之鑑別。在一特定態樣中，本發明化合物為ASK抑制劑，特定言之ASK1抑制劑。

本發明亦提供用於產生此等化合物的方法，包含此等化合物之醫藥組合物，及用於藉由投與本發明化合物來治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病之方法。

因此，在本發明之第一態樣中，提供具有式I之本發明化合物： I

在一個實施例中，R¹ 為F。

在一個實施例中，R¹ 為F且R² 為CH₃ 。

在一個實施例中，X為CH。在替代性實施例中，X為C-CN。在替代性實施例中，X為N。

在一個實施例中，X為N且R¹ 為F。在一特定實施例中，X為N，R¹ 為F且R² 為CH₃ 。在另一實施例中，R² 為CH₃ 或Cl。在另一實施例中，R² 為CH₃ 。

在一個實施例中，本發明化合物係選自： 2-胺基-5-氟-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺(化合物1)、 2-胺基-5-甲基-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺(化合物2)、 2-胺基-5-氯-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-吡啶-4-甲醯胺(化合物3)、 2-胺基-N-[1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺(化合物4)、 2-胺基-N-[1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺(化合物5)、 2-胺基-N-[1-(5-氰基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺(化合物6)，及 2-胺基-N-[1-(3-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺(化合物7)。

在一個實施例中，本發明化合物不為同位素變體。

在一個態樣中，根據本文所描述之實施例中之任一者的本發明化合物係以游離鹼形式存在。

在一個態樣中，根據本文所描述之實施例中之任一者的本發明化合物為醫藥學上可接受之鹽。

在一個態樣中，根據本文所描述之實施例中之任一者的本發明化合物為化合物之溶劑合物。

在一個態樣中，根據本文所描述之實施例中之任一者的本發明化合物為化合物之醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。

在一特定實施例中，根據本文實施例中之任一者的本發明化合物相較於結構上類似之化合物在針對ASK1活性之活體外細胞分析中顯示改良活性。在一特定實施例中，本發明化合物在針對周邊血液單核細胞(PBMC)中之ASK1活性的細胞分析中顯示改良活性，如本文中作為實例2.3所描述。

在一替代實施例中，根據本文實施例中之任一者的本發明化合物可展示減少的Cyp活性之誘發。特定言之，本發明化合物相較於結構上類似之化合物可展示減少的Cyp3A4活性之誘發。

在一替代實施例中，根據本文實施例中之任一者的本發明化合物可展示減少的Cyp活性之抑制。特定言之，本發明化合物相較於結構上類似之化合物可展示減少的Cyp3A4活性之抑制。更特定言之，本發明化合物可展示＞10 µM的Cyp抑制之IC₅₀ 。

雖然各實施例之指定群組已通常在上文單獨列出，但本發明化合物包括上述化學式以及本文中呈現之其他化學式中之若干實施例或各實施例係選自針對各變數分別指明之一或多個特定成員或群組的化合物。因此，本發明意欲將此類實施例之所有組合包括在其範疇內。

雖然各實施例之指定群組已通常在上文單獨列出，但本發明化合物可為一或多個變數(例如，R基團)選自根據上文列出之式(e)中之任一者的一或多個實施例的化合物。因此，本發明意欲將來自所揭示實施例中之任一者之變數的所有組合包括在其範疇內。

或者，本發明亦涵蓋自群組或實施例或其組合排除一或多個指定變數。

在某些態樣中，本發明提供根據上述化學式之化合物的前藥及衍生物。前藥為具有可代謝裂解之基團且藉由溶劑分解或在生理條件下變成在活體內具有醫藥活性之本發明化合物的本發明化合物之衍生物。此類實例包括(但不限於)膽鹼酯衍生物及其類似物、N-烷基嗎啉酯及其類似物。

本發明化合物之其他衍生物在其酸及酸衍生物形式下皆具有活性，但在酸敏感形式下通常提供在哺乳動物生物體中之溶解度、組織相容性或延緩釋放之優勢(Bundgaard, 1985)。前藥包括此項技術中從業人員熟知之酸衍生物，諸如藉由母體酸與適合醇反應製備之酯，或藉由母體酸化合物與經取代或未經取代之胺反應製備之醯胺，或酸酐或混合酸酐。衍生自本發明化合物側位上之酸基的簡單脂族或芳族酯、醯胺及酸酐為較佳前藥。在一些情況下，需要製備雙酯型前藥，諸如(醯氧基)烷基酯或((烷氧羰基)氧基)烷基酯。本發明化合物之C₁ 至C₈ 烷基、C₂ -C₈ 烯基、芳基、C₇ -C₁₂ 經取代芳基及C₇ -C₁₂ 芳基烷基酯尤其適用。醫藥組合物

當用作醫藥時，本發明化合物通常以醫藥組合物形式投與。此類組合物可以醫藥技術中熟知之方式製備且包含至少一種根據式I之本發明活性化合物。一般而言，本發明化合物以醫藥學上有效之量投與。實際上投與之本發明化合物之量通常將由醫師根據相關情況來判定，該等情況包括待治療之病況、所選投與途徑、投與之實際本發明化合物、個別患者之年齡、體重及反應，及患者症狀之嚴重度及其類似者。

本發明之醫藥組合物可藉由多種途徑投與，包括經口、經直腸、經皮、皮下、關節內、靜脈內、肌肉內及鼻內。視預期遞送途徑而定，本發明化合物較佳地調配為可注射或口服組合物，或均用於經皮投與之油膏、洗劑或貼劑。

用於經口投與之組合物可採取散裝液體溶液或懸浮液或散裝粉末之形式。然而，組合物更通常以單位劑型存在以便於精確給藥。術語『單位劑型』係指適用作人類個體及其他哺乳動物之單位劑量的實體離散單元，各單元含有經計算產生所要治療作用的預定量之活性材料，其與適合醫藥賦形劑、媒劑或載劑結合。典型單位劑型包括液體組合物之預填充、預量測安瓿或注射器或固體組合物情況下之丸劑、錠劑、膠囊或其類似物。在此類組合物中，根據式I之本發明化合物一般為次要組分(約0.1至約50重量%或較佳約1至約40重量%)，其餘為各種媒劑或載劑以及有助於形成所要劑型之加工助劑。

適於經口投與之液體形式可包括適合水性或非水性媒劑與緩衝劑、懸浮劑及分散劑、著色劑、調味劑及其類似物。固體形式可包括(例如)以下成分或具有類似性質之本發明化合物中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；滑動劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷或橙味調味劑。

可注射組合物通常係基於可注射無菌鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水或此項技術中已知的其他可注射載劑。如前所述，此類組合物中之根據式I之本發明活性化合物通常為次要組分，通常為約0.05至10重量%，其餘為可注射載劑及其類似物。

經皮組合物通常經調配為含有活性成分之局部用軟膏或乳膏劑，該/該等活性成分之量通常在約0.01至約20重量%、較佳約0.1至約20重量%、較佳約0.1至約10 wt%且更佳約0.5至約15%重量%之範圍內。當調配成軟膏時，活性成分通常將與石蠟或水可混溶性軟膏基劑組合。或者，活性成分可使用例如水包油乳膏基劑調配成乳膏。此類經皮調配物為此項技術中所熟知且通常包括額外成分以提高活性成分或調配物之真皮滲透穩定性。所有此類已知之經皮調配物及成分均包括在本發明範疇內。

本發明化合物亦可藉由經皮裝置投與。因此，經皮投與可使用儲集層型或多孔膜型或固體基質類貼劑來實現。

上文所描述之用於可經口投與、可注射或可局部投與組合物之組分僅為代表性的。其他材料以及加工技術及其類似者闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania之第8部分，其以引用的方式併入本文中。

本發明化合物亦可以持續釋放形式投與或自持續釋放藥物遞送系統投與。代表性持續釋放材料之描述可見於Remington's Pharmaceutical Sciences。

以下調配物實例說明可根據本發明製備之代表性醫藥組合物。然而，本發明不限於以下醫藥組合物。調配物 1 - 錠劑

可將根據式I之本發明化合物以乾燥粉末形式與無水明膠黏合劑以約1:2重量比摻合。可添加少量硬脂酸鎂作為潤滑劑。可將混合物在製錠機中形成為240-270 mg錠劑(每粒錠劑80-90 mg根據式I之本發明活性化合物)。調配物 2- 膠囊

可將根據式I之本發明化合物以乾燥粉末形式與澱粉稀釋劑以約1:1重量比摻合。可將混合物填充至250 mg膠囊(每粒膠囊125 mg根據式I之本發明活性化合物)。調配物 3- 液體

可將根據式I之本發明化合物(125 mg)與蔗糖(1.75 g)及三仙膠(4 mg)摻合且可摻混所得混合物，使其穿過10號篩孔美製篩網，且接著與先前製成的微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉(11:89，50 mg)於水中之溶液混合。可將苯甲酸鈉(10 mg)、調味劑及著色劑用水稀釋且在攪拌下添加。接著可在攪拌下添加足夠之水。接著可再添加足夠之水以產生5 mL之總體積。調配物 4- 錠劑

可將根據式I之本發明化合物以乾燥粉末形式與無水明膠黏合劑以約1:2重量比摻合。可添加少量硬脂酸鎂作為潤滑劑。可將混合物在製錠機中形成為450-900 mg錠劑(每粒錠劑150-300 mg根據式I之本發明活性化合物)。調配物 5- 注射劑

可將根據式I之本發明化合物溶解或懸浮於緩衝無菌鹽水可注射水性介質中，達到約5 mg/mL之濃度。調配物 6- 局部

可使硬脂醇(250 g)與白凡士林(250 g)在約75℃下熔融，接著可添加根據式I之本發明化合物(50 g)、對羥基苯甲酸甲酯(0.25 g)、對羥基苯甲酸丙酯(0.15 g)、月桂基硫酸鈉(10 g)及丙二醇(120 g)溶解於水(約370 g)中之混合物，且可攪拌所得混合物直至其凝結。治療方法

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物的醫藥組合物，以供用於藥品中。在一特定實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病的藥物。

在一個實施例中，本發明提供包含本發明化合物及另一治療劑之醫藥組合物。在一特定實施例中，其他治療劑為用於預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病的藥劑。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該病況。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該病況。

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療疼痛。在一特定實施例中，疼痛係選自慢性關節疼痛。在一特定實施例中，慢性關節疼痛為骨關節炎、類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、痛風性關節炎(痛風)及/或幼年期關節炎之疼痛。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療疼痛的藥物。在一特定實施例中，疼痛係選自慢性關節疼痛。在一特定實施例中，慢性關節疼痛為骨關節炎、類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、痛風性關節炎(痛風)及/或幼年期關節炎之疼痛。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患疼痛之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該病況。在一特定實施例中，疼痛係選自慢性關節疼痛。在一特定實施例中，慢性關節疼痛為骨關節炎、類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、痛風性關節炎(痛風)及/或幼年期關節炎之疼痛。

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療發炎性病況。在一特定實施例中，發炎性病況係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)及發炎性腸病。更特定言之，發炎性病況為骨關節炎。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療發炎性病況的藥物。在一特定實施例中，發炎性病況係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)及發炎性腸病。更特定言之，發炎性病況為骨關節炎。在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患發炎性病況之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該病況。在一特定實施例中，發炎性病況係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)及發炎性腸病。更特定言之，發炎性病況為骨關節炎。

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療心血管疾病。在一特定實施例中，心血管疾病係選自動脈粥樣硬化、肺動脈高血壓、心臟衰竭、急性冠狀動脈症候群、心肥大、心室纖維化及心肌重塑。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療心血管疾病的藥物。在一特定實施例中，心血管疾病係選自動脈粥樣硬化、肺動脈高血壓、心臟衰竭、急性冠狀動脈症候群、心肥大、心室纖維化及心肌重塑。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患心血管疾病之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該疾病。在一特定實施例中，心血管疾病係選自動脈粥樣硬化、肺動脈高血壓、心臟衰竭、急性冠狀動脈症候群、心肥大、心室纖維化及心肌重塑。

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療神經退化性疾病。在一特定實施例中，神經退化性疾病係選自退化性癡呆症、阿茲海默症、多發性硬化症及視網膜病。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療神經退化性疾病的藥物。在一特定實施例中，神經退化性疾病係選自退化性癡呆症、阿茲海默症、多發性硬化症及視網膜病。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患神經退化性疾病之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該疾病。在一特定實施例中，神經退化性疾病係選自退化性癡呆症、阿茲海默症、多發性硬化症及視網膜病。

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療神經疾病。在一特定實施例中，神經疾病係選自神經痛、癡呆症、多發性硬化症及視網膜病。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療神經疾病的藥物。在一特定實施例中，神經疾病係選自神經痛、癡呆症、多發性硬化症及視網膜病。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患神經疾病之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該疾病。在一特定實施例中，神經疾病係選自神經痛、癡呆症、多發性硬化症及視網膜病。

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療糖尿病之併發症。在一特定實施例中，併發症係選自糖尿病性視網膜病變、糖尿病微血管病、糖尿病腎病變及肝脂肪變性。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療糖尿病之併發症的藥物。在一特定實施例中，併發症係選自糖尿病性視網膜病變、糖尿病微血管病、糖尿病腎病變及肝脂肪變性。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患糖尿病之併發症之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該併發症。在一特定實施例中，併發症係選自糖尿病性視網膜病變、糖尿病微血管病、糖尿病腎病變及肝脂肪變性。

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療癌症。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療癌症的藥物。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患癌症之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文中所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該癌症。

在一個實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於預防及/或治療纖維化疾病。在一特定實施例中，纖維化疾病為個別器官或組織之纖維化，諸如肝纖維化、肺纖維化或腎臟纖維化。在一特定實施例中，纖維化疾病係選自特發性肺纖維化(IPF)、糖尿病腎病(DKD)及非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。

在另一實施例中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，以供用於製造用於預防及/或治療纖維化疾病的藥物。在一特定實施例中，纖維化疾病為個別器官或組織之纖維化，諸如肝纖維化、肺纖維化或腎臟纖維化。在一特定實施例中，纖維化疾病係選自特發性肺纖維化(IPF)、糖尿病腎病(DKD)及非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供預防及/或治療罹患纖維化疾病之哺乳動物的方法，該等方法包含投與有效量的本文所描述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物以供治療或預防該疾病。在一特定實施例中，纖維化疾病為個別器官或組織之纖維化，諸如肝纖維化、肺纖維化或腎臟纖維化。在一特定實施例中，纖維化疾病係選自特發性肺纖維化(IPF)、糖尿病腎病(DKD)及非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。

