PT1246623E

PT1246623E - Compostos específicos para o receptor de adenosina a1,a2a e a3 e as suas utilizações

Info

Publication number: PT1246623E
Application number: PT00988011T
Authority: PT
Inventors: Arlindo L Castelhano; Bryan Mckibben; David J Witter
Original assignee: Osi Pharm Inc
Priority date: 1999-12-02
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2006-12-29
Also published as: WO2001039777A1; CY1107653T1; EP1731520A1; MXPA02005357A; ES2269217T3; AU784878B2; JP2003519102A; DE60030002T2; DE60030002D1; EP1246623A4; AU2427001A; DK1246623T3; KR20020064327A; CA2393179A1; HK1050319B; EP1246623B1; EP1246623A1; ATE335489T1; IL149935A0; HK1050319A1

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSTOS ESPECÍFICOS PARA O RECEPTOR DE ADENOSINA

Ax, a2a e a3 e as suas utilizações

Ao longo deste pedido de patente de invenção, faz-se referência a compostos que se ligam especificamente a i) receptores de adenosina Αχ, ii) receptores de adenosina A2a e iii) receptores de adenosina A3. A adenosina é um modulador ubíquo de numerosas actividades fisiológicas, particularmente, dentro dos sistemas cardiovascular e nervoso. Os efeitos da adenosina parecem ser mediados por proteínas específicas dos receptores da superfície de células. A adenosina modula diversas funções fisiológicas incluindo a indução de sedação, vasodilatação, supressão do batimento cardíaco e contractilidade, inibição da capacidade de agregação das plaquetas, estimulação da gliconeogénese e inibição de lipólise. Para além dos seus efeitos sobre o adenilato-ciclase, a adenosina tem mostrado que abre os canais de potássio, reduz o fluxo através dos canais de cálcio e inibe ou estimula a alteração da fosfoinositida através de mecanismos mediados pelo receptor (ver, por exemplo, C. E. Muller e B. Stein "Adenosine

Receptor Antagonists: Structures and Potential Therapeutíc Applications", Current Pharmaceutical Design, 2:501 (1996) e C. E. Muller "Αχ-Adenosine Receptor Antagonists", Exp. Opin. Ther. Patents, 7 (5):419 (1997)).

Os receptores de adenosina pertencem à super-família dos receptores de purína, que estão normalmente subdivididos em receptores Ρχ (adenosina) e P2 (ATP, ADP, e outros nucleótidos). Já foram clonados quatro subtipos de receptores para o nucleósido adenosina, a partir de várias espécies incluindo os seres humanos. Dois subtipos de receptores (Αχ e A2a> exibiram afinidade para a adenosina ao nível nanomolar, enquanto dois outros subtipos conhecidos A2b e A3 são receptores de baixa afinidade, com afinidade para a adenosina no intervalo de poucos micromolares. A activação dos receptores de adenosina Ai e A3, pode levar a uma inibição da actividade de adenilato-ciclase, enquanto a activação de A2a e A'2b causa uma estimulação de adenilato-ciclase. Têm sido desenvolvidos alguns antagonistas de Ai para o tratamento de doenças cognitivas, falhas renais e arritmias cardíacas. Tem sido sugerido que os antagonistas de A2a podem ser benéficos para pacientes que sofrem de Morbus Parkinson (doença de Parkinson). Particularmente, tendo em vista o potencial de libertação local, os antagonistas do receptor de adenosina podem ser valiosos para o tratamento de inflamações alérgicas e de asma. A informação disponível (por exemplo, Nyce & Metzger "DNA antisense Therapy for Asthma in an Animal Model" Nature, (1997), 385:721-5), indica que neste contexto pato-fisiológico, os antagonistas de Ai podem bloquear a contracção do músculo liso subjacente ao epitélio respiratório, enquanto os antagonistas do receptor de A2b ou A3 podem bloquear a desgranulação da célula mástica, mitigando a libertação de histamina e outros mediadores inflamatórios. Os receptores de A2b têm sido descobertos ao longo do trato gastrointestinal, especialmente, no cólon e no epitélio intestinal. Tem sido sugerido que os receptores de A2b medeiam uma resposta a cAMP (Strohmeíer et al., J. Bío. Chem. (1995) 270:2387-94).

Os receptores de adenosina têm também mostrado que existem nas retinas de várias espécies de mamíferos, incluindo bovinos, porcinos, macacos, ratos, cobaias, 2 murganhos, coelhos e seres humanos (ver, Blazynski et al., Discrete Distributíons of Adenosine Receptors in Mammalian Retina, Journal of Neurochemistry, volume 54, páginas 648-655 (1990); Woods et al., Characterization of Adenosine Ai~ Receptor Binding Sites in Bovine Retinal Membranes, Experimental Eye Research, volume 53, páginas 325-331 (1991); e Braas et al., Endogenous adenosine and adenosine receptors localized to ganglion cells of the retina, Proceedings of the National Academy of Science, volume 84, páginas 3906-3910 (1987)). Recentemente, Williams referiu a observação dos sítios de transporte de adenosina numa linha de células da retina humana em cultura (Williams et al., Nucleoside Transport Sites in a Cultured Human Retinal Cell Line Established By SV-40 T Antigen Gene, Current Eye Research, volume 13, páginas 109-118 (1994)). Muller C. et al. Journal of Medicinal Chemistry, volume 39, (1996), páginas 2482-2491, descreve derivados de pírrolo[2,3—d]pirimidina como antagonistas do receptor de adenosina. Dooley M. J. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, volume 4, n°. 6, (1996), páginas 923-934, descreve estudos teóricos sobre a actividade da estrutura dos ligandos Aj de adenosina com uma atenção particular em relação aos requisitos para a actividade do receptor. Muller C. et al., Journal of Medicinal Chemistry, volume 33, (1990), páginas 2822-2828, descreve as relações da actividade da estrutura de antagonistas potentes e selectivos da adenosina, em particular de 7-deaza-2-feniladeninas.

Os compostos que regulam a ingestão de adenosina, têm sido sugeridos previamente como agentes terapêuticos potenciais para o tratamento de danos na retina e danos no nervo óptico principal. Na patente de invenção norte-americana U.S. N°. 5.780.450, para Shade, Shade discute a utilização dos inibidores da ingestão de adenosina para o 3 tratamento de distúrbios dos olhos. Shade não descreve a utilização de inibidores específicos do receptor de A3. São necessários antagonistas adicionais dos receptores de adenosina como instrumentos farmacológicos e são de considerável interesse como fármacos, para os estados de doença e/ou as condições referenciadas antes. A presente invenção baseia-se em compostos que se ligam selectivamente ao receptor de adenosina Ai, tratando assim uma doença associada com o receptor de adenosina Ai num indivíduo, por meio da administração ao indivíduo de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico desses compostos. Ά doença a ser tratada, está associada com doenças cognitivas, paragens renais, arritmias cardíacas, epitélio respiratório, libertação de transmissores, sedação, vasoconstrição, bradicárdia, inotropia cardíaca negativa e dromotropia, broncoconstrição, neutropil-quimiotaxia, condições de refluxo ou condições ulcerosas. A presente invenção tem por base, pelo menos em parte, a descoberta de que 7-deazapurinas substituídas em N-6, descritas infra, podem ser usadas para tratar um estado que responde a 7-deazapurinas substituídas em N-6. Exemplos desses estados, incluem aqueles em que a actividade dos receptores de adenosina está aumentada, por exemplo, bronquite, distúrbios gastrointestinais ou asma. Estes estados podem ser caracterizados pelo facto da aetivação do receptor de adenosina poder conduzir à inibição ou estimulação da actividade de adenilato-ciclase. As composições e processos da presente invenção incluem 7-deazapurinas substituídas em N-6 enantiomericamente ou diastereomericamente puras. As 7-deazapurinas substituídas em N-6 preferidas incluem aquelas que têm uma acetamida, 4 carboxamida, ciclo-hexilo substituído, por exemplo, ciclo-hexanol ou uma parte de ureia ligada ao azoto N-6 através de uma cadeia de alquileno. A presente invenção tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de uma 7-deazapurina substituída em N-6, para a modulação de um receptor de adenosina num mamífero, de tal forma que ocorra a modulação da actividade do receptor de adenosina. Os receptores de adenosina apropriados incluem as famílias de Αχ, A2 ou A3. Num enquadramento preferido, a 7-deazapurina substituída em N-6, é um antagonista do receptor de adenosina. A presente invenção tem ainda por objecto a utilização de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de uma 7-deazapurina substituída em N-6, para o tratamento de distúrbios de 7-deazapurina substituída em N-6, por exemplo, asma, bronquite, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crónica, distúrbios renais, distúrbios gastrointestinais e distúrbios dos olhos, num mamífero, de tal modo que ocorra o tratamento do distúrbio nesse mamífero. As 7-deazapurinas substituídas em N-6 apropriadas, incluem as ilustradas pela fórmula geral I:

em que o símbolo Rx representa 5 (X)

ΗΝ ο

r

6

e o símbolo R2 representa um átomo de H; ou NR1R2 em conjunto representam 7 \

em que o símbolo R3 representa um grupo fenilo substituído ou insubstituído, pirrole, tiofeno, furano, tiazole, imidazole, triazole, pirazole, piridina, 2(1H)-piridona, 4(1H)-piridona, pirazina, pirimidina, piridazina, isotiazole, isoxazole, oxazole, tetrazole, naftilo, tetralina, benzofurano, benzotiofeno, 2,3-di-hidroindole, lH-indole, indolilo, benzopírazole, 1,3-benzodioxole, benzoxazole, purina, coumarina, cromona, quinolilo, tetra-hidroquinolina, isoquinolina, benzimidazole, quinazolina, pteridina, 2(1H)~ quinolona, 1 (2H)-isoquinolona, 1, 4-benziscxar:'. i,:j, benzotiazole, quinoxalina, quinolino-N-óxido, isoquinolino-N-óxido, quinoxalino-N-óxido, quinazolino-N-óxido, benzoxazina, ftalazina ou cinolina; em que o símbolo R5 representa um átomo de H, um grupo CH3, alquilo substituído ou insubstituído, arilo ou fenilo,

em que o símbolo FU representa um átomo de H, um grupo CH3, alquilo substituído ou insubstituído, cicloalquílo, em que o substituinte, quando presente, representa um átomo de haloqénio, um grupo hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, car-boxilato, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fospinato, ciano, amino, acilamino, amidino, iroino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido,_nitro,_trif luorometilo,_ciano,_azido, heterociclilo ou alquilarilo, ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico,

OH

O/VW em que quando o símbolo Ri representa um grupo 1 o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo

9 e o símbolo R6 representa um átomo de H; em que o símbolo X representa um átomo de 0 ou S; e

em que quando o símbolo Ri representa um grupo o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo fenilo e o símbolo Rg representa um átomo de H;

em que quando o símbolo Rj representa um grupo o símbolo R3 representa um grupo 4-clorofenilo: os símbolos R5 e Rg representam, cada um, um átomo de H em que quando o símbolo Ri representa 10

os símbolos R5 e Re representam, cada um, independentemente um átomo de H ou um grupo alquilo; Ύ

HN em que quando o símbolo Ri representa um grupo o símbolo R3 representa um grupo fenilo; e os símbolos R5 e R6 representam ambos átomos de H ou o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo Rs representa um grupo e o símbolo Re representa um átomo

le H ou o símbolo R3 representa um grupo 4-piridiio; o símbolo R5 representa um grupo CH3 e o símbolo R6 representa

um grupo A presente invenção tem ainda por objecto composições farmacêuticas para o tratamento de um estado de resposta a 7-deazapurina substituída em N-6, num mamífero, por exemplo, asma, bronquite, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crónica, distúrbios renais, distúrbios gastrointestinais e distúrbios dos olhos. A composição farmacêutica incluí uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de uma 7-deazapurina substituída em N-6 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção também tem por objecto composições farmacêuticas embaladas, para o tratamento dum estado de resposta de 7-deazapurina substituída em N-6, num mamífero. As composições farmacêuticas embaladas incluem um recipiente que contém uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de pelo menos uma 7-deazapurina substituída em N-6 e instruções para a utilização da 7-deazapurina substituída em N-6 para um tratamento de um estado que responde às 7-deazapurinas substituídas em N-6, num mamífero.

As deazapurinas da presente invenção podem ser, com vantagem, antagonistas selectivos do receptor Aj. Estes compostos podem ser úteis para numerosas utilizações terapêuticas, tais como, por exemplo, o tratamento de asma, paragem do rim associada com paragem cardíaca e glaucoma. Num enquadramento particularmente preferido, a deazapurina é um pró-fármaco solúvel em água, que é capaz de ser metabolizado 12 in vivo num fármaco activo por, por exemplo, hidrólise catalisada por esterase.

Num dos aspectos, a presente invenção tem por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina (por exemplo, A3) numa célula, in vitro, por meio do contacto da célula com 7-deazapurina substituída em N-6 (por exemplo, preferencialmente, um antagonista de receptor de adenosina).

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva de uma 7-deazapurina substituída em N-6, de fórmula geral I, para o tratamento de problemas nos olhos de um animal. Preferencialmente, a 7-deazapurina substituída em N-6, é um antagonista dos receptores de adenosina A3 em células de um mamífero. Os danos podem ser na retina ou na parte superior do nervo óptico e podem ser agudos ou crónicos. Os problemas podem ser o resultado de, por exemplo, glaucoma, edema, isquémia, hipóxia ou trauma. A presente invenção também tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula geral I substituído em N-6. Preferencialmente, a preparação farmacêutica é uma formulação oftálmica (por exemplo, uma formulação de injecção periocular, retrobulbar ou intra-ocular, uma formulação sistémica ou uma solução de irrigação cirúrgica). A presente invenção tem ainda por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina (por exemplo, um receptor de adenosina Αχ) numa célula in vitro, por meio do contacto dessa célula com um composto da 13 presente invenção. Preferencialmente, o composto é um antagonista do receptor. A presente invenção também tem por objecto uma quantidade efeetiva de um composto de fórmula geral I (por exemplo, um antagonista de A2a) , para o tratamento de um distúrbio gastrointestinal (por exemplo, diarreia) ou um distúrbio respiratório (por exemplo, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crónica) num animal. Preferencialmente, o animal é um ser humano. A presente invenção tem ainda por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina Αχ numa célula ín vitro, que compreende o contacto da referida célula com os compostos mencionados antes.

As caracteristicas e outros detalhes da presente invenção serão descritos mais particularmente e desenvolvidos nas reivindicações. Deve entender-se que os enquadramentos particulares da presente invenção, são mostrados a titulo ilustrativo e não como limitações da presente invenção. As caracteristicas dos princípios da presente invenção podem ser utilizadas em vários enquadramentos sem sair do âmbito da presente invenção. A presente invenção tem por objecto a utilização de uma quantidade efeetiva sob o ponto o ponto de vista terapêutico de uma 7-deazapurina substituída em N-6, descrita infra, para o tratamento de um estado que responde a 7-deazapurina substituída em N-6, num mamífero. A expressão "estado que responde a 7-deazapurina substituída em N-6", é suposto incluir um estado de doença ou uma condição, caracterizada pela sua capacidade de responder 14 ao tratamento com uma 7-deazapurina substituída em N-6 da presente invenção, tal como descrito infra, por exemplo, o tratamento inclui uma diminuição significativa de pelo menos um sintoma ou efeito do estado conseguida com uma 7-deazapurina substituída em N-6 da presente invenção. Normalmente, esses estados de doença estão associados com um aumento de adenosina dentro de um hospedeiro, de tal forma que o hospedeiro muitas vezes experimenta sintomas fisiológicos que incluem, mas não se limitam a, libertação de toxinas, inflamação, coma, retenção de água, ganho de peso ou perda de peso, pancreatite, enfisema, artrite reumatóide, osteoartrite, paragem múltipla de órgãos, sintoma da angústia respiratório em crianças e adultos, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crónica, distúrbios dos olhos, distúrbios gastrointestinais, promoção do tumor da pele, imunodeficiência e asma. (Ver, por exemplo, C.E. Muller e B. Stein "Adenosine Receptor Antagonists: Structures and Potential Therapeutic Applications", Current Pharmaceutical Design, 2:501 (1996) e C.E. Muller "Αχ-Adenosine Receptor Antagonists", Exp. Opin. Ther. Patents 7(5):419 (1997) e I. Feoktistove, R. Polosa, S. T. Holgate e I. Biaggioni "Adenosine A2b- receptors: a novel therapeutic target in asthma?" TiPS 19:148 (1998)). Os efeitos muitas vezes associados com esses sintomas incluem, mas não se limitam a, febre, dificuldades de respiração, náusea, diarreia, fraqueza, dor de cabeça e mesmo morte. Num enquadramento, um estado que responde ao tratamento com 7-deazapurina substituída em N-6 inclui esses estados de doença, que são mediados pela estimulação dos receptores de adenosina, por exemplo, Ai, A2a, A2b, A3, etc., de tal maneira que as concentrações de cálcio nas células e/ou a activação de PLC (fosfolipase C) é modulada. Num enquadramento preferido, o estado que responde a 7-deazapurina substituída em N-6, está associado com os receptores de adenosina, por exemplo, a 7- 15 deazapurina substituída em N-6 actua como um antagonista. Exemplos de estados que respondem apropriadamente, que podem ser tratados pelos compostos da presente invenção, por exemplo, subtipos do receptor de adenosina que medeia efeitos biológicos, incluem efeitos do sistema nervoso central (SNC), efeitos cardiovasculares, efeitos renais, efeitos respiratórios, efeitos imunológicos, efeitos gastrointestinais e efeitos metabólicos. A quantidade relativa de adenosina num indivíduo pode estar associada com os efeitos listados a seguir; isto é, níveis aumentados de adenosina podem produzir um efeito, por# exemplo, uma resposta fisiológica indesejada, por exemplo, um ataque de asma.

Os efeitos no SNC incluem a libertação diminuída de transmissores (Αχ) , sedação (Ai) , diminuição da actividade locomotora (A2a) , actividade anti-convulsíva, estimulação do quimioreceptor (A2) e hiperalgesia. As aplicações terapêuticas dos compostos da presente invenção, incluem o tratamento da demência, da doença de Alzheimer e a melhoria da memória.

Os efeitos cardiovasculares incluem vasodilatação (A2a) , (A2b) e (A3) , vasoconstrição (Ai) , bradicárdia (Ai) , inibição das plaquetas (A2a) , inotropia cardíaca negativa e dromotropia (Ai) , arritmia, taquicárdia e angiogenese. As aplicações terapêuticas dos compostos da presente invenção, incluem, por exemplo, prevenção duma deterioração induzida por ísquémia do coração e protecção do tecido cardiotónico, miocárdico e restauração da função cardíaca.

Os efeitos renais incluem GFR diminuído (Αχ) , contracção da célula mesangial (Αχ) , anti-diurese (Αχ) e inibição da libertação de renina (Αχ). As aplicações terapêuticas apropriadas dos compostos da presente invenção, incluem a 16 utilização dos compostos da presente invenção como diuréticos, natriuréticos, escassez de potássio, prevenção/protecção do rim em paragem renal aguda, agentes anti-hipertensivos, anti-edemaciosos e anti-nefríticos.

Os efeitos respiratórios incluem broncodilatação (A2), broncoconstrição (Αχ), doença pulmonar obstrutiva crónica, rinite alérgica, secreção de músculo e depressão respiratória (A2). As aplicações terapêuticas apropriadas para os compostos da presente invenção, incluem aplicações anti-asmáticas, tratamento das doenças do pulmão após transplantação e distúrbios respiratórios.

Os efeitos imunológicos incluem imunossupressão (A2), quimiotaxia do neutrófilo (Αχ), geração de superóxido de neutrófilo (A2a) e desgranulação das células de mastócitos (A2b e A3). As aplicações terapêuticas de antagonistas incluem inflamação alérgica e não alérgica, por exemplo, libertação de histamina e de outros mediadores inflamatórios.

Os efeitos gastrointestinais incluem inibição da secreção de ácido (Αχ), sendo que a aplicação terapêutica pode incluir condições de refluxo e ulcerosas. Os efeitos gastrointestinais também incluem doenças colónicas, intestinais e diarreicas, por exemplo, doenças diarreicas associadas com a inflamação intestinal (A2b) ·

Os distúrbios dos olhos incluem feridas da retina ou feridas do nervo óptico superior e distúrbios relacionados com traumas (A3). Num enquadramento preferido, o distúrbio ocular é o glaucoma.

Outras aplicações terapêuticas dos compostos da presente invenção incluem o tratamento da obesidade (propriedades 17 lipolíticas), hipertensão, tratamento de depressão, sedativo, ansiolítico, como antilépticos e como laxantes, por exemplo, efectuando a mutualidade sem causar diarreia. A expressão "estado de doença", é suposto incluir as condições causadas ou associadas com níveis indesejáveis de adenosina, actividade de adeniiil-ciclase, actividade fisiológica acrescida, associada com a estimulação aberrante de receptores de adenosina e/ou um aumento no cAMP. Num enquadramento, o estado de doença é, por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, rinite alérgica, bronquite, distúrbios renais, distúrbios gastrointestinais ou distúrbios dos olhos. Exemplos adicionais incluem bronquite crónica e fibrose quística. Exemplos apropriados de doenças inflamatórias incluem leucemia não linfocítica, isquémia do miocárdio, angina, enfarte, isquémia cerebrovascular, claudicação intermitente, isquémia límbica critica, hipertensão venosa, veias varicosas, ulceração venosa e arteriosclerose. Os estados de reperfusão incluem, por exemplo, qualquer trauma pós-cirúrgico, tal como, cirurgia reconstrutiva, trombólise ou angioplastia. A expressão "tratamento de um estado que responde a 7-deazapurina substituída em N-6", significa que inclui alterações num estado ou condição da doença, tal como se descreveu antes, de tal modo que os sintomas fisiológicos num mamífero podem ser significativamente diminuídos ou minimizados. A expressão também inclui o controlo, a prevenção ou a inibição de sintomas ou efeitos fisiológicos associados com uma quantidade aberrante de adenosina. Num enquadramento preferido, o controlo do estado de doença ou a condição em que esse estado de doença ou condição é erradicado. Num outro enquadramento preferido, o controlo é selectívo de tal maneira que os níveis aberrantes da 18 actividade do receptor de adenosina são controlados embora outros sistemas fisiológicos e parâmetros não sejam afectados. A expressão "7-deazapurina substituída em N-6" é conhecida na técnica e supostamente inclui os compostos que têm a fórmula geral I:

(I) A "7-deazapurina substituída em N" inclui os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. A expressão "quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico" de uma 7-deazapurina substituída em N-6, descrita infra, é a quantidade de um composto terapêutico necessária ou suficiente para desempenhar a função pretendida num mamífero, por exemplo, tratar um estado que responde à 7-deazapurina substituída em N-6 ou um estado de doença num mamífero. Uma quantidade efectiva de um composto terapêutico, pode variar de acordo com factores, tais como, a quantidade de agente causador já presente no mamífero, a idade, o sexo e o peso do mamífero e a capacidade dos compostos terapêuticos da presente invenção para afectar um estado que responde a 7-deazapurina substituída em N-6, num mamífero.

Um especialista na matéria será capaz de estudar os factores mencionados antes e fazer uma determinação tendo em 19 vista a quantidade efectiva de um composto terapêutico sem uma experimentação desnecessária. Tal como se pode também utilizar um ensaio in vitro ou in vivo para determinar uma "quantidade efectiva" dos compostos terapêuticos, descritos infra. Um especialista na matéria poderá seleccionar uma quantidade apropriada do composto terapêutico para ser utilizada no ensaio mencionado antes ou como um tratamento terapêutico.

Uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico, preferencialmente, diminui pelo menos um sintoma ou efeito associado com o estado que responde à 7-deazapurina substituída em N-6 ou a uma condição a ser tratada, pelo menos em cerca de 20 % (mais preferencialmente, pelo menos em cerca de 40 %, ainda maís preferencialmente, pelo menos em cerca de 60 % e ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 80 %) relativamente aos indivíduos não tratados. Os ensaios podem ser desenhados por um especialista na matéria, para medir a diminuição desses sintomas e/ou efeitos. Qualquer ensaio reconhecido na técnica capaz de medir esses parâmetros, é suposto estar incluído como parte da presente invenção. Por exemplo, se a asma for o estado a ser tratado, então o volume de ar expandido do pulmão de um indivíduo pode ser medido antes e depois do tratamento para a medição do aumento do volume, utilizando uma técnica reconhecida na técnica. Do mesmo modo, se o estado a ser tratado for uma inflamação, então a área que está inflamada pode ser medida antes e depois do tratamento para avaliar a diminuição da área inflamada, utilizando uma técnica reconhecida -na técnica. 0 termo "célula" inclui tanto células procariótícas como eucarióticas. 20 0 termo "animal" inclui qualquer organismo com receptores de adenosina ou qualquer organismo susceptivel a um estado de resposta a 7-deazapurina substituída em N-6. Exemplos de animais incluem fungos, mamíferos, répteis e pássaros. Também inclui animais transgénicos. 0 termo "mamífero" é reconhecido na técnica e significa e inclui um animal, mais preferencialmente, um animal de sangue quente, ainda mais preferencialmente, gado bovino, ovelhas, porcos, cavalos, cães, gatos, ratos, murganhos e seres humanos. Os mamíferos susceptíveis a um estado que responde à 7-deazapurina substituída em N-6, inflamação, enfisema, asma, condições do sistema nervoso central ou síndroma de distress respiratório agudo, por exemplo, estão incluídos como parte da presente invenção.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de uma 7-deazapurina substituída em N-6, para modular um receptor de adenosina num mamífero. Os receptores de adenosina apropriados incluem as famílias de Αχ, A2 ou A3. Num enquadramento preferido, a 7-deazapurina substituída em N-6 é um antagonista de receptor de adenosina. A expressão "modulação de um receptor de adenosina", significa que incluí esses exemplos em que um composto interage com um receptor de adenosina, causando uma actividade fisiológica aumentada, diminuída ou anormal, associada com um receptor de adenosina ou efeitos em cascata subsequentes, resultantes da modulação do receptor de adenosina. As actividades fisiológicas associadas com os receptores de adenosina, incluem a indução de sedação, vasodilatação, supressão do batimento cardíaco e contractilídade, inibição da agregação de plaquetas, 21 estimulação da gliconeogenese, inibição de lipólise, abertura dos canais de potássio, redução do fluxo dos canais de cálcio, etc.

Os termos "modulado", "modulação", é suposto incluírem a prevenção, erradicação ou inibição do aumento resultante da actividade fisiológica indesejável associada com a estimulação anormal de um receptor de adenosina, por exemplo, no contexto de processos terapêuticos dà presente invenção. Num outro enquadramento, o termo modulado inclui efeitos antagonísticos, por exemplo, diminuição da actividade ou produção de mediadores de alergia e inflamação alérgica, que resulta da sobre-estimulação dos receptores de adenosina. Por exemplo, as deazapurinas terapêuticas da presente invenção, podem interagir com um receptor de adenosina para inibir, por exemplo, a actividade de adenilato-ciclase. A expressão "condição caracterízada por actividade aberrante do receptor de adenosina", significa e inclui as doenças, distúrbios ou condições que estão associadas com a estimulação aberrante de um receptor de adenosina, em que a estimulação do receptor causa uma cadeia de eventos bioquímicos e/ou fisiológicos, que está directamente ou indirectamente associada com a doença, distúrbio ou condição. Esta estimulação de um receptor de adenosina não tem que ser o único agente causador da doença, distúrbio ou condição, mas é meramente responsável por causar alguns dos sintomas normalmente associados com a doença, o distúrbio ou a Condição a ser tratada. A estimulação aberrante do r-eceptor, pode ser o único factor ou pelo menos um outro agente pode estar envolvido no estado a ser tratado. Exemplos de condições incluem os estados de doença listados supra, incluindo inflamação, distúrbios gastrointestinais e os sintomas manifestados pela presença de uma actividade 22 aumentada do receptor de adenosina. Exemplos preferidos incluem os sintomas associados com asma, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crónica, enfisema, bronquite, distúrbios gastrointestinais e glaucortia. A expressão "tratamento de uma condição caracterizada pela actividade aberrante do receptor de adenosina", é suposto incluir o alívio ou diminuição de pelo menos um sintoma, normalmente associado com a condição. 0 tratamento também inclui o alívio ou a diminuição mais do que um sintoma. Preferencialmente, o tratamento cura, por exemplo, praticamente elimina os sintomas associados com a condição. A presente invenção tem por objecto os compostos 7-deazapurinas substituídas em N-6 de fórmula geral I:

(I) em que o símbolo Ri representa 23

24

e o símbolo R2 representa um átomo de H; ou NRiR2 em conjunto representa

em que o símbolo R3 representa um grupo fenilo substituído ou insubstituído, pirrole, tiofeno, furano, tiazole, imidazole, triazole, pirazole, piridina, 2(1H)-piridona, 4(1H)-piridona, pirazina, pirimidina, piridazina, isotiazole, isoxazole, oxazole, tetrazole, naftilo, tetralina, benzofurano, benzotiofeno, 2,3-di-hidroindole, lH-indole, indolilo, benzopirazole, 1,3-benzodioxole, benzoxazole, purina, coumarina, cromona, quinolilo, tetra-hidroquinolina, isoquinolina, benzimidazole, quinazolina, pteridina, 2 (1H) — quinolona, 1(2H)-isoquinolona, 1,4-benzisoxazina, benzo-tiazole, quinoxalina, quinolino-N-óxidof isoquinolino-N-óxido, quinoxalíno-N-óxido, quinazolino-N-óxído, benzoxazina, ftalazina ou cinolina; em que o símbolo R5 representa um átomo de H, um grupo CH3, alquilo substituído ou insubstituído, arilo ou fenilo,

/ Ο ou e em que o símbolo Re representa um átomo de H, um grupo CH3, alquilo substituído ou insubstituído, cicloalquilo, em que o substituínte, quando presente, representa um átomo de halogénio, um grupo hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi , ariloxicarboniloxi, carboxilato f alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fospinato, ciano, amino, acilamino, amidino, imino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo ou alquilarilo, ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico,

OH

em que quando o símbolo Ri representa um grupo o símbolo R3 representa um grupo fenilo;

o símbolo R5 representa um grupo 27 e o símbolo Re representa um átomo de H; em que o símbolo X representa um átomo de O ou S; e

em que quando o símbolo Ri representa um grupo o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo fenilo e o símbolo R6 representa um átomo de H;

em que quando o símbolo Ri representa um grupo o símbolo R3 representa um grupo 4-clorofenilo: os símbolos R5 e R6 representam, cada um, um átomo de H em que quando o símbolo Ηχ representa 28

os símbolos R5 e R6 representam, cada um, independentemente, um átomo de H ou um grupo alquilo; em que quando o símbolo Rx representa um grupo

Y° HN

o símbolo R3 representa um grupo fenilo; e os símbolos R5 e Re representam ambos átomos de H ou o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo

e o símbolo Re represen ta um átomo de H ou o símbolo R3 representa um grupo 4-píridilo; 29 o simbolo R5 representa um grupo CH3 e o símbolo R6 representa

um grupo

Os compostos da presente invenção podem compreender pró-fármacos solúveis em água, que estão descritos na patente de invenção WO 99/33815, no pedido de patente de invenção internacional PCT/US98/04595, registado em 09 de Março de 1998 e publicado em 8 de Julho de 1999. Todo o conteúdo da patente de invenção WO 99/33815, está expressamente aqui incorporado como referência. Os pró-fármacos solúveis em água, são metabolizados in vivo, com um fármaco activo, por exemplo, por hidrólise catalisada por esterase. Exemplos de pró-fármacos potenciais incluem deazapurinas com, por exemplo, o simbolo R2 como um grupo cicloalquilo substituído por -OC(O) (Z) NH2, em que o simbolo Z representa uma cadeia lateral de um aminoácido, que pode ter ocorrência natural ou não natural ou um seu análogo, aminoácidos α, β, γ ou ω ou um dipéptido. As cadeias laterais de aminoácidos preferidas incluem as de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, lisina, α-metilalanina, aminociclopropano, ácido carboxilico, ácido azetidino-2-carboxílico, β-alanina, ácido γ~ aminobutírico, alanina-alanina ou glicina-alanina.

Num enquadramento, a deazapurina é 4-(cis-3-hidroxiciclopentil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7ff-pirrolc-[2,3d]pirimidina.

Num outro enquadramento, a deazapurina é um sal do ácido trifluoroacético de 4-(cis-3-(2-aminoacetoxi)ciclopentil)-amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-pírrolo[2,3d]pirimidina. 30

Ainda num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina (per exemplo, Ai, A2a, A2a ou, preferencialmente, A3} , numa célula in vitro, por meio do contacto da célula com 7-deazapurina substituída em N-6 (por exemplo, preferencialmente, um antagonista do receptor de adenosina).

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva de uma 7-deazapurina substituída em N-6, para o tratamento de problemas dos olhos de um animal (por exemplo, um ser humano). Preferencialmente, a 7-deazapurina substituída em N-6 é um antagonista dos receptores de adenosina A3 em células do animal. 0 distúrbio é na retina ou na parte superior do nervo óptico e pode ser agudo ou crónico. 0 problema pode ser o resultado de, por exemplo, glaucoma, edema, isquéxnia, hipóxia ou trauma.

Num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica contendo uma 7-deazapurina substituída em N-6 da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de uma deazapurína da presente invenção, para o tratamento de um estado que responde a 7-deazapurina substituída em N-6 num animal, de tal forma que o tratamento de um estado que responde a 7-deazapurina substituída em N-6 num animal possa ocorrer. Com vantagem, o estado de doença pode ser um distúrbio mediado por adenosina. Exemplos de estados de doença preferidos incluem: distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares, distúrbios renais, distúrbios inflamatórios, distúrbios alérgicos, distúrbios 31 gastrointestinais, distúrbios dos olhos e distúrbios respiratórios. 0 termo "alquilo", refere-se ao radical de grupos alifáticos saturados, incluindo grupos alquilo de cadeia linear, grupos alquilo de cadeia ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclicos), grupos cicloalquilo substituídos por alquilo e grupos alquilo substituídos por cicloalquilo. 0 termo alquilo inclui ainda grupos alquilo, que podem ainda incluir átomos de oxigénio, azoto, enxofre ou fósforo, substituindo um ou mais átomos de carbono da estrutura do hidrocarboneto, por exemplo, átomos de oxigénio, azoto, enxofre ou fósforo. Em enquadramentos preferidos, uma cadeia de alquilo, linear ou ramificada, tem 30 átomos de carbono ou menos na sua estrutura (por exemplo, uma cadeia linear em Cq-C3o ou para a cadeia ramificada C3-C30) e, mais preferencialmente, 20 ou menos. Do mesmo modo, os cicloalquilos preferidos têm entre 4-10 átomos de carbono na sua estrutura de anel e, mais preferencialmente, têm 5, 6 ou 7 átomos de carbono na sua estrutura de anel.

Além disso, o termo alquilo, tal como é utilizado na presente descrição e nas reivindicações, inclui tanto "alquilos insubstituídos" como "alquilos substituídos" sendo que estes últimos se referem a partes de alquilo, que têm substituintes substituindo um átomo de hidrogénio em um ou mais dos átomos de carbono da estrutura do hidrocarboneto. Esses substituintes podem incluir, por exemplo, átomos de halogénio, grupos hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboníloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, car-boxilato, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquíItiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarílamino e alquilarilamino), acilamino 32 (incluindo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo e ureido), amidino, imino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trif luorometilo, ciano, azidc-, heterociclilo, alquilarilo ou uma parte aromática ou heteroaromática. Deverá ser entendido pelos especialistas na matéria que as partes substituídas na cadeia do hidrocarboneto podem elas próprias ser substituídas, se apropriado. Os cicloalquilos podem ser ainda substituídos, por exemplo, com os substituintes descritos antes. Uma parte "alquilarilo" é um alquilo substituído com um arilo (por exemplo, fenilmetilo (benzilo)). 0 termo "alquilo" também inclui grupos alifáticos insaturados, análogos no comprimento e possível substituição com os alquilos descritos antes, mas que contém pelo menos uma ligação dupla ou tripla, respectivamente. 0 termo "arilo", tal como se utiliza aqui, refere-se ao radical de grupos arilo, incluindo grupos aromáticos com um anel simples com 5 a 6 átomos no núcleo, que pode incluir de zero a quarto heteroátomos, por exemplo, benzeno, pirrole, furano, tiofeno, imidazole, benzoxazole, benzotiazole, triazole, tetrazole, pirazole, piridina, pirazina, piridazina e pirimidina e similares. Os grupos arilo também incluem grupos aromáticos fundidos com grupos policíclicos, tais como, naftílo, quinolilo, indolilo e similares. Esses grupos arilo que têm heteroátomos na estrutura do anel, podem também ser referidos como "heterociclos de arilo", "heteroarílos" ou "heteroaromáticos". 0 anel aromático pode ser substituído em uma ou ma is posições no anel com esses substituintes, tal como se descreveu antes, como, por exemplo, átomos de halogénio, grupos hidroxilo, alcoxi, alquíicarboníloxi, arilcarboníloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquiIcarbonílo, alcoxicarbonilo, fosfato, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, 33 fosfinato, ciano, amino (incluindo alquilamino, dialquiiamino, arilamino, diarilamino e alquilarilamino), acilamino (incluindo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo e ureido) , amidino, iirtino, sulfídrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo ou uma parte aromática ou heteroaromática. Os grupos arilo podem também estar fundidos ou ligados com anéis aliciclicos ou heterocíclicos, que não aromáticos de modo a formar um policiclo (por exemplo, tetralina).

Os termos "alcenilo" e "alcinilo" referem-se a grupos alifáticos insaturados, análogos em comprimento e possível substituição com os grupos alquilo descritos antes, mas que contêm pelo menos uma ligação dupla ou tripla, respectivamente. Por exemplo, a presente invenção contempla grupos ciano e propargilo. A menos que o número de átomos de carbono seja diferente do especificado, "alquilo inferior", tal como se utiliza aqui, significa um grupo alquilo, tal como se definiu antes, mas tendo de um a dez átomos de carbono, mais preferencialmente, de um a seis átomos de carbono na sua estrutura, ainda mais preferencialmente, de um a três átomos de carbono na sua estrutura. Do mesmo modo, "alcenilo inferior" e "alcinilo inferior" têm comprimentos de cadeia semelhantes.

Os termos "alcoxialquilo", "poliaminoalquilo" e "tioalcoxialquilo", refere-se a grupos alquilo, tal como se definiu antes, que incluem ainda átomos de oxigénio, azoto ou enxofre, substituindo um ou mais átomos de carbono da 34 estrutura do hidrocarboneto, por exemplo, átomos de oxigénio, azoto ou enxofre.

Os termos e a expressão "policiclilo" ou "radical policíclíco", referem-se ao radical de dois ou mais anéis cíclicos (por exemplo, cicloalquilos, cicloalcenilos, cícloalcinilos, arilos e/ou heterociclilos) em que dois ou mais átomos de carbono são comuns aos dois anéis adjacentes, por exemplo, os anéis são "anéis fundidos". Os anéis que se juntam através de átomos não adjacentes designam-se por anéis com "pontes". Cada um dos anéis do policiclico pode ser substituído com os substituintes, tal como se descreveram antes, por exemplo, átomos de halogénio, grupos hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, arílcarboniloxi, alcoxi-carboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbo-nilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino e alquilarilamino) , acilamino (incluindo alquilcarbonilaitd.no, arilcarbonilamino, carbamoílo e ureído), amidino, imino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo ou uma parte aromática ou heteroaromática. 0 termo "heteroátomo", tal como se utiliza aqui, significa um átomo de qualquer elemento diferente de carbono ou de hidrogénio. Os heteroátomos preferidos são átomos de azoto, oxigénio, enxofre e fósforo. 0 termo "aminoácidos", inclui aminoácidos de ocorrência natural e não natural, encontrados nas proteínas, tais como, glicina, alanina, valína, cisteína, leucina, isoleucina, serina, trionina, metionina, ácido glutâmico, ácido 35 aspártico, glutamína, asparagina, lisina, arginina, prolina, histídína, fenilalanina, tirosina e triptofano. Análogos de aminoácidos incluem aminoácidos com cadeias laterais mais longas ou mais curtas ou cadeias laterais que constituem variantes com grupos funcionais apropriados. Os aminoácidos também incluem estereoisómeros D e L de um aminoácido, quando a estrutura do aminoácido admite formas estereoisoméricas. 0 termo "dipéptido" inclui dois ou mais aminoácidos ligados em conjunto. Preferencialmente, os dipéptidos são dois aminoácidos ligados por uma ligação peptidica. Os dipéptidos patticularmente preferidos incluem, por exemplo, alanina-alanina e glicina-alanina.

Deve notar-se que a estrutura de alguns dos compostos da presente invenção, incluem átomos de carbono assimétricos e assim ocorrem como racematos e misturas racémicas, enantiómeros simples, misturas diastereoméricas e diastereómeros individuais. Todas estas formas isoméricas destes compostos estão expressamente incluídas na presente invenção. Cada átomo de carbono estereogénico pode estar na configuração R ou S. De acordo com isto, deve entender-se que os isómeros que resultam dessa assimetria (por exemplo, todos os enantiómeros e diastereómeros) estão incluídos dentro do âmbito da presente invenção, a menos que seja indicado de outra forma. Esses isómeros podem ser obtidos de uma forma praticamente pura, por técnicas clássicas de separação e por síntese controlada sob o ponto de vista estereoquímico. A presente invenção tem ainda por objecto composições farmacêuticas para o tratamento de estados que respondem à 7-deazapurina substituída em N-6, num mamífero, por exemplo, distúrbios respiratórios (por exemplo, asma, bronquite, distúrbio pulmonar obstrutivo crónico e rinite alérgica), distúrbios renais, distúrbios gastrointestinais e distúrbios 36 dos olhos. As composições farmacêuticas incluem uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de uma 7-deazapurina substituída em N-6, descrita supra e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Deve entender-se que todas as deazapurinas descritas antes, são incluídas para tratamento terapêutico. Deve também entender-se que as deazapurinas da presente invenção, podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação com outras deazapurinas da presente invenção ou em combinação com outros compostos terapêuticos, tal como, antibióticos, anti-inflamatórios ou agentes anti-cancerigenos, por exemplo. 0 termo "antibiótico", é reconhecido na técnica e é suposto incluir as substâncias produzidas fazendo crescer microrganismos e os seus derivados sintéticos, que eliminam ou inibem o crescimento de agentes patogénicos e são selectivamente tóxicos para o agente patogénico, ao mesmo tempo que produzem efeitos mínimos ou efeitos não prejudiciais no indivíduo hospedeiro infectado. Exemplos apropriados de antibióticos incluem, mas não se limitam às classes principais de aminoglicósidos, cefalosporinas, cloranfenicóis, ácidos fuscídicos, macrólidos, penicilinas, polimixinas, tetraciclinas e estreptomicinas. 0 termo "anti-inflamatório", é reconhecido na técnica e é suposto incluir os agentes que actuam nos mecanismos do corpo, sem antagonizarem directamente o agente causador da inflamação, tal como, glicocorticóides, aspirina, íbuprofen, NSAIDS, etc.- A expressão "agente anti-cancerígeno", é reconhecida na técnica e é suposto incluir os agentes que diminuem, erradicam ou previnem o crescimento de células cancerosas sem, preferencialmente, afectarem adversamente outras funções 37 fisiológicas. Exemplos representativos incluem cisplatina e ciclofosfamida.

Quando os compostos da presente invenção são administrados como produtos farmacêuticos a seres humanos e a mamíferos, eles podem ser dados per se ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,1 a 99,5 % (mais preferencialmente, 0,5 a 90 %) do ingrediente activo em combinação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A expressão " veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico", tal como se utiliza aqui, significa um material, composição ou veículo aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, tal como, uma carga líquida ou sólida, um diluente, um excipiente, um dissolvente ou material de encapsulação, envolvido no transporte de um composto da presente invenção para o indivíduo onde vai realizar a sua função. Normalmente, esses compostos são transportados de um órgão ou de uma parte do corpo para outro órgão ou para outra parte do corpo. Cada veículo pode ser "aceitável", no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, incluem: açúcares, tais como, lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como, amido de milho e amido de batata; celulose e os seus derivados, tais como, carboximetilcelulose de sódio, etílcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina;- talco; excipientes, tais como, manteiga de cacau e ceras de supositórios; óleos, tais como, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como, propileno-glicol; polióis, tais como, glicerina, sorbitol, manitol e 38 polietileno-glicol; ésteres, tais como, oleato de etilo e laurato de etilo; agar; agentes de tamponamento, tais como, hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido alginico; água isenta de pirogénio; solução salina isotónica; solução de Ringer; álcool de etilo; soluções tamponadas com fosfato e outras substâncias não tóxicas compatíveis, utilizadas nas formulações farmacêuticas.

Tal corno se estabeleceu antes, em certos enquadramentos da presente invenção os compostos podem conter um grupo funcional básico, tal como, amino ou alquilamino e são por isso capazes de formar sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com ácidos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. A expressão "sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico", sob este ponto de vista, refere-se a sais de adição de ácidos inorgânicos e orgânicos, relativamente não tóxicos dos compostos da presente invenção. Estes sais podem ser preparados in situ durante o isolamento final e a purificação dos compostos da presente invenção ou por uma reacção separada, fazendo reagir um composto purificado da presente invenção na sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico apropriado e isolando o sal assim formado. Os sais representativos incluem bromidratos, cloridratos, sulfatos, bissulfatos, fosfatos, nitratos, acetatos, valeratos, oleatos, palmitatos, estearatos, lauratos, benzoatos, lactatos, fosfatos, tosilatos, citratos, maleatos, fumaratos, succinatos, tartratos, naftilatos, mesilatos, glico-heptonatos, lactobionatos e sais de laurílssulfonato e similares.,. (Ver, por exemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 66:1-19).

Noutros casos, os compostos da presente invenção podem conter um ou ma is grupos funcionais ácidos e assim são 39 capazes de formar sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com bases aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. A expressão "sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico" nestes casos, referem-se a sais de adição de bases inorgânicas e orgânicas relativamente não tóxicas dos compostos da presente invenção. Estes sais podem preparar-se do mesmo modo in situ durante o isolamento final e a purificação dos compostos ou por reacções de purificação do composto de forma separada na sua forma de ácido livre com uma base apropriada, tal como, hidróxidos, carbonatos ou bicarbonatos de um catião metálico aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, com amónia ou com uma amina orgânica primária, secundária ou terciária, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Os sais de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos representativos, incluem sais de litio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e alumínio e similares. As aminas orgânicas representativas, úteis para a formação de sais de adição de bases incluem etilamina, dietilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina e similares. A expressão "ésteres aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico", refere-se a produtos esterifiçados, relativamente não tóxicos, dos compostos da presente invenção. Estes ésteres podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos compostos ou por reacção separada do composto purificado na sua forma de ácido livre ou de hidroxilo, com um agente de esterificação apropriado. Os ácidos carboxílicos podem ser convertidos em ésteres por via do tratamento com um álcool, na presença de um catalisador. Os derivados contendo hidroxilo podem ser convertidos em ésteres por via do tratamento com um agente de esterificação, tal como, halogenetos de alcanoílo. 0 termo é suposto ainda incluir grupos de hidrocarboneto inferior, 40 capazes de serem solvatados em condições fisiológicas, por exemplo, ésteres de alquilo, metilo, etilo e propilo. (Ver, por exemplo, Berge et al., supra). A presente invenção contempla ainda a utilização de pró-fármacos que são convertidos in vivo nos compostos terapêuticos da presente invenção (ver, por exemplo, R.B. Silverman, 1992, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Academic Press, capítulo 8). Esses pró-fármacos podem ser utilizados para alterar a bíodistribuição (por exemplo, para permitir que os compostos que não entram normalmente no sítio da reacção da protease) ou a farmacocinética do composto terapêutico. Por exemplo, um grupo de ácido carboxílico pode ser esterifiçado, por exemplo, com um grupo metilo ou um grupo etilo para originar um éster. Quando se administra um éster a um indivíduo, o éster é clivado, enzimaticamente ou não enzimaticamente, redutivamente ou hidrolíticamente, para revelar o grupo aniónico. Pode-se esterificar um grupo aniónico com partes (por exemplo, ésteres de aciloximetilo), que são clivadas para revelar um composto intermédio, que em seguida se decompõe para originar o composto activo. Num outro enquadramento, o pró-fármaco é uma forma reduzida de um sulfato ou de um sulfonato, por exemplo, um tiol, que é oxidado in vivo com o composto terapêutico. Além disso, pode- se esterificar uma parte aníónica num grupo que é transportado activamente in vivo ou que é selectivamente captado pelos órgãos alvo. Pode-se seleccionar o éster para -permitir que se atinja- o alvo de forma específica com as partes terapêuticas em sítios reactivos particulares, tal como se descreve a seguir para as partes de veículos.

Agentes de molhagem, emulsionantes e lubrificantes, tais como, sulfato de laurilo e sódio e estearato de magnésio, 41 assim como, agentes de coloração, agentes de libertação, agentes de revestimento, adoçantes, agentes aromatizantes e perfumes, conservantes e antioxidantes, podem também estar presentes nas composições.

Exemplos de antioxidantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem: antioxidantes solúveis em água, tais como, ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, meta-bissulfureto de sódio, sulfureto de sódio e similares; antioxidantes solúveis em óleo, tais como, palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (HAB), hidroxitolueno butilado (HTB), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol e similares; e agentes de quelação de metais, tais como, ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.

As formulações da presente invenção incluem as que são apropriadas para administração oral, nasal, tópica, transdérmica, bocal, sublingual, rectal, vaginal e/ou parentérica. As formulações podem apresentar-se de uma forma conveniente em formas de dosagem unitárias e podem ser preparadas por quaisquer processos bem conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material veicular para produzir uma forma de dosagem única, será geralmente a quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. Geralmente, um de cem por cento, esta quantidade variará entre 1 por cento até cerca de 99 por cento de ingrediente activo, preferencialmente, de cerca de 5 por cento até cerca de 70 por cento, mais preferencialmente, de cerca de 10 por cento até cerca de 30 por cento. 42

Os processos de preparação destas formulações ou composições, incluem a etapa que consiste em associar um composto da presente invenção com o veículo e, eventualmente, um ou maís ingredientes acessórios. Em geral, as formulações preparam-se misturando uniformemente e intimamente um composto da presente invenção com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e depois, se necessário, molda-se o produto.

As formulações da presente invenção apropriadas para administração oral, podem estar sob a forma de cápsulas, comprimidos revestidos, pílulas, comprimidos, pastilhas (utilizando uma base aromatizada, normalmente, sacarose e acácia ou tragacanto) , pós, grânulos ou sob a forma de uma solução ou de uma suspensão, no seio de um líquido aquoso ou não aquoso ou sob a forma de uma emulsão líquida de óleo em água ou água em óleo ou sob a forma de elixir ou de xarope ou sob a forma de pastilhas (utilizando uma base inerte, tal como, gelatina e glicerina ou sacarose e acácia) e/ou sob a forma de líquidos de lavagem da boca e similares, cada um deles contendo uma quantidade pré-determinada de um composto da presente invenção como ingrediente activo. Um composto da presente invenção, pode ser administrado também sob a forma de bolus, electuário ou pasta.

Nas formas de dosagem sólidas da presente invenção para administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drageias, pós, grânulos e similares), o ingrediente activo pode ser misturado com um- -ou ma is veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, tais como, citrato de sódio ou fosfato de dicálcio e/ou qualquer um dos seguintes: cargas ou extensores, tais como, amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e/ou ácido silícico; ligantes, tais como, por exemplo, carboximet11celulose, algínatos, gelatina, 43 polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; humectantes, tais como, glicerol; agentes desintegrantes, tais como, agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algíníco, alguns silicatos e carbonato de sódio; agentes de retardamento da solução, tal como, parafina; aceleradores da absorção, tais como, compostos de amónio quaternário; agentes de molhagem, tais como, por exemplo, álcool cetilico e monoestearato de glicerol; absorventes, tais como, caulino e argila de bentonite; lubrificantes, tais como, talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno-glicóis sólidos, sulfato de laurilo e sódio e as suas misturas; e agentes corantes. No caso de cápsulas, comprimidos, as composições farmacêuticas podem também compreender agentes de tamponamento. As composições sólidas de um tipo semelhante, podem também ser utilizadas como cargas em cápsulas de gelatina mole e duras cheias, utilizando excipientes, tais como, lactose ou açúcar do leite, assim como, polietileno-glicóis de elevado peso molecular e similares.

Um comprimido pode ser feito por compressão ou por moldagem, eventualmente, com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos feitos por compressão, podem ser preparados utilizando um ligante (por exemplo, gelatina ou hidroxipropilmetílcelulose), lubrificantes, diluentes inertes, conservantes, desintegrantes (por exemplo, glicolato de amido de sódio ou carboximetilcelulose de sódio reticulada), agentes tensioactivos ou dispersantes. Os comprimidos -moldados podem ser feitos por moldagem numa máquina apropriada, de uma mistura de um composto em pó, humidificado com um diluente líquido inerte.

Os comprimidos e outras formas de dosagem sólidas das composições farmacêuticas da presente invenção, tais como, 44 drageias, cápsulas, pílulas e grânulos, podem eventualmente ser preparados com revestimentos e vernizes, tais como, revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Podem também ser formulados de modo a providenciar uma libertação lenta ou controlada do ingrediente activo durante a sua utilização, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis para providenciar o desejado perfil de libertação, para além de matrizes de polímeros, lipossomas e/ou microesferas. Podem ser esterilizados por meio de, por exemplo, filtração através de um filtro que retenha as bactérias ou por incorporação de agentes de esterilização, sob a forma de composições sólidas esterilizadas, que podem ser dissolvidas em água esterilizada ou alguns outros meios de injecção esterilizados imediatamente antes da sua utilização. Estas composições podem também, eventualmente, conter agentes para tornar o produto opaco e podem ser de uma composição que libertem apenas o ingrediente activo ou, preferencialmente, o ingrediente activo, numa certa porção do trato gastrointestinal, eventualmente, de uma forma retardada. Exemplos de composições que embebem, que podem ser utilizadas incluindo substâncias poliméricas e ceras. 0 ingrediente activo pode também estar sob a forma micro-encapsulada, se for apropriado, com um ou mais dos excipientes descritos antes.

As formas de dosagem líquida para administração oral dos compostos da presente invenção incluem emulsões, micro-emulsões, -soluções, suspensões, xaropes e elixires,... aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Para além do ingrediente activo, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes vulgarmente utilizados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros dissolventes, agentes de solubilização e emulsionantes, tais como, álcool de etilo, 45 álcool de isopropilo, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool de benzilo, benzoato de benzilo, propileno-glicol, 1/3-butileno-glicol, óleos (em particular, óleo de semente de algodão, óleo de nozes, óleo de milho, óleo de gérmen, azeite, óleo de rícino e óleo de sésamo), glicerol, álcool de teíra-hidrofurilo, poiietileno-glicóís e ésteres de ácidos gordos de sorbitano e as suas misturas.

Para além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes, tais como, agentes de molhagem, agentes de emulsão e de suspensão, adoçantes, aromatizantes, corantes, perfumes e agentes conservantes.

As suspensões, para além dos compostos activos, podem conter agentes de suspensão como, por exemplo, álcoois de isoestearilo etoxilados, ésteres de polioxietileno-sorbitol e sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, agar-agar e tragacanto e as suas misturas.

As formulações das composições farmacêuticas da presente invenção, para administração rectal ou vaginal, podem apresentar-se como supositórios, que se podem preparar misturando um ou mais compostos da presente invenção, com um ou mais excipientes ou veículos apropriados, não irritantes, compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau, polietileno-glicol, uma cera de supositórios ou um salicilato e de modo a que seja sólido à temperatura ambiente, mas líquido à temperatura do corpo e por isso funda no recto ou na cavidade vaginal e liberte o composto activo.

As formulações da presente invenção que são apropriadas para administração vaginal, também incluem pessários, tampões, cremes, geles, pastas, espumas ou formulações de 46 pulverização contendo esses veículos, tal como é conhecido na técnica como sendo apropriado.

As formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de um composto da presente invenção, incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, geles, soluções, adesivos e inaladores. 0 composto activo pode ser misturado em condições esterilizadas com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e com quaisquer conservantes, tampões ou propelentes que possam ser necessários.

As pomadas, pastas, cremes e geles, podem conter para além do composto activo da presente invenção, excipientes, tais como, gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietileno-glicois, silicones, bentonites, ácido silicico, talco e óxido de zinco ou as suas misturas.