注射劑量水準之範圍介於約0.1 mg/kg/h至至少10 mg/kg/h，或持續約1至約120 h且尤其為24至96 h。亦可投與約0.1 mg/kg至約10 mg/kg或更多的預載推注以達成足夠穩定狀態之水準。對於40至80 kg人類患者，最大總劑量預期不超過約1公克/天。

對於長期病況(諸如退化性病況)之預防及/或治療，治療方案通常延續多月或多年，因此經口給藥就患者便利性及耐受性而言較佳。就經口給藥而言，每天一至四次(1至4)規律給藥，尤其每天一至三次(1至3)規律給藥，通常每天一至兩次(1至2)規律給藥，且最通常每天一次(1)規律給藥為代表性方案。或者對於作用持續時間較長的藥物，就經口給藥而言，每隔一週一次、每週一次及一天一次為代表性方案。特定言之，給藥方案可為每1至14天，更特定言之1至10天，甚至更特定言之1至7天，且最特定言之1至3天。

使用此等給藥模式，各劑量提供約1至約1000 mg本發明化合物，其中特定劑量各提供約10至約500 mg且尤其約30至約250 mg。

通常選擇經皮給藥以提供與使用注射給藥所達成的血液含量相比類似或較低的血液含量。

當用於預防病況發作時，應通常根據醫師之建議且在醫師之監督下，以上文所描述之劑量向有罹患該病況之風險的患者投與本發明之化合物。有罹患特定病況之風險的患者通常包括具有該病況之家族病史之彼等患者，或已藉由遺傳測試或篩檢經鑑別為尤其易於罹患該病況之彼等患者。

本發明之化合物可作為單獨活性劑投與或可與其他治療劑組合投與，該等其他治療劑包括展現相同或類似治療活性及經判定對該組合投與安全且有效之其他本發明化合物。在一特定實施例中，共同投與兩種(或更多種)藥劑允許顯著降低各待使用藥劑之劑量，由此減輕可見副作用。

在一個實施例中，本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物作為藥物經投與。在一特定實施例中，該醫藥組合物另外包含另一活性成分。

在一個實施例中，本發明化合物與另一治療劑共同投與以用於治療及/或預防發炎性病況，特定藥劑包括(但不限於)免疫調節劑(例如，硫唑嘌呤(azathioprine))、皮質類固醇(例如，潑尼龍(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone))、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環孢素A (cyclosporin A)、他克莫司(tacrolimus)、黴酚酸酯(mycophenolate)、莫非替克(mofetil)、莫羅莫那-CD3 (muromonab-CD3) (OKT3，例如Orthocolone®)、ATG、阿司匹林(aspirin)、乙醯胺苯酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)及吡羅昔康(piroxicam)。

在一個實施例中，本發明化合物與另一治療劑共同投與以用於治療及/或預防關節炎(例如，類風濕性關節炎)，特定藥劑包括(但不限於)鎮痛劑、非類固醇消炎藥(NSAIDS)、類固醇、合成疾病修飾抗風濕藥物(DMARDS) (例如(但不限於)甲胺喋呤(methotrexate)、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺胺吡啶、金諾芬(Auranofin)、金硫蘋果酸鈉、青黴胺(penicillamine)、氯奎、羥基氯奎、硫唑嘌呤、托法替尼(tofacitinib)、巴瑞替尼(baricitinib)、福他替尼(fostamatinib)及環孢素)及生物DMARDS (例如(但不限於)英利昔單抗(infliximab)、依那西普、阿達木單抗(adalimumab)、利妥昔單抗(rituximab)及阿巴西普(abatacept))。

如熟習此項技術者將顯而易見，共同投與包括作為同一治療方案之部分向患者遞送兩種或更多種治療劑之任何手段。儘管兩種或更多種藥劑可在單一調配物中同時投與(亦即作為單一醫藥組合物)，但並非必須如此。該等藥劑可在不同調配物中且在不同時間投與。化學合成程序 通用

根據本發明之另一態樣，提供一種用於製備式I化合物之方法。本文之流程為可用於合成本發明化合物之合成流程之實例。在本文之流程中，反應基可根據公認技術經保護基保護及去保護。

根據本發明之另一態樣，提供一種用於製備如本文所定義之式I化合物的方法，其包含： (a) 使式II化合物：

其中X及R₂ 如本文所定義，與式III化合物：

或其經保護衍生物反應，其中R¹ 如本文所定義； (b) 去保護式I化合物之經保護衍生物； (c) 使式I化合物或其經保護衍生物相互轉化為另外的式I化合物或其經保護衍生物；以及 (d) 視情況形成式I化合物之醫藥學上可接受之鹽。

式II及III之化合物可根據流程1A、1B、1C中之本文所描述之程序及用於製備化合物1至7之程序來製備。

本發明化合物可使用以下通用方法及程序自容易獲得之起始材料製備。應瞭解，除非另行說明，否則在給定典型或較佳的製程條件(亦即反應溫度、時間、反應物之莫耳比、溶劑、壓力等)之情況下，亦可使用其他製程條件。最佳反應條件可隨所使用之特定反應物或溶劑而變化，但此類條件可由熟習此項技術者藉由常規最佳化程序來確定。

此外，如熟習此項技術者將顯而易知，可能必需習知保護基來防止某些官能基經歷非所需反應。特定官能基之適合保護基以及保護及去保護之適合條件的選擇為此項技術中所熟知

藉助關於製備如上文所定義之本發明化合物及比較實例之細節呈現以下方法。本發明化合物可由熟習有機合成技術者用已知或市售起始材料及試劑來製備。

除非另行說明，否則所有試劑均為商品級且不經進一步純化即按原樣使用。在惰性氛圍下進行之反應使用市售無水溶劑。除非另外規定，否則所有其他情況中均使用試劑級溶劑。在矽膠60 (35-70 µm)上進行管柱層析。使用預先塗佈之矽膠60F-254盤(0.25 mm厚)進行薄層層析。在配備有5 mm BBI探針之Bruker DPX 300 MHz、配備有5 mm PABBO探針之Bruker AV400 MHz、配備有5 mm PABBI探針之Bruker DRX 500 MHz及配備有5 mm RT BBI探針之Bruker Avance III 600光譜儀上記錄NMR光譜。除非另行說明，否則使用DMSO-d₆ 或CDCl₃ 作為溶劑在25℃下記錄樣本。以每百萬分率(ppm)報導相對於作為內部參考之四甲基矽烷(δ0.00)的¹ H NMR光譜之化學位移(δ)。

在具有Waters Acquity PDA偵測器及SQD質譜儀之Waters Acquity UPLC上獲得電噴霧MS質譜。所使用管柱：UPLC BEH C18 1.7 µm，2.1×5 mm VanGuard前置柱與Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm，2.1×50 mm管柱或Acquity UPLC CSH C18 1.7 µm， 2.1×50 mm管柱。所有方法均使用MeCN/H₂ O梯度。MeCN及H₂ O含有0.1%甲酸或10 mM NH₄ HCO₃ 。

對於製備型純化，使用HPLC Waters質量定向自動純化系統。系統由Waters樣本管理器2767、Waters系統流體處理器、Waters二進位梯度模組2545、Waters 515 HPLC泵、Waters光電二極體陣列偵測器2998及Waters Micromass ZQ MS偵測器構成。所使用軟體：FractionLynx及MassLynx v4.1。通用HPLC方法參數：0.1%甲酸/H₂ O及MeCN或10 mM NH₄ HCO₃ pH=10及MeCN之梯度行動相。管柱XBridge 30×150 mm，5 µm。PDA偵測器設置：波長：210-400 nm，解析度：1.2 nm，取樣速率：1.0點/秒，過濾器回應：1。使用Biotage引發器進行微波加熱。實驗部分所使用之縮寫清單：

質量導向自動 HPLC

適用時，使用以下設備及條件藉由質量導向自動HPLC來實行純化：硬體： Waters 2525二進位梯度模組 Waters 515補充泵 Waters泵控制模組 Waters 2767噴射收集 Waters管柱流體學管理器 Waters 2996光電二極體陣列偵測器 Waters ZQ質譜儀 Gilson 202溶離份收集器 Gilson Aspec廢料收集器軟體：Waters MassLynx型號4 SP2 管柱：所使用管柱為Waters Atlantis，其尺寸為19 mm ×100 mm (小規模)及30 mm×100 mm(大規模)。固定相粒徑為5 μm。酸性方法： 溶劑： A：水溶劑=水+0.1%甲酸 B：有機溶劑=乙腈+0.1%甲酸補充溶劑=甲醇:水80:20 針頭沖洗溶劑=甲醇方法：

視相關化合物之分析型滯留時間而定，使用五種方法。各方法具有13.5分鐘執行時間，其包含10分鐘梯度，隨後3.5分鐘管柱沖洗及再平衡步驟。大/小規模1.0-1.5 (HPLC)，0.4-0.6 (UPLC) = 5-30% B 大/小規模1.5-2.2 (HPLC)，0.6-0.9 (UPLC) = 15-55% B 大/小規模2.2-2.9 (HPLC)，0.9-1.2 (UPLC) = 30-85% B 大/小規模2.9-3.6 (HPLC)，1.2-1.4 (UPLC) = 50-99% B 大/小規模3.6-5.0 (HPLC)，1.4-2.0 (UPLC) = 80-99% B (6分鐘，隨後7.5分鐘沖洗及再平衡) 流速：所有上述方法具有20 mL/min (小規模)或40 mL/min (大規模)之流速。高 pH 方法：管柱：在XBridge C18管柱(100 nm×19 nm內徑，5 μm填料直徑)上在環境溫度下進行HPLC分析溶劑： A：含10 mM碳酸氫銨/水，其用氨溶液調節至pH 10。 B：乙腈。方法：

視相關化合物之分析型滯留時間而定，使用五種方法。其具有15分鐘執行時間，其包含10分鐘梯度，隨後5分鐘管柱沖洗及再平衡步驟。大/小規模1.0-1.5 (HPLC)，0.4-0.6 (UPLC) = 1-30% B 大/小規模1.5-2.2 (HPLC)，0.6-0.9 (UPLC) = 15-55% B 大/小規模2.2-2.9 (HPLC)，0.9-1.2 (UPLC) = 30-85% B 大/小規模2.9-3.6 (HPLC)，1.2-1.4 (UPLC) = 50-99% B 大/小規模3.6-5.0 (HPLC)，1.4-2.0 (UPLC) = 80-99% B (6分鐘，隨後7.5分鐘沖洗及再平衡) 流速：所有上述方法具有20 ml/min (小規模)或40 ml/min (大規模)之流速。液相層析 / 質譜

使用在以下展示之方法中所指示之設備及條件藉由液相層析/質譜(LC/MS)實行對上文實例之分析液相層析：方法描述：甲酸通用分析型UPLC開放式入口(Open Access) LC/MS 2分鐘方法 LC/MS系統：與SQD質譜儀耦接之Acquity UPLC LC條件管柱： Acquity UPLC BEH C18 (50 mm×2.1 mm內徑，1.7 µm填料直徑) 管柱溫度： 40℃ 溶劑： A=甲酸於水中之0.1 v/v%溶液 B=甲酸於乙腈中之0.1 v/v%溶液注射體積：2 µl 梯度表：

終止時間：2 minUV 條件 PDA範圍：210 nm-350 nm

UV偵測為210 nm至350 nm波長之總計信號獲取速率：40 HzMS 條件電離模式：交替掃描正電噴霧及負電噴霧(ES⁺ /ES^- ) 掃描範圍： 100至1000 AMU 掃描時間： 0.15 掃描間延遲： MS掃描間延遲： 0.02秒極性/模式切換掃描間延遲： 0.02秒方法描述：碳酸氫銨通用分析型UPLC開放式入口LC/MS 2分鐘方法 LC/MS系統：與SQD質譜儀耦接之Acquity UPLC LC條件管柱： Acquity UPLC BEH C18 (50 mm×2.1 mm內徑，1.7 µm填料直徑) 管柱溫度： 40℃ 溶劑： A=10 mM NH₄ HCO₃ 水溶液(用氨調節至pH 10) B=乙腈注射體積：1 µl 梯度表：

終止時間：2 minUV 條件 PDA範圍：210 nm-350 nm UV偵測為210 nm至350 nm波長之總計信號獲取速率：40 HzMS 條件電離模式：交替掃描正電噴霧及負電噴霧(ES⁺ /ES^- ) 掃描範圍： 100至1000 AMU 掃描時間：0.15掃描間延遲： MS掃描間延遲：0.02秒極性/模式切換掃描間延遲： 0.02秒本發明化合物之合成製備 流程1A 中間物A之合成

流程1B 中間物B之合成

流程1C 化合物1之合成

1 . 1 化合物 1 ： 2 - 胺基 - 5 - 氟 - N -[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 吡啶 - 4 - 甲醯胺 1.1.1 步驟 1 ： 2 - 溴 - 5 - 氟 - 吡啶 - 4 - 甲酸甲酯之合成

歷經30分鐘向冷卻至0℃之2-溴-5-氟-吡啶-4-甲酸(10.0 g，45.5 mmol)於甲醇(300 mL)中之溶液中逐滴添加亞硫醯氯(16.5 mL，227.3 mmol)。在環境溫度下攪拌反應混合物24小時。將甲苯(40 mL)添加至反應混合物。在蒸發甲醇之後，蒸餾出亞硫醯氯。在旋轉式蒸發器上蒸發剩餘甲苯，得到粗產物，將該粗產物溶解於二氯甲烷(30 mL)中，在減壓下蒸發，得到2-溴-5-氟-吡啶-4-甲酸甲酯(10.3 g)。LCMS: MW (計算值): 232.9; MS (ES⁺ ,m/z ): 234, 236 (M+H)⁺ 。1.1.2 替代合成程序 ：