Os pós e os aerossóis podem conter, para além de um composto da presente invenção, excipientes, tais como, lactose, talco, ácido silicico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de políamida ou as misturas destas substâncias. Os aerossóis podem conter adicionalmente propelentes apropriados, tais como, clorofluoro-hidrocarbonetos e hidrocarbonetos voláteis insubstituídos, tais como, butano e propano.

Os adesivos transdérmicas têm a vantagem adicional de providenciarem uma libertação controlada de um composto da presente invenção para o corpo. Essas formas de dosagem podem ser feitas dissolvendo ou dispersando o composto num meio apropriado. Os melhoradores de absorção podem também ser utilizados para aumentar o fluxo do composto através da pele. 47 A taxa desse fluxo pode ser controlada quer providenciando uma membrana de controlo da taxa ou dispersando o composto activo numa matriz de polímero ou num gel.

As formulações oftálmicas, pomadas para os olhos, pós, soluções e similares, estão também contempladas como fazendo parte do âmbito da presente invenção. Preferencialmente, a preparação farmacêutica é uma formulação oftálmica (por exemplo, uma formulação de injecção periocular, retrobulbar ou intraocular, uma formulação sistémica ou uma solução de irrigação cirúrgica).

As formulações oftálmicas da presente invenção, podem incluir uma ou mais deazapurinas e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Podem utilizar-se vários tipos de veículos. Os veículos serão normalmente aquosos quanto à sua natureza. Preferem-se, geralmente, soluções aquosas, baseadas no caso da formulação, assim como, na capacidade do paciente para administrar facilmente essas composições por meio de instilação de uma ou duas gotas das soluções nos olhos afectados. Contudo, as deazapurinas da presente invenção, podem também ser facilmente incorporadas noutros tipos de composições, tais como, suspensões, geles viscosos ou semi-viscosos ou outros tipos de composições sólidas ou semi-sólidas. As composições oftálmicas da presente invenção podem também incluir vários outros ingredientes, tais como, tampões, conservantes, co-dissolventes e agentes de melhoria da viscosidade.

Um sistema de tampão apropriado (por exemplo, fosfato de sódio, acetato de sódio ou borato de sódio), pode ser adicionado para evitar a alteração do pH em condições de armazenagem. 48

Os produtos oftálmicos são armazenados normalmente em fcrma de multi-doses. Os conservantes são assim necessários para evitar contaminações microbianas durante a utilização. Os conservantes apropriados incluem: cloreto de benzalcónio, timerosal, clorobutanol, metil-paraben, propil-paraben, álcool de feniletilo, edetato disódico, ácido sórbico, poliquaternário-1 ou outros agentes conhecidos dos especialistas na matéria. Esses conservantes são utilizados normalmente a um nível entre 0,001 até 1,0 % peso/volume ("% p/v").

Quando se administram as deazapurinas da presente invenção, durante processos cirúrgicos intra-oculares, tal como, através de injecção retrobulbar ou periocular e reperfusão ou injecção intraocular, a utilização de soluções de irrigação de sais equilibrados como veículos, são as mais preferidas. A solução de irrigação esterilizada BSS® e solução de irrigação intraocular esterilizada BSS Plus® (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Texas, EUA), são exemplos de soluções de irrigação intraoculares equilibradas sobre o ponto de vista fisiológico. O último tipo de solução está descrito na patente de invenção norte-americana U.S. N°. 4.550.022 (Garabedian, et al.), cujo conteúdo está aqui incorporado na presente descrição como referência. As injecções retrobulbares e perioculares são conhecidas pelos especialistas na matéria e estão descritas em numerosas publicações incluindo, por exemplo, Ophthalmic Surgery: Principies of Practice, Ed., G. L. Spaeth. W. B. Sanders Co., Philadelfia, Pa., E.U.A., páginas 85-87 (1990).

Tal como se indicou antes, a utilização de deazapurinas para evitar ou reduzir danos na retina e nos tecidos superiores do nervo óptico ao nivei celular, é um aspecto particularmente importante de um dos enquadramentos da 49 presente invenção. As condições oftálmicas que podem ser tratadas incluem, mas não se limitam, a retinopatias, degeneração macular, isquémia ocular, glaucoma e danos associados com feridas nos tecidos oftálmicos, tais como, feridas isquémicas de reperfusão, feridas fotoquimicas e feridas associadas com cirurgia ocular, particularmente, feridas na retina ou na parte superior do nervo óptico feitas por exposição à luz ou a instrumentos cirúrgicos. Os compostos podem também ser utilizados como um adjuvante nas cirurgias oftálmicas, tais como, por injecção vítria ou subconjuntival no seguimento de cirurgia oftálmica. Os compostos podem ser utilizados para tratamentos agudos de condições temporárias ou podem ser administrados cronicamente, especialmente no caso de doenças degenerativas. Os compostos podem também ser utilizados profilaticamente, especialmente, antes de cirurgia ocular ou em processos oftálmicos não invasivos ou noutros tipos de cirurgia.

As composições farmacêuticas da presente invenção, apropriadas para administração parentérica, compreendem um ou mais compostos da presente invenção, em combinação com uma ou mais soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aquosas, isotónicas, esterilizadas ou não aquosas, isotónicas, esterilizadas, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ou pós esterilizados, que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões injectáveis esterilizadas imediatamente antes da sua utilização, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, solutos que tornam a solução isotónica com o sangue do receptor pretendido ou agentes de suspensão ou de espaçamento.

Exemplos de veículos aquosos e não aquosos apropriados, que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, etanol, polióis (tais como, 50 glicerol, propileno-glicol, polietileno-glícol e similares) e as suas misturas apropriadas, óleos vegetais, tais como, azeite e ésteres orgânicos ínjectáveis, tais como, oleato de etilo. Pode-se manter uma fluidez apropriada, por exemplo, por meio da utilização de materiais de revestimento, tais como, lecitina, pela manutenção da dimensão de partícula requerida no caso de dispersões e pela utilização de tensioactivos.

Estas composições podem também conter adjuvantes, tais como, conservantes, agentes de molhagem, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da acção de microrganismos pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes anti-bacterianos e anti-fungícos, por exemplo, paraben, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como, açúcares, cloreto de sódio e similares nestas composições. Além disso, A absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser realizada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tal como, mono-estearato de alumínio e gelatina.

Nalguns casos, para prolongar o efeito de um fármaco, é desejável retardar a absorção do fármaco a partir de ínjecções subcutâneas ou intramusculares. Isto pode ser conseguido pela utilização de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com uma fraca solubilidade em água. A taxa de absorção do fármaco depende então da sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender da dimensão do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de um fármaco administrado parentericamente é conseguida pela dissolução ou suspensão do fármaco num veículo oleoso. 51

As formas de depósitos injectáveis são feitas formando matrizes micro-encapsuladas dos compostos em questão em polímeros biodegradáveis, tais como, polilactídio-poliglicólido. Consoante a relação do fármaco com o polímero e a natureza particular do polímero utilizado, a taxa de libertação do fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(orto-ésteres) e poli(anidridos). As formulações de depósitos injectáveis são também preparadas por meio da retenção do fármaco em lipossomas ou micro-emulsões que são compatíveis com os tecidos do corpo.

As preparações da presente invenção podem ser dadas oralmente, parentericamente, topicamente ou rectalmente. São obviamente dadas por meio de formas apropriadas para cada via de administração. Por exemplo, são administradas sob a forma de comprimidos ou de cápsulas, por injecção, inalação, loções para os olhos, pomadas, supositórios, etc., administração por injecção, infusão ou inalação; tópica por loção ou pomada; e rectal, por supositórios. Prefere-se a administração oral.

As frases "administração parentérica" e "administrada parentericamente", tal como se utiliza aqui, significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, normalmente, por injecção e incluem, sem limitação, injecção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperítoníal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular,' intra-articular, subcapsular, subaraquenóide, intra-espínal e intra-esternal e também infusões das mesmas vias.

As frases sistemicamente", "administração sistémica", "administrado "administração periférica" e "administrado 52 perifericamente", tal como se utiliza aqui, significa a administração de um composto, fármaco ou outro material não directamente no sistema nervoso central, de tal modo que entre no sistema do paciente e assim esteja sujeito ao metabolismo e a processos semelhantes, por exemplo, administração subcutânea.

Estes compostos podem ser administrados a seres humanos e a outros animais para terapia por qualquer via apropriada de administração, incluindo oralmente, nasalmente, como por exemplo, por meio de um vaporizador, rectalmente, intravaginalmente, parentericamente, intracisternalmente e topicamente, sob a forma de pós, pomadas ou gotas, incluindo bocalmente e sublingualmente.

Independentemente da via de administração seleccionada, os compostos da presente invenção que podem ser utilizados numa forma hidratada apropriada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formulados em formas de dosagem aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, por meio de processos convencionais conhecidos pelos especialistas na matéria.

Os níveis de dosagem actual dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas da presente invenção, podem variar de modo a obter-se uma quantidade de ingrediente activo, que é eficaz para se alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. 0 nível de dosagem seleccionado dependerá de uma variedade de factores, incluindo a actividade do composto em particular da presente invenção que foi utilizado ou do seu éster, sal ou aroida, de via de administração, do tempo de 53 administração, da taxa de excreção do composto em particular que se está a utilizar, da duração de tratamento, de outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com o composto particular utilizado, da idade, do sexo, do peso, da condição, da saúde em geral e da anterior história clinica do paciente a ser tratado e de factores similares bem conhecidos na técnica médica.

Um médico ou um veterinário que seja especialista na matéria pode facilmente determinar e prescrever a quantidade efectiva de composição farmacêutica necessária. Por exemplo, um médico ou um farmacêutico podem iniciar doses dos compostos da presente invenção utilizados na composição farmacêutica a níveis mais baixos dos que os necessários, de modo a conseguir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até se alcançar o efeito desejado.

Em geral, uma dose diária apropriada de um composto da presente invenção será a quantidade de composto que é a dose efectiva mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Essa dose efectiva dependerá geralmente dos factores descritos antes. Geralmente, as doses intravenosas e subcutâneas dos compostos da presente invenção para um paciente, quando utilizadas para os efeitos analgésicos indicados, variarão de cerca de 0, 0001 até cerca de 200 mg por kg do peso do corpo por dia, mais preferencialmente, desde cerca de 0,01 até cerca de 150 mg por kg por dia e, ainda mais preferencialmente, desde cerca de 0,2 até cerca de 140 mg per kg por dia.

Se desejado, a dose efectiva diária do composto actívo, pode ser administrada sob a forma de duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente, a 54 intervalos apropriados ao longo do dia, eventualmente, em formas de dosagem unitárias.

Embora seja possível para um composto da presente invenção ser administrado sozinho, é preferível administrar o composto sob a forma de uma composição farmacêutica. A presente invenção também tem por objecto composições farmacêuticas embaladas para o tratamento de um estado que responde a 7-deazapurina substituída em N-6, por exemplo, a actividade do receptor de adenosina indesejavelmente aumentada num mamífero. As composições farmacêuticas embaladas incluem um recipiente contendo uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de pelo menos uma deazapurina, tal como descrito supra e as instruções para a utilização da deazapurina para o tratamento de um estado que responde à deazapurina num mamífero.

As deazapurinas da presente invenção podem ser preparadas utilizando processos normalizados para a síntese orgânica. As deazapurinas podem ser purificadas por CLER de fase inversa, cromatografia, recristalização, etc. e as suas estruturas podem ser confirmadas por meio de análise da massa espectral, análise elementar, IV e/ou espectroscopia de RMN.

Normalmente, a síntese dos produtos intermédios assim como das deazapurinas da presente invenção, é realizada em solução. A adição e eliminação de um- ou ma is grupos de protecção é também uma prática típica e é conhecida dos especialistas na matéria. A seguir, no esquema I, exemplifica-se esquemas sintéticos típicos para a preparação de produtos intermédios de deazapurina da presente invenção. 55 A presente invenção tem ainda por objecto um composto com a estrutural geral:

em que o símbolo R3 tem o significado definido antes; em que os símbolos R5 e Rê representam, independentemente, átomos de H ou grupos alquilo.

Num enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1500)

Num enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 56

Num outro estrutura: enquadramento do composto, o composto tem a

Ch,

Y

Num outro a estrutura: enquadramento do composto 1500, o composto tem 57 CM,

tem

Ainda num outro enquadramento do composto, o composto a estrutura: CK,

de e A presente invenção também tem por objecto um composto strutura: 58

ΝΗ

(VII) (Composto 1501) A presente invenção também tem ainda por objecto um composto de estrutura:

(VIII) em que o símbolo R3 tem o significado definido antes; em que os símbolos R5 e R6 representam, independentemente, átomos de H ou grupos alquilo.

Num dos enquadramentos do composto, o composto tem a estrutura: 59 ο

(Composto 1520) A presente invenção também tem por objecto um composto de estrutura:

NH

em que o símbolo R3 tem o significado definido antes; em que o símbolo X representa um átomo de oxigénio ou de enxofre.

Num dos enquadramentos do composto, o composto tem a estrutura: 60

(Composto 1503) A presente invenção também tem por objecto um composto de estrutura geral:

HCU

'""NH

(X) em que o símbolo R3 tem o significado definido antes; em que o símbolo X representa um átomo de oxigénio ou de enxofre.

Num dos enquadramentos do composto, o composto tem a estrutura: 61 HO,

(Composto 1504) A presente invenção tem ainda por objecto a utilização de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico, de um compostos de fórmula geral VI, VII, VIII, IX ou X, para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença associada com o receptor de adenosina Ai num indivíduo.

Num enquadramento, o indivíduo é um mamífero. Noutro enquadramento, o mamífero é um ser humano.

Num outro enquadramento, o receptor de adenosina Ai está associado com doenças cognitivas, insuficiência renal, arritmias cardíacas, epitélio respiratório, libertação de transmissor, sedação, vasoconstrição, bradicárdia, inotropia cardíaca negativa e dromotropia, broncoconstrição, quimiotaxia neutrofílica, condição de refluxo ou condição uicerosa. A presente invenção também tem por objecto, um pró-fármaco solúvel em água de um composto com as estruturas gerais VI, VII, VIII, IX ou X, em que o referido pró-fármaco solúvel em água, que é metabolizado in vivo com um fármaco activo que inibe selectivamente o receptor de adenosina Aj. 62

Num enquadramento do pró-fármaco, o referido pró-fármaco é metabolizado in vivo por meio de hidrólise catalisada por esterase. A presente invenção também tem objecto, uma composição farmacêutica que compreende o pró-fármaco e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção tem ainda por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina Ax numa célula, in vitro, o qual compreende o contacto da referida célula com um composto com as estruturas gerais VI, VII, VIII, IX ou X.

Num enquadramento do processo, o composto é um antagonista do referido receptor de adenosina Ai· A presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva de um composto com as estruturas gerais VI, VII, VIII, IX ou X para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio gastrointestinal num indivíduo.

Num enquadramento, o referido distúrbio é diarreia.

Noutro enquadramento, o indivíduo é um ser humano.

Num outro enquadramento, o composto é um antagonista dos receptcres de adenosina Ai. A presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva de um composto com as estruturas gerais VI, VII, VIII, IX ou X para o fabrico de um 63 medicamento para o tratamento de distúrbios respiratórios num indivíduo.

Num enquadramento, o referido distúrbio é asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, rinite alérgica ou um distúrbio respiratório do trato superior.

Noutro enquadramento, o indivíduo é um ser humano.

Num outro enquadramento, o composto é um antagonista dos receptores de adenosina Αχ. A presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva de um composto com as estruturas gerais VI, VII, VIII, IX ou X para o fabrico de um medicamento para o tratamento de danos dos olhos num indivíduo.

Num enquadramento, o referido dano compreende um dano da retina ou da parte superior do nervo óptico.

Num outro enquadramento, o referido dano é agudo ou crónico.

Num outro enquadramento, em que o referido dado é o resultado de glaucoma, edema, isquémia, hipoxia ou trauma.

Noutro enquadramento, o indivíduo é um ser humano.

Noutro enquadramento, o composto é um antagonista dos receptores de adenosina Αχ. A presente invenção também tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade 64 efectiva sob o ponto de vista terapêutico de um composto com as estruturas gerais VI, VII, VIII, IX ou X e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Noutro enquadramento da composição farmacêutica, a referida quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico, é efectiva para tratar um distúrbio respiratório ou um distúrbio gastrointestinal.

Noutro enquadramento da composição farmacêutica, o referido distúrbio gastrointestinal é diarreia.

Noutro enquadramento da composição farmacêutica, o referido distúrbio respiratório é asma, rinite alérgica ou doença pulmonar obstrutiva crónica.

Noutro enquadramento da composição farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma formulação oftálmica.

Noutro enquadramento da composição farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma formulação para injecção periocular, retrobulbar ou intraocular.

Ainda noutro enquadramento da composição farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma formulação sistémica.

Num outro enquadramento da preparação farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma solução de irrigação cirúrgica. A presente invenção também tem por objecto uma composição farmacêutica embalada, para o tratamento de uma doença associada com o receptor de adenosina Ai num indivíduo, compreendendo: (a) uma embalagem contendo uma 65 quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de um composto especifico de adenosina Ai e (b) instruções para a utilização do referido composto para o tratamento da referida doença num indivíduo.

Tal como se utiliza aqui, "o composto A é selectivo para Αχ", significa que um composto tem uma ligação constante ao receptor de adenosina Αχ, pelo menos 10 vezes superior ao da ligação a adenosina A2a, A2b ou Ã3. A presente invenção também tem por objecto um processo de preparação do composto com a estrutura I, compreendendo as etapas de a) reacção de

para se obter ? em que o símbolo P representa um grupo de protecção eliminável; b) tratamento do produto da etapa da alínea a) em condições de ciclização para se obter

66 c) tratamento do produto da etapa da alínea b) em condições apropriadas para se obter

d) tratamento do produto colorado da etapa da alínea c) com NH2Ri para se obter

em que os símbolos Ri, R3, R5 e R6 têm os significados definidos antes.

Os compostos representados pelas fórmulas gerais VI, VII e VIII, podem ser sintetizados por qualquer um dos esquemas I-VIII. Os compostos representados pelas fórmulas gerais IX e X podem ser preparados pelo esquema IX. A presente invenção é também ilustrada pelos exemplos que se seguem, que não foram feitos com o sentido de serem limitativos. Os conteúdos de todas as referências, os pedidos de patentes de invenção pendentes e os pedidos de patentes de invenção publicadas, citados ao longo do presente pedido de patente de invenção, incluindo os referenciados na secção de antecedentes, são aqui incorporados como referência. Deve entender-se que os modelos utilizados ao longo dos exemplos, são modelos aceites e que a demonstração da eficácia nestes modelos é indicativa da eficácia em seres humanos. 67 A presente invenção será melhor entendida a partir dos detalhes experimentais que se seguem. Contudo, um especialista na matéria compreenderá facilmente que os processos específicos e os resultados discutidos, são meramente ilustrativos da presente invenção, tal como ela está descrita com mais detalhe nas reivindicações que se seguem no fim.

As deazapurinas da presente invenção, podem ser preparadas utilizando processos padrão de síntese orgânica. As deazapurinas podem ser purificadas por CLER de fase reversa, cromatografia, recristalização, etc. e as suas estruturas podem ser confirmadas por análise espectral de massa, análise elementar, IV e/ou espectroscopia do RMN.

Normalmente, as sínteses dos produtos intermédios, assim como, as deazapurinas da presente invenção, são realizadas em solução. A adição e a eliminação de um ou mais grupos de protecção, é também uma prática corrente e é conhecida pelos especialistas na matéria. Os esquemas típicos de síntese para a preparação de produtos intermédios da deazapurina da presente invenção, estão descritos a seguir no esquema I. 68

Esquema I

em que os símbolos R3, Rs e R6 têm os significados definidos antes.

Em geral, um grupo 2-amino-3-ciano-pirrolo protegido, pode ser tratado com um halogeneto de acilo para formar um carboxiamido-S-ciano-pirrolo, que pode ser tratado com metanol ácido para efectuar o fecho do anel, obtendo-se uma pirrolo[2, 3]pirimidino-4-(3H) -ona (Muler, C. E. et al., J. Med. Chem. 40:4396 (1997)). A eliminação do grupo de protecção de pirrolo seguida do tratamento com um reagente de coloração, por exemplo, oxicloreto fosforoso, produziu 4-cloro-7H-pirrolo[2,3d]pirimidinas substituídas ou ínsubs-tituídas. O tratamento da cloropirimidina com aminas originou as 7-deazapurinas.

Por exemplo, tal como se mostra no esquema I, um N- (1-dl-feniletil)-2-amino-3-ciano-pirrolo foi tratado com um halogeneto de acilo, no seio de piridina e de diclorometano. 69 Ο Ν-(l-dl-feniletil)-2-fenilcarboxiamido-3-ciano-pirrolo resultante, foi tratado com uma mistura a 10:1 de metanol/ácido sulfúrico para efectuar o fecho do anel, resultando numa dl-ΊΗ-Ί-(1-feniletil)pirrolo[2,3d]-pirimídino-4(3H) -ona. A eliminação do grupo feniletilo por tratamento da piridina com ácido polifosfórico {APF), seguida de P0C13, originou um produto intermédio chave, a 4-cloro-7H-pirrolo[2,3d]-pirimidina. Um tratamento posterior da 4-cloro-7H-pirrolo[2,3d]pirimidina com várias aminas listadas no quadro I, dá compostos de fórmula geral I. QUADRO 1 R Μ' + H R Μ - H ϊ'Ό Referência 343,2 I N L/ Ref. 351,27 Ref. 343,18 r^crV Ref. 430,35 to Ref. 337,21 cm (Ga Re f. 359,44 Ref. 364,19 Ref. 404,32 RO Ref. 330,18 Ref. 330,45 1 Ref. 347,22 oc Ref. 339,47 t Ref 1 350,28 Ref. 353,41 70 Γ »í T ’^ΤΛΛν ! J ief. 344,19 ---L T- 1 H Ref. 324,45 /-\ /ν/ tC\_/\ Ref. 394,16 Ref. 359,38 CX^ ΝΜ-1 Ref. 371,12 ^0, Ref. 379,40 *>0 0Μ Ref . 359,39 GCth- Ref. 387,41 Η S--Nv ^ Ref. 403,33 çr^ Ref. 344,48 a"1' Ref. 351,49 HO'*""" Rei 337,53 ry^ Ref. 330,37 Ref. 295,2 »» *y\ Ref. 407,23 1 H Rei 321,2 0 I 0-* lef. 355,45 *xx DM Ref. 337,53 ^OuO Ref. 441,33 x> * N Ref. 350,2 /r°X> Ref. 413,24 ,v0 | 343,2 71

Uma abordagem geral para preparar pirrolos substituídos na posição 6, está descrita no esquema que se segue (esquema II) .

Esquema II

72 em que os símbolos R2 até R5 têm os significados definidos antes. A trans-esterificação e a alquilação do cianoacetato de etilo com α-halogenocetona, origina ou éster de cetometilo. A protecção da cetona seguida do tratamento com um cloridrato de amídina (por exemplo, alquilo, arilo ou alquilarilo), produziu a pirimidina protegida por acetal resultante. A eliminação do grupo de protecção seguida da ciclização e do tratamento com oxicloreto fosforoso, originou o cloreto intermédio, que podia ainda ser tratado com uma amina para se obter um pirrolo substituído na posição 6 de amina. Adicionalmente, a alquilação do azoto do pirrolo pode ser conseguida em condições reconhecidas na técnica.

Uma abordagem geral para preparar pirrolos substituídos na posição 5, está descrita no esquema que se segue (esquema III) .

Esquema III

r

OH

H

H 73 em que os símbolos Ri até R6 têm os significados definidos antes e o símbolo R representa um grupo de protecção eliminável. A condensação de malononitrilo e um excesso de uma cetona seguida da bromação do produto originou uma mistura de material inicial, produtos mono-bromados e di-bromados, que foram tratados com uma alquilamina, arilamina ou alquilarilamina. 0 produto de amina resultante foi acilado cora ácido clorídrico e o pirrolo mono-acílado foi ciclizado na presença de ácido, para se obter a pixirai dína correspondente. 0 grupo de protecção do pirrolo foi eliminado com ácido polifosfórico e tratado com oxicloreto fosforoso para produzir um produto colorado. 0 pirrolo colorado pode, subsequentemente, ser tratado com uma amina, para produzir um pirrolo substituído na posição 5 de amino. A alquilação do azoto do pirrolo pode ser conseguido em condições reconhecidas na técnica.

Os esquemas IV e V descrevem processo de acordo com a presente invenção para a preparação das deazapurinas 1 e 2.

1 2 em que os símbolos R5 e Re têm os significados definidos antes, por exemplo, CH3. 74

Preparação Especifica de 6-Metil-pirrolo-pirintidinas: A reacção chave para a obtenção de 6-metil-pirrolo-pirimídinas (1) [R5 = CH3] , foi a ciclização de um cianoacetato com benzamidina para se obter uma pírimidína. Crê-se que o cianoacetato de metilo vai ciclizar mais efieientemente com benzamidina para dar uma pirimidina do que o éster de etilo correspondente. Por isso, a trans-esterificação e a alquilação do cianoacetato de etilo na presença de NaOMe e um excesso de uma parte de a-halogenoacetilo, por exemplo, cloroacetona, originou o éster de metilo desejado (3) com um rendimento de 79 % (esquema IV). 0 cetoéster (3) foi protegido como o acetal (4) com um rendimento de 81 %. Realizou-se um novo processo de ciclização para se obter a pirimidina (5) com um cloridrato de amidina, por exemplo, cloridrato de benzamidina com 2 equivalentes de DBU, para se obter um rendimento de produto isolado de 5 em 54 h Este processo melhora o rendimento em 20 % utilizando as condições publicadas, em que se utiliza NaOMe durante a ciclização com guanidina. A ciclização para se obter pirrolo-pirimidina (6), foi conseguida por via da desprotecção do acetal no seio de HC1 aquoso com um rendimento de 78 %. A reacção de (6) com oxicloreto fosforoso à temperatura de refluxo, originou o derivado de 4-cloro correspondente (7). 0 acoplamento com trans-4-aminociclo~ hexanol, no seio de dimetilssulfóxido a 135 °C, originou (1) em 57 % de (7) . Um especialista na matéria será capaz de escolher os reagentes que permitem uma maior flexibilidade na escolha do substituinte desejado, representado pelo símbolo Rs- 75

Esquema IV

Preparação especifica de 5-metilpirrolo-pirimidinas A condensação de Knoevengel de malononitrilo e um excesso de cetona, por exemplo, acetona à temperatura de refluxo do benzeno, originou (8) com um rendimento de 50 % após a destilação. A bromação de (8) com 2\J-bromo-suecinimida, na presença de peróxido de benzoilo, no seio de clorofórmio, originou uma mistura de material inicial, produtos mono- (9) e di-bromados (5/90/5) após a destilação (70 %). Fez-se reagir a mistura com uma α-metilalquílamina ou com uma a-metilarílamina, por exemplo, α-metilbenzilamina, para se obter o aminopirrolo (10) . Após uma passagem através de uma coluna curta de gel de sílica, a amina parcialmente 76 purificada (rendimento de 31 %), foi acilada com ácido clorídrico, por exemplo, cloreto de benzoílo, para se obter pirrolos mono- (11) e diacilados (12), que foram separados por cromatografía rápida. Ά hidrólise ácida do pirrolo (12) di-substituído, gerou um rendimento combinado de 29 % para o aciipírrolo (11). A ciclização na presença de ácido suifúríco concentrado e de DMF, originou (13) (23 %), que foi desprotegido com ácido polifosfórico, para se obter (14). A reacção de (14) com oxicloreto fosforoso, à temperatura de refluxo, originou o derivado de 4-cloro correspondente (15). 0 acoplamento com trans-4-aminociclo-hexanol, no seio de sulfóxido de dimetilo, a 135 °C, originou (2) [Ηε = CH3] , no seio de 30 % de (14) (ver esquema V) . Um especialista na matéria será capaz de escolher os reagentes que permitam uma maior flexibilidade na escolha do substituinte desejado, representado pelo símbolo Re. 77

Esquema V

Via Sintética Alternativa para os Pirrolos Substituídos em R6, por exemplo, 5-Meti.lpirrolo-pirimidinas

Esta via alternativa para os pirrolos substituídos em Rg, por exemplo, 5-metilpirrolo-pirimidinas, envolve a trans- esterificação e a alquilação de cianoacetato de etilo, para se obter (16) (esquema VI). h condensação de (16) com clorídrato de benzamidina, com 2 equivalentes de DBU, origina 78 a pirimiciina (17). A ciclízação para se obter pirrolo-pirimidina (14), será conseguida por via da desprotecção do acetal no seio de HCl aquoso. A reacção de (4) com o oxicloreto fosforoso, à temperatura de refluxo, originou o derivado de 4-cloro correspondente (15). 0 acoplamento com trans-4-aminociclo-hexanol, no seio de sulfóxido de dimetilo, a 135 °C, originou (2). Este processo reduz o número de reacções de síntese para se obter o composto alvo (2) de 9 para 4 etapas. Além disso, o rendimento é imensamente aumentado. Novamente, um especialista na matéria será capaz de escolher os reagentes que permitam uma maior flexibilidade na escolha do substítuinte desejado, representado pelo símbolo R6. 79

Esquema VI

Abordagem geral para preparar o pirrolo de des-metilo, descrita no esquema que se segue (esquema VII).

80

Esquema VII

em que os símbolos Ri a R3 têm os significados definidos antes. A alquilação de um cianoacetato de alquilo com um acetal de dietilo, na presença de uma base, originou um acetal de ciano e dietilo, que foi tratado com um sal de amidina para produzir um precursor de pirrolo-pirimidina de metilo. Colorou-se o percursor e tratou-se com uma amina para formar a pirrolo-pirimidina de des-metilo que se pretendia, tal como se mostrou antes.

Por exemplo, o esquema VIII descreve a síntese do composto (18). 81

Alquilou-se o cianoacetato de metilo, disponível comercialmente, com acetal de dietilo e bromoacetaldeído, na presença de um carbonato de potássio e de Nal, para se obter (19) . A ciclízação para a pirimidina (20) foi conseguida em duas etapas. Inicialmente, a pirimidina-acetal foi formada por via da reacção de (19), com cloridrato de benzamidina com 2 equivalentes de DBU. A pirimidina-acetal resultante, foi desprotegida sem purificação com HC1 aquoso 1 N e o aldeído resultante foi ciclizado para se obter pirrolo-pirimidína (20) , que se isolou por filtração. A reacção de (20) com oxicloreto fosforoso, à temperatura de refluxo, originou o 82 derivado de 4-cloro correspondente (21). 0 acoplamento do derivado de cloro com trans-4-aminociclo-hexanoi, no seio de DMSO, a 135 °C, originou o composto (18) a partir do composto (21) .

Os esquemas II-VIII demonstram que é possível funcionalizar as posições 5 e 6 do anel de pirrolo- pirimidina. Por meio da utilização de diferentes reagentes iniciais e de ligeiras modificações dos esquemas de reacção anteriores, podem introduzir-se vários grupos funcionais nas posições 5 e 6 na fórmula geral (I) . 0 quadro II ilustra alguns exemplos.

Quadro 2. Lista seleccionada de pirrolo-pírimidinas substituídas nas posições 5 e 6.

Reagente Inicial Rs Re X H H Ar substituído XX H CH2C (0) och3 a C(0)och3 ch3 9 0 1 1 C(0)NHCH3 ch3 χχ i a (Jm especialista na matéria saberá que o metabolismo dos compostos aqui descritos num indivíduo, produz alguns metabolitos activos sob o ponto de vista biológico, que podem servir como fármacos. A presente invenção é melhor ilustrada pelos exemplos que se seguem, que de nenhuma forma foram construídos como sendo limitativos. Deve entender-se que os modelos utilizados 83 através dos exemplos, são modelos aceites e que a demonstração da eficácia nestes modelos faz prever a sua eficácia em seres humanos.

Exemplificação

Preparação 1:

Utilizou-se uma modificação do processo de alquilação de Seela e Liipke1. A uma solução arrefecida com gelo (0 °C) de cianoacetato de etilo (6,58 g, 58,1 mmole) , no seio de MeOH (20 mL), adicionou-se, lentamente, uma solução de NaOMe (25 % p/v; 58,1 mmole). Passados 10 minutos, adicionou-se, lentamente, cloroacetona (5 mL; 62,8 mmole). Passadas 4 horas, eliminou-se o dissolvente. Diluiu-se o óleo castanho com EtOAc (100 mL) e lavou-se com H2O (100 mL) . Secou-se a fracção orgânica, filtrou-se e concentrou-se até se obter um óleo castanho (7,79 g; 79 %). 0 óleo (3) (esquema IV) era uma mistura de produtos de éster de metilo/etilo (9/1) e foi utilizado sem mais purificação. RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 4,24 (q, J = 7,2 Hz, OCH2) , 3,91 (dd, 1H, J = 7,2, 7,0 Hz, CH), 3,62 (s, 3H, OCH3) , 3,42 (dd, 1H, J = 15,0, 7,1 Hz, 1 x CH2) ; 3,02 (dd, 1H, J = 15,0, 7,0 Hz, 1 x CH2) ; 2,44 (s, 3H, CH3), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, éster-CH3) . “Seela, F.; Liipke, U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462-1469. Preparação 2;

Utilizou-se o processo de Seela e Liipke1. Assim, a desprotecção da cetona (3) (esquema IV; 5,0 g, 32,2 mmole) cora etileno-glicol (4 mL, 64,4 mmole), na presença de TsOH (100 mg), originou (4) sob a forma de um óleo (esquema IV; 5,2 g, 81,0) após cromatografia rápida (Si02; 3/7 EtOAc/Hex, 84

Rf 0,35). Continha ainda ~5 % de éster de etilo: RMN do 3H (200 MHz, CDCI3) δ 4,24 (q , J = 7,2 Hz, OCH2), 3,98 (s, 4H, 2 x acetal-CH2) , 3,7 9 (s, 3H , OCH3) , 3,62 (dd, 1H, J = 7,2 , 7,0 Hz, CH), 2,48 (dd, 1H, J = = 15,0, 7,1 Hz , 1 x CH,) , 2,32 (dd, 1H, J = 15,0, 7,0 Hz, 1 X CH2); 1,35 (s, 3H, CH3), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, éster-CH3) ; EM (ES) : 200, 1 (M~+l). 1Seela, F. ; Líipke, U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462-1469. Preparação 3:

Aqueceu-se até 85 °C, durante 15 horas, uma solução do acetal (4) (esquema IV, 1 g, 5,02 mmole) , benzamidina (786 mg, 5,02 mmole) e DBU (1,5 mL, 10,04 mmole), no seio de DMF anidro (15 mL) . Diluiu-se a mistura com CHC13 (30 mL) e lavou-se com NaOH 0,5 N (10 mL) e H20 (20 mL) . Secou-se a fracção orgânica, filtrou-se e concentrou-se até se obter um óleo castanho. Tentou-se uma cromatografia rápida (Si02; 1/9 EtOAc/CH2Cl2, Rf 0,35), mas o material cristalizou na coluna. Lavou-se o gel de sílica com MeOH. Concentraram-se as fracçoes contendo o produto (5) (esquema IV) e utilizou-se sem mais purificação (783 mg, 54,3 %) : RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 8,24 (m, 2H, Ar-H) , 7,45 (m, 3H, Ar-H) , 5,24 (s largo, 2H, NH2) , 3,98 (s, 4H, 2 x acetal-CH2), 3,60-3,15 (m, 2H, CH2), 1,38 (s, 3H, CH3) ; EM (ES) : 288, 1 (M"+l) .

Preparação do composto (20) (esquema VIII): Aqueceu-se a 85 °C, durante 15 horas, uma solução do acetal (19) (4,43 g, 20,6 mmole)3, cloridrato de benzamina (3,22 g, 20,6 mmole) e DBU (6,15 mL, 41,2 irmole) , no seio de DMF anidro (20 mL) . Diluíu-se a mistura com 100 rnL de CHC13 e lavou-se com H20 (2 x 50 mL). Secou-se a fracção orgânica, filtrou-se e concentrou-se até se obter um óleo castanho-escuro. Agitou-se o óleo castanho-escuro no seio de HC1 1 N (100 mL) , 85 durante 2 horas, à temperatura ambiente. A pasta resultante foi filtrada, obtendo-se o sal de HCi de (20), sob a forma de um sólido escuro (3,60 g, 70,6 %); RMN do 1H (200 MHz, DMSO-d6) δ 11,92 (s, 1H) , 8,05 (m, 2H, Ar-H) , 7,45 (m, 3H, Ar-H) , 7,05 (s, 1H, pirrolo-H); EM (ES): 212,1 (M"+l).

Preparação 4:

Agitou-se uma solução do acetal (5) (700 mg, 2,44 mmole) , no seio de HCI 1 N (40 mL) , durante 2 horas, à TA. Filtrou-se a pasta resultante, originando o sal de HCI de 2-fenil-6-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-(3H)-ona, sob a forma de um sólido escuro (498 mg, 78,0 %) : RMN do 1H (200 MHz, DMSO-d6) δ 11,78 (s, 1H) , 8,05 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m,

3H, Ar-H), 6,17 (s, 1H, pirrolo-H), 2,25 (s, 3H, CH3) ; EM (ES): 226,1 (M"+l).

Preparação 5:

Utilizou-se uma modificação do processo de ciclização de Chen et ai.1. A uma solução arrefecida com gelo (0 °C) de uma solução do brometo (9), (esquema V; 20,0 g, 108 mmole; 90 % puro), no seio de álcool de isopropilo (60 mL) , adicionou-se lentamente uma solução de a-metilbenzilamina (12,5 mL, 97,3 mmole). Deixou-se a solução preta aquecer até à TA e agitou-se durante 15 horas. Diluiu-se a mistura com EtOAc (200 mL) e lavou-se com NaOH 0,5 N (50 mL) . Secou-se a fracção orgânica e secou-se, filtrou-se e concentrou-se, até se obter um tar preto (19,2 g; 94 %). O resíduo foi parcialmente purificado por cromatografia rápida (Si02; 4/96 MeOH/CH2Cl2, Rf- 0,35) até se obter um sólido preto (6,38 g, 31 %), como um composto de dl-1-(1-feniletil)-2-amino-3-ciano-4-metilpirrolo: EM (ES): 226,1 (M~+l). 86 ^hen, Y. L.; Mansbach, R. S.; Winter, S. M.; Brooks, E.; Collins, J. ; Corman, M. L. ; Dunaiskis, A. R.; Faraci, W. S.; Gallaschun, R. J. ; Schmidt, A.; Schulz, D. W. J. Med. Chem. 1997, 40, 1749-1754.

Preparação 6: A uma solução de dj-1-(1-feniletil)-2-amino-3-ciano-4,5-dímetilpirrolo1 (14,9 g, 62,5 mmole) e piridina (10,0 mL) , no seio de diclorometano (50,0 mL), adicionou-se cloreto de benzoílo (9,37 g, 66,7 mmole), a 0 °C. Depois de se agitar a 0 °C, durante 1 hora, adicionou-se hexano (10,0 mL), para ajudar à precipitação do produto. Eliminou-se o dissolvente in vacuo e o sólido recristalizou no seio de Et0H/H20, para se obter 13,9 g (65 %) de dl-l-(l-feniletil)-2- fenilcarbonilamino-3-ciano-4,5-dimetilpirrolo. pf 218-221 °C; RMN do (200 MHz, , CDCI3) δ 1,72 (s, 3H) , 1,76 (d, J = 7,3 Hz, 3H) , i ,98 (s, 3H), 5,52 (q, J - 7,3 Hz, 1H) LO ο ι i—í r- (m, 9H) , 7 ,68-7,72 (dd, J = 1,4 Hz, 6,9 Hz, 2H) , 10,73 (s, 1H) ; EM (ES): 344,4 (M~+l) . 1Liebigs Ann. Chem. 1986, 1485-1505.

Os compostos que se seguem foram obtidos de uma forma semelhante.

Preparação 6Ά: dl-1- (1-feniletil)-2-(3-piridil)carbonilamíno-3-ciano-4,5- dimetilpirrolo. RMN do JH (200 MHz, CDC13) δ 1,83 (d, J - 6,8 Hz, 3H) , 2,02 (s, 3H) , 2,12 (s, 3H) , 5,50 (q, J = 6, 8 Hz, 1H), 7,14-7,42 (m, 5H) , 8,08 ( (m, 2H) , 8,75 (m, 3H) ; EM (ES) : 345,2 (M~+l) . 87 dl-1-(1-feniletil)-2-(2-furil)carbonilamino-3-ciano-4,5-

),49 (q, J H), 7,12-7,47 (d, J = 7,4 = 7,4 Hz, (m, 7 H) , ; EM dimetílpirrolo. RMN do 1ti (200 MHz, CDCi3) δ

Hz, 3H) , 1, 92 (s, 3H), 2, 09 (s, 3H), 1H) , 6, 54 (dd, J = 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H) (ES) : 334, ,2 (M* + 1) , 230,1. dl-1-(1-feniletil)-2-(3-furil)carbonilamino-3-ciano-4 , 5-dimetilpirrolo. RMN do (200 MHz, CDC13) δ 1,80 (d, J= 7 Hz 3H), 1,89 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 5,48 (q, J= 7 Hz, 1H), 6,59 (s, 1H) , 7,12-7,40 (m, 6H) , 7,93 (s, 1H) ; EM (ES) : 334,1 (1Γ+1), 230,0. dl-1- (1-feniletil)-2-ciclopentilcarbonilamino-3-ciano-4,5-dimetílpirrolo. RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 1,82 (d, J = 7,4

Hz, 3H) , co co %—1 (s, 3H 5, 2,05 (s, 3H), 1 ,63-1,85 (m, 8H) , 2,63 (m, 1H) , 5,43 (q/ J= 7,4 Hz, 1H), 6,52 (s, 1H), 7,05-7,20 (m, 5H) , : EM (ES) : 336, .3 (M“+l). dl-1-(1-feniletil)-2-{2-tieil)carbonilamino-3-ciano-4,5-dimetilpírrolo, RMN do 1H (200 MHz, CDCI3) δ 1,82 (d, J = 6,8

Hz, 3H) , 1,96 (s, 3H) , 2,09 (s, 3H) , 5,49 (q, J = 6,8 Hz, 1H), 7,05-7,55 (m, 8H); EM (ES): 350,1 (M"+l), 246,0. dl-1-(1-feniletil)-2-(3-tienil)carbonilamino-3-ciano-4,5-dimetilpirrolo. RMN do XH (200 MHz, CDCI3) δ 1,83 (d, J = 7,0

Hz, 1H), 6,90 (m, 1H) , 7,18-7,36 (m, 6H) , 7,79 (m, 1H) ; EM (ES) 350,2 (M~+l), 246,1. dl-1-(1-feniletil)-2-(4-fluorofenil)carbonilamino-3-ciano- 4,5-dimetilpirrolo. RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 1,83 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 1,96 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 5,51 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 7,16-7,55 (m, 9H); EM (ES): 362,2 (M~+l), 258,1. 88 dl-1-(1-feniletil)-2-(3-fluorofenil)carbonilamino-3-ciano-4,5-dímetiipirrolo. RMN do ΧΗ (200 MHz, CDC13) δ 1,83 (d, J = 7,4 Hz, 3H) , 1, 97 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 5, 50 (q, J = 7,4 Hz, 1H) , Ί ' f 05-7, . 38 (m, r 7 H) , 7,67-7,74 (m, 2H) ; EM (ES) . O . -J 62,2 (M~+ 1), 258. 1. 1—) 1 T5 -d -feni let il) -2- (2-fl'i uorofenil)carbonilamino-3-ci ano - 4,5- dimetilp irrolo . RMN do XH (200 MHz, CDCI3) δ 1,85 (d, J = 7,2 Hz, 3H) , 1, 94 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 5,50 íq, J = 7,2 Hz, 1H) , 7, 12-7, 35 (m, 6H), 7, 53 (m, 1H), 7 ,77 (m, , 1H), 8 ,13 (m, 1H) ; EM (ES) : 3 62, 2 (M'+l), 258,0. dl-1-(1-feniletil)-2-isopropilcarbonilamino-3-ciano-4,5-dimetilpirrolo. RMN do (200 MHz, CDC13) δ 1,19 (d, J = 7,0 Hz, 6H) , 1,82 (d, J = 7,2 Hz, 3H) , 1,88 (s, 3H) , 2,06 (s, 3H) , 2,46 (m, 1H) , 5,39 (m, J = 7,2 Hz, 1H) , 6,64 (s, 1H) , 7,11-7,36 (m, 5H); EM (ES): 310,2 (M"+l), 206,1.

No caso da acilação de dl-1-(1-feniletil)-2-amino-3-ciano-4-metilpirrolo, obteve-se dl-1-(1-feniletil)-2- benzoilairtino-3-cíano-4-díinetilpirrolo monoacilado e c/J-l-(l-feniletil)-2-dibenzoilamino-3-ciano-4-metilpirrolo com pir-rolo diacilado. Pirrolo monoacilado: RMN do 1H (200 MHz,

CDC13) δ 7,69 (d, 2H, J = 7,8 Hz, Ar-H) , 7,58-7,12 (m, 8H, Ar-H), 6,18 (s, 1H, pirrolo-H), 5,52 (q, 1H, J = 7,2 Hz, CH-CH3), 2,05 (s, 3H, pirrolo-CH3) , 1,85 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH3); EM (ES): 330,2 (M"+l); Pirrolo diacilado: RMN do ΧΗ (200 MHz, CDCI3) δ 7,85 (d, 2H, J = 7,7 Hz, Ar-H), 7,74 (d, 2H, J = 7,8 Hz, Ar-H), 7,52-7,20 (m, 9H, Ar-H), 7,04 (m, 2H, Ar-H), 6,21 (s, 1H, pirrolo-H), 5,52 (q, 1H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) , 1,77 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) , 1,74 (s, 3H, pírrolo-CH3) ; EM (ES): 434,1 (M~+l). 89

Preparação 7: A uma solução de dl-1-(1-feniletil)-2-fenilcarboxiamido-3-ciano-4,5-dimetílpirrolo (1,0 g, 2,92 mmole), no seio de metanol (10,0 raL) , adícíonou-se ácido sulfúrico concentrado (1,0 mi) , a 0 °C. Fez-se o refluxo da mistura resultante durante 15 horas e arrefeceu-se para a temperatura ambiente. Filtrou-se o precipitado, para se obter 0,48 g (48 %) de dl-5,6-dimetil-2-f enil-7fí-7-(l-feniletil)pirrolo[2,3d]pirimidin- 4 (3 ff) -ona. RMN do 1H (200 MHz , CDCI3) δ 2,02 (d, J = = 7, 4 Hz 3H) , 2,04 (s, 3H) , r 2, 41 ( s, 3H), 6,25 (q, J = 7,4 Hz, 1H) 7,22- 7,50 (m, 9H) , 8, 07-8 ,12 (dd, J = 3,4 Hz, 6,8 Hz, 2H) 10,51 (s, 1H) ; EM (ES) ' : 34 4,2 (M"+l)·

Os compostos que se seguem foram obtidos de uma forma semelhante ao da preparação 7: dl-5,6-dimetil-2-(3-piridil)-ΊΗ-Ί-(1-feniletil)pirrolo[2,3d]-pirimidin-4 (3 ff) -ona. RMN do XH (200 MHz, CDC13) δ 2,03 (d, J = 7,2 Hz, 3H) , 2,08 (s, 3H) , 2,42 (s, 3H) , (q, J = 7,2 Hz, 1H), 7,09-7,42 (m, 5H), 8,48 (m, 2H), (m, 3H); EM (ES): 345,1 (M‘+l).

dl-5,6-dimetil-2-(2-furil)-ΊΗ-Ί-(l-feniletil)pirrolo[2,3d] -pirimidin-4 (3ff) -ona. RMN do ΧΗ (200 MHz, CDC13) δ 1,98 (d, J = 7,8 Hz, 3H) , 1,99 (s, 3H) , 2,37 (s, 3H) , 6,12 (q, J = 7,8

Hz, 1H) , 6,48 (dd, J = 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H) , 7,17-7,55 (m, 7H) , 9,6 (s, 1H); EM (ES): 334,2 (M'+l).

dl-5,6-dimetí1-2-(3-furil)-7ff-7-(1-feniletil)pirrolo[2,3 d] — pirímidin-4 {3H)~ona. RMN do 1H (200 MHz, CDCls) δ 1,99 (d, J = 7 Hz, 3H), 2,02 (s, 3H) , 2,42 (s, 3H) , 6,24 (q, J = 7 Hz, 1H), 7,09 (s, 1H), 7,18-7,32 (m, 5H), 7,48 (3, 1H), 8,51 (s, 1H); EM (ES): 334,2 (M"+l). 90 dl-5,6-dimet il-2-ciclopentil-7jy-7 -(l-feniletil)pirrolo[2,3dj- pirimidin- -4 (3H) -ona . RMN do XH (200 MHz, CDCI3) δ 1, 95 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 2,00 (s, 3H), 2,33 (s , 3H) , 1,68- -1,88 (m, 8H), 2,97 (m, 1H) , 6,10 (q, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,16- 7, 30 (m, 5H) , 9,29 (s, 1H) ; EM (ES) : 336,3 (M"+l).

dl-5,6-dimetil-2-(2-tienil)-ΊΗ-1-(1-feniletil)pirrolo[2,3d]-pirimidin-4 (3H) -ona. RMN do (200 MHz, CDC13) δ 2,02 (d, J = 7,2 Hz, 3H) , 2,06 (s, 3H) , 2,41 (s, 3H) , 6,13 (q, J = 7,2

Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 4,8, 2,8 Hz, 1H), 7,26-7,32 (m, 5H) , 7,44 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 2,8 Hz, 1H) 11,25 (s, 1H); EM (ES): 350,2 (M~+l). dl-5,6-dimetil-2-(3-tienil)-ΊΗ-1-(1-feniletil)pirrolo[2,3d]-pirimidin-4(3tf) -ona. RMN do 1H (200 MHz, CDCI3) δ 2,00 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 6,24 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 7,24-7,33 (m, 5H) , 7,33-7,39 (m, 1H), 7,85 (m, 1H) , 8,47 (m, 1H), 12,01 (s, 1H); EM (ES): 350,2 (M"+l). dl-5,6-dimetil-2-(4-fluorofenil)-ΊΗ-Ί-(1-feniletil)pirrolo-[2,3d] pirimidin-4 (3ff) -ona. RMN do ΧΗ (200 MHz, CDCI3) δ 2,01 (d, J = 6,8 Hz, 3H) , 2,05 (s, 3H), 2,42 (s, 3H) , 6,26 (q, J = 6,8 Hz, 1H), 7,12-7,36 (m, 7H) , 8,23-8,30 (ία, 2H) , 11,82 (s, 1H); EM (ES): 362,3 (M"+l). dl-5, 6-dimetil-2-(3-fluorofenil)-ΊΗ-Ί-(1-feniletil)pirrolo-[2,3d] pirimidin-4 (3H)-ona. RMN do ΧΗ (200 MHz, CDC13) δ 2,02 (d, J = 7,4 Hz, 3H) , 2,06 (s, 3H), 2,44 (s, 3H) , 6,29 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 7,13-7,51 (m, 7H) , 8,00-8,04 (m, 2H), 11,72 (s, 1H); EM (ES): 362,2 (M“+l). dl-5,6-dimetil-2-(2-fluorofenil)-1Η-Ί-(1-feniletil)pirrolo-[2,3d] pirimidin-4 (3H) -ona. RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 2,00 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 6,24 (q, J = 91 7,2 Hz, 1H) , 7,18-7,45 (m, 8H), 8,21 (m, 1H), 9,54 (s, 1H) ; EM (ES): 362,2 (M'+l).

dl-5,6~dimetil-2-isopropil-7fl-7-(1-feniletil)pirrolo[2,3d]-pirimidin-4(3H)-ona. RMN do XH (200 MHz, CDC13) δ 1,30 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,32 (d, J = 7,0 HZ, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 2,90 (m, 1H), 6,13 (m, 1H), 7,17-7,34 (m, 5H), 10,16 (s, 1H); EM (ES): 310,2 (M‘+l).

Preparação 8:

Agitou-se a 130 °C, durante 48 horas, uma solução de dl-1-(1-feniletil)-2-benzoilamino-3-ciano-4-dimetilpirrolo (785 mg, 2,38 mmole) com H2S04 concentrado (1 mL) , no seio de DMF (13 mL) . Diluiu-se a solução preta com CHCI3 (100 mL) e lavou-se com NaOH 1 N (30 mL) e salmoura (30 mL) . Secou-se a fracção orgânica, filtrou-se, concentrou-se e purificou-se por cromatografia rápida (Si02; 8/2 EtOAc/Hex, Rf 0,35), para se obter um sólido castanho (184 mg, 24 %) , como dl-5- metil-2-feni 1-727-7-(1-feniletil)pirrolo[2, 3d]pirimidin-4(3H)- ona. RMN do XH (200 MHz, CDC13) δ 8, 18 (m, 2H, Ar-H) , 7,62- 7,44 (m, 3H, Ar-H), 7,40-7,18 I [m, 5H, Ar-H), 6,48 (s, 1H, pirrolo-H ), 6,28 (q, 1H, J = 7, 2 Hz, CH-CH3) , 2,18 (s, 3H, pirrolo-CH3) , 2,07 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) ; EM (ES) : 330,2 (M++l) .

Preparação 9:

Fez-se o refluxo, durante 5 horas, de uma mistura de dl-1- (1-feniletil)-2-amino-3-ciano-4,5-dimetilpirrolo (9,60 g, 40,0 mmole) e de ácido fórmico (50,0 mL, 98 %)· Depois de se arrefecer para a temperatura ambiente e de se raspar as partes laterais do frasco, formou-se um grande precipitado, que se filtrou. Lavou-se o material com água até as águas de 92 lavagem mostrarem um pH neutro, para se obter dl-5,6 -dimetil- 7H-7-(1-feniletil}pi rrolo[2,3d]pi rimi din-4 ( 3H) -ona . RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ : 1,96 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 2,00 (s, 3H) , 2,38 (s, 3H) , 6,21 (q, j = 7,4 Hz, 1H), 7,11-7,35 (m, 5H) , 7,81 (s, 1H), 11,71 (s, 1H); EM (ES): 268,2 (M++l) .

Preparação 10:

Fez-se uma suspensão de dl-5,6-dimetil-2-fenil-7H-7~(l-f eniletil) pirrolo [2, 3d] pirimidin-4 ( 3Jí)-ona (1,0 g, 2,91 mmole), no seio de ácido polifosfórico (30,0 mL) . Aqueceu-se a mistura a 100 °C, durante 4 horas. Verteu-se a suspensão quente sobre água gelada, agitou-se vigorosamente para dispersar a suspensão e tornou-se básico com um pH 6 com KOH. Filtrou-se o sólido resultante e recolheu-se, para se obter 0,49 g (69 %) de 5,6-dimetil~2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]- pirimidin-4 (3tf) -ona. RMN do (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,17 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 7,45 (largo, 3H), 8,07 (largo, 2H), 11,49 (s, 1H), 11,82 (S, 1H); EM (ES): 344,2 (M~+l).