歷經30分鐘向冷卻至0℃之2-溴-5-氟-吡啶-4-甲酸(10.0 g，45.5 mmol)於甲醇(35 mL)及甲苯(65 mL)中之溶液中逐滴添加(三甲基矽烷基)重氮甲烷(2.0 M二乙醚溶液；45.5 mL，90.9 mmol)。在環境溫度下攪拌反應混合物。2 h後，在減壓下蒸發反應混合物，得到粗產物，將該粗產物溶解於乙酸乙酯(50 mL)中，分別用水(100 mL)及鹽水(50 mL)洗滌，經由相分離過濾器過濾且在減壓下蒸發，得到2-溴-5-氟-吡啶-4-甲酸甲酯(10.46 g)。LCMS: MW (計算值): 232.9; MS (ES⁺ ,m/z ): 234, 236 (M+H)⁺ 。1.1.3 步驟 2 ： 2 -( 第三丁氧羰基胺基 )- 5 - 氟 - 吡啶 - 4 - 甲酸甲酯之合成

向2-溴-5-氟-吡啶-4-甲酸甲酯(10.3 g，44.0 mmol)於1,4-二噁烷(150 mL)中之溶液中添加胺基甲酸第三丁酯(6.18 g，52.8 mmol)、參(二苯亞甲基丙酮)二鈀(0) (0.86 g，0.88 mmol)、4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃(1.02 g，1.76 mmol)及碳酸銫(20.08 g，61.6 mmol)。將反應混合物用氬氣吹掃，經音波處理，封蓋且在90℃下攪拌24 h。將反應混合物冷卻，經由矽藻土墊過濾且用乙酸乙酯洗滌。將母液用水(2×100 mL)及鹽水(100 mL)洗滌且在減壓下蒸發，得到粗產物，該粗產物自乙酸乙酯濕磨，得到2-(第三丁氧羰基胺基)-5-氟-吡啶-4-甲酸甲酯(8.43 g)。LCMS: MW (計算值): 270.1; MS (ES⁺ ,m/z ): 215.41 (M+H-56)⁺ 。1.1.4 替代合成程序 ( 2 -(( 二苯亞甲基 ) 胺基 )- 5 - 氟異菸鹼酸甲酯中間物 ) ：

向經脫氣且用氬氣吹掃的2-溴-5-氟-吡啶-4-甲酸甲酯(308 mg，1.32 mmol)於1,4-二噁烷(6 mL)中之懸浮液添加二苯酮亞胺(0.266 mL，1.58 mmol)、參(二苯亞甲基丙酮)二鈀(0) (24.1 mg，0.026 mmol)、4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃(30.5 mg，0.053 mmol)及碳酸銫(602.0 mg，0.053 mmol)。將反應混合物用氬氣沖洗，經音波處理，封蓋且在100℃下攪拌16 h。將反應混合物冷卻，用乙酸乙酯(15 mL)稀釋，用水(15 mL)、鹽水(15 mL)洗滌且在減壓下蒸發，得到2-((二苯亞甲基)胺基)-5-氟異菸鹼酸甲酯(230 mg)。LCMS: MW (計算值): 334.1; MS (ES⁺ ,m/z ): 335.34 (M+H)⁺ 。1.1.5 步驟 3 ： 2 -( 第三丁氧羰基胺基 )- 5 - 氟 - 吡啶 - 4 - 甲酸之合成

向2-(第三丁氧羰基胺基)-5-氟-吡啶-4-甲酸甲酯(8.43 g，31.19 mmol)於四氫呋喃(100 mL)中之懸浮液中添加氫氧化鋰(2.98 g，124.76 mmol)及水(50 mL)。在環境溫度下攪拌反應混合物隔夜。次日，在減壓下蒸發四氫呋喃，將水層之pH調節至4。將所形成沈澱物經濾且與甲苯(4×20 mL)一起共蒸發並在40℃下於真空烘箱中乾燥5 h，得到2-(第三丁氧羰基胺基)-5-氟-吡啶-4-甲酸(7.79 g)。LCMS: MW (計算值): 256.08; MS (ES⁺ ,m/z ): 201.4 (M+H-56)⁺ 。1.1.6 步驟 4 ： 4 - 氯 - 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶之合成

將5-溴-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(10.0 g，43.0 mmol)溶解於無水THF (350 mL)中且在氬氣氛圍下冷卻至-78℃。歷經一個小時逐滴添加n-BuLi (2.5 M於己烷中，38 mL，94.6 mmol)。在完成添加之後，攪拌溶液40 min且添加碘甲烷(4.3 mL，68.8 mmol)。使溶液緩慢到達室溫。添加水(20 mL)且在真空中移除溶劑以得到棕色漿液，將該棕色漿液溶解於水(200 mL)中並用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取。將合併之有機物用鹽水(150 mL)洗滌，經無水Na₂ SO₄ 乾燥，過濾且濃縮以得到粗化合物，該粗化合物自乙酸乙酯濕磨，以得到4-氯-5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(5.32 g)。LCMS: MW (計算值): 167.03; MS (ES⁺ ,m/z ): 168.37 (M+H)⁺ 。1.1.7 步驟 5 ： N -[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 胺基甲酸第三丁酯之合成

向4-氯-5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(10.0 g，59.7 mmol)於1-甲基-2-吡咯啶酮(40 mL)中之溶液中添加N-(4-哌啶基)胺基甲酸第三丁酯(17.95 g，89.6 mmol)及N , N -二異丙基乙胺(25.2 mL，149.3 mmol)。在150℃下攪拌反應混合物3 h。使反應混合物冷卻且接著倒入冷水(300 mL)中。向混合物添加乙酸乙酯(40 mL)且在環境溫度下攪拌30 min。將所形成沈澱物過濾，用水及二乙醚洗滌且在40℃下於真空烘箱中乾燥隔夜。乾燥得到N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-胺基甲酸第三丁酯(19.91 g)。LCMS: MW (計算值): 331.2; MS (ES⁺ ,m/z ): 332.7 (M+H)⁺ 。1.1.8 步驟 6 ： 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 ) 哌啶 - 4 - 胺之合成

向冷卻至0℃之N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]胺基甲酸第三丁酯(38.9 g，117.3 mmol)於1,4-二噁烷(200 mL)中之懸浮液中添加HCl (4M於二噁烷中之溶液) (290 mL)。在環境溫度下攪拌反應混合物。23 h後，使反應混合物在減壓下蒸發，與甲苯(200 mL)一起共蒸發且在40℃下於真空烘箱中乾燥隔夜。乾燥得到1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-胺(47.68 g)作為HCl鹽。LCMS: MW (計算值): 231.15; MS (ES⁺ ,m/z ): 232.6 (M+H)⁺ 。1.1.9 步驟 7 ： N -[ 5 - 氟 - 4 -[[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 胺甲醯基 ]- 2 - 吡啶基 ] 胺基甲酸第三丁酯之合成

向2-(第三丁氧羰基胺基)-5-氟-吡啶-4-甲酸(14.25 g，55.6 mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(130 mL)中之懸浮液中添加HATU (19.03 g，50.1 mmol)。在環境溫度下攪拌反應混合物20 min，接著添加1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-胺×2HCl (16.92 g，55.6 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(47.56 mL，278.1 mmol)。在環境溫度下攪拌反應混合物。3 h後，反應完成。將反應混合物倒入冰冷之水(1.2 L)中將所形成沈澱物過濾，接著用乙腈洗滌且在40℃下於真空烘箱中乾燥4 h，得到N-[5-氟-4-[[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]胺甲醯基]-2-吡啶基]胺基甲酸第三丁酯(19.26 g)。LCMS: MW (計算值): 469.22; MS (ES⁺ ,m/z ): 470.7 (M+H)⁺ 。1.1.10 步驟 8 ： 2 - 胺基 - 5 - 氟 - N -[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成

向冷卻至0℃之N-[5-氟-4-[[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]胺甲醯基]-2-吡啶基]胺基甲酸第三丁酯(25.76 g，54.9 mmol)於二氯甲烷(300 mL)中之懸浮液中逐滴添加HCl (4M於二噁烷中之溶液) (130 mL)。幾分鐘後，形成膠質殘餘物。將額外量之二氯甲烷(200 mL)添加至反應混合物。藉由超音波處理粉碎膠質殘餘物(在45 min之後)。在環境溫度下攪拌反應混合物隔夜。次日，將沈澱物過濾且用水、乙腈及甲醇洗滌，並在40℃下於真空烘箱中乾燥5 h且接著在環境溫度下隔夜。乾燥得到2-胺基-5-氟-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺(13.65 g)。LCMS: MW (計算值): 369.17; MS (ES⁺ ,m/z ): 370.77 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ = 1.59 - 1.70 (m, J = 12.3, 3.7 Hz, 2 H), 1.93 (dd, J = 12.6, 2.7 Hz, 2 H), 2.34 (s, 3H), 3.06 (t, J = 11.4 Hz, 2 H), 3.94 (d, J = 13.2 Hz, 2 H), 3.95 - 4.03 (m, J = 11.2, 11.2, 7.5, 4.2, 4.2 Hz, 1 H), 6.02 (s, 2 H), 6.51 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 7.05 (s, 1 H), 7.91 (d, J = 1.5 Hz, 1 H), 8.19 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 11.51 (br. s., 1 H) ppm。 1.2 化合物 2 ： ( 2 - 胺基 - 5 - 甲基 - N -[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 吡啶 - 4 - 甲醯胺 ) 1.2.1 步驟 1 ： 2 - 胺基 - 5 - 甲基 - 吡啶 - 4 - 甲酸甲酯之合成

將2-胺基-5-溴-吡啶-4-甲酸甲酯(200 mg，0.87 mmol)、S-Phos (4.6 mg，3.2 mmol)、磷酸三鉀(369.3 mg，1.74 mmol)及二乙醯氧基鈀(19.5 g，0.011 mmol)合併、脫氣並用N₂ 回填且接著在室溫下溶解於DMSO (4 ml)及三甲基硼氧雜環己烷(467.5 µL，3.2 mmol)中。接著將混合物加熱至80℃且攪拌隔夜。16小時後，將混合物用EtOAc稀釋且用H₂ O洗滌。將有機相經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾，吸收至矽藻土並在真空中濃縮以得到粗產物，該粗產物經由Biotage純化裝置在4 g KP-Sil Interchim管柱上純化，其中流速為9 ml/min，DCM作為溶劑A且DCM:MeOH=20:1作為溶劑B。收集適當溶離份以得到2-胺基-5-甲基-吡啶-4-甲酸甲酯(167.03 mg)。LCMS: MW (計算值): 166.07; MS (ES⁺ ,m/z ): 167.03 (M+H)⁺ 。1.2.2 步驟 2 ： 2 - 胺基 - 5 - 甲基 - 吡啶 - 4 - 甲酸之合成

將2-胺基-5-甲基-吡啶-4-甲酸甲酯(125 mg，0.75 mmol)溶解於MeOH/H₂ O (2/2)中且添加NaOH (1M溶液，0.75 µL)。接著將混合物加熱至60℃且將其攪拌1 h。1 h後，蒸發MeOH且用EtOAc萃取水性殘餘物。將所需產物保留在水層中，凍乾隔夜。在凍乾之後，將混合物溶解於丙酮中，過濾且蒸發母液，以獲得2-胺基-5-甲基-吡啶-4-甲酸(55 mg)。LCMS: MW (計算值): 152.06; MS (ES⁺ ,m/z ): 153.02 (M+H)⁺ 。1.2.3 步驟 3 ：合成 2 - 胺基 - 5 - 甲基 - N -[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 吡啶 - 4 - 甲醯胺

在0℃下向2-胺基-5-甲基-吡啶-4-甲酸(33 mg，0.22 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加EDCxHCl (54.8 mg，0.29 mmol)及DIPEA (111.1 µL，0.64 mmol)且攪拌30分鐘。接著添加HOBtxH₂ O (35.6 mg，0.26 mmol)及1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-胺(50.2 mg，0.22 mmol)。使在室溫下攪拌反應物隔夜。次日，將反應混合物用水(5 mL)稀釋且用EtOAc (3 × 5 mL)萃取。將合併之有機層用鹽水(10 mL)洗滌，經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾且真空濃縮以得到粗產物，該粗產物經由Biotage純化裝置在4 g KP-Sil Interchim管柱上純化，其中流速為9 ml/min，DCM作為弱溶劑，且DCM:MeOH:NH₄ OH=90:1.5:0.15作為強溶劑。收集適當溶離份以得到2-胺基-5-甲基-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺(8 mg)。LCMS: MW (計算值): 365.20; MS (ES⁺ ,m/z ): 366.23 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.51 (br. s., 1H), 8.35 (d, J=8.01 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.81 (s, 2H), 3.95 (m, 3H), 3.05 (t, J=11.41 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.92 (d, J=9.58 Hz, 2H), 1.56-1.70 (m, 2H) ppm。 1.3: 化合物 3 ： 2 - 胺基 - 5 - 氯 - N -[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 吡啶 - 4 - 甲醯胺 1.3.1 步驟 1 ： 3 - 氯 - 1 - 側氧基 - 吡啶 - 4 - 甲酸之合成

將3-氯吡啶-4-甲酸(620 mg，3.94 mmol)溶解於乙酸(2 mL)中且添加30% H₂ O₂ 水溶液(6 mL)。在80℃下加熱反應混合物38 h。完成後，將其濃縮至其體積之一半。過濾出所形成晶體且在真空乾燥器中乾燥以得到3-氯-1-側氧基-吡啶-4-甲酸(420 mg)。LCMS: MW (計算值): 172.99; MS (ES⁺ ,m/z ): 174.33 (M+H)⁺ 。1.3.2 步驟 2 ： 3 - 氯 - N -[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 1 - 側氧基 - 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成

在0℃下向3-氯-1-側氧基-吡啶-4-甲酸(52 mg，0.30 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加EDCxHCl (74.8 mg，0.39 mmol)及DIPEA (161 µL，0.87 mmol)且攪拌30分鐘。接著添加HOBtxH₂ O (55.1 mg，0.36 mmol)及1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-胺(69.4 mg，0.30 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。次日，將反應混合物蒸發至乾燥。油性殘餘物藉由矽膠管柱層析(弱溶離劑：DCM，強溶離劑：DCM:MeOH:NH₄ OH=90:5:0.1)純化，以得到3-氯-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-1-側氧基-吡啶-4-甲醯胺(87 mg)。LCMS: MW (計算值): 386.13; MS (ES⁺ ,m/z ): 387.49 (M+H)⁺ 。1.3.3 步驟 3 ： 2 - 胺基 - 5 - 氯 - N -[ 1 -( 5 - 甲基 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成

在0℃下向3-氯-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-1-側氧基-吡啶-4-甲醯胺(87 mg，0.23 mmol)及第三丁胺(0.160 mL，1.53 mmol)於氯仿(10 mL)及三氟甲苯(1 mL)之混合物中之溶液中逐份添加對甲苯磺酸酐(260 mg，0.57 mmol)，同時將溫度維持於5℃。10 min後，反應完成。在80℃下攪拌三氟乙酸(5 mL)及反應混合物之溶液3 h。在真空下還原溶劑且將殘餘物用二氯甲烷稀釋並用40% NaOH淬滅至pH 9-10。用二氯甲烷(4 × 15 mL)萃取水層。使合併之有機物經Na₂ SO₄ 乾燥，濃縮且藉由矽膠管柱層析(弱溶離劑：DCM，強溶離劑：DCM:MeOH:NH₄ OH=90:9:0.5)純化，以得到2-胺基-5-氯-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺(9.05 mg)。LCMS: MW (計算值): 385.14; MS (ES⁺ ,m/z ): 386.54 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.52 (br. s., 1H), 8.52 (d, J=7.63 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.91 (d, J=4.88 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.52 (d, J=4.88 Hz, 1H), 6.42 (s, 2H), 3.94 (m, 3H), 3.08 (t, J=11.44 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.95 (d, J=9.77 Hz, 2H), 1.57-1.71 (m, 2H) ppm。 1.4: 化合物 4 ： 2 - 胺基 - N -[ 1 -( 5 - 氯 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 吡啶 - 4 - 甲醯胺 1.4.1 步驟 1 ： 4 , 5 - 二氯 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶之合成

向4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(2.0 g，13.04 mmol)於DCM (80 mL)中之溶液中添加N-氯丁二醯亞胺(1.7 g，13.04 mmol)。使反應混合物回流3天。將反應混合物溶解於水中且用EtOAc (3 × 50 mL)萃取。使合併之有機層經MgSO₄ 乾燥，過濾且蒸發，以得到4,5-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1.08 g)。LCMS: MW (計算值): 186.97; MS (ES⁺ ,m/z ): 187.98 (M+H)⁺ 。1.4.2 步驟 2 ： N -( 5 - 氯 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 ) 胺基甲酸第三丁酯之合成

將N-(4-哌啶基)胺基甲酸第三丁酯(895.3 mg，4.47 mmol)及4,5-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1080 mg，5.36 mmol)溶解於NMP (8 ml)中且逐滴添加DIPEA (2.33 ml ,13.4 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物3天。將混合物溶解於水中且用EtOAc (3×15 mL)萃取。將合併之有機層乾燥且濃縮以得到粗產物，該粗產物用乙腈再結晶以得到N-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)胺基甲酸第三丁酯(1.42 g)。LCMS: MW (計算值): 351.15; MS (ES⁺ ,m/z ): 352.22 (M+H)⁺ 。1.4.3 步驟 3 ： 1 -( 5 - 氯 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 ) 哌啶 - 4 - 胺之合成

向N-[1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]胺基甲酸第三丁酯(2.0 g，5.69 mmol)於DCM (10 mL)中之溶液中添加三氟乙酸(3.3 mL)且在室溫下攪拌所得溶液2 h。完成後，蒸發溶劑且將粗產物置於先前經調節 (40 mL MeOH)之SCX管柱(20 g)上。用MeOH (2×40 mL)且接著用7 N NH₃ /MeOH (100 mL)洗滌管柱。蒸發溶劑以得到1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-胺(1.3 g)。LCMS: MW (計算值): 251.09; MS (ES⁺ ,m/z ): 252.10 (M+H)⁺ 。1.4.4 步驟 4 ： 2 - 胺基 - N -[ 1 -( 5 - 氯 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成

在0℃下向2-胺基吡啶-4-甲酸(200 mg，1.45 mmol)於DMF (4 mL)中之溶液中添加EDCxHCl (362.3 mg，1.89 mmol)及DIPEA (732 µL，4.21 mmol)且攪拌30分鐘。接著添加HOBtxH₂ O (266.4 mg，1.74 mmol)及1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-胺(546.23 mg，2.17 mmol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜，用水(10 mL)稀釋且用EtOAc (3×10 mL)萃取。將合併之有機層用鹽水(20 mL)洗滌，經Na₂ SO₄ 乾燥且在真空中濃縮。粗產物經由Biotage純化裝置在12 g KP-Sil Interchim管柱上純化：DCM作為弱溶劑且DCM:MeOH:NH₄ OH=90:1.5:0.15作為強溶劑。收集適當溶離份以得到產物，該產物用乙腈濕磨，以得到2-胺基-N-[1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-吡啶-4-甲醯胺(162.1 mg)。LCMS: MW (計算值): 371.13; MS (ES⁺ ,m/z ): 372.18 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.15 (br. s., 1H), 8.39 (d, J=7.32 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.97 (d, J=4.88 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.77-6.87 (m, 2H), 6.09 (br. s., 2H), 4.21 (d, J=12.21 Hz, 2H), 4.05 (d, J=7.32 Hz, 1H), 3.10 (t, J=12.36 Hz, 2H), 1.91 (d, J=10.68 Hz, 2H), 1.74 (m, 2H) ppm。 1.5 化合物 5 ： 2 - 胺基 - N -[ 1 -( 5 - 氯 - 7H - 吡咯并 [ 2 , 3 - d ] 嘧啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 5 - 氟 - 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成

在0℃下向2-(二苯亞甲基胺基)-5-氟-吡啶-4-甲酸(43.0 mg，0.13 mmol)於DMF (5 mL)中之溶液中添加EDCxHCl (32.6 mg，0.17 mmol)及DIPEA (66.1 µL，0.38 mmol)且攪拌30分鐘。接著添加HOBtxH₂ O (24.5 mg，0.16 mmol)及1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-胺(50.3 mg，0.20 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。蒸發溶劑至乾燥。經由製備型LC-MS純化粗產物。收集適當溶離份且將其凍乾隔夜，以得到2-胺基-N-[1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺(17 mg)。LCMS: MW (計算值): 389.12; MS (ES⁺ ,m/z ): 390.39 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.15 (br. s., 1H), 8.47 (d, J=7.70 Hz, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 6.51 (d, J=4.40 Hz, 1H), 6.02 (s, 2H), 4.14 (d, J=12.65 Hz, 2H), 4.02 (m, 1H), 3.13 (t, J=11.83 Hz, 2H), 1.93 (d, J=10.82 Hz, 2H), 1.67 (m, 2H) ppm。 1.6 化合物 6 ： 2 - 胺基 - N -[ 1 -( 5 - 氰基 - 3 - 甲基 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 5 - 氟 - 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成 1.6.1. 3 - 溴 - 4 - 氯 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 5 - 甲腈之合成

向4-氯-1H-吡咯并(3,2-b)吡啶-5-甲腈(3 g，16.89 mmol)於DMF (20 mL)中之攪拌溶液中添加N-溴代丁二醯亞胺(3.3 g，18.582 mmol)。在室溫下攪拌所得溶液20 min。將反應混合物用水(50 mL)稀釋且用乙酸乙酯(2×25 mL)萃取。將經合併之有機層用鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥，且在真空中濃縮。將所得粉末用EtOAc濕磨且乾燥以得到3-溴-4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈(1.5 g)。LCMS: MW (計算值): 256.49; MS (ES⁺ ,m/z ): 257.93 (M+H)⁺ 。1.6.2. 4 - 氯 - 3 - 甲基 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 5 - 甲腈之合成

在-78℃下於氬氣下向3-溴-4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈(1.5 g，5.85 mmol)於THF (48 mL)中之溶液中添加丁基鋰溶液(5.2 mL，12.87 mmol)且攪拌反應物20 min。接著逐滴添加碘甲烷(590 µL，9.36 mmol)且在冷浴中使反應物升溫至室溫。用水(30 mL)淬滅反應物且將pH調節至7。蒸發THF且添加水。將所得固體過濾，用水洗滌且用EtOAc濕磨，以得到4-氯-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈(813 mg)。LCMS: MW (計算值): 191.6; MS (ES⁺ ,m/z ): 192.05 (M+H)⁺ 。1.6.3. N -[ 1 -( 5 - 氰基 - 3 - 甲基 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 胺基甲酸第三丁酯之合成

在150℃下攪拌4-氯-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈(813 mg，4.24 mmol)、4-第三丁氧羰基-胺基哌啶(1.27 g，6.36 mmol)及DIPEA (1.85 mL，10.61 mmol)於NMP (5 mL)中之混合物3 h且在室溫下繼續攪拌一個週末。將反應混合物用水(110 mL)及二乙醚稀釋。將所得固體過濾，用水及二乙醚洗滌且乾燥，以得到N-[1-(5-氰基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]胺基甲酸第三丁酯(1.28 g)。LCMS: MW (計算值): 355.43; MS (ES⁺ ,m/z ): 356.30 (M+H)⁺ 。1.6.4. 4 -( 4 - 胺基 - 1 - 哌啶基 )- 3 - 甲基 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 5 - 甲腈之合成

向N-[1-(5-氰基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]胺基甲酸第三丁酯(1.28 g，3.6 mmol)於DCM (40 mL)中之溶液中添加三氟乙酸(5.5 mL，72.03 mmol)。在室溫下攪拌所得溶液1 h。將反應混合物負載至SCX管柱(20 g，經100 mL MeOH預調節)上。使MeOH (200 mL)穿過管柱且用含7N NH₃ /MeOH:MeOH=1:4 (300 mL)溶離化合物。在真空中濃縮濾過物以得到4-(4-胺基-1-哌啶基)-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈(1.06 g)。LCMS: MW (計算值): 255.32; MS (ES⁺ ,m/z ): 256.21 (M+H)⁺ 。1.6.5. 2 - 胺基 - N -[ 1 -( 5 - 氰基 - 3 - 甲基 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 5 - 氟 - 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成

在0℃下向2-胺基-5-氟-吡啶-4-甲酸(66.0 mg，0.30 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加EDCxHCl (50.0 mg，0.26 mmol)及DIPEA (101 µL，0.58 mmol)且攪拌30分鐘。接著添加HOBtxH₂ O (37.0 mg，0.24 mmol)及4-(4-胺基-1-哌啶基)-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲腈(108.0 mg，0.30 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。蒸發溶劑至乾燥。粗產物經由Biotage純化裝置在4 g KP-Sil Interchim管柱上純化，DCM作為弱溶劑且DCM:MeOH=10:1作為強溶劑。收集適當溶離份以得到2-胺基-N-[1-(5-氰基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺(1.27 mg)。LCMS: MW (計算值): 393.42; MS (ES⁺ ,m/z ): 394.53 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.82 (br. s., 1H), 8.55 (d, J=7.32 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.54 (d, J=4.27 Hz, 1H), 6.04 (br. s., 2H), 3.97 (br. s., 1H), 3.62 (d, J=12.21 Hz, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.41 (s, 3H), 1.97 (d, J=11.29 Hz, 2H), 1.72-1.83 (m, 2H) ppm。 化合物 7 ： 2 - 胺基 - N -[ 1 -( 3 - 氯 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 5 - 氟 - 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成 1.7.1. N -[ 1 -( 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 胺基甲酸第三丁酯之合成

在150℃下攪拌4-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(4.0 g，26.20 mmol)、N-(4-哌啶基)胺基甲酸第三丁酯(7.8 g，39.30 mmol)及DIPEA (11.4 mL，65.50 mmol)於NMP (28 mL)中之混合物72 h。將反應混合物用水稀釋且用EtOAc (4×)萃取。將合併之有機層乾燥且濃縮以得到粗產物，該粗產物用乙腈再結晶以得到N-[1-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]胺基甲酸第三丁酯(1.88 g)。LCMS: MW (計算值): 316.41; MS (ES⁺ ,m/z ): 317.22 (M+H)⁺ 。1.7.2. N -[ 1 -( 3 - 氯 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ] 胺基甲酸第三丁酯之合成

將N-[1-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]胺基甲酸第三丁酯(316 mg，1 mmol)溶解於無水DCM (10 ml)中且添加N-氯丁二醯亞胺(147 mg，1.1 mmol)。在40℃下攪拌反應混合物隔夜。16 h後向反應混合物添加水且用DCM (3×)萃取。使經合併之有機層經無水Na₂ SO₄ 乾燥，經由相分離器過濾且蒸發以獲得粗化合物，該粗化合物經由Biotage純化裝置在4 g KP-Sil Interchim管柱上純化，其中流速為10 ml/min，DCM作為溶劑A且DCM:MeOH=7:3作為溶劑B。方法：0-5% B 4 CV；20% 4 CV；20-40% B 5 CV；40% B 5 CV；40-60% B 4 CV；60% B 4 CV。收集適當溶離份以得到N-[1-(3-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]胺基甲酸第三丁酯(150 mg)。LCMS: MW (計算值): 350.85; MS (ES⁺ ,m/z ): 351.43 (M+H)⁺ 。1.7.3. 1 -( 3 - 氯 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 4 - 基 ) 哌啶 - 4 - 胺之合成

在0℃下向N-[1-(3-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]胺基甲酸第三丁酯(320 mg，1.8 mmol)於DCM (10 mL)中之混合物中添加TFA (1.5 mL)。在室溫下攪拌反應混合物1 h。完成後，蒸發溶劑且將粗產物置於先前經調節(用MeOH)之SCX管柱(5 g)上。將管柱用MeOH (2 × 5 ml)且接著用7 N NH₃ /MeOH (10 ml)洗滌以得到1-(3-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)哌啶-4-胺(108 mg)。LCMS: MW (計算值): 250.73; MS (ES⁺ ,m/z ): 251.38 (M+H)⁺ 。