Os compostos que se seguem obtiveram-se de uma forma semelhante aos da preparação 10: 5-metíl-2-fenil-7if-pirrolo [2,3d] pirimidin-4 (3H) -ona . EM (ES): 226,0 (M'+l). 5,6-dimetil-2- (3-piridil)-7fí-pirrolo[2,3d]pirimidin-4(3H) -ona. EM (ES): 241,1 (M“+l). 5,õ-dimetil-2-(2-furil)-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4(3H) -ona. RMN do 1R (200 MHz, DMS0-d6) δ 2,13 (s, 3H) , 2,18 (s, 3H) , 6,39 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, 1H) , 6,65 (dd, J = 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H), 7,85 (dd, J = 1,6, 3,6 Hz, 1H, ) , 11,45 (s, 1H) , 11,60 (s, 1H); EM (ES): 230,1 (M"+l). 93 5,6-dimetΪ1-2-(3-furil)-777-pirrolo[2,3d]pirimidin-4(371} -ona. RMN do XH (200 MHz, DMSO-dg) δ 2,14 (s, 3H) , 2,19 (s, 3H), 6,66 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 11,3 (s, 1H), 11,4 (s, 1H); EM (ES): 230,1 (M"+l). 5, 6-dimet í 1-2-ciclopentil-777-pirrolo [2, 3d] pirimidin-4 (377) - ona. RMN do XH (200 MHz, DMSO-d6) δ 1,57-1,91 (m, 8 H), 2,12 (s, 35 3H), 2,16 (s, 3H) , 2,99 (m, 1H) , 11,24 (s, 1H), 11,38 (s, 1H); EM (ES) : 2 32,2 (M” +1) . 5.6- dimetil-2- (2-tienil) -777-pirrolo [2,3d] pirim.idin-4 ( 377) -ona. RMN do XH (200 MHz, DMSO-dg) δ 2,14 (s, 3H) , 2,19 (s, 3H) , 7,14 (dd, J = 3,0, 5,2 Hz, 1H) , 7,70 (d, J = 5,2 Hz, 1H) , 8,10 (d, J=3,0 Hz, 1H), 11,50 (s, 1H); EM (ES): 246,1 (M”+l). 5.6- dimet il-2- (3-tienil) -777-pirrolo [2, 3d] pirimidin-4 (377) -ona. RMN do XH (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,17 (s, 3H) , 2,21 (s, 3H) , 7,66 (m, 1H) , 7,75 (m, 1H) , 8,43 (m, 1H) , 11,47 (s, 1H) , 11,69 (s, 1H) ; EM (ES): 246, 1 (M~+l). 5.6- dimeti 1-2- (4-f luorof enil) -777-pirrolo [2,3d] pirimidin- 4 (377)-ona. RMN do XH (200 MHz, DMS0-d6) δ 2,17 (s, 3H) , 2,21 (s, 3H), 7,31 (m, 2H), 8,12 (m, 2H) , 11,47 (s, 1H); EM (ES): 258,2 (M-+l) . 5.6- dimetil-2- (3 —f luorof enil) -777-pirrolo [2,3 d] pirimiain- 4 (377)-ona. RMN do 1H (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,18 (s, 3H) , 2-21 (s, 3H), 7,33 (m, 1H), 7,52 (m, 1H) , 7,85-7, 95 (m, 2H) , 11,56 (s, 1H), 11,80 (s, 1H); EM (ES): 258,1 (M++l). 5.6- dimetil-2- (2—fluorofenil) -777-pirrolo [2,3d]pirimidin- 4 (377)-ona. RMN do (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,18 (s, 3H) , 2,22 (s, 3H), 7,27-7,37 (m, 2H), 7,53 (m, 1H), 7,68 (m, 1H), 11,54 (s, 1H), 11,78 (s, 1H); EM (ES): 258,1 (M++l). 94 5, 6-dimetil-2-isopropil-7i7-pirrolo [2, 3d]pirixnidin-4 (3H) -ona. RMN ao XH (200 MHz, DMSO-de) δ 1,17 (d, J = 6,6 Hz, 6H) 2,12, (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,81 (m, 1H), 11,20 (s, 1H) 11,39 (s, 1H); EM (ES) >: 206,1 (M++l).

5.6- dimetil-7H-pirrolo[2, 3d] pirimidin-4 ( 3ff) -ona . RMN do '•H (200 MHz, DMSO-d6) õ 2,13 (s, 3H) , 2,17 (s, 3H) , 7,65 (s, 1H); EM (ES): 164,0 (M"+l).

Preparação 11:

Fez-se o refluxo, durante 6 horas, de uma solução de 5.6- dimetil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4(3H) -ona (1,0 g, 4,2 mmole) , no seio de oxicloreto fosforoso (25,0 mL) e depois concentrou-se in vacuo até à secagem. Adicionou-se água ao resíduo para induzir a cristalização e filtrou-se o sólido resultante e recolheu-se, para se obter 0,90 g (83 %) de 4-cloro-5, 6-dimetil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidina. RMN do ΧΗ (200 MHz, DMS0-d6) δ 2,33 (s, 3H) , 2,33 (s, 3H) , 7,46-7,49 (m, 3H), 8,30-8,35 (m, 2H), 12,20 (s, 1H); EM (ES): 258,1 (M"+l) .

Os compostos que se seguem obtiveram-se de uma forma semelhante aos da preparação 11: 4-cloro-5-metil-2-fenil-7if-pirrolo [2,3d] pirimidina . EM (ES) : 244,0 (M++l) . 4-cloro-6-metil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidina. EM (ES) : 24 4,0 (M++l) . 4-cloro-2-fenil-7 H-pirrolo[2,3d]pirimidina. RMN do MHz, DMSO-dg) 8,35 (2, 2H), 7,63 (s largo, 1H), 7,45 6,47 (s largo, 1H) ; EM (ES) : 230,0 (M++l). XH (200 (m, 3H) , 95 4-cloro-5, 6-dimetil-2- (3-piridil) -7Jí-pírrolo [2,3d] pirímidina . EM (ES) : 2 5 9,0 (M++l). 4-cloro-5, 6-dimetil-2- (2-furil) -7if-pírrolo [2,3d] pirímidina. RMN do 1H (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,35 (s, 3H) , 2,35 (s, 3H) , 6,68 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, 1H) , 7,34 (dd, J = 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H) , 7,89 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, 1H) ; EM (ES) : 248,0 (M++l). 4-cloro-5, 6-dimetil-2- (3-furil) -7íí-pirrolo [2,3d] pirímidina. RMN do XH (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,31 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H) ,

6,62 (s, 1H), 7,78 (s, 1H) , 8,18 (s, 1H) , 12,02 (s, 1H) ; EM (ES) : 248,1 (M++l) . 4-cloro-5, 6-dimetíl-2-ciclopentil-7ií-pirrolo [2,3d] pirímidina . RMN do XH (200 MHz, DMSO-de) δ 1,61-1,96 (m, 8H) , 2,27 (s, 3H) , 2,27 (s, 3H), 3,22 (m, 1H) , 11,97 (s, 1H) ; EM (ES): 250,1 (M'+l). 4-cloro-5,6-dimetil-2-(2-tienil)-7H-pirrolo[2, 3d]pirímidina. RMN do aH (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,29 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H) , 7,14 (dd, J = 3,1 Hz, 4,0 Hz, 1H) , 7,33 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 3,1 Hz, 1H) , 12,19 (s, 1H) ; EM (ES): 264,1 (M~ + 1) · 4-cloro-5,6-dimetil-2-(3-tienil)-7H-pirroio[2, 3d]pirímidina. RMN do 2H (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,32 (s, 3H) , 2,32 (s, 3H) , 7,62 (dd, J = 3,0, 5,2 Hz, 1H) , 7,75 (d, J = 5,2 Hz, 1H) , 8,20 (d, J = 3,0 Hz, 1H); EM (ES): 264,0 (M++l). 4-cloro-5,6-dimetil-2-(4-fluorofení1)-7H~pirrolo[2,3d]pírími-dina. RMN do XH (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,33 (s, 3H) , 2, 33 (s, 3H) , 7,30 (m, 2H) , 8,34 (m, 2H) , 12,11 (s, 1H) ; EM (ES): 276,1 (M~+l). 96 4-cloro-5, 6-dimetil-2- (3-f luorofenil) -7ff-pirrolo [2,3d] pirirai-dina. RMN do XH (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,31 (s, 3H) , 2,33 (s, 3H), 7,29 (m, 1H), 7,52 (m, 1H), 7,96 (m, 1H), 8,14 (m, 1H), 11,57 (s, 1H); EM (ES): 276,1 (M"+l). 4-cloro-5, 6-dimetil-2- (2-f luorof enil) -7H-pirrolo [2,3d]pirimi-dina. RMN do (200 MHz, DMSO-d6) δ 2,34 (s, 3H) , 2,34 (s, 3H), 7,33 (m, 2H), 7,44 (m, 1H), 7,99 (m, 1H), 12,23 (s, 1H); EM (ES): 276,1 (M++l). 4-cloro-5, 6-dimetil-2-isopropil-7íí-pirrolo [2,3d] pirimidina. RMN do ΧΗ (200 MHz, DMSO-d6) δ 1,24 (d, J = 6,6 Hz, 6H), 2,28 (s, 3H) , 2,28 (s, 3H) , 3,08 (q, J = 6,6 Hz, 1H) , 11,95 (s, 1H); EM (ES): 224,0 (M'+l). 4-cloro-5, 6-dimetil-7íí-pirrolo [2,3d] pirimidina. RMN do XH (200 MHz, DMSO-dg) δ 2,31 (s, 3H) , 2,32 (s, 3H) , 8,40 (s, 1H); EM (ES): 182,0 (M“+l). dl-4-cloro-5,6-dimetil-2-fenil-7H-7-(1-feniletil)pirrolo- [2,3d]pirimidina.

Preparação 12: A uma solução de di-1,2-diaminopropano (1,48 g, 20,0 mmole) e carbonato de sódio (2,73 g, 22,0 mmole), no seio de dioxano (100,0 mL) e água (100,0 mL), adicionou-se di-terc-dicarbonato (4,80 g, 22,0 mmole), à temperatura ambiente. Agitou-se a mistura resultante durante 14 horas. Eliminou-se o dioxano in vacuo. Filtrou-se o precipitado e concentrou-se o filtrado in vacuo até à secagem. Triturou-se o resíduo no seio EtOAc e depois filtrou-se. Concentrou-se o filtrado in vacuo até à secagem, para se obter uma mistura de dl-1-amino-2- (1,1-dímetiietoxi)carbonilamino-propano e dl-2-amino-1- 97 (1,1-dimetiletoxi)carbonilamino-propano, que não se puderam separar por um processo normal de cromatografia. Utilizou-se a mistura para a reacção no exemplo 8.

Preparação 13: A uma solução de Fmoc-p-Ala-OH (1,0 g, 3,212 mmole) e cloreto de oxalilo (0,428 g, 0,29 mL, 3,373 mmole), no seio de diclorometano (20,0 mL) , adicionou-se algumas gotas de N, N-dimetilformamida, a 0 °C. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente, durante 1 hora, seguida da adição de cielopropilmetilamina (0,229 g, 0,28 mL, 3,212 mmole) e trietilamina (0,65 g, 0,90 mL, 6, 424 mmole) . Passados 10 minutos, tratou-se a mistura com cloridrato 1 M (10,0 mL) e extraiu-se a mistura aquosa no seio de diclorometano (3 x 30,0 mL) . Concentrou-se a solução orgânica in vacuo até à secagem. Tratou-se o resíduo com uma solução de piperidina a 20 %, no seio de N,N-dimetilformamida (20,0 mL) , durante 0,5 horas. Após a eliminação do dissolvente in vacuo, tratou-se o resíduo com cloridrato 1 M (20,0 mL) e acetato de etilo (20,0 mL). Separou-se a mistura e tornou-se básica a camada aquosa com hidróxido de sódio sólido até a um pH = 8. Eliminou-se o precipitado por filtração e submeteu-se a solução aquosa a uma coluna de permuta iónica que se eluíu com piridina a 20 %, para se obter 0,262 g (57 %) de N-ciclopropilmetil-β- alanina-amida. RMN do 1¥< (200 MHz, CD30D) δ 0,22 (m, 2H) , O, 49 (m, 2H) , 0,96 (m, 2H) , 2,40 (t, 2H) , 2,92 (t, 2H) , 3,05 (d, 2H); EM (ES) : 143,1 (M"+l).

Preparação 14: N-terc-butoxicarboni1-trans-l,4-cíclo-hexi1diamina. 98

Dissolveu-se trans-1,4-ciclono-hexildiamina (6,08 g, 53,2 ramole) no seio de diclorometano (100 mL) . Adicionou-se uma solução de di-t-butildicarbonato (2,32 g, 10,65 mmole, no seio de 4 0 mL de diclorometano) por via de uma canula. Passadas 20 horas, dividiu-se a mistura reaccional entre CHCi3 e água. Separaram-se as camadas e extraiu-se a camada aquosa no seio de CHC13 (3x) . Secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre MgS04, filtraram-se e concentraram-se, para se obter 1,20 g de um sólido branco (53 %) . RMN do 1H (200MHz, CDC13) δ 1,0-1,3 (m, 4H) , 1,44 (s, 9H), 1,8-2,1 (m, 4H) , 2,62 (m largo, 1H) , 3,40 (s largo, 1H) , 4,37 (s largo, 1H) ; EM (ES) : 215,2 (M++l). 4-(N-acetil)-N-terc-butoxicarbonil-trans-1,4-ciclo-hexil-diamina.

Dissolveu-se N-terc-butoxicarbonil-trans-l,4-ciclo- hexildiamina (530 mg, 2,47 mmole), no seio de diclorometano {20 mL). Adicionou-se, gota a gota, anidrido acético (250 mg, 2,60 mmole). Passadas 16 horas, diluiu-se a mistura reaccional com água e CHCI3. Separaram-se as camadas e extraiu-se a camada aquosa no seio de CHC13 (3x). Secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre MgS04, filtraram-se e concentraram-se. A recristalização (Et0H/H20) originou 190 mg de cristais brancos (30 %). RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 0,9-1,30 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,96-2,10 (m, 7H), 3,40 (s largo, 1H) , 3,70 (s largo, 1H), 4,40 (s largo, 1H), 4,40 (s largo, 1H); EM (ES) : 257,2 (M“+l) , 242, 1 (M_-15) , 201,1 (M'-56) . 4-(4-trans-acetamidociclo-hexil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H- (l-feníletii)pírrolo[2,3d]pirimidina.

Dissolveu-se 4-(N-acetil)-N-terc-butoxicarbonil-trans-1, 4-ciclo-hexildíamina (190 mg, 0,74 mmole), no seio de 99 diclorometano (5 mL) e diluiu-se no seio de ATF (6 mL) . Passadas 16 horas, concentrou-se a mistura reaccional. Combinou-se o sólido impuro, DMSO (2 mL) , NaHCC>3 (200 mg, 2,2 mmole) e 4-cloro-5, 6-dimetil-2-fenil-7iT-pirrolo [2, 3d] -píri-midina (35 mg, 0,14 mmole) num frasco e aqueceu-se até 130 °C. Passadas 4,5 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e diluiu-se com EtOAc e água. Separaram-se as camadas e extraiu-se a camada aquosa no seio de EtOAc (3x). Secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre MgS04, filtraram-se e concentraram-se. A cromatografia (placa preparatória de sílica; CHCl3:EtOH 20:1), originou 0,3 mg de um sólido acastanhado (rendimento de 1 %) . EM (ES) : 378,2 (M++l). 4-(N-metanossulfonil)-N-terc-butoxicarbonil-trans-1,4-ciclo-hexildiamina.

Dissolveu-se trans-1,4-ciclo-hexildiamina (530 mg, 2,47 mmole) , no seio de diclorometano (20 mL) e diluiu-se com piridina (233 mg, 3,0 mmole). Adicionou-se, gota a gota, cloreto de metanossulfonilo (300 mg, 2,60 mmole). Passadas 16 horas, diluiu-se a mistura reaccional com água e CHCI3. Separaram-se as camadas e extraiu-se a camada aquosa no seio de CHCI3 (3x). Secaram-se as camadas orgânicas combinadas sobre MgS04, filtraram-se e concentraram-se. A recristalização (EtOH/H20) , originou 20 6 mg de cristais brancos (29 %) . RMN do XH í (200 MHz, CDCI3) δ 1,10 -1,40 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 2,00-2,20 (m, 4H) , 2,98 (s, 3H) , 3,20-3,50 (s largo, 2H), 4,37 (s largo, 1H) ; EM (ES) 2 93, 1 ..,(M++1), 278, 1 (M++15) , 237, 1 (M+56) . 4-(4-trans-metanossulfamidociclo-hexi1)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-(1-feniletil)pirrolo[2,3d]pirimidina. 100

Dissolveu-se 4-(N-sulfonil)-N-terc-butoxicarbonil-trans-1, 4-ciclo-hexildiamina (206 mg, 0,71 mmole), no seio de diclorometano '5 mL) e diluiu-se com ATF (6 niL) . Passadas 16 horas, concentrou-se a mistura reaccional. Combinou-se a mistura reaccional impura, DMSO (2 mL) , NaHC03 (100 mg, 1,1 mmole) e l-cloro-5,6-dimeti1-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]- pirimidina num frasco e aqueceu-se a 130 °C. Passadas 15 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e diluiu-se com EtOAc (3x). Secara-se as camadas orgânicas combinadas .sobre MgS04, filtraram-se e concentraram-se. A cromatografia (placa preparatória de silica, CHCl3/EtOH 20:1), originou 2,6 mg de um sólido escuro (rendimento de 5 %). EM (ES): 414,2 (M-+l).

Exemplo de Referência 1:

Aqueceu-se a 130 °C, durante 5 horas, uma solução de 4-cloro-5, 6-dimetil-2-fenil-7fí-pirrolo [2,3d] pirimidina (0,50 g, 1,94 mmole) e 4-trans-hidroxiciclo-hexilamina (2,23 g, 19,4 mmole), no seio de sulfóxido de metilo (10,0 mL) . Depois de se arrefecer para a temperatura ambiente, adicionou-se água (10,0 mL) e extraiu-se a solução aquosa resultante no seio de EtOAc (3 x 10,0 mL) . Secou-se a solução combinada de EtOAc (MgS04) e filtrou-se, concentrou-se o filtrado in vacuo até à secagem, fez-se a cromatografia do resíduo em gel de sílica, para se obter 0,49 g (75 %) de 4-(4-trans-hidroxiciclo- hexil) amino-5, 6-dimetí 1-2-f enil-7ií-pí rrolo [ 2,3d] pirimidina . pf 197-199 °C; RMN do XH (200 MHz, CDC13) δ 1,25-1,59 (m, 2, 08 (s, 3H) , 2, 29 (s, 3H) , 3,68-3,79 F I-X 4,32-4,38 1H) 00 co α II = 8 Hz, 1H), 7,26-7,49 (m, 3H), CO O 1 co 0^ J = 2,2, 8 Hz, 2H) , 10,60 (s, 1H); EM (ES) : 337,2 (M~ 101 + 1) -

Os compostos que se seguem foram obtidos de uma forma semelhante à do exemplo de referência 1: dl-4-{3-trans-hidroxieiclopentil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7íí-pirrolo [2,3d] pirimidina . RMN do ΧΗ (200 MHz, CDCI3) δ 1,58-1,90 (largo, 6 H), 2,05 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 4,48-4,57 (m, 1H), 4,91-5,01 (m, 2H), 7,35-7,46 (m, 3H), 8,42-8,47 (m, 2H), 10,11 (s, 1H); EM (ES): 323,2 (M"+l).

Para a preparação de 3-trans-hidroxiciclopentilamina, ver a patente de invenção europeia EP-A-322242. dl-4- ( 3-cis-hidroxiciclopentil) amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7.fi-pirrolo [2,3d] pirimidina. RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 1,82-2,28 (largo, 6H) , 2,02 (s, 3H) , 2,30 (s, 3H) , 4,53-4,60 (m, 1H), 4,95-5, 08 (m, 1H), 5,85-5, 93 (d, 1H), 7,35-7,47 (m, 3H) , 8,42-8,46 (m, 2H), 10,05 (s, 1H); EM (ES): 323,2 (M‘+l).

Para a preparação de 3-cis-hidroxiciclopentilamina, ver a patente de invenção europeia EP-A-322242.

Exemplo de Referência 2: A uma suspensão agitada de trifenilfosfina (0,047 g, 0,179 mmole) e ácido benzóico (0,022 g, 0,179 mmole), no seio de THF (1,0 mL) , arrefecida para 0 °C, adicionou-se 4 — (4 — trans-hidroxiciclo-hexil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-pirro-lo[2,3d]pirimidina (0,05 g, 0,149 mmole), a 0 °C. Adicionou-se então, gota a gota, azodicarboxilato de dietilo (0,028 mL, 0,179 mmole), durante 10 minutos. Deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente. Depois da reacção estar completa, verificada por CCF, parou-se a reacção com bicarbonato de sódio aquoso (3,0 mL) . Separaram-se a fase aquosa e extraiu-se no seio de éter (2 X 5,0 mL) . 102

Combinaram-se os extractos orgânicos, secaram-se e concentraram-se in vacuo até à secagem. Adicionou-se éter ao resíduo (2,0 mL) e hexano (5,0 mL) e filtrou-se o volume do óxido de trifenilfosfina. A concentração do filtrado deu um óleo viscoso, que foi purificado por cromatografia em coluna (hexano:acetato de etilo = 4:1), para se obter 5,0 mg (7,6 %) de 4-(4-cis-benzoiloxiciclo-hexil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7fí-pirrolo[2,3d]pirimídina. EM (ES): 441,3 (M~+l). A reacção também produziu 50,0 mg (84 %) de 4-(3-ciclo-hexanil)amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7i7-pirrolo [2,3d] pirimídina . EM (ES): 319,2 (M~+l) .

Exemplo de Referência 3: A uma solução de 4-(4-cis-benzoiloxiciclo-hexil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]pirimídina (5,0 mg, 0,0114 mnaole) , no seio de etanol (1,0 mL) , adicionou-se 10 gotas de hidróxido de sódio 2 M. Passada 1 hora, extraiu-se a mistura reaccional no seio de acetato de etilo (3 x 5,0 mL) e secou-se a camada orgânica, filtrou-se e concentrou-se in vacuo até à secagem. Submeteu-se o resíduo a cromatografia em coluna (hexano:acetato de etilo = 4:1), para se obter 3,6 mg (94 %) de 4-(4-cis~(hidroxiciclo-hexil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7//-pirrolo [2, 3d] pirimídina . EM (ES) : 337,2 (M"+l).

Exemplo de Referência 4:

Dissolveu^se 4-(3-terc-butiloxi-3-oxopropii)amino-5,6- dimetil-2-fenil-7íT-pirrolo [2,3d] pirimídina (70,0 mg, 0,191 mmole), no seio de ácido trifluoroacético:diclorometano 11:1, 5,0 mL. Agitou-se a solução resultante à temperatura ambiente, durante 1 hora e depois fez-se o seu refluxo, durante 2 horas. Depois de se arrefecer para a temperatura 103 ambiente, concentrou-se a mistura in vacuo até à secagem. Submeteu-se o resíduo a uma cromatografía preparativa em camada fina (EtOAc:hexano:AcOH = 7:2,5:0,5), para se obter 40,0 mg (68 %) de 4-(3-hidroxi-3-oxopropil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7if-pirrolo [2,3d] pirimidina. RMN do 1H (200 MHz, CD3OD) δ 2,32 (s, 3H) , 2,38 (s, 3H) , 2,81 (t, 2H) , 4,01 (t, 2H), 7,55 (m, 3H), 8,24 (m, 2H); EM (ES): 311,1 (M'+l) .

Exemplo de Referência 5:

Dissolveu-se 4-(3-hidroxi-3-oxopropil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidina (50,0 mg, 0,161 mmole), no seio de uma mistura de N,N-dimetilformamida (0,50 mL), dioxano (0,50 mL) e água (0,25 mL) . A esta solução, adicionou-se metilamina (0,02 mL, 40 % em peso, em água, 0,242 mmole), trietilamina (0,085 mL) e tetrafluoroborato de N, N,Ν' Ν'-tetrametilo e urónio (61,2 mg, 0,203 mmole). Depois de se agitar à temperatura ambiente, durante 10 minutos, concentrou-se a solução e submeteu-se o resíduo a cromatografía preparativa em camada fina (EtOAc), para se obter 35,0 mg (67 %) de 4-(3-N-metil-3-oxopropil)amino-5,6-dimetii-2-fenil-7.fí-pirrolo [2,3d] pirimidina . RMN do (200 MHz, CDCI3) δ 1,92 (s, 3H), 2,30 (s, 3H) , 2,65 (t, 2H) , 4,08 (t, 2H) , 5,90 (t, 1H), 6,12 (m, 1H) , 7,45 (m, 3H) , 8,41 (m, 2H), 10,68 (s, 1H); EM (ES) 311,1 (M"+l).

Exemplo de Referência 6:

Fez-se o refluxo de uma mistura de 4-cloro-5,6-dimetii-2-f enil-7íí-pirrolo [2,3d] pirimidina (0,70 g, 2,72 mmole) e 1,2-diaminoetano (10,0 mL, 150 mmole), em atmosfera inerte, durante 6 horas. Eliminou-se o excesso de amina in vacuo, lavou-se o resíduo sequencialmente com éter e hexano, para se obter 0,75 g (98 %) de 4-(2-aminoetii)amino-5,6-dimetil-2- 104 f enil-7ií-pirrolo [2,3d] pirimidina . EM (ES): 282,2 (M'+l), 265,1 (M’-NH3) .

Exemplo de Referência 7: A uma solução de 4-(2-amínoetíl)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7if-pirrolo [2,3d] pirimidina (70,0 mg, 0,249 mmole) e trietilamina (50,4 mg, 0,498 mmole), no seio de diclorometano (2,0 mL), adicionou-se cloreto de propionilo (25,6 mg, 0,024 mL. 0,274 mmole), a 0 °C. Passada 1 hora, concentrou-se a mistura iii vacuo e submeteu-se o resíduo a uma cromatografia preparativa em camada fina (EtOAc), para se obter 22,0 mg (26 %) de 4-(2-propionilaminoetil) amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7ii-pirrolo[2,3d]pirimidina. EM (ES): 338,2 (M”+l).

Os compostos que seguem foram obtidos de uma forma semelhante à do exemplo de referência 7: 4- (2-N' -metilureia-etil) amino-5,6-dimetil-2-fenil-7fT-pirrolo-[2,3d]pirimidina. RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 2,13 (s, 3H) , 2,32 (s, 3H), 3,53 (d, 3H), 3,55 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 4,29 (m, 1H), 5,68 (t, 1H), 5,84 (m, 1H), 7,42 (m, 3H), 8,36 (dd, 2H), 9,52 (s, 1H); EM (ES): 339,3 (M‘+l).

Exemplo de Referência 8: A uma solução de cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi-imida (41,1 mg, 0,215 mmole), dimetilaminopiridina (2,4 mg, 0,020 mmole) e ácido pirúvico (18,9 mg, 0,015 mL, 0,215 mmole}, no seio de diclorometano (2,0 mL) , adícionou-se 4-(2-aminoetilamino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-pírrolo[2,3d]pirimidina (55,0 mg, 0,196 mmole). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente, durante 4 horas. O trabalho usual e a cromatografia em coluna (EtOAc), 105 originou 10,0 mg (15 %) de 4 -(2'-piruvilamidoetil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3 d]pirimidina. EM (ES): 352,2 (M~+l).

Exemplo de Referência 9: A uma solução de 4-(2-aminoetil)amino-5,6-dimetíl-2-fenil-7H-pirrolo [2,3d]pirimidina (60,0 mg, C,213 mmole), no seio de diclorometano (2,0 mL), adicionou-se isocianato de N-trimetilsililo (43,3 mg, 0,051 mL, 0,320 mmole). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente, durante 3 horas, seguida da adição de bicarbonato de sódio aquoso. Após filtração através de uma pequena quantidade de gel de silica, concentrou-se o filtrado in vacuo até à secagem, para se obter 9,8 mg (14 %) de 4- (2-ureia-etil) amino-5, 6-dímetil-2-fenil-71í-pirrolo- [2,3d]-pirimidina. EM (ES): 325,2 (M'+l).

Exemplo de Referência 10:

Realizou-se a reacção de 4-cloro-5,6-dimetil-2-fenil-7.fi- pirrolo[2,3d]pirimidina com a mistura de dl-l-amino-2-(1,1-dimetiletoxi)carbonilamino-propano e dl-2-amino-l-(1,1-dimetiletoxi)carbonílamino-propano, de uma forma semelhante à do exemplo 1. A reacção deu uma mistura de dl-4-(1-metil-2-(1,1-dimetiletoxi)carbonilamino)etilamino-5,β-dimetil-2-fenil-7H-pirrolo [2, 3d]pirimidina e dl-4-(2-metil-2-(1, 1-dimetiletoxi) carbonilamino) etilamino-5,6-dimetil-2-fenil-7íí-pírrolo[2,3d]pirimidina, que foram separados por cromatografia em coluna· (EtOAc:hexanos = 1:3). A primeira fracção foi dl-4-(1-metil-2-(1,1-dimetiletoxi)-carbonil-aminoetil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7ff-pirrolo[2,3d]-pirimi- di na : RMN do (200 MHz, CDC13) δ 1,29- 1,38 (m, 12H) , 1,95 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H) 3,34 -3,43 i (m, 2H), 4,62- -4, 70 (m, 1H) , 5, 36 -5,40 (d, J = 8 Hz, 1H] 1, 5,53 (largo, 1H) , 7-, 37-7,49 (m, 106 3Η), 8,37-8,44 (m, 2H) , 10,75 (s, 1H) . EM 396,3 (M"+l); A segunda fracção foi dI-4-(2-(1,1-dimetiletoxi)carbonilamino-propil) amino-5, 6-dimetil-2-f enil-7íf-pirrolo [2,3d]pirimidina: RMN do ΧΗ (200 MHz, CDCI3) δ 1,26-1,40 (m, 12H) , 2,00 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H) 3,60-3,90 (m, 2H), 3,95- 4,10 (m, 1H) , 5,41- 5,4 4 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5, 65 (largo, 1H), 7,40-7,46 (m, 3H) , 8,37- 8,44 (m, 2H) , 10,89 1 (s, 1H) ; EM (ES): 396,2 (M“+l).

Exemplo de Referência 11:

Tratou-se dl-4-(l-metil-2-(1,1-dimetiletoxi)carbonil-aminoetil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7fl-pirrolo[2,3d]pirimi-dina (60,6 mg, 0,153 mmole) com ácido trifluoroacético (0,5 mL) , no seio de diclorometano (2,0 mL) , durante 14 horas. Eliminou-se o dissolvente orgânico in vácuo até à secagem. Dissolveu-se o resíduo no seio de N,N-dimetilformamida (2,0 mL) e trietilaraina (2,0 mL) . À solução, a 0 °C, adicionou-se anidrído acético (17,2 mg, 0,016 g, 0,169 mmole). Agitou-se a mistura resultante, à temperatura ambiente, durante 48 horas e depois concentrou-se in vacuo até à secagem. Submeteu-se o resíduo a cromatografia preparativa em camada fina (EtOAc), para se obter 27,0 mg (52 %) de cLZ-4 - (l-metil-2- acetilaminoetil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7ff-pirrolo[2, 3d]-pirimidina. RMN do "H (200 MHz, CDCI3) δ 1,38-1, 42 (d, J = 8

Hz, 3H) , 1, 69 (s, 3H) , 2,01 (s, 3H) , 2, 32 (s, 3H) 3,38 -3,60 (m, 2H) , 4,65 -4,80 (m, 1H) , 5, 23-5, 26 (d, J = 6 Hz, 1H) , 7,40 -7,51 (m, 3H) , 8,37- -8, 43 (m, 2H) , 10 ,44 (s, 1H) ; • EM (ES) : 338,2 (M~+l).

Exemplo de Referência 12:

Tratou-se (R,R)-4-(2-aminociclo-hexil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidina, preparado de uma forma semelhante à do exemplo de referência 1, a partir de 4-cloro- 107 5.6- dimetil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidina (0,15 g, 0,583 mmole) e (IR,2R)-(-)-1,2-diaminociclo-hexano (0,63 g, 5,517 mmole) , com trietilamina (0,726 g, 7,175 mmole) e anidrido acético (0,325 g, 3,18 mmole), no seio de N,N-dimetilformaruida (10,0 mL) , à temperatura ambiente, durante 2 horas. Após a eliminação do dissolvente in vácuo, adicionou-se acetato de etilo (10,0 mL) e água (10,0 mL) ao resíduo. Separou-se a mistura e extraiu-se a camada aquosa no seio de acetato de etilo (2 x 10,0 mL) . Secou-se a solução combinada de acetato de etilo (MgS04) e filtrou-se. Concentrou-se o filtrado in vacuo até à secagem e submeteu-se o resíduo a cromatografia em coluna (EtOAc:hexano = 1:1), para se obter 57,0 mg (26 %) de (R,R)-4-(2-acetilaminociclo-hexil)amino-

5.6- dimetil-2-fenil-7i7-pí rrolo [2,3d] pirimidina . RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 1,43 (m, 4H) , 1,60 (s, 3H), 1,84 (m, 2H), 2,22 (s, 3H) , 2,30 (m, 2H) , 2,33 (s, 3H) , 3,72 (largo, 1H) , 4,24 (largo, 1H), 5,29 (d, 1H), 7,43-7,48 (m, 3H), 8,35-8,39 (m, 2H), 8,83 (s, 1H); EM (ES): 378,3 (M"+l).

Exemplo de Referência 13: A uma solução de 4-(2-hidroxietil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7Jí-pirrolo [2,3d] pirimidina (40,0 mg, 0,141 mmole), no seio de pirídina (2,0 mL) , adicionou-se anidrido acético (0,108 g, 1,06 mmole), a 0 °C. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente, durante 4 horas e eliminou-se o dissolvente in vacuo. Submeteu-se o resíduo a cromatografia preparativa em camada fina (EtOAc:hexano = 1:1), para se obter 32,3 mg (71 %) de 4-(2-acetiloxíetil)amino-5,6-dime-til-2-fení 1-7 fí-pir rolo [2,3d] pirimidina . RMN do 1ti (200 MHz, CDCI3) δ 1, 90 (s, 3H) , 2,08 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H) , 4,05 (m, 2H), 4,45 (t, 2H), 5,42 (m, 1K), 7,41-7,49 (m, 3H), 8,42 (m, 2H), 11,23 (s, 1H). 108

Exemplo de Referência 14:

Agitou-se uma solução de Fmoc-p-Ala-OH (97,4 m, 0,313 mmole) e cloreto de oxalilo (39,7 mg, 27,3 pL, 0,313 mmole) , no seio de diciorometano (4,0 mL) , com uma gota de N,N-dimetilformamida, a 0 °C, durante 1 hora, seguido da adição de 4- (2-aminoetil) amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7Jf-pirrolo [2,3d] -pirimidina (80,0 mg, 0,285 mmole) e trietilamina (57,6 mg, 79,4 pL, 0,570 mmole), a 0 °C. Passadas 3 horas, concentrou-se a mistura in vacuo e tratou-se o resíduo com uma solução de piperidina, no seio de N, N-dimet ilformamida a 20 % (2,0 mL), durante 0,5 horas. Após a eliminação do dissolvente in vacuo, lavou-se o resíduo com éter de dietilo:hexano (1:5), para se obter 3,0 mg (3 %) de 4-(6-amino-3-aza-4-oxo- hexil) amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7Jí-pirrolo [2,3d] pirimidina . EM (ES): 353,2 (M“+l).

Exemplo de Referência 15:

Agitou-se à temperatura ambiente, durante 4 horas, uma solução de 4-(2-aminoetil) amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7íí-pirrolo[2,3d]pirimidina (70,0 mg, 0,249 mmole) e anidrido succínico (27,0 mg, 0,274 mmole), no seio de diciorometano (4,0 mL) com uma gota de N, N-dimet ilformamida. Extraiu-se a mistura reaccional com hidróxido de sódio a 20 % (3 x 5,0 mL). Acidificou-se a solução aquosa com cloridrato 3 M até pH = 7,0. Extraiu-se toda a mistura no seio de acetato de etilo (3 x 10 mL). Secou-se a solução orgânica combinada (MgS0<i) e filtrou-se. Concentrou-se o filtrado in vacuo até à secagem, para se obter 15,0 mg (16 %) de 4-(7-hidroxi-3-aza-4,7-dioxo-heptil) amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7ií-pirrolo [2,3d] pirimidina . EM (ES): 382,2 (M‘+l). 109

Exemplo de Referência 16: A 10 mL de dimetilformamida (DMF), à temperatura ambiente, adicionou-se 700 mg de 4-cis-3-hidroxi- ciclopentil)amino-2-fenil-5,6-dimetil-7H-pirrolo[ 2,3d]pirimi-dina, seguido de 455 mg de N-Boc-glicina, 20 mg de N,N- dimetilaminopiridina (DMAP), 293 mg de hidroxibenzotriazole (HOBT) e 622 mg de cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbo-imida (EDC1). Deixou-se a mistura reaccional em agitação durante a noite. Eliminou-se então a DMF a pressão reduzida e dividiu-se a mistura reaccional entre 20 mL de acetato de etilo e 50 mL de água. Extraiu-se a porção aquosa com mais 2 x 20 mL de acetato de etilo e lavaram-se as porções orgânicas combinadas com salmoura, secaram-se sobre sulfato de sódio anidro, filtraram-se e concentraram-se. A purificação em gel de sílica, eluindo-se com acetato de etilo /hexano, originou 410 mg do produto desejado: 4-(cis-3- (N-t-butoxicarbonil-2-aminoacetoxi)ciclopentil)amino-2-fenil-5, 6-dimetil-7ií-pirrolo [2,3d] pirimidina, EM (ES): 480,2 (M~

+ 1) . Tratou-se então o éster com 5 mL de ácido trifluoroacético a 20 %, no sexo de diclorometano, à temperatura ambiente, deixou-se durante a noite e depois concentrou-se. A trituração no seio de acetato de etilo, originou 300 mg de um sólido branco; sal do ácido trifluoroacético de 4-(cis-3-(2-aminoacetoxi)ciclopentil)-amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7i7-pirro-lo [2,3d] pirimidina. EM (ES): 380,1 (M~+l).

Um especialista na matéria será capaz de sintetizar os compostos que se seguem pelos processos descritos antes: 4-(cis-3-hidroxiciclopentil)amino-5,6-dimetil-2-fenil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidina. EM (ES): 323,1 (M‘+l). 110

Sal do ácido trifluoroacético de 4-(cis-3-(2-aminoacetoxi)-ciclopentil) amino-5, 6-dimetil-2-fenil-7fl-pirrolo [2,3d] -pirimidina. EM (ES): 380,1 (M”+l).

Exemplo de Referência 17

Esquema IX

Protegeu-se o azoto do pirrolo (7) (esquema IX) com di-t-butildícarbonato, em condições básicas, para se obter o carbamato (22) correspondente. A bromação do radical (22) procedeu de uma forma regio-selectiva para se obter o brometo (23) . Em geral, o composto (23) serviu como um produto intermédio electrofílico chave, para vários parceiros do acoplamento nucleofílico. A deslocação do brometo de alquilo com tri-hidrato de fenolato de sódio, originou o composto (24) . A subsequente deslocação do cloreto de arílo e a eliminação do grupo de protecção do carbamato de t-butilo, ocorreu numa etapa que originou o composto desejado (25). 111

Síntese Detalhada dos Compostos de Referência (22)-(25) de Acordo com o Esquema IX (3

Adicionou-se dicarbonato de di-t-butilo (5,37 g, 24,6 mmole) e dimetilaminopiridina (1,13 g, 9,2 mmole} a uma solução contendo (7) (1,50 g, 6,15 mmole) e piridina (30 mL).

Após 20 horas da reacção, concentrou-se e voltou-se a dividir o resíduo entre CH2CI2 e água. Separou-se a camada de CH2CI2, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se para se obter um sólido preto. A cromatografia rápida (S1O2; EtOAc/hexanos 1:9, Rf 0,40), originou 1,70 g (80 %) de um sólido branco (22). RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 8,50 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m, 3H, Ar-H) 6,39 (s, 1H, pirrolo-H) , 2,66 (s, 3H, pirrolo-CH3) , 1,76 (s, 9H, carbamato-CH3) ; EM (ES) 344,1 (M+l); Mpt 175-177 °C. α

Adiciorxou-se N-bromosuccinímida (508 mg, 2,86 mmole) e AIBN (112 mg, 0,68 mmole) a uma solução contendo (22) (935 mg, 2,71 mmole) e CC14 (50 mL) . Aqueceu-se a solução à temperatura de refluxo. Passadas 2 horas, arrefeceu-se a 112 mistura reaccional para a temperatura ambiente e concentrou-se in vácuo, para se obter um sólido branco. A cromatografia rápida (Si02; CH2Cl2/hexanos 1/1, Rf 0,30), para se obter 960 mg (84 %) de um sólido branco (23) . RMN do 1H (200 MHz, CDC13) δ 8,52 (m, 2H, Ar-H), 7,48 (m, 3H, Ar-H), 6,76 (s, 1H, pirrolo-H) , 4,93 (s, 2H, pirrolo-CHaBr) , 1,79 (s, 9H, carbamato-CH3) ; EM (ES): 423,9 (M+l); Mpt = 155-157 °C.

Cl

Adicionou-se tri-hidrato de fenóxido de sódio (173 mg, 1,02 mmole) numa porção, a uma solução do brometo (23) (410 mg, 0,97 mmole), dissolvido no seio de CH2CI2 (5 mL) e DMF (10 mL) . Passadas 2 horas, a solução reaccional foi dividida entre CH2CI2 e água. Extraiu-se a camada de água no seio de CH2C12 · Lavaram-se as camadas combinadas de CH2C12 com água, secaram-se sobre MgS04, filtraram-se e concentraram-se, para se obter um sólido amarelo. A cromatografia rápida (SÍO2; EtOAc/hexanos 1/6, Rf 0,30), originou 210 mg (50 %) de um sólido branco (24). RMN do ΧΗ (200 MHz, CDC13) δ 8,53 (m, 2H, Ar-H), 7,48 (m, 3H, Ar-H), 7,34 (m, 2H, Ar-H), 7,03 (m, 3H, Ar-H), 6,83 (s, 1H, pirrolo-H), 5,45 (s, 2H, ArCH20) , 1,76 (s, 9H, carbamato-CH3) ; EM, M+ = 436, 2. 113 :0 MN.

NH

Aqueceu-se até 100 °C, uma solução contendo (24) (85 mg, 0,20 mmole), N-acetiletilenodiamina (201 mg, 1,95 mmole) e DMSO (3 mL). Passada 1 hora, a temperatura subiu para 130 °C. Passadas 3 horas, a mistura reaccional foi arrefecida para a temperatura ambiente e dividida entre EtOAc e água. Extraiu-se a camada aquosa no seio de EtOAc (2x). As camadas de EtOAc combinadas foram lavadas com água, secas sobre MgSO^, filtradas e concentradas. A cromatografia rápida (Si02; EtOH/CHCl3 1/10, Rf 0,25), originou 73 mg (93 %) de um sólido espumoso branco (25). RMN do XH (200 MHz, DMSO-de) δ 11,81 (s largo, 1H, N-H), 8,39 (m, 2H, Ar-H), 8,03 (t largo, 1H, N- H), 7,57 (t largo, 1H, N-H), 7,20-7,50 (m, 5H, Ar-H), 6,89- 7,09 (m, 3H, Ar-H), 6,59 (s, 1H, pirrolo-H) , 5,12 (s, 2H,

ArCH20), 3,61 (m, 2H, NCH2) , 3,36 (m, 2H, NCH2) , 1,79 (s, 3H, COCH3) ; EM (ES) : 402,6 (M+l).

Exemplo de Referência 18: Síntese do Antagonista de Adenosina A2 0 composto 1319 e o composto 1320 (quadro 13 a seguir), podem ser sintetizados pelos seguintes processos gerais. 114 α

Composto 26 X = F Composto 27 X = Cl

Composto 1319 Composto 1320

Composto 1319 (81 %) RMN do 1H (m, 2H) , 2,01 (m, 2H) , 4,11 (s 4,4 Hz), 6,59 (m, 1H), 7,09 (m, IH, J = 8 Hz, 14 Hz), 8,03 (m, II, 55 (s largo, 1H). EM (ES): 3Í ;DMSO-d6) δ 1,37 (m, 4H) , 1,93 largo, 1H) , 4,61 (d, 1H, J = 1H), 7,21 (m, 2H), 7,49 (dd, 1H) , 8,18 (d, 1H, J = 8 Hz) , 7,0 (M'+l).

Composto 1320 (31 %) EM (ES): 343,1 (M~+l).

Exemplo de Referência 19: Síntese do Antagonista de Adenosina Ai 0 composto 1321 (quadro 13 a seguir) , pode ser sintetizado pelos processos gerais indicados a seguir.

Dissolveu-se o composto (28) (10,93 g, 50,76 mmole), nq seio de DMF (67 mL) . Adicionou-se, sequencialmente, cloridrato de 4-amidinopiridina (8,0 g, 50,76 mmole) e DBU (15,4 g, 101,5 mmole) e aqueceu-se a reacção até 85 °C. Passadas 22 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e eliminou-se a DMF ín vacuo. Diluiu-se 115 o óleo preto com HC1 2 M (80 mL) . Deixou-se a mistura reaccional em repouso. Passadas 2 horas, arrefeceu-se a solução para 10 °C e filtrou-se. Lavou-se o sólido com água fria e secou-se, para se obter 7,40 g de um sólido amarelo, composto 29 (69 %) . RMN do 1H (200 MHz, DMSO-dg) δ 6,58 (s, 1H), 7,27 (s, 1H), 8,53 (d, 2H, J = 5,6 Hz), 9,00 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 12,35 (s largo, 1H). EM (ES): 212,8 (M++l).

Diluiu-se 0 composto 29 (7,4 mmole, 29,8 mmole) com POCI2 e aqueceu- -se até 105 °C. Passadas 18 horas, arrefeceu- se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e eliminou-se o POCI2 in vacuo. Diluiu-se o óleo escuro, espesso com MeOH (75 mL) seguido de éter (120 mL). Filtrou-se o sólido vermelho amorfo e lavou-se com éter, para se obter 3,82 g de um sólido vermelho. 0 sólido impuro é, aproximadamente, 80 % ouro e utilizou-se sem mais purificação na reacção seguinte. EM (ES); 230,7 (M++l).

Composto 1321 RMN do XH (15 %) (200 MHz, DMSO-d6) δ 1,38 (m, 4H) , 1,92 (s largo, 2H) , 2,02 (s largo, 2H) , 3,44 (s largo, 1H) , 4,14 (s largo, 1H) , r 4,56 (d, 1H, J = 4 : HZ) , 6, 63 (m, 1H) , 7,15 (m, 1H), 7, 32 1 ;d, 1H, J = 6, 2 Hz), 8 ,20 (d, 2H, J = 4,4 Hz) , 8, 65 (d, 2H , J = 4,4 Hz) , 11 ,67 (s largo, 1H) . EM (ES) : 310, 2 (M“+l) . Composto 1501 (quadro 15 a seguir) RMN do XH ( 70 %) ( 200 MHz, CD3OD) δ 1 ,84 (s, 3H) a r f 52 (t, 2H, J = 6, 0 Hz ), 3,83 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 6,51 (d, . 1H t J = 3,4 Hz) , 7,06 (d, 1H, J = 3,8 Hz) , 7, 42 (m, 3H), 8, 36 ( m, 2H) . EM (ES ) : 296, 0 (m"+i; ) .

Composto 1502 (quadro 15 a seguir) EM (ES): 345,0 (M"+l).

Composto 1500 (quadro 15 a seguir) RMN do hH (200 MHz, CDC13) δ 1,40-1,80 (m, 6H), 1,85-2,10 (m, 2H) , 2,18 (s, 3H), 2,33 116 (s, 3H) , 2,50 (d, 3H), 3,90-4,10 (m, 2H), 4,76 (m, 1H), 5,50 (d, 1H), 6,03 (m, 1H) , 7,40 (m, 3H) , 8,37 (m, 2H) , 9,15 (s largo, 1H). EM (ES): 393,3 (M~+l).

Exemplo 20: Sintese do Antagonista da Adenosina Αχ

Pode sintetizar-se o composto 1504 (quadro 15 a seguir) pelos processos gerais dados a seguir.

Composto 1504

Dissolveu-se o composto 31 (200 mg, 0,47 mmole), no seio de DCM (4 mL) . Adicionou-se, sequencialmente, trietílamina (51 mg, 0,5 mmole) e tiomorfolina (52 mg, 0.5 mmole). Misturou-se a solução durante vários minutos e deixou-se em repouso durante 72 horas. Diluiu-se a mistura reaccional com DCM e H20 e separaram-se as camadas. Extraiu-se a camada aquosa no seio de DCM. Secaram-se as camadas combinadas de DCM sobre MgS04, filtraram-se e concentraram-se. Adicionou-se éter de etilo à amostra impura e filtrou-se o sólido resultante, para se obter 100 mg de um sólido branco, 32 (62 %) . RMN do ΧΗ (200 MHz, CDC13) δ 1,76 (s, 9H) , 2,6 6 (s largo, 2H), 2,79 (s largo, 2H), 3,86 (s, 2H) , 7,46 (m, 3H), 8, 50 (rti, 2H) . Combinou-se o composto 32 com DMSO (3 mL ) e trans-4- aminociclo-hexanol (144 mg, 1,25 mmole) e aqueceu-se para 130 °C, durante 4 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e diluiu-se no seio de EtOAc e Η20. Separaram-se as camadas e extraíu-se a camada aquosa, no seio 117 de EtOAc (2x). Lavaram-se as camadas orgânicas combinadas com H20 e salmoura, secaram-se sobre MgSCL, filtraram-se e concentraram-se. A cromatografia (sílica, CHCls/EtOH 8:1), originou 32 mg de um óleo escuro. Adicionou-se éter de etilo e filtrou-se o sólido resultante, para se obter 5 mg de um sólido branco (9 %). OSIC-148265: RMN do 1H (200 MHz, CD3OD): δ 1,44 (m largo, 4H), 2,03 (m largo, 2H), 2,21 (m largo, 2H), 2,70 (m largo, 8H) , 3,63 (m, 4H) , 3,92 (m, 1H) , 4,26 (s largo, 1H), 6,42 (s, 1H), 7,42 (m, 3H), 8,33 (m, 2H).

Exemplo 21: Sintese do Antagonista de Adenosina Ai

Pode sintetizar-se o composto 1503 (quadro 15 a seguir) pelos processos gerais dados a seguir.

Composto 1503

Dissolveu-se o brometo, composto 31 (220 mg, 0,47 mmole), no seio de DMF:diclorometano 1:1 (5 mL). Adicionou-se a esta solução K2CO3 (71 mg, 0,52 mmole) e morfolina (0,047 mL, 0,47 mmole). Deixou-se a mistura em agitação à temperatura ambiente, durante a noite. Eliminaram-se os dissolventes in vacuo e dividiu-se resíduo entre H20 e diclorometano. Secou-se a camada orgânica sobre MgSO^, filtrou-se e concentrou-se, para se obter um sólido branco sujo que, após trituração no seio de éter/hexanos, originou 17 5 mg de um sóli ^do branco, (33) (84 %). RMN do XH (200 MHz, CDCI3) δ 1 , 9 (s, 9H), 2,54 (s, 4H), 3,65 (s, 4H) , 3,85 (s, 1H), 6, 59 (s, 1H) , 7,45 (m, 3H) , 8,5 (m, 2H) . 118

Recolheu-se o composto 33 (50 mg, 0,11 mmole) e trans-4-aminociclo-hexanol (105 mg, 0,91 mmole), no seio de DMSO (2 rriL) . Aspergiu-se a solução resultante com N2 e depois aqueceu-se até 100 °C, num banho de óleo e agitou-se durante a noite. Verteu-se a mistura reaccionai impura sobre água e extraiu-se duas vezes no seio de acetato de etilo (50 mL) . Lavaram-se as camadas orgânicas combinadas com H20. Após a secagem com MgSCg e a filtração, concentrou-se a camada orgânica in vácuo. para se obter um sólido cor de laranja. A cromatografia (sil ica, CH2OH a 10 % no seio de CH2C12) , originou 15 mg (33 %) · RMN do 1H (200 MHz, CDCla) : 1,24-1,62 (m, 4H) , 1,85 (m, 2H) , 2,10 (m, 2H) , 2,26 (m, 4H) , 3,53 (m, 4H) , 4,22 (m, 1H), 4,73 (m, 1H) , 5, 85 (d, 1H) , 6,15 (s, 1H) , 7,25 (m, 3H) , 8,42 (m, 2H) , 10,0 (s, 1H) . EM (ES) : 408 (M++l) .

Os compostos 1500, 1501 e 1502 podem ser sintetizados utilizando etapas de preparação similares as do exemplo 20, tratando o composto (32) com uma amina substituída de forma apropriada.

Ensaios do gene relator.de β-galactosidase de levedura, para o receptor de adenosina Αχ e A2a humana: Transformaram-se estirpes de levedura (S. cerevísiae) com adenosina humana Αχ (AxR; estirpe CY12 660 de CADUS) ou A2a humana (A2a; estirpe CY8362 de CADUS) e adicionou-se o gene relator de lacZ(U~ galactosidase) para utilizar como uma leitura de memória funcional. Uma descrição completa da transformação está listada a seguir (ver estirpes de levedura). Utilizou-se NECA (5'-N-etilcarboxamídoadenosina) , um agonista potente do receptor de adenosina com uma afinidade semelhante para os receptores de Ai e A2a, como ligando, para todos os ensaios. Examinaram-se os compostos do ensaio em 8 concentrações (0,1 - 10.000 nM) para saber a capacidade para inibir a actividade 119 de β-galactosidase induzida por NEGA, por meio de CY12660 ou CY8362.

Preparação das Culturas Concentradas de Levedura: Cada uma das culturas das estirpes de leveduras CY12660 e CY8362, foram espalhadas numa placa de agar de LT e incubadas a 30 °C, até se observarem colónias. As leveduras destas colónias foram adicionadas ao liquido de LT (pH 6,8} e cresceram durante a noite a 30 °C. Cada estirpe de levedura foi então diluída até um DOgoo = 1,0-2,0 (aproximadamente, 1-2 X 107 células/mL), como se determinou por espectrofotometria (Molecular Devices VMAX) . Para cada 6 mL de cultura de líquido de levedura, adicionou-se 4 mL de glicerol a 40 % (volrvol 1:1,5) ("1evedura/concentrado de glicerol"). A partir deste concentrado de levedura/concentrado de glicerol, prepararam-se aliquotas de 1 mL e armazenaram-se a -80 °C, até serem necessárias para os ensaios.

Levedura de AiR e Ensaio de A2aR: Descongelou-se um frasco de cada uma das CY8362 e CY12660 de levedura/concentrado de glicerol e utilizou-se para inocular um meio líquido de LT complementado, a pH 6,8 (92 mL de líquido de LT, ao qual se adicionou: 5 mL de glicose a 40 %, 0,45 mL de KOH 1 M e 2,5 mL de Pipes, pH 6,8). As culturas em meio líquido cresceram durante 16-18 horas (durante a noite), a 30 °C. Diluíram-se então as aliquotas das culturas da noite em meio de LT contendo 4U/mL de adenosina desaminase (do tipo VI ou VII da mucosa do intestino de bovinos, Sigma), para se obter DOgoo = 0,15 (1,5 X 106 células/mL) para CY8362 (A2aR) e D06oo = 0/50 (5 X 106 células/mL) para CY12660 (AiR).

Realizaram-se os ensaios com um volume final de 100 pL em placas microtituladoras com 96 microtubos, de tal modo que se obteve uma concentração final de DMSO a 2 % em todos os 120 microtubos. Para uma avaliação primária, utilizou-se concentrações de 1-2 dos compostos de ensaio (10 μΜ, 1 μΜ) . Para fazer o perfil do composto, ensaiaram-se 8 concentrações (10.000, 1.000, 500, 100, 50, 10, 1 e 0,1 nM) . A esta placa microtituladora, adicionou-se 10 μΜ de DMSO a 20 % para os tubos de "controlo" e de "total" enquanto se adicionou 10 pL do composto de ensaio (no seio de DMSO a 20 %) aos microtubos "desconhecidos". Em seguida, adicionou-se 10 pL de NECA (5 μΜ para AXR, 1 μΜ para A2aR) aos microtubos de "total" e "desconhecidos"; adicionou-se 10 pL de SBF aos microtubos "controlo". Na adição final, adicionou-se 80 pL das estirpes de levedura CY8362 ou CY12660 a todos os microtubos. Agitaram-se então todas as placas brevemente (agitador orbital da LabLine; 2-3 minutos) e deixou-se incubar durante 4 horas, a 30 °C, num forno anidro. A actividade de β-galactosidase pode ser quantificada utilizando quer substratos colorimétricos (por exemplo, ONPG, CPRG), luminescentes (por exemplo, Galacton-Star) ou fluorométricos (por exemplo, DGF, Resorufin). Normalmente, é preferível a detecção por fluorescência com base na relação superior de sinal: ruído, relativamente livre de interferências e de baixo custo. Adicionou-se digalactopiranósido de flucresceína (DGF, sondas moleculares ou tecnologias de genes marcadores), um substrato de β-galactosidase fluorescente, a todos os microtubos, a 20 pL/microtubo (concentração final = 80 μΜ) . Agitaram-se as placas durante 5-6 segundos (agitador orbital da LabLine) e depois incubaram-se a 37 °C, durante 90 minutos {incubador-de 02 a 95 %/CC>2 a 5 %) . No final do período de incubação de 90 minutos, parou-se a actividade de β-galactosidase utilizando 20 pL/microtubo de Na2C03 1 M e agitaram-se todas as placas durante 5-6 segundos. Agitaram-se depois então as placas durante 6 segundos e determinou-se a intensidade relativa da 121 fluorescência utilizando um fluorómetro (Tecan Spectrafluor; excitação = 485 nm, emissão = 535 nm). Cálculos: Os valores da fluorescência relativa para os microtubos de "controlo", foram interpretados como a base e foram subtraídos do "total" e dos valores de "desconhecidos". Analisaram-se os perfis dos compostos por via de uma transformação logarítmica (eixo do x: concentração do composto) seguidos de uma adaptação da curva da concorrência do sítio para calcular os valores de CI50 (GrafPad Prism).