1.7.4. 2 - 胺基 - N -[ 1 -( 3 - 氯 - 1H - 吡咯并 [ 2 , 3 - b ] 吡啶 - 4 - 基 )- 4 - 哌啶基 ]- 5 - 氟 - 吡啶 - 4 - 甲醯胺之合成

在0℃下向2-胺基-5-氟-吡啶-4-甲酸(66.0 mg，0.43 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加EDCxHCl (70.0 mg，0.36 mmol)及DIPEA (141 µL，0.81 mmol)且攪拌30分鐘。接著添加HOBtxH₂ O (52.0 mg，0.34 mmol)及1-(3-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)哌啶-4-胺(108.0 mg，0.43 mmol)。在室溫下攪拌反應物隔夜。用水(10 mL)稀釋反應混合物且沈澱產物。過濾出晶體且在65℃下在真空乾燥器中乾燥3 h。用EtOAc (4×5 mL)萃取濾過物。使合併之有機層經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾且在真空中濃縮，以得到粗產物。粗產物經由Biotage純化裝置在4 g KP-Sil Interchim管柱上純化：DCM作為弱溶劑且E1作為強溶劑。收集適當溶離份以得到2-胺基-N-[1-(3-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺(7.77 mg)。LCMS: MW (計算值): 388.8; MS (ES⁺ ,m/z ): 389.47 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.81 (br. s., 1H), 8.51 (d, J=7.63 Hz, 1H), 8.06 (d, J=5.19 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 6.47-6.64 (m, 2H), 6.03 (s, 2H), 3.94 (m, 1H), 3.50-3.64 (m, 2H), 2.87 (t, J=11.44 Hz, 2H), 1.96 (d, J=10.38 Hz, 2H), 1.72-1.87 (m, 2H) ppm。生物實例 2. 活體外分析2.1 ASK1 / 2 生物化學分析 ( IMAP 技術 )

IMAP^® 技術提供適用於各種激酶、磷酸酶及磷酸二酯酶之均質分析且無需考慮受質肽序列。分析為簡單的混合及讀取程序，其允許酶活性之準確測定。基於磷酸基與三價含金屬奈米顆粒(珠粒)之特定高親和力相互作用，IMAP為用於評定激酶、磷酸酶及磷酸二酯酶活性的通用的基於非抗體之平台。使用經螢光標記之受質進行酶反應。IMAP結合系統之添加終止酶反應且引發珠粒與磷酸化受質之結合。可使用FP或TR-FRET作為讀數偵測到受質與珠粒之結合(其與酶活性相關)。

細胞凋亡信號調節激酶(ASK1) (亦稱為MAP3K5)為激酶之有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族之成員。其經由MAP2K MKK4/7及MKK3/6 (分別地)活化Jnk及p38途徑。此ASK1 IMAP分析使用以下IMAP肽：RP7140-T2 (5TAMRA-GTFRAAIRRLAARRR-OH，SEQ ID NO: 1)。分析經設計以針對ATP (150 mM)在Km處執行，使得其將對ATP競爭性抑制劑敏感。最終分析條件為150 mM ATP、1 mM DTT、200 nM肽及6 nM ASK1 (總蛋白)。結合試劑以1:200之最終稀釋度補充於100% A中。溶液：

KIT IMAP FP，目錄號R8127；反應緩衝液-Tween (5×濃度)，分子裝置，目錄號R7436；用H₂ O 1:5稀釋且含有DTT (1 mM來自1 M儲備液)；漸進性結合緩衝液(PBB) A (5×濃度)，分子裝置，目錄號R7282；漸進性結合試劑(PB試劑)，分子裝置，目錄號R7284；酶溶液(在反應緩衝液中含有2× Ask1)；受質溶液(在反應緩衝液中含有2×肽受質，及在反應緩衝液中含有2×150 µM ATP)；珠粒緩衝液(漸進性結合緩衝液A，用H₂ O 1:5稀釋)；珠粒溶液(珠粒緩衝液，含有1:200漸進性結合試劑(2×))實驗

將100 nL含測試化合物之100% DMSO添加至384孔培養盤。對於劑量反應實驗，使用1/4稀釋化合物(25 µM最高最終濃度)。除在對照孔中添加3 µL緩衝液以外，將3 µL hASK1 (6 nM)、hASK2 (25 nM)或rASK1 (15 nM)添加至各孔。將3 µL受質溶液添加至各孔且在室溫下培育培養盤4 h。之後，將6 µL IMAP™珠粒溶液(漸進性結合緩衝液A+PB試劑；最終稀釋度1:100)添加至各孔且以1000 rpm自旋1分鐘。接著在室溫下培育培養盤2 h，之後在Perkin Elmer EnVision盤式讀取器上進行讀取。資料分析

藉由使用Excel工具及GraphPadPrism軟體第5.03版進行IC₅₀ 資料之計算、獲得曲線及進行QC分析。簡言之，藉由使用最小平方(普通)擬合繪製經測試化合物之經測試濃度(X)對比對應抑制百分比值(Y)之對數來產生個別濃度效應曲線。允許排除來自高/低對照之至多¼點，但僅在值＞Avg.±1*SD時排除。用於IC₅₀ 計算之擬合等式=對數(抑制劑)對比反應-變數斜率(四個參數)。計算結果：計算值1：FP量測之mP值= 1000 * (S - G * P) / (S + G * P)，其中S = ＜偵測器2或FP-BodipyTAMRA_Ex531-Em579-最佳化(1)通道2 ＞ p = ＜偵測器1或FP-BodipyTAMRA_Ex531-Em579-最佳化(1)通道1 ＞ G = G-因子。增益=100。僅在未正確地計算最高值時才使用最高限制。

若小於-30%I或大於30%I，則最小值受限。若小於70%I或大於130%I，則最大值受限。Z'-因子目標≥0.4。希爾斜率(Hill Slope)範圍0.5至5。

根據實例2.1之方法測試本發明之說明性化合物。結果展示如下：

2.2 ASK1 / 2 生物化學分析 ( AlphaScreen 技術 ) AlphaScreen 技術描述

亦使用AlphaScreen技術定量ASK1及ASK2生物化學活性，該技術量測蛋白受質(MKK7)之磷酸化的程度。AlphaScreen技術係基於受質與兩種類型之珠粒(受體及供體)的結合。經由受質蛋白之標記物與一種珠粒結合。經由抗體與受質之磷酸化位點(phosphosite)的磷酸特異性結合來結合第二種珠粒。如此形成夾層，其中受體及供體珠粒極為接近。當供體珠粒由在680 nm範圍中之光激發時，釋放單態氧且造成在620 nm範圍中的光自受體之發射，其可使用適合盤式讀取器來偵測。ASK1 / 2 AlphaScreen 分析描述

經由使用GST標記物藉由全長非活性MKK7蛋白與麩胱甘肽供體珠粒之結合來實現ASK1/2 AlphaScreen分析。接著藉由磷酸特異性抗體識別MKK7 (Ser271/Thr275)上之磷酸化位點。磷酸特異性抗體經由蛋白質-A相互作用與AlphaScreen受體珠粒結合。藉由ASK1或ASK2進行MKK7之磷酸化隨後有助於使供體及受體珠粒極其接近，因此單態氧之轉移引起AlphaScreen信號之產生。ASK1 / 2 AlphaScreen 試劑、條件及方案 · 具有N端6His-Avi標記物之全長人類ASK1蛋白。 · 具有N端6His-Avi標記物之全長ASK1蛋白(非活性酶，其中離胺酸709經甲硫胺酸置換)及具有6His-FLAG標記物之全長ASK2蛋白的雜二聚體。 · 人類MKK7無活性(Carna Bioscience，目錄號07-147-10)。 · 磷酸-MKK7(Ser171/Thr275)抗體(Cell Signalling Technologies，目錄號4171)。 · 蛋白質A受體珠粒(Perkin Elmer，目錄號6760137)。 · 麩胱甘肽供體珠粒(Perkin Elmer，目錄號6765301)。 · 三磷酸腺苷，ATP (Promega，目錄號V915B)。 · 反應緩衝液：50 mM Hepes，150 mM NaCl，10 mm MgCl₂ ，1 mM CHAPS，pH 7.2。 · 終止緩衝液：50 mM Hepes，150 mM NaCl，60 mM EDTA，1 mM CHAPS，pH 7.2。

分析經設計以使用以下條件(最終濃度)執行：150 µM ATP；400 nM MKK7；0.8 nM ASK1及2 nM ASK2。實驗

將100 nL含測試化合物(起始濃度6 μM，藉由3倍連續稀釋之11個濃度)之100% DMSO添加至較小容量384孔培養盤。除向對照孔添加2.5 µl緩衝液以外，將2.5 µl ASK1或ASK2添加至各孔。將2.5 µl MKK7溶液添加至所有孔。在室溫下培育培養盤60分鐘。培育蛋白質-A受體珠粒及磷酸特異性抗體30分鐘且接著將2.5 µl蛋白質-A受體珠粒/磷酸特異性抗體混合物(2.5 µg/ml受體珠粒最終濃度及1/800抗體最終稀釋度)添加至各孔。在室溫下培育培養盤30分鐘且接著將2.5 µl GSH供體珠粒(10 µg/ml受體珠粒最終濃度)添加至各孔。在室溫下再培育培養盤60分鐘，之後在Perkin Elmer Enspire盤式讀取器上讀取。資料分析

藉由使用Excel工具及GraphPadPrism軟體第5.03版進行IC₅₀ 資料之計算、獲得曲線及進行QC分析。簡言之，藉由使用最小平方(普通)擬合繪製經測試化合物之經測試濃度(X)對比對應抑制百分比值(Y)之對數來產生個別濃度效應曲線。用於IC₅₀ 計算之擬合等式=對數(抑制劑)對比反應-變數斜率(四個參數)。

根據實例2.2之方法測試本發明之說明性化合物。結果展示如下：

2.3ASK1 / 2 細胞分析

使用西方墨點方法藉由測定磷酸-MKK3蛋白在H₂ O₂ 受激PBMC中之數量來分析活體外ASK1/2活性。MKK3經展示為p38活化路徑中之ASK1/2催化磷酸化之直接受質。2.3.1 材料及分析條件 · 淋巴細胞分離劑(Axis-Shield，目錄號1114545) · 氯化銨裂解物緩衝液pH 7.4 (10×濃縮)： - NH₄ Cl-最終濃度1.5 M (Kemika，目錄號0137407) - NaHCO₃ -最終濃度100 mM (Kemika，目錄號1411007) - Na₂ EDTA-最終濃度10 mM (Sigma Aldrich；目錄號E-4884) · RPMI 1640 (Lonza，目錄號BE12-115F/U1) · FBS (Sigma，目錄號F7524，熱不活化30'/56℃) · 二甲亞碸(DMSO) (Sigma，目錄號D2650) · 細胞裂解緩衝液(pH 7.4)：PBS+ 1% Triton X-100 (Sigma Aldrich；目錄號X100) - 10 ml - 磷酸終止-1錠劑(Sigma，目錄號4693124001) - 蛋白酶抑制劑-1錠劑(Sigma，目錄號4906837001) · 過氧化氫溶液3% w/w (Sigma Aldrich，目錄號H-6520) · PBS (Sigma Aldrich，目錄號P4417-100TAB) · 微量盤，96孔，pp，v形底，透明(Greiner bio-one；目錄號651201) · 組織培養盤，6孔，平底，具有低蒸發蓋(Falcon，目錄號353224) · 50 mL 法爾康管(TPP，目錄號91050) · Pierce BCA蛋白分析套組(Thermo Scientific，目錄號23225) · Immulon® Microtiter™ 96孔培養盤1B (Thermo Scientific，目錄號3355) · Wes 12-230 kDa 主套組(Protein Simple，目錄號PS-MK14) · MKK3 (D4C3)兔mAb (Cell Signaling，目錄號8535) · 磷酸-MKK3 (Ser189)/MKK6 (Ser207) (D8E9)兔mAb (Cell Signaling，目錄號12280)

分析經設計以使用以下條件執行：經測試化合物濃度範圍：1 - 0.0014 µM (7次三倍連續稀釋)；H₂ O₂ 濃度：3 mM2.3.2 實驗

為自白血球層分離PBMC，在PBS中以1:1稀釋白血球層，接著將稀釋之白血球層(25 mL)小心地吸入至法爾康管中之20 mL淋巴細胞分離劑之頂部上。接著使管在400× g下自旋35 min。接著小心地移除上部血漿層，留下含有MNC之層。接著將含有MNC之層轉移至新管，添加PBS達至50 mL之總體積且接著使管自旋10分鐘(200× g，25℃)。接著將所得小球再懸浮於2 mL PBS中，重複洗滌步驟。將最終小球再懸浮於至多50 mL之氯化銨裂解物緩衝液中，輕緩地混合且離心10分鐘(200× g，25℃)，再懸浮於2-3 mL細胞培養基中且在細胞培養基中稀釋至50 mL。使用自動細胞計數器來測定細胞培養基中1/20稀釋之細胞密度。

在6孔培養盤中的1 mL之補充有10% FBS之RPMI 1640細胞培養基中每孔接種10×10⁶ 個PBMC。自96孔v形底培養盤中之1 mM開始，製備七組含三倍連續稀釋化合物之DMSO。在細胞培養基中將DMSO化合物溶液稀釋100×。每孔添加200 µL 100×稀釋化合物溶液，對照孔含有在細胞培養基中製備之200 µL的1% DMSO。製備含7.5 mM H₂ O₂ 之細胞培養基且將800 µL添加至各孔，但向陰性對照孔添加800 µL細胞培養基。在37℃，5% CO₂ ，95%濕度下培育細胞30 min。將細胞轉移至2 mL埃彭道夫管(Eppendorf tubes)且在下300× g下於4℃下離心10分鐘，其接著用1 mL PBS洗滌，將細胞小球再懸浮於100 µL裂解緩衝液中且在冰上培育30分鐘。之後，細胞裂解物在10000× g下於4℃下離心5分鐘且接著在-20℃下儲存上清液。