Estirpes de Leveduras: desenvolveram-se estirpes de

Saccharomices cerevisiae CY12660 [farl*1442 tbtl-1 fusl-HIS3 canl stel4::trpl::LIS2 ste3*1156 gpal(41)-Gai3 lis2 ura3 leu2 trpl: his3; LEU2 PGKp-MfalLeader-hAlR-PH05term 2mu-ori REP3 Ampr) e CY8362 [gpalp-rGasElOK farl*1442 tbtl-1 fusl-HIS3 canl stel4::trpl: LIS2 ste3*1156 lis2 ura3 leu2 trpl his3; LEU2 PGKp-hA2aR 2mu-ori REP3 Ampr].

Meio LT: 0 meio LT (Leu-Trp complementado) é composto por 100 g de levedura da DIFCO à base de azoto, complementada com o seguinte: 1,0 g de valina, 1,0 g de ácido aspártico, 0,75 g de fenilalanina, 0,9 g de lisina, 0,45 g de tirosina, 0,45 g de isoleucina, 0,3 g de metionina, 0,6 g de adenina, 0,4 g de uracilo, 0,3 g de serina, 0,3 g de prolina, 0,3 g de cisteína, 0,3 g de arginina, 0,9 g de histidina e 1,0 g de treonina.

Construção das Estirpes de Levedura que Expressam o Receptor de Adenosina Ai Humana

Neste exemplo, a produção das. estirpes de levedura que expressam ura receptor de adenosina Ai humana, funcionalmente 122 integrado no sistema de feromona de levedura, foram feitos da forma que se descreve a seguir. I. Construção do Vector de Expressão

Para preparar um vector de expressão de levedura para o receptor de adenosina Ai humana, obteve-se o ADNc do receptor de adenosina Ai por RCP de transcriptase reversa de ARNm do hípocampus humano, utilizando iniciadores designados com base na sequência publicada do receptor de adenosina Ai humana e em técnicas normalizadas. 0 produto de RCP foi sub-clonado nos sitios de Ncol e Xbal do plasmido de expressão da levedura pM15.

Criou-se o plasmido pMP15 a partir de pLPXt como se segue: Eliminou-se o sítio de Xbal de YEP51 (Broach, J.R. et al., (1983) "Vectors for high-level, inducible expression of cloned genes in yeast" p. 83-117 em M. Inouye (ed.), Experimental Manipulation of Gene Expression. Academic Press, New York) por digestão, preenchimento da extremidade e nova ligação para criar Yep51NcoDXba. Criou-se outro sítio de Xbal no sítio de BamHI, por digestão com BamHI, preenchimento da extremidade, ligação do ligante (New England Biolabs, # 1081) , digestão de Xbal e nova ligação para gerar YEP51NcoXt. Este plasmido foi digerido com Esp31 e Ncol e ligado a fragmentos de Leu2 e PGKp gerados por RCP. O produto de RCP Leu2 de 2 kb, foi gerado por amplificação a partir do YEP51Nco utilizando iniciadores contendo sítios de Esp31 e BglII. O produto de RCP PGKp com 660 pares de bases, foi gerado por amplificação a partir de pPGKas (Kang, Y.-S. et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10_: 2582-2590) com iniciadores de RCP contendo sítios de BglII e Ncol. 0 plasmido resultante é designado por pLPXt. Modificou-se o pLPXt por meio da inserção de uma região de codificação do lider pre-pro do 123 factor α no sitio de Ncol. Um lider pre-pro foi inserido de tal maneira, que o sitio de clonagem de Ncol foi mantido na extremidade 3' do lider, mas não foi regenerado na extremidade 5'. Desta forma, os receptores podem ser cionados por digestão do plasmido com Ncol e Xbal. O plasmido resultante é designado por pMP15. 0 plasmido pMP15 no qual se inseriu o ADNc do receptor da adenosina Αχ humana, foi designado por p5095. Neste vector, o ADNc do receptor é fundido com a extremidade 3' da sequência lider pre-pro do factor a da levedura. Durante a maturação da proteína, as sequências de peptídio pre-pro são clivadas para gerar receptores maduros de comprimento completo. Isto ocorre durante o tratamento do receptor através da via secretória da levedura. Este plasmido é mantido por meio de uma selecção de Leu (isto é, crescimento em meio com falta de leucina) . A sequência da região de codificação clonada foi determinada e verificou-se que era equivalente à publicada na literatura (GenBank, números de acesso S45235 e S56143) . II. Construção da Estirpe de Levedura

Para criar uma estirpe de levedura que expresse o receptor de adenosina Αχ humana, utilizou-se a estirpe de levedura CY7967 como a estirpe parental inicial. 0 genótipo de CY7967 é o seguinte: MATa gpaDll,63 gpal (41) Gai3 farlD1442 tbt-1 FUS1-HIS3 canl stel4::trpl::LYS2 ste3D1156 lys2 ura3 leu2 trpl his3

Em seguida revêem-se os marcadores genéticos: MATa................................. Entrançamento do tipo a. 124 gpalD1163.................. A proteína G, GPAl, da levedura endógena tinha sido eliminada. gpal(41)Gai3......... gpal(41)Gai3 foi integrada no genoma da levedura. Esta proteína Ga quimérica é composta dos primeiros 41 aminoácidos da subunidade de Ga da levedura endógena GPA1, fundida com Gai3 da proteína G de mamífero, em que os aminoácidos cognados de terminação N tinham sido eliminados. farlD1442.................. Gene FAR1 (responsável pela paragem do ciclo das células), tinha sido eliminando (evitando assim a paragem do ciclo das células após a activação da via da resposta das feromonas). tbt-1.............................. Estirpe com uma elevada eficiência de transformação por meio de electroporação. FUS1-HIS3.................. Uma fusão entre o promotor de FUS1 e a região de codificação de HIS3 (criando assim um gene de HIS3 indutível por feromona). can 1.............................. Arginina/canavinina permease. stel4::trpl::L Rompimento do gene STE14, um C-farnesil- YS2.................................... metiltransferase (baixando assim a sinalização básica através da via das feromonas). ste3D1156.................. STR de levedura endógena, o factor α do receptor de feromona (STE3) foi destruído.

Iis2................................. Defeito na 2-aminopidato reductase, levedura que necessita da lisina para crescer. ura3................................. Defeito na orotidína-5'-fosfato descarboxilase, levedura que precisa de uracilo para crescer.

Ieu2................................. Defeito na b-isopropilmalato desidrogenase, levedura que necessita da leucína para crescer. trpl................................. Defeito no fosforibosílantranilato, levedura que necessita do tripcofano para crescer. 125 his3

Defeito na imidazoleglicerolfosfato desidrogenase, levedura que necessita da histidina para crescer.

Transformaram-se dois plasmidos para a estirpe CY7967 por electroporação: o plasmido p5Q95 (codificando o receptor de adenosina Αχ humana; descrito antes) e o plasmido pl584, que é um plasmido do gene relator de FUSl^-galactosidase. 0 plasmido pl584 derivou do plasmido pRS426 (Christianson, T.W. et al., (1992) Gene 110:119-1122). O plasmido pRS426 contém um sitio de poli-ligação nos nucleótidos 2004-2016. Inseriu-se uma fusão entre o promotor de FUSl e o gene de β-galactosidase nos sítios de restrição EagI e Xhol para criar o plasmido pl584. Manteve-se o plasmido pl584 por meio da selecção de Trp (isto é, crescimento em meio com falta de leucina). A estirpe resultante comportando p5095 e pl584, referida como CY12660, expressa o receptor de adenosina Αχ humana. Para fazer crescer esta estirpe em placas líquidas ou em agar, utilizou-se um meio mínimo isento de leucina e de triptofano. Para realizar um ensaio de crescimento em placas (ensaio FUS1-HIS3), as placas estavam a um pH de 6,8 e continham 3-amino-l,2,4-triazole 0,5-2,5 mM e estavam isentas de leucina, triptofano e histidina. Como controlo para a especificidade, fez-se uma comparação com uma ou mais avaliações do receptor da transmembrana de sete de outras à base de levedura, em todas as experiências.

Construção de Estirpes de Levedura que Expressam o Receptor de Adenosina A2a Humana

Neste exemplo, a construção das estirpes de levedura que expressam o receptor de adenosina Ã2a humana integrado 126 funcionalmente no sistema da feromona da levedura, está descrito. I. Construção do Vector de Expressão

Para produzir um vector de expressão de levedura para o receptor de adenosina A2a humana, obteve-se o ADNc do receptor A2a humana do Dr. Phil Murphy (INH). Depois da recepção deste clone, a inserção do receptor de A2a foi sequenciada e verificou-se que era idêntica à sequência publicada (GenBank número de acesso # S46950). Retirou-se o ADNc do receptor a partir do plasmido por RCP com VENT polimerase e clonou-se no plasmido pLPBX, que conduz a expressão do receptor por meio de um promotor de fosfoglicerato cinase (FGC) constitutivo na levedura. A sequência de toda a inserção foi novamente sequenciada e verificou-se que era idêntica à sequência publicada. Contudo, em virtude da estratégia de clonagem utilizada, houve três arrtinoácidos ligados ao terminal carboxi do receptor, GliSerVal. II. Construção da Estirpe de Levedura

Para criar uma estirpe de levedura que expresse o receptor de adenosina A2a humana, utilizou-se a estirpe CY8342 de levedura, como a estirpe parental inicial. 0 genótipo de CY8342 é o seguinte: MATa farlD1442 tbtl-1 lis2 ’U-ra3 leu2 trpl his3 FUS1-HIS3 canl ste3D1156 gpaDll63 stel4::trpl::LIS2 gpalp-rGasE10K (ou gpalprGasD229S ou gpalp-rGasE10K+D22 9S) .

Os marcadores genéticos são tal como descritos no exemplo 1, excepto para a variação da proteína G. Para a 127 expressão do receptor de A2a humana, utilizaram-se estirpes de levedura, em que a proteína G da levedura endógena GPAl tinha sido eliminada e substituída por uma Gas de mamífero. Utilizaram-se três mutantes de Gas de rato. Estas variantes contêm uma ou duas mutações pontuais, que as convertem em proteínas que se podem acoplar com eficiência ao βγ da levedura. Identificaram-se como GasElQK (na qual o ácido glutâmico na posição dez está substituído por lisina), GasD229S (em que o ácido aspártico na posição 229 está substituído por serina) e GasE10K+D229S (que contém ambas as mutações pontuais).

Transformou-se a estirpe CY8342 (comportando uma das três proteínas mutantes Gas de rato) quer com o vector parental pLPBX (receptor") ou com pLPBX-A2a (receptor+) . Adicionou-se um plasmido com o promotor FUS1 fundido com as sequências que codificam β-galactosidase (descritas antes), para avaliar a dimensão da activação da via da resposta das feromonas.

Ensaio Funcional Utilizando Estirpes de Levedura que Expressam o Receptor de Adenosina Αχ Humana

Neste exemplo, o desenvolvimento de um ensaio de avaliação funcional na levedura para moduladores dos receptores de adenosina Αχ humana, está descrito. I. Ligandos Utilizados no Ensaio

Utilizou-se adenosina, um agonista natural para este receptor, assim como, dois outros agonistas sintéticos, para o desenvolvimento deste ensaio. A adenosina, referida como tendo um CE50 de, aproximadamente, 75 nM e (-)-N6-(2- 128 fenilisopropil)-adenosina (PIA) com uma afinidade relatada de, aproximadamente, 50 nM, foram utilizadas num subconjunto de experiências. Utilizou-se 5'-N-etilcarboxamido-adenosina (NECA) em todos os ensaios de crescimento. Para evitar a sinalização devida à presença de adenosina no meio de crescimento, adicionou-se a todos os ensaios adenosina desaminase (4 U/mL). II. Resposta Biológica na Levedura A capacidade do receptor de adenosina Αχ para acoplar funcionalmente num sistema heterólogo de levedura, foi avaliado por introdução do vector de expressão do receptor Αχ (p5095, descrito antes) numa série de estirpes de levedura, que expressam diferentes subunidades da proteína G. A maioria destes transformantes expressaram subunidades de Ga do subtipo de Gai ou Ga0. Ensaiaram-se também proteínas Ga adicionais para a possível identificação de acoplamentos promíscuos entre o receptor e a proteína Ga. Nas várias estirpes, integrou-se uma STE18 ou uma estrutura quimérica de STE18-Gy2 no genoma da levedura. As estirpes de levedura exibiram um gene de HIS3 defeituoso e uma cópia integrada de FUS1-HIS3, permitindo assim a selecção num meio selectivo contendo 3-amino-l,2,4-triazole (ensaiado a 0,2, 0,5 e 1,0 mM) e com falta de histidina. Isolaram-se os transformantes e prepararam-se mono-camadas no meio contendo 3-amino-l,2,4-triazole, 4 U/mL de adenosina desaminase e com falta de histidina. Aplicaram-se cinco microlitros das várias concentrações de ligando (por exemplo, NECA a 0, 0,1, 1,0 e 10 mM). Controlou-se o crescimento durante 2 dias. Ensaiaram-se as respostas do crescimento dependentes de ligando desta forma, nas várias estirpes de levedura. Os resultados estão resumidos no quadro 3 a seguir. O símbolo (-) indica que a activação do receptor dependente do ligando não foi 129 detectada, enquanto (+) assinala a resposta dependente do ligando. O termo "LIRMA" indica a activação mediada pelo receptor independentemente do ligando.

Quadro 3

Estirpe de Levedura Subunidade de Ga Subunidade de Gy Variantes da estirpe Resultados CY1316 GPAi STE18 - GPA4 1-Gaii + GPA4 1-Gai2 + GPA4 1-Gai3 + GPA4 l-Gaiz-Gaos LIRMA GPA4 l-GasE10K - GPA4 l-GasD22 9S - CY7967 GPA41-Gcd3 integrado v.Q·: STE18 +++ 1 CY2120 GPAi STE18 sst2A + GPA41-Gaii + GPA41-Gai2 4- GPA41-Gai3 + αΡΑ41-βα12_6αο3 LIRMA GPA4 l-GasE10K - GPA41-GasD229S - CY9438 GPAi STE18-GY2 - GPA41-Gaii + GPA41-Gai2 + GPA41-Gai3 + GPA4 l-Gai2-Gaos LIRMA GPA4 l-GasEl 0K - GPA4 l-GasD22 9S - CY10560 GPAx-integrado STE18-Gy2 sst2A ++

Tal como se indica no quadro 3, a sinalização mais robusta"' ocorreu numa estirpe de levedura que expressou a GPAI (41)-Gai3 quimérica. 130

III. Ensaio de fusl-LacZ

Para caracterizar de uma forma mais completa a activação da via de resposta das feromonas, mediu-se a síntese de β-galactosidase através de fuslLacZ na resposta à estimulação do agonista. Para realizar o ensaio de β-galactosidase, adicionaram-se concentrações crescentes do ligando à cultura em meio logarítmico de receptor de adenosina Ai humana, expressa numa estirpe de levedura que co-expressa uma STE18-Gy2 quimérica e GPA41-Gai3. Isolaram-se os transformantes e fizeram-se crescer durante a noite na presença de histidina e 4 U/mL de adenosina desaminase. Passadas cinco horas de incubação com 4 U/mL de adenosina desaminase e ligando, mediu-se a indução de β-galactosidase utilizando CPRG como o substrato para β-galactósido. Utilizaram-se 5 x 105 células por ensaio.

Os resultados obtidos com a estimulação por NECA indicaram que a uma concentração de NECA de IO"8 M, conseguia-se uma estimulação da actividade de β-galactosidase, aproximadamente, superior em 2 vezes. Além disso, observou-se um índice de estimulação de, aproximadamente, 10 vezes para uma concentração de NECA de 10"5 M. A utilidade deste ensaio foi muito grande porque validou a actividade dos antagonistas nesta estirpe. Ensaiaram-se dois antagonistas conhecidos de adenosina, XAC e DPCPX, quanto à sua capacidade para competir contra NECA (a 5 mM) no que respeita à actividade no ensaio de β-galactosidase. Nestes ensaios, mediu-se a indução de β-galactosidase utilizando FDG como o substrato e 1,6 x 105 células por ensaio. Os resultados indicaram que tanto XAC como DPCPX serviram como antagonistas potentes do receptor de adenosina 131

Ai expresso na levedura, com valores de CI50 de 44 nM e 49 nM, respectivamente.

Para determinar se este efeito inibidor era especifico do subtipo de Ai, reaiizou-se uma série de experiências complementares com o ensaio de receptor de A2a à base de levedura (descrito no exemplo 4). Os resultados obtidos com o ensaio à base de levedura de A2a, indicaram que XAC era um antagonista do receptor de A2a relativamente efectivc-, consistente com relatórios publicados. Pelo contrário, DPCPX era relativamente inerte neste receptor, tal como se esperava a partir dos relatórios publicados. IV. Ligação de Rádio-Ligandos 0 ensaio do receptor de adenosina Ai foi melhor caracterízado por meio da medição dos parâmetros de ligação do rádio-ligando ao receptor. A ligação de deslocamento de (3H)CPX por meio de vários compostos de referência do receptor de adenosina, XAC, DPCPX e CGS, foi analisada utilizando membranas preparadas a partir de levedura expressando o receptor de adenosina Ai humana. Os resultados com membranas de levedura que expressam o receptor de adenosina Ai humana, foram comparados com os das membranas de levedura que expressa o receptor de adenosina A2a humana ou o receptor de A3 humana, para examinar a especificidade da ligação. Para realizar o ensaio, fez-se a incubação de 50 mg de membranas com (3H)CPX 0,4 nM e concentrações crescentes dos ligandos do receptor de adenosina. A incubação foi feita em Tris-HCl 50 mM, a pH 7,4, EDTA 1 mM, MgCl2 10 mM, ASB a 0,25 % e 2 U/rrtL de adenosina desaminase, na presença de

inibidores de protease, durante 60 minutos, à temperatura ambiente. A ligação terminou pela adição de Tris-HCl 50 mM arrefecido com gelo, a pH 7,4 mais MgCl2 10 mM, seguido de 132 filtração rápida em filtros GF/B previamente moídos com polietianimina a 0,5 %, utilizando um dispositivo de colheita com 96 microtubos da Packard. Analisaram-se os dados por meio de um processo de ajustamento da curva não linear dos mínimos quadrados, utilizando o software Prism 2.01. Os valores de CI50 obtidos nesta experiência, estão resumidos no quadro 4 a seguir: QUADRO 4 CI50 (nM) Composto hAxR hA2aR hA3R XAC 6, 6 11,7 53, 1 DPCPX 8,5 326, 4 1,307,0 CGS-15943 13, 1 15, 8 55,5 NECA 215, 5 294,9 34,9 R-PIA 67, 6 678,1 23, 6 IB-MECA 727,7 859, 4 3,1 Aloxozina 1.072,0 1.934,0 8.216,0

Estes dados indicam que os compostos de referência têm actividades consistentes com as referidas na literatura. Os dados indicam ainda que os ensaios à base de levedura têm uma sensibilidade suficiente para descriminar a especificidade do subtipo do receptor.

Ensaio Funcional Utilizando Estirpes de Levedura que Expressam o Receptor de Adenosina A2a Humana

Neste exemplo, descreve-se o desenvolvimento de um ensaio de avaliação funcional em leveduras quanto aos moduladotes do receptor de adenosina Αχ humana. I. Ligandos Utilizados nos Ensaios O ligando natural da adenosina, assim como, outros ligandos disponíveis comercialmente e cuidadosamente 133 caracterizados, foram utilizados para estudar o receptor de A2a humana expresso funcionalmente na levedura. Utilizaram-se três ligandos para estabelecer este ensaio. Incluem:

Ligando Adenosina

Kj relatado Função

500 nM 5' -N-etilcarboxamidoadenosina

10-15 nM agonista agonista (NECA) (-)-N6-(2-fenilisopropil)- 100-125 nM agonista adenosina (PIA)

Para evitar a sinalização devida à presença de adenosina no meio de crescimento, adicionou-se adenosina desaminase (4 U/mL) a todos os ensaios. II. Resposta Biológica na Levedura

Analisaram-se os agonistas do receptor A2a quanto à capacidade para estimular a via de resposta da feromona nas leveduras transformadas com o plasmido de expressão do receptor de A2a e expressando quer GasE10K, GasD229S ou GasE10K+D229S. A capacidade do ligando para estimular a via da resposta das feromonas numa forma dependente do receptor, foi indicada por uma alteração no fenótipo da levedura. A activação do receptor modificou o fenótipo de auxotrofia de histidina para prototrofia de histidina (activação de fusl-HIS3). Isolaram-se três transformantes independentes e fizeram-se crescer durante a noite, na presença de histidina. Lavaram-se as células para eliminar a histidina e diluiu-se para 2 x 106 células/mL. Incluiu-se 5 pL de cada transformante num meio não selectivo (incluindo histidina) ou num meio selectivo (AT 1 mM) na presença ou na ausência de 4 U/mL de adenosina desaminase. Fez-se crescer as placas a 30 °C, durante 24 horas. Na presença de histidina, tanto as estirpes do receptor+ (R+) como as estirpes do receptor” (R”) 134 foram capazes de crescer. Contudo, na ausência de histidina, apenas cresceram as células R+. Dado que não tinha sido adicionado nenhum ligando a estas placas, são possíveis duas explicações para este resultado. Uma interpretação possível é que a levedura que se liga ao receptor estava em vantagem de crescimento devido à activação mediada pelo receptor independentemente do ligando (LIRMA). Alternativamente, a levedura podia ter sintetizado a adenosina do ligando. Para distinguir estas duas possibilidades, adicionou-se à levedura de crescimento e às placas, uma enzima que degrada o ligando, a adenosina desaminase (ADA). Na presença das células R+ de adenosina desaminase, não houve mais crescimento na ausência de histidina, indicando que a levedura era na verdade um ligando de síntese.

Esta interpretação foi confirmada por um ensaio de crescimento de A2a em liquido. Nesta experiência a levedura R+ (uma estirpe de GasElOK que expressa o receptor de A2a) , foi inoculada a três densidades (1 x 106 células/mL; 3 x 105 células/mL; ou 1 x 105 células/mL) , na presença ou na ausência de adenosina desaminase (4 U/mL). 0 rigor do ensaio foi aumentado com as concentrações crescentes (0, 0,1, 0,2 ou 0,4 mM) de 3-amino-l,2,4-triazole (AT), um antagonista competitivo de imidazoleglieerol-P-desidratase, o produto de proteína do gene HIS3. Na presença de adenosina desaminase e 3-amino-l,2,4-triazole, a levedura cresceu menos vigorosamente. Contudo, na ausência de 3-amino-l,2,4-triazole, a adenosina desaminase teve pouco efeito. Assim, a própria adenosina desaminase não tinha um efeito directo na via de resposta da feromona.

Uma abordagem alternativa para medir o crescimento e uma que pode ser feita em miniatura para uma avaliação elevada do resultado, é um ensaio de mancha do ligando do receptor de 135 A2a· Fez-se crescer durante a noite uma estirpe de GasElOK expressando o receptor de A2a (R+A2a) ou com falta de receptor (Ff), na presença de histidina e 4 U/mL de adenosina desaminase. Lavaram-se as células para eliminar a histidina e diluiu-se para 5 x 106 células/mL. Pulverizaram-se 1 x 106 células/mL sobre as placas selectívas contendo 4 U/mL de adenosina desaminase e 3-amino-l,2,4-triazole (AT) 0,5 ou 1,0 mM e deixou-se secar durante 1 hora. Aplicou-se 5 pL dos reagentes que se seguem à mono-camada: adenosina 10 mM, histidina 38,7 mM, dimetilssulf óxido (DMSO), PIA 10 mM ou NECA 10 mM. Fez-se crescer as células durante 24 horas, a 30 °C. Os resultados mostraram que as células sem receptor apenas podiam crescer quando se adicionava histidina ao meio. Pelo contrário, as células com R+ apenas cresceram em áreas em que os ligandos do receptor de A2ar PIA e NECA tinham sido pulverizados. Dado que as placas que continham adenosina desaminase, a falta de crescimento nos sítios em que a adenosina tinha sido pulverizada, confirmaram que a adenosina desaminase estava activa.

III. Ensaio de fuslLacZ

Para quantificar a activação da via de acoplamento da levedura, mediu-se a síntese de β-galactosidase através de fusllacZ. Transformaram-se as estirpes que expressam GasE10K, GasD229S ou GasE10K+D229S com um plasmido que codifica o receptor de A2a humana (R+) ou com um plasmido em que falta o receptor (R_) . Isolaram-se os transformantes e deixou-se crescer durante a noite na presença de histidina e 4 U/mL de adenosina desaminase. Diluiu-se 1 x 10' células para 1 x 106 células/mL e expôs-se a concentrações crescentes de NECA, durante 4 horas, seguida de determinação da actividade de β-galactosidase nas células. Os resultados demonstraram que não se detectou praticamente nenhuma actividade de β- 136 galactosidase na estirpes de Ff, enquanto que se detectaram quantidades crescentes da actividade de β-galactosidase nas estirpes R+ que expressam quer GasE10K, GasD229S ou

GasE10K+D229S, à medida que aumentou a concentração de NECA, indicando um aumento dependente da dose nas unidades de β-galactosidase detectadas em resposta à exposição a uma concentração crescente de ligando. Esta dependência da dose foi apenas observada em células que expressam o receptor de Ã2a * Além disso, a estrutura de Gas mais potente para o receptor de A2a, foi GasE10K. A estrutura GasD229S foi a segunda estrutura mais potente de Gas para o receptor de A2a, enquanto que a estrutura de GasE10K+D229S foi a menos potente das três estruturas de Gas, embora mesmo a estrutura de GasE10K+D229S estimulou quantidades facilmente detectáveis de actividade de β-galactosidase.

Para uma descrição mais detalhada dos ensaios identificados, ver a série do pedido de patente de invenção norte-americana N°. 09/088985, intitulada "Functional

Expression of Adenosine Receptors in Yeast", registada em 2 de Junho de 1998 (Attorney Docket N°. CPI-093), cujo conteúdo se incorpora aqui como referência.

Caracterização Farmacológica dos Subtipos dos Receptores Humanos de Adenosina

Materiais e Processos

Materiais: Comprou-se [3H]-DPCPX [ciclopentíl-1,3- dípropilxantina, 8-[dipropil-2,3-3H (N) ] (120,0 Ci/mmole); [3H] -CGS 21680, [carboxietil-3H (N) ] (30 Ci/mmole) e [i25I] -AB- MECA ( [lz5I] -4-amínobenzil-5'' -N-metilcarboxamido-adenosina) (2,200 Ci/mmole) no New England Nuclear (Boston, MA). XAC (cogeração de amina e xantina) ; NECA (5'-N- 137 etilcarboxamido-adenosina); e IB-MECA do Research Biochemicals International (RBI, Natick, MA). Compraram-se os comprimidos com um cocktail de adenosina desaminase e um inibidor completo de protease na Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, IN). As membranas das células HEK-293 que expressam estavelmente a subtipos do receptor de adenosina A.2a humana [RB-HA2a] ; adenosina A2b [RB-HA2b] ou adenosina A3 [RB-Hr3] , respectivamente, foram comprados no Receptor Biology (Beltsvile, MD) . Os reagentes da cultura de células foram comprados na Life Technologies (Grand Island, NY) excepto para o soro que foi comprado na Hyclone (Logan, UT).

Estirpes de Levedura: Estirpes de Saccharomyces cerevisiae CY12660 [farl*1442 tbtl-1 fusl-HIS3 canl stel4 : : trpl: : LIS2 ste3*1156 gpal (41)-Gai3 lis2 ura3 leu2 trpl : his3; LEU2 PGKp- MfalLeader-hAlR-F05term 2mu-orig REP3 Ampr] e CY8362 [gpalp-r G^EIOR farl*1442 tbtl-1 fusl-HIS3 canl stel4: : trpl: LIS2 ste3*1156 lis2 ura3 leu2 trpl his3; LEU2 PGKp-hA2aR 2mu-ori REP3Ampr], foram desenvolvidas como se descreveu antes.

Cultura de Levedura: fez-se crescer levedura transformada em meio de Leu-Trp [LT] (pH 5,4), complementado com glicose a 2 %. Para a preparação de membranas, inoculou-se 250 mL do meio LT com um titulo inicial de 1-2 x 106 células/mL de uma cultura de 30 mL feita à noite e incubada a 30 °C, em permanente oxigenação por rotação. Passadas 16 horas de crescimento, ..colheram-se as células por centrifugação e preparam-se membranas tal como se descreve a seguir.