樣本在細胞裂解緩衝液中稀釋5×且在96孔Immulon 1B培養盤中使用BCA蛋白分析套組遵照製造商說明書測定總蛋白濃度。

使用Protein Simple Wes主套組及裝置遵照製造商說明書進行西方墨點分析。每個樣本負載0.5 mg/mL之總蛋白質；將磷酸-MKK3及MKK3抗體稀釋300×。

使用Compass 2.7.1軟體分析西方墨點結果，且將磷酸MKK3數量除以各樣本之MKK3數量。使用以下等式藉由標準化對照之資料來計算抑制百分比： [(樣本-低對照)/(高對照-低對照)]*100

藉由使用GraphPad Prism軟體繪製抑制百分比及化合物濃度之對數、非線性回歸(曲線擬合)、對數(抑制劑)對比反應-變數斜率(四個參數)來測定化合物之IC₅₀ 值。

根據實例2.3之方法測試本發明之說明性化合物。結果展示如下：

2.4. ASK1 / 2 人類全血分析

使用ELISA藉由測定用LPS刺激之人類全血中產生之CCL2細胞介素之數量來分析活體外ASK1/2活性。其描述於在未經刺激及經LPS刺激條件下CCL2產生在來自ASK1基因剔除小鼠之血清中減少的文獻中。2.4.1 材料及分析條件 · RPMI 1640 (Lonza，目錄號BE12-115F/U1) · 二甲亞碸(DMSO) (Sigma，目錄號D2650) · 來自大腸桿菌(E . coli )之脂多醣(LPS) (Sigma，目錄號L4391) · 微量盤，96孔，pp，v形底，透明(Greiner；目錄號651201) · MasterBlock 96孔，2 ml (Greiner，目錄號780271) · 微量盤，96孔，ps，u形底，透明，有蓋(Greiner，目錄號650180) · 50 mL法爾康管(TPP，目錄號91050) · Immulon 2HB 96孔培養盤(Thermo Fisher Scientific，目錄號3455) · 蔗糖(Kemika，目錄號1800408) · 抗生蛋白鏈菌素-HRP (Calbiochem，目錄號OR03L) · 硫酸(Kemika，目錄號1816501) · 抗hCCL2抗體(R&D Systems，目錄號MAB679)，溶解於1 ml PBS中 · 抗hCCL2偵測抗體(R&D Systems，目錄號BAF279)，溶解於1 ml PBS中 · 重組hCCL2 (標準物，R&D Systems，目錄號366-6C) · 洗滌緩衝液(PBS + 0.05% Tween-20) - PBS (Sigma，目錄號P4417) - Tween-20 (Sigma，目錄號P2287) · 20 ml受質：18 ml H₂ O + 2 ml 1M乙酸鈉 + 200 µl TMB混合物+2.5 µl 30% H₂ O₂ - 乙酸鈉(Kemika，目錄號1441908) - TMB混合物(Sigma，目錄號T2885) - 過氧化氫(Merck，目錄號1.08597) · 塗佈緩衝液(15 mM Na₂ CO₃ (xH₂ O) + 35 mM NaHCO₃ ) - 碳酸鈉(Sigma，目錄號S-2127) - 碳酸氫鈉(Kemika，目錄號1411007) · 分析緩衝液(PBS + 0.05% Tween-20 + 1% BSA) - 牛血清白蛋白(BSA) (Sigma，目錄號A2153)2.4.2 實驗

用檸檬酸鹽抗凝血劑收集全血。將100 µL用於使用自動細胞計數器測定細胞計數。

將300 µL全血添加至2 mL master block96孔培養盤。自96孔v形底培養盤中之10 mM開始，製備六份含三倍連續稀釋化合物之DMSO。將來自v形底培養盤的0.6 µL經製備化合物或0.6 µL DMSO (陽性及陰性對照孔)添加至具有血液之master block培養盤。製備2 ng/mL含LPS之不具有血清之培養基且以300 µL/孔添加至具有測試孔血液之master block培養盤。將300 µL培養基添加至陰性對照孔。將培養盤在CO₂ 培育箱(37℃，5% CO₂ ，95%濕度)中與全血一起培育隔夜。接著在1500× g下將培養盤離心7分鐘且將上清液轉移至96孔u形底培養盤以用於測定CCL2細胞介素或將上清液儲存在-20℃下以用於未來測試。

進行ELISA之前一天，用100 µL/孔的含250× 稀釋抗hCCL2抗體之塗佈緩衝液塗佈Immulon 2HB培養盤。接著在4℃下培育培養盤隔夜。用300 µL/孔之洗滌緩衝液洗滌培養盤三次且在各步驟後重複此洗滌。將200 µL阻斷液(分析緩衝液+5%蔗糖)添加至各孔且在37℃下培育60分鐘。自2000 pg/mL開始一式兩份製備七組含兩倍連續稀釋hCCL2標準物之分析緩衝液。空白孔經製備僅含有分析緩衝液。將測試樣本(上清液)在分析緩衝液中稀釋10倍添加至培養盤。培養盤中所有最終體積為100 µL。在37℃下培育培養盤60分鐘。添加100 µL/孔之含500×稀釋抗hCCL2偵測抗體之分析緩衝液且在37℃下培育培養盤45分鐘。添加100 µL/孔之含50 ng/mL抗生蛋白鏈菌素-HRP之分析緩衝液且在37℃下培育培養盤30分鐘。添加100 µL/孔之經製備受質溶液且在室溫下培育培養盤，避光直至藍色產生於孔中。為停止色彩產生，添加100 µL/孔之1 M硫酸。在盤式讀取器上以450 nm讀取培養盤吸收度。2.4.3 資料分析

使用Microsoft Excel軟體分析ELISA結果(450 nm下之吸收度)。自所有值減去空白組之平均值。用x軸上之連續稀釋之標準物(pg/mL)對比y軸上之對應吸收度值來繪製標準曲線。根據標準曲線計算樣本中之細胞介素之量(pg/mL)。使用以下等式藉由標準化對照之資料來計算抑制百分比： [(樣本-低對照)/(高對照-低對照)]*100

藉由使用GraphPad Prism軟體繪製抑制百分比及化合物濃度之對數、非線性回歸(曲線擬合)、對數(抑制劑)對比反應-變數斜率(四個參數)來測定化合物之IC₅₀ 值。 3. 活體內分析3.1 使用負重法評估之大鼠中 CFA ( 完全弗氏佐劑 ( Complete Freunds Adjuvant )) 誘發之過敏

足底注射完全弗氏佐劑(CFA)造成誘發過敏及水腫且模仿臨床發炎性疼痛之一些態樣的發炎性反應。可使用量測負重之裝備及器官充滿度測量器來研究此等影響。3.1.1 負重

未經治療之大鼠將其體重均等地分佈於兩個後爪之間。然而，當經注射之(左)後爪發炎和/或疼痛時，重量經重新分佈以使得較少重量置於病爪上(減小受傷之腳爪上的負重)。使用大鼠雙足平衡測痛儀(Linton Instruments, UK)來量測各後肢之負重。

將大鼠置於雙足平衡測痛儀中，其中後爪在單獨的感測器上且歷經4秒記錄由兩個後肢施加之平均力。

獲取基線負重及腳爪體積讀數且經由注射CFA誘發過敏(在誘發損傷之前獲取基線負重及腳爪體積記錄)。藉由向大鼠左後爪足底進行足底注射CFA (100 µL 1 mg/mL溶液)來誘發發炎性過敏。

根據拉丁方設計中之負重CFA窗口將動物(雄性，史泊格多利大鼠(Charles River, UK)，212-260 g)分級且隨機分為處理組。CFA後，動物經媒劑、化合物1 (10 mg/kg)或吲哚美辛(10 mg/kg) (10Ll/kg劑量體積)處理24小時。治療後1、2及4小時處量測負重。獲取右後爪及左後爪兩者之負重讀數並計算差。資料表述為過敏與疼痛之逆轉% (平均值 ± 平均值標準誤差)。獲取左後爪之腳爪體積(mLl)讀數。資料表述為水腫之逆轉% (平均值 ± 平均值標準誤差)。統計分析：用重複量測ANOVA繼之以使用InVivoStat (invivostat.co.uk, Clark等人, 2012)之計劃比較測試進行，p＜0.05視為顯著。

化合物1及吲哚美辛(10 mg/kg)在投與後在所有經測試時間點處顯著地抑制過敏。3.2 大鼠之 MIA 誘發痛覺過敏 — 活體內慢性疼痛模型

在史泊格多利大鼠之同側膝蓋中關節內投與碘乙酸單鈉(Monosodium Iodoacetate；MIA)導致產生起初與發炎性反應相關聯的穩固且長效之痛覺過敏及感覺異常。咸信此動物模型中之此等徵象之產生為臨床上相關的；反映患者顯現之症狀，該等患者呈現與潛在病況(諸如骨關節炎(OA)或類風濕性關節炎)相關聯之慢性發炎性疼痛(Bove SE等人, Osteoarthritis Cartilage 2003; 11 (11): 821-30; Fernihough J等人, Pain 2004; 112 (1-2): 83-93; Kalbhen DA. J Rheumatol 1987; 14 Spec No: 130-1)。負重

未經治療之大鼠將其體重均等地分佈於兩個後爪之間。然而，當經注射之(左)後膝發炎和/或疼痛時，重量經重新分佈以使得較少重量置於病肢上(減小受傷之肢體上之負重)。使用大鼠雙足平衡測痛儀(Linton Instruments, UK)來量測各後肢之負重。

大鼠(史泊格多利，雄性，10組)之骨關節炎(OA)經由將MIA溶液(Sigma，I2512) (25 µL，80 mg/mL) (2 mg)注射至左後腿之膝關節中來誘發。在注射MIA之後第3、5、7、9、12及16天針對慢性疼痛之產生來評估負重。在第3天，獲取負重量測值且根據動物之拉丁方設計中之MIA窗口將動物分級且隨機分為處理組。

在第3天用含化合物1 (10 mg/kg)之0.5%甲基纖維素或媒劑(0.5%甲基纖維素) (10 mL/kg)經口治療動物且接著每天一次直至第16天。在第3天給藥後1、2及4小時及在第5、7、9、12及16天給藥後2小時獲取負重量測值。

獲取右後爪及左後爪兩者之負重讀數並計算差。資料表述為同側/對側百分比((WB左側/WB右側)*100) (平均值±平均值標準誤差)。

計算：同側讀數/對側讀取×100。未治療之WB差-預先給藥WB差定義為MIA窗口。

統計分析：重複量測ANOVA，繼之以使用InVivoStat (invivostat.co.uk)之計劃比較測試，(p＜0.05視為顯著)。藉由在各時間點比較處理組與媒劑對照組來分析資料。

當自給藥後1小時以10 mg/kg給藥時直至第12天(給藥後9天)，發現化合物1顯著逆轉過敏。以10 mg/kg給予之化合物1與媒劑相比在各時間點處展示顯著逆轉，與陽性對照塞內昔布(celecoxib)相當。3.3 肝纖維化之 CCl₄ 模型 - 方案 1

此研究之目標在於藉由CCl₄ 中毒評定肝纖維化之模型。藉由在不同時間點探究組織學、生物化學、成像及基因表現來評定肝纖維化，從而評估疾病之發作及潛在陽性參考之影響。Starkel P., Animal models for the study of hepatic fibrosis, Best practice & Research Clinical Gastroenterology 25: 319-333, 20113.3.1 研究組：

使用5週齡雄性BalbC J小鼠(Janvier Lab)進行研究。

3.3.2 材料： · CCl₄ ：四氯化碳ACROS 99.8% CAS= 56-23-5 批次A0293900 · 橄欖油，SIGMA O1514-500 mL批次#BCBQ4885V · colF (ImmunoChemistry Technologies)，ref 6346批次13Y39 Exp 05/2017 o 待稀釋於100 µL DMSO (6.8 mM)中且在4℃下儲存之儲備溶液 o 在成像前15 min向動物注射1:170稀釋之ppi水(100 µL，竇靜脈內) · CCl₄ 以½稀釋於橄欖油中且以0.6 mL/kg每週兩次IP投與。3.3.2 樣本及結果

在血清管中收集血液且以3000 t/min離心樣本5 min並在 -20℃下冷凍以用於AST、ALT、ALP及總膽紅素評估。亦獲取肝右中葉之樣本且快速地置於在4℃下儲存之具有1 mL RNAlater (安全鎖管)之埃彭道夫管(2 mL圓底)中。

採集肝且進行稱重。緊接著進行肝之colF結合之離體成像(Bruker Xtreme)。將肝置放於甲醛(小瓶25 mL-60 cc)中以供針對aSMA及col I IHC定量進行組織學評估。

將脾稱重以用於未來分析。

一組9個纖維化基因用於基因表現分析。3.4 肝纖維化之 CCl₄ 模型 - 方案 2

此研究之目標在於藉由CCl₄ 中毒評定肝纖維化之模型。藉由在不同時間點探究組織學、生物化學、成像及基因表現來評定肝纖維化，從而評估疾病之發作及潛在陽性參考之影響。Starkel P., Animal models for the study of hepatic fibrosis, Best practice & Research Clinical Gastroenterology 25: 319-333, 20113.4.1 研究組：

使用8週齡雄性BALB/c小鼠(Charles River, Italy)進行研究。

3.4.2 材料： · CCl₄ (液體)將以濃度0.06 mL/mL添加至橄欖油。溶液將以0.6 mL/kg之劑量IP投與。施用體積將為10 mL/kg。 · 測試化合物將溶解/懸浮於甲基纖維素(MC 0.5%)中。3.4.3 樣本及結果

對於穩態PK取樣，血液將收集在He-鋰管中以產生血漿。所有血液樣本將在收集30分鐘內藉由離心(在4℃下以5,000 rpm進行10分鐘)進行血漿處理。接著在-80℃下儲存樣本直至分析。

最終血液樣本將藉由切割頸靜脈收集至K2EDTA微管中。所有血液樣本將在收集30分鐘內藉由離心(在4℃下以3500 rpm進行10分鐘)進行血漿處理。在-80℃下儲存來自各血液樣本之血漿直至分析。

採集肝且儲存左側葉之部分以用於RNA基因表現分析、OH脯胺酸量測之切片，且其餘部分置放於10%福馬林中以用於組織病理學評估。

一組5個纖維化基因(Col1、Timp1、Pai1、Snail1、Acta2)用於基因表現分析。3.5 脂肪變性肝炎及纖維化之甲硫胺酸及膽鹼缺乏模型

MCD為由飲食誘發之脂肪變性肝炎及纖維化之新小鼠模型：甲硫胺酸及膽鹼缺乏(MCD)。(Wehr等人 2013 J immunol, 190(10):5226-36; Baeck等人, 2014 Hepatology, 59(3):1060-72; Gautheron等人, 2014 EMBO, 6(8):1062-74)。 3.5.1 研究組及給藥方案：

將C57BL/6小鼠(來自Janvier Labs (France))劃分成下述各組，小鼠在誘發階段開始時為8週(＞20公克)。

3.5.2 材料及化合物 · MCD飲食w/o膽鹼&甲硫胺酸參考EFTD.90262 MCD模型。批次8206423，Ssniff，Soest，Germany- · 甲基纖維素0.5%，VWR， · PEG 400: P3265，Sigma · Cryomold®標準物25×20×5 mm (Sakura Finetec，4557) · O.C.T.™化合物冷凍切片用包埋模型(cryomold)(Sakura Finetec，4583) · 用於樣本保存之福馬林-4%，用MetOH緩衝3.5.3 化合物製備：

在攪動下將化合物溶解/懸浮於合適媒劑中(參看上表)。在製備之後，在室溫下在恆定磁攪拌下將溶液/懸浮液保存在暗處。當給藥時，使用經定量10 mL/kg體積且根據動物之體重調節溶液之濃度。 3.5.4方案：

誘發階段為3週。不給與空腹葡萄糖。給與小鼠MCD對照飲食或MCD飲食。

在治療階段期間，小鼠如同誘發階段保持MCD對照飲食或MCD飲食。根據小鼠體重將其隨機分配成處理組以便確保均勻重分配。在評估階段期間，小鼠每天一次或兩次給藥測試化合物。 3.6 預防性博萊黴素誘發之肺纖維化 14 天小鼠模型

研究之目標在於測試三種不同劑量之測試化合物在小鼠之博萊黴素誘發肺纖維化之14天模型中的功效。3.6.1 動物

對Charles River, Italy供應之C5²7BL/6N雄性小鼠進行此研究，其在維持於22℃、55%相對濕度之環境中適應至少5天，其中在12 h之光循環下每小時有15-20次空氣變化。向小鼠任意提供粒化食物及水。

在實驗開始之前至少一天，將所有動物隨機分配成如下表所指示之組。

根據2010/63/EU及科學研究中及針對其他目的規範實驗室動物使用之國家法規(Official Gazette 55/13)進行所有動物相關之研究。3.6.2 研究組

3.6.3 材料

藉由在不加熱之情況下經電磁攪拌器連續攪拌5 h而將0.5 g羥基乙基纖維素(納特羅索)添加至500 mL淺綠色餾出物(0.1%)中來製備測試溶液之溶劑。

藉由將1 mL Narketan (Narketan 10, Vetoquinol, Bern, Switzerland, 03605877535982)及0.5 mL Rompun (Rompun, 2%：Bayer, Leverkusen, Germany)添加至9 mL鹽水中來製備麻醉溶液。投與10 mL/kg之所得溶液。

為製備用於鼻內(i.n.)攻擊之溶液，將0.8 mg/mL博萊黴素之儲備溶液(硫酸博萊黴素，Enzo Life Sciences, Inc.，USA；CAS編號9041-93-4；目錄號BML-AP302-0010)解凍且稀釋於330 µL鹽水中。

在鼻內投與之前，用上文所描述之麻醉溶液腹膜內麻醉小鼠。

在每天用0.1%納特羅索調配物將新鮮吡非尼酮調配物製備為最終濃度5 mg/mL。在給藥之前，將動物稱重且針對與10毫升/公斤體重對應之個別重量相應地調節投與之吡非尼酮量，每天兩次經口投與，兩次投與之間具有7.5 h時間間隔。

最終，如下製備測試化合物溶液：將適合量之該測試化合物溶解於PEG 400 (最終體積之20%)，接著溶解於MC 0.5% (最終體積之80%)中以達到最終濃度為1 mg/mL、0.3 mg/mL及0.1 mg/mL，因此產生劑量為10 mg/kg、3 mg/kg及1 mg/kg之化合物。在給藥之前，將動物稱重且針對個別重量相應地調節投與量。

測試劑量之施用體積對應於10 mL/kg體重，且測試化合物每日兩次經口投與，兩次投藥之間具有7.5 h時間間隔。3.6.4 研究

每天兩次對動物進行臨床檢查。臨床徵象及參數之清單指示於人類端點表中。由第0天開始每天將動物稱重。

在第14天，給藥吡非尼酮或測試化合物後兩小時，藉由麻醉過量將小鼠處死。

切下肺且個別地稱重。對於所有組：將整個右肺上葉置放於含有二氧化矽珠粒之Precellys管中，且用液氮即刻快速冷凍且經受基因表現分析。

將所有剩餘肺置放於含有10%經緩衝福馬林之標記瓶中以進行進一步組織病理學評估。3.6.5 樣本分析、資料處理及統計學評估

體重資料及肺重量資料使用MS Excel處理。統計學分析及圖形展現使用GraphPad Prism軟體(版本5.04)執行。

對於肺重量採用單向ANOVA或曼惠特尼測試。

對於體重變化採用雙向ANOVA。

當p＜0.05時，各組之間的差異將視為統計顯著的。

對於組織病理學評估，將整個肺(除取樣之右上肺外)包埋於石蠟中且用馬洛里氏三色染色法(Mallory's trichrome)染色。

使用阿希克夫評分之馬特蘇塞修改(Matsuse modification of Ashcroft score)評定肺部組織學變化(Ashcroft等人, 1988；Matsuse等人, 1999)。統計學分析及圖形展現使用GraphPad Prism軟體(版本5.04)執行。採用曼-惠特尼測試。

當p＜0.05時，各組之間的差異將視為統計顯著的。

3.6.6 PK 分析 - 第 7 組 3.6.6.1 方案

對於PK研究僅包括第7組中之動物(n=10)，且不經受臨床徵象評分。

此等動物在第0天治療開始時經誘發疾病且第7天依序在第一次投與測試化合物之後1 h、3 h、6 h、8 h、24 h處死。

各時間點自尾部靜脈收集血液樣本(50 μL)至Li-肝素抗凝劑管中且保持於冰上直至分離。在收集之後最長30 min內，在4℃下以2000 g離心血液樣本10 min且將所得血漿樣本等分至聚丙烯管(1×25 µL)中。在-20℃下冷凍儲存樣本直至分析。

在血液取樣之後處死時收集各動物之肺組織，接著稱重且置放於聚丙烯管中，之後冷凍。在-80℃下冷凍儲存樣本直至分析。3.6.6.2 血漿濃度及藥物動力學分析

血漿及肺濃度經由LC-MS/MS量測。經由蛋白沈澱製備用於LC-MS/MS分析之樣本。經量測低於定量下限(LLOQ)之血漿濃度經報導為低於定量極限(BLQ)。

血漿中之測試化合物濃度以ng/mL表述。

計算平均血漿濃度。對於平均值計算，低於LLOQ之濃度設定為零。因此，平均值可為BLQ。當至少三個血漿濃度值高於LLOQ時，將標準差(SD)、平均值之標準誤差(SE)及變化係數(CV，%)製成表格。

使用PhoenixTM WinNonlin® 6.3 (Pharsight Corporation)進行個別血漿濃度之非房室分析以至少確定以下藥物動力學參數：

對應時間tmax (h)之最大血漿濃度Cmax (µg/mL)，

根據線性上升/對數下降梯形規則計算達至最後可定量濃度AUC₀ _- _t 或達至24 h AUC₀ _- _24h (µg.h/mL) (在化合物在給藥後24 h可定量之情況下)及/或達至無窮AUC0-∞ (µg.h/mL)的電漿濃度對比時間曲線下之面積。若必要，可計算部分AUC。將低於定量極限(BLQ)之濃度設定為零。若存在小於三個可定量時間點，則不計算AUC。若%AUCextra ＜ 20%，則考慮AUC0-∞。

若將不包括tmax之三個或更多個時間點用於線性回歸，且若經調節R² ＞0.80，則，僅報導表觀末端消除半衰期t1/2 (h)。

標準化AUC及Cmax劑量。

計算平均藥物動力學參數。若可獲得至少三個值，則將標準差(SD)及變化係數(CV，%)製成表格。 3.7 CIA 模型 3.7.1 材料

完全弗氏佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)係購自Difco。牛II型膠原蛋白(CII)、脂多醣(LPS)及恩博分別獲自Chondrex (Isle d'Abeau, France)；Sigma (P4252, L'Isle d'Abeau, France)、Whyett (25 mg可注射注射器，France) Acros Organics (Palo Alto, CA)。所使用其他全部試劑為試劑級的且全部溶劑為分析級的。3.7.2 動物

Dark Agouti大鼠(雄性，7-8週齡)係獲自Harlan Laboratories (Maison-Alfort, France)。將大鼠保持在12 h光/暗循環(0700-1900)。將溫度維持在22℃下，任意提供食物及水。3.7.3 膠原蛋白誘發之關節炎 (CIA)

在實驗前一天，用0.05 M乙酸製備CII溶液(2 mg/mL)且在4℃下儲存。就在免疫之前，在冰水浴中於預先冷卻之玻璃瓶中藉由均質機混合相等體積之佐劑(IFA)及CII。若未形成乳液，可能需要額外佐劑及延長之均質化。在第1天，在各大鼠之尾根部皮內注射0.2 mL乳液，在第9天進行第二增效劑皮內注射(含2 mg/mL CII溶液之CFA 0.1 mL鹽水)。此免疫方法自公開方法(Jou等人, 2005；Sims等人, 2004)修改而來。3.7.4 研究設計

在大鼠CIA模型中測試化合物之治療作用。將大鼠隨機分成相同組且每組含有10隻大鼠。所有大鼠在第1天經免疫且在第9天增強免疫。治療劑量自第16天持續至第30天。陰性對照組用媒劑處理且陽性對照組用恩博(10 mg/kg，3×週，皮下)處理。相關化合物通常在4個經口劑量(例如0.3、1、3及10 mg/kg)下測試。3.7.5 關節炎之臨床評定

根據文獻描述之方法對關節炎進行評分(Khachigian 2006 Nat Protoc. 2006;1(5):2512-6; Lin等人 2007, Br J Pharmacol, 150, 第862-872頁; Nishida等人 2004, Arthritis and Rheumatism, 50(10), 第3365-3376頁)。四隻腳爪中之每一者的腫脹如下用關節炎評分分級：0—無症狀；1—一種類型之關節(諸如踝或腕)的輕度、但明確之發紅及腫脹，或限於個別趾之明顯發紅及腫脹，與患病趾之數目無關；2—兩種或兩種以上類型之關節的中度發紅及腫脹；3—包括趾之整個腳爪之重度發紅及腫脹；4—包含多個關節之肢體最大限度地發炎(每一動物最大累計臨床關節炎評分為16) (Nishida等人, 2004)。

為准許多個研究之綜合分析，臨床評分值可如下標準化：

AUC臨床評分(AUC評分)：計算每一個別大鼠自第1天至第14天之曲線下面積(AUC)。各動物之AUC除以獲得動物資料之研究中關於媒劑獲得之平均AUC且乘以100 (亦即AUC表述為每一研究平均媒劑AUC之百分比)。

臨床評分自第 1 天至第 14 天 ( 端點評分 ) 增加：各動物之臨床評分差除以獲得動物資料之研究中關於媒劑獲得之平均臨床評分差且乘以100 (亦即差異表述為每一研究關於媒劑之平均臨床評分差之百分比)。3.7.6 在關節炎發作後體重之變化 (%)

臨床上，體重減輕與關節炎相關聯(Rall & Roubenoff 2004 Rheumatology (Oxford); 43(10):1219-23; Shelton等人. 2005 Pain ;116(1-2):8-16; Walsmith等人 2004 J Rheumatol. ;31(1):23-9)。因此，在關節炎發作後之體重變化可用作非特異性端點以評估治療劑在大鼠模型中之作用。在關節炎發作後之體重變化(%)計算如下：小鼠：

大鼠：

3.7.7 放射學

獲取每一個別動物之後爪之X射線像片。將隨機盲法標識號分配於每一像片，且骨侵蝕之嚴重度由兩個獨立評分者使用如下放射學拉森氏評分系統(radiological Larsen’s score system)分級：0—正常，具有完整骨輪廓及正常關節空間；1—輕微異常，其中任一或兩個外蹠骨展示輕微骨侵蝕；2—明確早期異常，其中任意三至五個外蹠骨展示骨侵蝕；3—中度破壞性異常，其中全部外蹠骨以及任一或兩個內蹠骨展示明確骨侵蝕；4—重度破壞性異常，其中全部蹠骨展示明確骨侵蝕且至少一個內蹠骨關節完全侵蝕，部分保留一些骨關節輪廓；5—毀形性異常，無骨輪廓。此評分系統為文獻方案之修改(Bush等人 2002, Arthritis and Rheumatism, 46(3), 802-805; Jou等人 2005, Arthritis Rheum, 52(1), 339-44; Salvemini等人 2001, Arthritis Rheum, 44(12), 2909-21; Sims等人 2004, Arthritis Rheum, 50(7), 2338-46)。3.7.8 組織學

在放射學分析後，將小鼠後爪固定於10%磷酸鹽緩衝之福馬林(pH 7.4)中，用精細組織學之快速骨骼脫鈣劑(EUROBIO, Les Ulis, France)脫鈣且包埋於石蠟中。為確保關節炎關節之全面評估，切割至少四個連續切片(5 µm厚)且每一系列切片在100 µm之間。切片用蘇木紫(hematoxylin)及伊紅(eosin) (H&E)染色。對滑膜發炎及骨骼與軟骨損傷進行雙盲法組織學檢查。在每一腳爪中，使用四點標度評估四個參數。參數為細胞浸潤、關節翳嚴重度、軟骨侵蝕及骨侵蝕。如下進行評分：1—正常、2—輕度、3—中度、4—顯著。將此四個評分加在一起且表示為另一評分，亦即『RA總分』。3.7.9 踵骨 ( 跟骨 ) 之微電腦斷層攝影術 (µ CT ) 分析

RA中觀察到的骨退化尤其出現在皮質骨且可藉由µCT分析揭示(Oste等人, 2007；Sims等人, 2004)。在踵骨之掃描及3D立體重構後，骨退化以每次滑動存在之離散對象之數目的形式加以量度，該等離散對象垂直於骨骼之縱向軸線加以電子雜交分離。骨骼退化愈嚴重，量測到愈多離散對象。分析沿踵骨均勻分佈(間隔約10.8 µm)之一千個切片。3.7.10 穩態 PK

在第7天或稍晚，使用肝素鋰作為抗凝劑在以下時間點收集在後眼眶竇處的血液樣本：給藥前、1、3及6 h。離心全血樣本且將所得血漿樣本儲存在-20℃下以待分析。各測試化合物之血漿濃度藉由LC-MS/MS方法加以測定，其中質譜儀以正電噴霧模式加以操作。使用WinNonlin^® (Pharsight^® , United States)計算藥物動力學參數且假定給藥前血漿含量等於24 h血漿含量。3.8 MAB 模型

MAB模型允許藉由治療劑(Khachigian, 2006)快速評定RA樣發炎反應之調節。DBA/J小鼠靜脈內注射有針對膠原蛋白II之mAb混合液。一天後，開始化合物治療。三天後，小鼠腹膜內接受LPS注射(50微克/小鼠)，引起炎症之快速發作。繼續化合物治療直至mAb注射之後10天。藉由量測腳爪腫脹且記錄各腳爪之臨床評分來讀取炎症。呈現四肢之累計臨床關節炎評分以展示炎症之嚴重度。使用0-4之標度將評分系統應用於各肢體，其中4為最嚴重炎症。 0 無症狀 1 一種類型之關節(諸如踝或手腕)之輕度但明確的發紅及腫脹，或限於個別足趾之明顯發紅及腫脹，與患病趾之數目無關 2 兩種或更多種類型之關節的中度發紅及腫脹 3 包括趾之整個腳爪之重度發紅及腫脹 4 包含多個關節之肢體的最大限度發炎 3.9 活體內半月板切除(MNX)大鼠模型 3.9.1 大鼠MNX模型中之活體內功效

在雌性路易(Lewis)半月板切除大鼠(MNX)模型中研究活體內功效。MNX大鼠模型為經良好驗證的骨關節炎之疾病模型(Bendele, 2001, J Musculoskel Neuron Interact, 1(4), 377-85; Janusz等人, 2002, Osteoarthr Cartilage, 10, 785-91; Pritzker 等人, 2006, Osteoarthr Cartilage, 14, 13-29)。 3.9.2 手術及給藥

藉由在第0天(D0)於每一大鼠右腿處藉由橫切內側側韌帶進行半月板切除術來誘發骨關節炎，且移除4 mm韌帶。半月板內部經垂直橫切成兩瓣，其經推至滑膜腔前部及背部。假處理組動物僅經歷麻醉、皮膚及肌肉切開，隨後縫合。在第1天，根據大鼠體重將其隨機分配成處理組(每組n=20)以便具有均勻分佈。自C2至D21，大鼠每日一次(qd)或一天兩次(bid)經口(po)給藥以甲基纖維素(MC) 0.5%或HPβCD 10% pH3.0調配之化合物。 3.9.3 穩態PK測定(ssPK)

在處理至少7天之後，在投與後之4個時間點取樣血液：0、1、3及6 h (且假定24 h等於給藥前樣本)以便測定穩態血漿暴露。 3.9.4 組織學

在處死時，收集每一大鼠之右脛骨且處理以用於組織學分析。在4%甲醛中固定48 h之後，使脛骨在Osteosoft中脫鈣7天且在面對面包埋於石蠟中之前切成2個半部。以200 µm間隔切割五個系列之切片，覆蓋骨骼中間部分之約1.5 mm。一系列載片用番紅O及淺綠色染色以用於形態學評估及OARSI評分。其他系列者載片上置有DAPI以用於軟骨細胞密度量測。

使用基於軟骨病灶之分級及分期的OARSI方法(Pritzker等人, 2006)來評估及評分反映脛骨平台中之骨關節炎的軟骨損傷程度。OARSI評分以盲法方式藉由兩種不同讀取器評定。對於各脛骨，一個評分歸結為5個切片之OARSI評分之中位值。

對於統計學分析，使用分層克魯斯凱-沃利斯測試(stratified Kruskal-Wallis test)，隨後之鄧尼特多重比較事後測試(Dunnett multiple comparison post hoc test)比較各組的中位值。

顯著性水準：ns：統計學上不顯著；對比MNX-媒劑*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。對該等研究之所有組進行統計學分析。 3.10 - 飲食誘發之非酒精性脂肪變性肝炎之鼠模型 ( NASH )

此模型使用由60 kcal%脂肪及0.1%甲硫胺酸組成的膽鹼缺乏、L-胺基酸限定之高脂飲食(CDAHFD)以誘發NASH。 3.10.1 研究組及給藥方案：

將C57/BL6小鼠(Charles River)劃分成下述各組，小鼠在誘發階段開始時為8週(＞20公克)。

3.10.2 材料及化合物 · CDAHFD；Research Diets Inc.，參考編號A06071302 · 對照飲食：正常飲食(VRF 1，P)，特定飲食服務 3.10.3治療方案： 誘發階段： 4 週

為誘發非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)，向動物餵食膽鹼缺失型、L-胺基酸限定之高脂飲食(CDAHFD)。治療階段： 6 週

將小鼠隨機分配成處理組且根據上表展現之排程進行處理直至評估階段。3.10.4 - 取樣

穩態PK取樣，血液將收集在K2-EDTA管中以產生血漿。所有血液樣本將在收集30分鐘內藉由離心(在4℃下以5,000 rpm進行10分鐘)進行血漿處理。來自各血液樣本之血漿將快速地冷凍於液氮中且儲存在維持在在-80℃處之冰箱中直至分析。

最終血液樣本—血液將收集在管中以用於含有蛋白酶抑制劑之血清製備。所有血液樣本將藉由離心(在4℃下以3,500 rpm進行15分鐘)處理。所獲得血清樣本之等分試樣將在-80℃下冷凍儲存直至進一步分析。

組織樣本：採集肝且儲存左外葉之部分以供RNA基因表現分析、TG分析，切片用於OH脯胺酸量測且將其餘部分置放於10%福馬林中以用於組織病理學評估。組織病理學評估包括用天狼星紅染色以評估纖維化之程度的切片及用F4/80染色以評定巨噬細胞聚集的切片。

一組6個纖維化基因(Col1A1、Timp1、Pai1、CTGF、TGFβ及Acta2)、炎症基因(TNFα、IL10及CCL2)及2個管家基因用於基因表現分析。3.10.5 結果

當在此模型中測試時，化合物1展示對關於纖維化基因組中之Pai1、TIMP1、CTGF及TGFβ之表現量(圖3)及對炎症組中之所有三個基因(圖4)測試之至少最高劑量的顯著影響。另外，其展示對15 mg/kg/QD及15 mg/kg/BID下之羥基脯胺酸水準的顯著影響(圖5)、對15 mg/kg/QD及15 mg/kg/BID下之天狼星紅纖維化定量的顯著影響(圖6)及對15 mg/kg/BID下之F4/80定量的顯著影響(圖7)。 4 CYP 抑制

使用cDNA表現之人類細胞色素P450同功酶及代謝為螢光代謝物之非螢光受質來評定測試化合物對人類細胞色素P450同功酶(CYP1A2、2C9、2C19、2D6及3A4)之抑制性潛能。

化合物在3.3及10 µM下經測試，最終DMSO濃度為0.3%。在添加輔因子受質混合物之前將化合物與酶一起培育15 min。用於CYP3A4 (BD Biosciences，456202)、CYP2C9 (BD Biosciences，456258)、CYP2C19 (BD Biosciences，456259)及CYP1A2 (BD Biosciences，456203)分析之輔因子混合物中之最終反應濃度為：0.4 U/mL 葡萄糖-6-磷酸鹽-去氫酶(G6PDH, Roche, 10165875001)、3.3 mM MgCl₂ (Sigma, M2670)、3.3 mM D-葡萄糖-6-磷酸鹽(Sigma, G7879)及1.3 mM NADP+ (Sigma, N0505)。對於CYP2D6 (BD Biosciences，456217)，分析中之最終反應濃度為0.4 U/ml G6PDH、0.41 mM MgCl₂ 、0.41 mM D-葡萄糖-6-磷酸鹽及8.2 µM NADP+。酶及受質之濃度以0報導。在培育期之後，藉由添加終止溶液終止反應。對於用DBF作為受質之實驗，使用2 N NaOH終止溶液，而對於所有其他受質，終止溶液為80% MeCN/20% 0.5 M Tris鹼。

緊接著(對於CEC、AMMC、BFC)或在20 min之後(對於CYP2C9及CYP3A4，使用DBF作為受質)在PerkinElmer EnVision^® 讀取器上以合適激發及發射波長(參考0)讀取螢光。

接著藉由將資料標準化為空白樣本來計算測試化合物對CYP的抑制百分比：100%抑制為在添加酶/受質混合物之前終止之空白樣本，且0%抑制為在酶反應發生之後(50 min)終止之空白樣本。用於所研究各CYP450同工酶之抑制分析條件

AMMC：胺乙基-7-甲氧基-4-甲基香豆素 BFC：7-苯甲氧基-4-三氟甲基香豆素 CEC：3-氰基-7-乙氧基香豆素 DBF：二苯甲基螢光素5 時間依賴性 CYP3A4 抑制

在合併HLM中評定之藉由化合物的時間依賴性CYP3A4抑制根據Grimm等人, Drug Metabolism and Disposition 2009, 37, 1355-1370及FDA工業指南草案(the draft FDA Guidance for Industry) (Drug Interaction Studies - Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations), 2006, http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.經由IC₅₀ 測定來測定。睪固酮用作探針受質且醋竹桃黴素用作陽性對照。

圖1展示經口給予之兩個不同劑量之化合物1在實例3.1之大鼠模型中對CFA誘發之痛覺過敏的影響。

圖2展示經口給予之10 mg/kg化合物1在實例3.2之大鼠模型中對MIA誘發之痛覺過敏的影響。

圖3展示5 mg/kg/QD、15 mg/kg/QD及15 mg/kg/BID之化合物1在來自纖維化之CFAHFD模型(實例3.10)之小鼠肝樣本中對一組纖維化相關基因之表現量的影響。圖3A：PAI1，圖3B：TIMP1，圖3C：COL1A1，圖3D：CTGF，圖3E：ACTA2及圖3F：TGFβ。資料來自第73天且呈現為平均值±SEM，* p＜0.05、** p＜0.01、***p＜0.001、****P＜0.0001對比CDAHFD飲食+媒劑，曼惠特尼測試(Mann-Whitney test)。

圖4展示5 mg/kg/QD、15 mg/kg/QD及15 mg/kg/BID之化合物1在來自纖維化之CFAHFD模型(實例3.10)之小鼠肝樣本中對一組炎症相關基因之表現量的影響。圖4A：TNFα，圖4B：IL10及圖4C：CCL2。資料來自第73天且呈現為平均值±SEM，* p＜0.05、** p＜0.01、***p＜0.001、****P＜0.0001對比CDAHFD飲食+媒劑，曼惠特尼測試。

圖5展示5 mg/kg/QD、15 mg/kg/QD及15 mg/kg/BID之化合物1在來自纖維化之CFAHFD模型(實例3.10)之小鼠肝臟組織中對羥基脯胺酸水準的影響。資料來自第73天且呈現為平均值±SEM，* p＜0.05、** p＜0.01、***p＜0.001、****P＜0.0001對比CDAHFD飲食+媒劑，曼惠特尼測試。

圖6展示使用來自纖維化之CFAHFD模型(實例3.10)的天狼星紅(Sirius red)纖維化量的5 mg/kg/QD、15 mg/kg/QD及15 mg/kg/BID之化合物1的影響。資料來自第73天且呈現為平均值±SEM，* p＜0.05、** p＜0.01、***p＜0.001、****P＜0.0001對比CDAHFD飲食+媒劑，曼惠特尼測試。

圖7展示5 mg/kg/QD、15 mg/kg/QD及15 mg/kg/BID之化合物1對來自纖維化之CFAHFD模型(實例3.10)之F4/80量的影響。資料來自第73天且呈現為平均值±SEM，* p＜0.05、** p＜0.01、***p＜0.001、****P＜0.0001對比CDAHFD飲食+媒劑，曼惠特尼測試。

Claims

一種根據式I之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，
其中R¹為H、CH₃、F或Cl；X為N、CH或C-CN；且R²為CH₃或鹵素。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R¹為F。
如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R²為CH₃。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中X為CH。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中X為C-CN。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中X為N。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物係選自：2-胺基-5-氟-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺、2-胺基-5-甲基-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺、2-胺基-5-氯-N-[1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-吡啶-4-甲醯胺、2-胺基-N-[1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]吡啶-4-甲醯胺、2-胺基-N-[1-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺、2-胺基-N-[1-(5-氰基-3-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺，及2-胺基-N-[1-(3-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4-哌啶基]-5-氟-吡啶-4-甲醯胺。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑。
一種如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項8之醫藥組合物之用途，其用於製造藥物。
一種如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或如請求項8之醫藥組合物之用途，其用於製造預防及/或治療疼痛、發炎性病況、心血管疾病、神經退化性疾病、神經疾病、糖尿病之併發症、癌症及/或纖維化疾病之藥劑。
一種用於製備如請求項1之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽的方法，其包含：(a)使式II化合物：
其中X及R₂如請求項1中所定義，與式III化合物：
或其經保護衍生物反應，其中R¹如請求項1中所定義；(b)去保護式I化合物之經保護衍生物； (c)使式I化合物或其經保護衍生物相互轉化為另外的式I化合物或其經保護衍生物；以及(d)視情況形成式I化合物之醫藥學上可接受之鹽。