Culturas de Tecido de Mamífero: Fez-se crescer células HEK-293 que expressam estavelmente o subtipo do receptor de 138 adenosina 2a humano (clone Cadus # 5) em meio essencial mínimo de Dulbeco (MEMD), complemento com soro bovino fetal a 10 % e 1 X penicilina/estreptomicina, sob uma pressão selectiva, utilizando 500 mg/mL do antibiótico G418, a 37 °C, numa atmosfera de C02 a 5 % humidificada.

Preparações da Membrana das Células de Levedura: Colheram-se 250 mL de culturas após uma noite de incubação, por centrifugação, a 2.000 x g, numa centrifugadora RT6Q00 da Sorvai. Lavaram-se as células em água arrefecida com gelo, centrifugou-se a 4 °C e voltou a suspender-se a massa no seio de 10 mL de tampão de lise arrefecido com gelo [Tris-HCl 5 mM, pH 7,5; EDTA 5 mM; e EGTA 5 mM] , complementado- com comprimidos de um cocktail de inibidor de protease (um comprimido por 25 mL de tampão). Adicionaram-se pérolas de vidro (17 g; Mesh400-600; Sigma) à suspensão e partiram-se as células por uma centrifugação vigorosa, a 4 °C, durante 5 minutos. Diluiu-se o produto homogeneizado com mais 30 mL de tampão de lise mais inibidores de protease e centrifugou-se a 3.000 x g, durante 5 minutos. Subsequentemente, colocaram-se as membranas em placas a 36.000 x g (rotor do tipo SS34, RC5B da Sorvai), durante 45 minutos. A massa de membrana resultante foi novamente suspensa em 5 mL de tampão de membrana [Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; EDTA 0,6 mM; e MgCÍ2 5 mM] complementado com comprimidos de um cocktail inibidor de protease (1 comprimido por 50 mL de tampão) e armazenou-se a -80 °C para outras experiências.

Preparações da Membrana das Células de Mamíferos: Prepararam-se células de HEK-293, tal como se descreveu previamente (Duzic E et al.: J. Biol. Chem267r 9844-9851, 1992). Em resumo, lavaram-se as células com SBF e colheram-se com uma fita de polícia. Juntaram-se as células a 4 °C, a 200 x g numa centrifugadora RT6000 da Sorvai. Voltou a fazer-se 139 uma suspensão com argamassa em 5 mL/prato de tampão de lise a 4 °C (Trís-HCi 5 m, pH 7,5; EDTA 5 mM; EGTA 5 mM; fluoreto de fenilmetilssulfonilo 0,1 mM, 10 mg/mL de pepstatina A; e 10 mg/mL de aprotinina) e homogeneizou-se num homogeneizador da Dounce. Centrifugou-se então o lisado das células a 36.000 x g (rotor do tipo SS34, RC5B da Sorvai), durante 45 minutos e voltou a suspender-se a massa em 5 rnL de tampão de membrana [Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; EDTA 0,6 mM; MgCl2 5 mM; fluoreto de fenilmetilssulfonilo 0,1 mM, 10 mg/mL de pepstatina A; e 10 mg/mL de aprotinina) e armazenou-se a -80 °C para outras experiências.

Os kits de ensaio da proteína Bío-Rad, baseiam-se no processo de ligação do corante de Bradford (Bradford, M. : Anal. Biochem, 72:248 (1976)) foram utilizadosp ara determiner a concentração total de proteína na levedura e nas membranas dos mamíferos.

Saturação e Competição da Ligação do Radio-Ligando dos Subtípos dos Receptores de Adenosína 1: A saturação e a competição da ligação nas membranas das células de levedura transformadas com o subtipo do receptor Ai humano, foram realizadas utilizando o antagonista [3H]DPCPX como um ligado radíoactivo. Diluíram-se as membranas em tampão de ligação [Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; contendo MgCl2 10 mM; EDTA 1,0 mM; ASB a 0,25 %; 2 U/mL de adenosina desaminase e 1 comprimido de cocktail de inibidor de protease/50 mL] , a concentrações de 1,0 mg/mL.

Incubou-se em membranas de saturação da ligação (50 pg/tubo) com concentrações crescentes de [JH]DPCPX (0,05-25 nM) , no seio de um volume final de 100 pL de tampão de ligação, a 25 °C, durante 1 hora, na presença ou na ausência 140 de XAC não marcado 10 mM, numa placa microtituladora de 96 microtubos.

Comparação das membranas de ligação (50 pq/tubo) foram incubadas com [3H]DPCPX (1,0 nM) , num volume final de 100 mL de tampão de ligação, a 25 °C, durante 1 hora, na presença ou na ausência de XAC não marcado 10 μΜ ou concentrações crescentes de compostos de competição numa placa microtituladora de 96 microtubos.

Ligação do Radio-ligando de Competição com o Subtipo do Receptor de Adenosina 2a: A ligação de competição nas membranas a partir de células HEK293 que expressam estavelmente o subtipo do receptor A2a humano, foi realizada utilizando o agonista [3H]CGS-21680 como um ligando radioactivo. Diluíram-se as membranas em tampão de ligação [Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; contendo MgCl2 10 mM; EDTA 1,0 mM; ASB a 0,25 %; 2 U/mL de adenosina desaminase e 1 comprimido do cocktail iríibidor de protease/50 mL] , a concentrações de 0,2 mg/mL. Incubaram-se as membranas (10 pg/microtubo) com [3H] CGS-21680 (100 nM) , para um volume final de 100 mL de tampão de ligação, a 25 °C, durante 1 hora, na presença ou na ausência de NECA não marcado 50 pM ou concentrações crescentes de produtos de competição numa placa microtituladora com 96 microtubos.

Ligação do Radio-ligando de Competição do Receptor de Adenosina 3: A ligação de competição nas membranas a partir de células HEK293 que expressam estavelmente o subtipo do receptor A3 humano, foi realizada utilizando o agonista [ IJAB-MECA como um ligando radioactivo. Diluíram-se as membranas em tampão de ligação [Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; contendo MgCl2 10 mM; EDTA 1,0 mM; ASB a 0,25 %; 2 U/mL de adenosina desaminase e 1 comprimido do cocktail ínibidor de 141 protease/50 mL] , a concentrações de 0,2 mg/mL. Incubaram-se as membranas (10 pg/microtubo) com [ 125I ] AB-MECA (0,75 nM) , para um volume final de 100 mL de tampão de ligação, a 25 °C, durante 1 hora, na presença ou na ausência de IB-MECA não marcado 10 μΜ ou concentrações crescentes de produtos de competição numa placa microtituladora com 96 microtubos.

No fim da incubação, os ensaios de ligação do radio-ligando dos subtipos do receptor Αχ, A2a e A3, terminou pela adição de tampão de Tris-HCl 50 mM arrefecido com gelo (pH 7,4), complementado com MgCl2 10 mM, seguido de uma rápida filtração em filtros de fibra de vidro (96 microtubos GF/B UniFilters, Packard) previamente pré-moídos em polietilonimina a 0,5 % num dispositivo de recolha de células Filtermate 196 (Packard). Secaram-se as placas de filtros revestidas com 50 pL/microtubo de fluido de cintilação (MicroScint-20, Packard) e contaram-se num TopCount (Packard). Realizaram-se os ensaios em triplicado. A ligação não específica foi de 5,6 + 0,5 %, 10,8 + 1,4 % e 15,1 + 2,6 % da ligação total, num ensaio de ligação de AiR, A2aR e A3R, respectivamente.

Ligação do Radio-ligando de Competição com o Subtipo do Receptor de Adenosina 2b: A ligação de competição nas membranas a partir de células HEK293 que expressam estavelmente o subtipo do receptor A2b humano, foi realizada utilizando o antagonista do receptor Ax [3H]DPCPX como um ligando radioactivo. Diluíram-se as membranas em tampão de ligação [HEPES-KOH 10 mM, pH 7,4; contendo EDTA 1,0 mM; benzamidina 0,1 mM e 2 U/mL de adenosina desaminase], a

concentrações de 0,3 mg/mL. Incubaram-se as membranas (15 pg/microtubo) com [3H]DPCPX (15 nM) , para um volume final de 100 mL de tampão de ligação, a 25 °C, durante 1 hora, Πα presença ou na ausência de XAC não marcado 10 μΜ OU 142 concentrações crescentes de produtos de competição numa placa mícrotituladora com 96 mícrotubos. No fím da incubação, os ensaio terminou pela adição de HEPES-KOH 10 mM arrefecido com gelo (pH 7,4), seguido de uma rápida filtração em filtros de fibra de vidro (96 microtubos GF/B UniFilters, Packard) previamente pré-moídos em polietilonimina a 0,5 % num dispositivo de recolha de células Filtermate 196 (Packard). Secaram-se as placas de filtros revestidas com 50 pL/microtubo de fluido de cintilação (MicroScint-20, Packard) e contaram-se num TopCount (Packard). Realizaram-se os ensaios em triplicado. A ligação não especifica foi de 14,3 + 2,3 % da ligação total.

Definiu-se a ligação especifica de [JH] DPCPX; [3H] CGS-21680 e [lz5I] AB-MECA como a diferença entre a ligação total e a ligação não específica. A percentagem de inibição dos compostos foi calculada em função da ligação total. Analisaram-se os dados comparativos por ajustamento da curva interactiva a um modelo de sítio e calcularam-se os valores de Ki a partir dos valores de CI50 (Cheng e Prusof, Biochem.· Pharmacol. 22, 3099-3109, 1973) utilizando o software GrafPad Prizm 2.01.

Resultados

Uma função principal de alguns receptores da superfície das células, é reconhecer os ligandos apropriados. DE acordo com isto, os requerentes determinaram as afinidades de ligação do ligando, para estabelecer a integridade funcional do subtipo do receptor de adenosina 1 expresso na levedura. As membranas impuras preparadas a partir de Saccharomices cerevisiae transformadas com a estrutura do subtipo do receptor de adenosina 1 humano, exibiu uma ligação saturada, específica de [3H]DPCPX com um KD de 4,0 + 0,19 nM. Os 143 foram calculados a partir da isotérmica valores de KD e Bmax de saturação e transformação de Scatchard dos dados indicando uma única classe de sítios de ligação. As densidades dos sítios de ligação de adenosina nas preparações de membranas de levedura, foram estimadas como 716,8 + 43,4 fmole/mg de proteína da membrana.

As características farmacológicas do subtipo das células de levedura recombinante transformadas com o subtipo do receptor de Ai humano, foram investigadas com subtipos de ligandos selectivos de adenosina (XAC, DPCPX; CGS-15943; composto 600; composto 1002; NECA, (R)-PIA; IB-MECA e aloxazina) , que se compararam com [JH] DPCPX numa ordem de classificação esperada, As curvas de deslocação registadas com estes compostos, mostram a inclinação típica com todos os ligandos e os dados para cada um dos ligandos podem ser modulados por um ajustamento num sítio. As constantes de dissociação aparente estimadas para o composto individual a partir das curvas (quadro 5) são consistentes com o valor publicado para o receptor obtido a partir de outras fontes.

Quadro 5

Valores de Ki para as membranas de células de levedura, transformadas com o subtipo do receptor de Ai humano

Ligandos Ki (nM) XAC 5, 5 DPCPX 7,1 CGS-1594 10,8 NECA 179, 6 (R)-PIA 56, 3 IB-MECA 606, 5 Aloxazina 894,1 Composto 600 13, 9 Composto 1002 00

Os quadros 6 a 12 demonstram a eficácia e os perfis de actividade da estrutura de deazapurinas da presente invenção. Os quadros 13 e 14 demonstram que a selectividade pode ser conseguida para os sítios do receptor de adenosina humana por meio da modulação da funcionalidade próxima das deazapurinas. 0 quadro 14 também demonstra a descoberta surpreendente de que os compostos aqui estabelecidos têm actividade sub-nanomolar e uma selectividade mais elevada para o receptor de A2b quando comparados com os compostos no quadro 13. 145 QUADRO 6

Efeito do Substituinte de N6 nhr N il ce Me Me í H Ai Compostos R Ligação Ki (nM) Levedura Ciso (nM) Ref. 600 i-O 13, 9 97,2 Ref. 601 1.423 >10.000 Ref. 602 .OH j·—/ V—QH 483,5 >10.000 Ref. 603 OH / l—/ OH 8 \ j wn 196, 9 4.442,0 Ref. 604 ,- HO KJ-H- >10.000 >10.000 Ref. 605 - Η O K_j-“ >10.000 >10.000 Ref. 606 297,9 >10.000 Ref. 607 K0 309, 7 >10.000 608 (í) 29, 1 609 κχΗ 193, 9

Ref. 610 vO 1 <+> OH “ 411,5 Ref. 611 K>Y‘ 785,6 >10.000 Ref. 612 vd x : ÃHAc Trans (S.S) 64,8 Ref. 613 vO ÃHAc Trans (R.R) 6.726,0 Ref. 614 P (dl) 32,1 Ref. 615 Xl ' (dl) 816, 9 2.577,0 Ref. 616 κα» 'OH 34,3 QUADRO 7

Efeito do Substituinte de C2

147

Ai Compostos de R Ligação Levedura Referência Ki (nM) CI50 (nM) 700 co 604,5 >10.000 701 tf Ό 157,7 763,1 702 ÇR 198,5 2.782,5 703 Cm 443, 6 >10.000 704 íf 61,1 297,0 705 30, 1 194,7 706 ço F 19, 9 707 tfò 62,8 708 >+ 2.145 709 F γ\ 48,7 148 QUADRO 8

Efeito do Substítuinte do Anel de Pirrole

Ai Compostos de Referência R R' R' ' R, / > Ligação Ki (nM) CI50 (nM) da levedura 800 θ' Me Me Me 3.311 >10.000 801 θ' Η Me H 22,3 148,3 802 θ' Η Η Me 8,9 803 θ' 20 Me Me 2.210 >10.000 804 θ' όΟ Me Me 863, 1 805 θ' yο Me Me 4.512 806 θ' Me Me 8.451 807 θ' yo Me Me 35, 3 149

QUADRO

Ax Compostos de Referência R Ligação Κχ (nM) CI5o (nM) da levedura 900 vO" 836, 1 901 *jO 4.512 902 8.451 903 35,3 QUADRO 10

Efeito do Substituinte de N6

Αχ Compostos de Referência R Ligação Κχ (nM.) CI50 (nM) da levedura 1000 1.789 >10.000 1001 H 1 O 54,4 1.865 150 1002 H 0 9, 8 82,8 1003 <^HY\ 0 26,7 195,7 1004 A 0 32,8 545,8 1005 í X il Õ 147,5 3.972 1006 ν-γ\ 0 151,7 2.918 1007 o V^NH-S-Me ' 0 692,5 >10.000 1008 V^VNH^—v/COOH í 0 93,1 3.217 1009 0 475,3 >10.000 1010 NT^^NHAc 674, 9 9.376,0 1011 -OAc 121,9 2.067,5 1012 0 n 233,9 3.462 1013 0 . 11 270,1 3.009,5 1014 384,9 2.005 1015 ^Γ^^ΟΗ 179,3 3.712 1016 Χχ^/0Η 176, 1 5.054 QUADRO 11

Efeito do Substituinte de N6

151

Ai Compostos de Referência R Ligação Ki (nM) Levedura CI50 (nM) 1100 0 9, 8 _L J- Zj f 4 1101 v—V NH -NH, O 53, 9 551, 0 1102 0 10,3 101, 3 1103 V—s_.NH .NHEt T 0 71,1 3.217 1104 orV* Me 0 Cr) 6, 5 58,7 1105 H -γ Me 0 (;) 105,4 472, 1 1106 Me H 0 (I) 27,8 162,4 1107 Me H 0 <*> 126, 5 1.297,0 1108 |^v^.NHAc 2,3 1109 |J\^NHAc 9,0 1110 J^^,NHAc ls 17,3 1111 t^v^NHAc 1 1 R 2,5 1112 lA^NHAc 213 QUADRO 12

Análogos de "Retro-amidas"

Ai Compostos de Referência R Ligação Ki (nM) Levedura CI50 (nM) 1200 0 1! 16, 5 189, 4 1201 O 7,4 45, 7 1202 0 1 H 95,8 3.345,0 1203 O 529, 1 4.040,0 1204 O X OH % 1.060,0 >10.000 1205 0 11 1.272 >10.000 1206 % li 0 50, 8 4.028 1207 ν^γΝΗΜβ 0 48,5 701,5 QUADRO 13

Perfil de Antagonistas Selectivos de Adenosina HN X Me f iT^-Me Ph^N^N rí Ligação K, (nM) Compostos de Referência R Aj A2a &2b a3 1300 ^^^.NKAC 9, 8- 25, 1 18,0- 48, 6 80,3 513,0 1301 Me 27,8 50,7 84, 6 429, 8 1302 H ' II 0 20,2 75, 6 20, 1 4,3 1303 0 ^ X 'ts^XNHMe 17, 4 111,3 120, 6 44, 6 1304 Q- 13, 9- 30, 9 933,7 138,0 21,5 13051 £T 4 6,6 730, 9 30 % 9,9 13062 £T 16, 4 766, 3 168,3 71,7 1307 1—1 (di) 29, 1 190, 6 1.143,0 3,1 1308 í-oí; 180 230 670 1,0 1309 H I U í N 40 109 109 0, 3 154 1310 ^ ? H 255 76 % 275 <2, 6 1311 H 531 981 736 5,3 1312 ^(CH^|íAN(We I H 443 2.965 37 5 <6,2 13133 >WnX£*· 1 H 30 % 65 % 515 24 1314 >4 ° H 87 204 30 0, 02 1315 ^ΗώχΝΑ^ΝΗ,· 1 H 75.000 720.000 3.400 507 1316 0 1 H 333 710.000 710.000 97 1317 M asJ 0 710.000 710.000 720.000 369 13184 *0" 3,7+0,5 630+56,4 2.307 + 926 630+76 13194'5 w χ-^„,,·ΟΗ 1, 8 206 802 270 13204'6 „..OH 8,0 531 530 419 13214,7 0 8, 0 131 1.031 54 %e 12-tienil-2-íIo; 3C5-H; 3solúvel em água; os símbolos K5 e R6 representam átomos de hidrogénio; 5o símbolo R3 representa um grupo 3-fluorofenilo; 6o símbolo R3 representa um grupo 3-clorofenilo; 'o símbolo R3 representa um grupo 4-piridilo; 8 % da actividade 0 10 μΜ, 155 QUADRO 14

Perfil dos Antagonistas Selectivos de A2b *2y° HN J 1 fl Λ- qAJ "Ή H Compostos de Referência XRi r2 Ligação Ki (nM) Ai A2a A2b a3 1400 -O-Ph Me 41,7 21 10,3 14, 6 1401 -O-Ph (p)F Me 33 58 8, 8 18 1402 -O-Ph(p)Cl Me 825 591 22 60 1403 -N-piridin-2-ona Me 60 41 18 48 1404 -NH-Ph Me 49 31 4, 6 57 QUADRO 15

Compostos Selectivos do Receptor de Adenosina Ai * pelo menos 10 vezes mais selectivos do que os outros três sub-tipos.

Compostos Estrutura Ki-Ai Relativo a Kí—A2a Relativo a Ki-A2b Relativo a Ki—A3 706 Ref. Ό, . •^ár k 156 1318 Ref . "a ~k 1319 Ref. rO- F :k 1320 Ref. rO~· çÍQ o k 1500 Γ oc. * 1321 Ref. P NH 0^ * 157 1501 qÍ? * 1502 0 **P—/ >0*.....-C»i bò? O 1503 Ό. * 1504 U (A) * A presente invenção baseia-se em compostos que se ligam selectivamente ao receptor de adenosina Α23, tratando assim uma doença associada com o receptor de adenosina A2a num indivíduo, por meio da administração ao indivíduo de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico desses compostos. A doença a ser tratada, está associada com doenças, por exemplo, um distúrbio do sistema nervoso central, um distúrbio cardiovascular, um distúrbio renal, um distúrbio respiratório, um distúrbio gastrointestinal, um distúrbio ocular, um distúrbio alérgico ou um distúrbio respiratório. 158 Δ presente invenção também tem por objecto um composto com a estrutura geral:

em que NFqí^ representa um grupo (D)-2-aminocarbonil-N-pirrolidinilo, (D)-2-hidroximetil-N-pirrolidinilo, (D)-2-hidroximetil-traiis-4-hidroxi-N-pirrolidinilo ou N- piperazinilo; em que o símbolo R3 tem o significado definido antes; em que o símbolo R5 representa um átomo de H, um grupo fenilo

em que o símbolo R6 representa um átomo de H, um grupo alquilo ou cícloalquilo; e um composto com a estrutura anterior, em que NR1R2 representa um grupo 3-hidroximetil-N-piperidinilo; em que o símbolo R3 representa um grupo 4-piridilo; 159 em que o símbolo R5 representa um átomo de H ou um grupo alquilo; e em que o símbolo R6 representa um átomo de H ou um grupo alquilo. A presente invenção também tem por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina Aza. numa célula, in vitro, que compreende o contacto da referida célula com os compostos mencionados antes.

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1600)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1601)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 160

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 161 Η%

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1607) 162 E ainda noutro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

A presente invenção tem ainda por objecto um composto com a estrutural geral (V):

163 em que o símbolo R5 representa um átomo de H ou um grupo metilo.

Num enquadramento do composto de fórmula geral V, o composto tem a estrutura:

(Composto 1608)

Num outro enquadramento do composto de fórmula geral V, o composto tem a estrutura:

u, Ά presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de compostos de fórmula geral IV ou V para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença associado com o receptor de adenosina A2a num indivíduo. 164

Num enquadramento, o composto trata as referidas doenças por estimulação de adenilato ciclase.

Num outro enquadramento, o indivíduo é um mamífero.

Num outro enquadramento, o mamífero é um ser humano.

Num outro enquadramento do presente processo, o referido receptcr de adenosina A2a está associado com a doença de Parkinson e com as doenças associadas à actividade locomotora, à vasodilatação, à inibição de plaquetas, à geração de superóxidos neutrófilos, a distúrbios cognitivos ou à demência senil.

As doenças associadas com os receptores Ai, A2a/ A2b e A3 estão descritos nas patentes de invenção WO 99/06053 e WO-09822465, WO-09705138, WO-09511681, WO-09733879, patente de invenção japonesa JP-09291089, patente de invenção norte-americana PCT/US98/16053 e patente de invenção norte-americana U.S. N°. 5.516.894, sendo o seu conteúdo total incorporado aqui como referência. A presente invenção também tem por objecto um pró-fármaco solúvel em água dos compostos IV ou V; em que o referido pró-fármaco solúvel em água, isto é, metabolizado in vivo, para produzir um fármaco activo que inibe selectivamente o receptor de adenosina A2a.

Num enquadramento do pró-fármaco, o referido pró-fármaco é metabolizado in vivo per hidrólise catalizada por esterase. A presente invenção também tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende o pró-fármaco e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 165 A presente invenção também tem por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina A2a numa célula, in vitro, que compreende o contacto da referida célula com os compostos de fórmula geral IV ou V.

Num enquadramento do presente processo, o composto é um antagonista do referido receptor de adenosina A2a.

Num outro enquadramento da composição farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma formulação oftálmica.

Num outro enquadramento da composição farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma formulação para injecção periocular, retrobulbar ou intraocular.

Num outro enquadramento da composição farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma formulação sistémica. A presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva dos compostos de fórmula geral IV ou V, para o fabrico de um medicamento, para o tratamento para um distúrbio gastrointestinal num indivíduo.

Num enquadramento, o referido distúrbio é diarreia.

Num outro enquadramento, o indivíduo é um ser humano.

Num outro enquadramento, o composto é um antagonista dos receptores de adenosina A2a- A presente invenção tem ainda por objecto a utilização de uma quantidade efectiva dos compostos de fórmula geral IV ou V, para o fabrico de um medicamento, para o tratamento de distúrbios respiratórios num indivíduo. 166

Num enquadramento, o referido distúrbio é asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, rinite alérgica ou um distúrbio do trato respiratório superior.

Num outro enquadramento, o indivíduo é um ser humano.

Num outro enquadramento do presente processo, o composto é um antagonista do referido receptor de adenosina A2a. A presente invenção também tem por objecto, a utilização de uma quantidade efectiva de compostos de fórmula geral IV ou V, para o fabrico de um medicamento, para o tratamento de distúrbios oculares num indivíduo.

Num enquadramento, o referido distúrbio compreende danos na retina ou danos da parte superior do nervo óptico.

Num outro enquadramento, o referido distúrbio é agudo ou crónico.

Num outro enquadramento, o referido distúrbio é o resultado de glaucoma, edema, isquémia, hipoxía ou trauma.

Num outro enquadramento, o indivíduo é um ser humano.

Num outro enquadramento, o composto é um antagonista dos receptores de adenosina A2a· A presente invenção também tem por objecto uma composição farmacêutica, que compreende a quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de compostos de fórmula geral IV ou V e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 167

Num enquadramento da composição farmacêutica, a referida quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico é efectiva para tratar doença de Parkinson e doenças associadas com a actividade locomotora, vasodilatação, inibição de plaquetas, geração de superóxidos neutrófilos, distúrbios cognitivos ou demência senil.

Num referida outro enquadramento da composição farmacêutica, a composição farmacêutica é uma formulação oftálmica.

Num referida outro enquadramento da composição farmacêutica, a composição farmacêutica é uma formulação sistémica.

Num outro enquadramento da composição farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma solução de irrigação cirúrgica. A presente invenção também tem por objecto uma terapia de combinação para a doença de Parkinson, que compreende os compostos de fórmula geral IV e V e qualquer melhorador de dopamina. A presente invenção tem ainda por objecto uma terapia combinada para o cancro, compreendendo os compostos de fórmula geral IV e V e qualquer um dos agentes citotóxicos. A presente invenção tem ainda por objecto uma terapia de combinação para glaucoma, compreendendo os compostos de fórmula geral IV ou V e um agonista de prostaglandina, um agonista muscrinico ou um antagonista de β-2. 168 A presente invenção também tem por objecto uma composição farmacêutica embalada, para o tratamento de uma doença associada com o receptor de adenosina A2a num indivíduo, compreendendo: (a) uma embalagem contendo uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico dos compostos de fórmula geral IV ou V; e (b) instruções para utilização do referido composto para o tratamento da referida doença num indivíduo. A presente invenção também tem por objecto um processo de preparação do composto de fórmula geral IV, que compreende as etapas de

CN

Rb

HjN dl a) reacção de N I p e

Ra 0

Cl

para se obter em que o símbolo P representa um grupo de protecção eliminável; b) tratamento do produto da etapa da alínea a) em condições de ciclização para se obter

c) tratamento do produto da etapa da alínea b) em condições apropriadas para se obter 169

Re α Ν'

’Rs : e Ή Η d) tratamento do produto colorado da etapa da alínea c) com NH2Ri para se obter

em que os símbolos Ri, R3, R5 e Rg têm os significados definidos antes. A presente invenção tem ainda por objecto um processo de preparação do composto de fórmula geral V, que compreende as etapas de

NC Rs

para se obter ? em que o símbolo P representa um grupo de protecção eliminável; b) tratamento do produto da etapa da alínea a) em condições de ciclização para se obter 170

OH

c) tratamento do produto da etapa da alínea b) em condições apropriadas para se obter

d) tratamento do produto colorado da etapa da alínea c) primeiro com dimetilamino e formaldeído, depois com N-metil-benzilamina e finalmente com NH2Ri para se obter NHR,

em que os símbolos Ri representa um grupo acetamido-etilo, R3 representa um grupo 4-piridilo; em que o símbolo R5 representa um átomo de H ou um grupo metilo; em que o símbolo R6 representa um grupo N-metil-N-benzilaminometilo.

Tal como se utiliza aqui "um composto é selectivo para A2a", significa que um composto tem uma ligação constante ao receptor de adenosina A2a de pelo menos cinco vezes ma is do que à adenosina Αχ, A2b ou A3. 171 A presente invenção será melhor ilustrada pelos exemplos que se seguem que não foram construídos com o sentido de serem limitativos. Os conteúdos de todas as referências, os pedidos de patentes de invenção pendentes e dos pedidos de patentes de invenção publicadas, citados ao longo desta descrição do pedido de patente de invenção, incluindo os referenciados na secção dos antecedentes, são aqui incorporados como referência. Deve entender-se que os modelos utilizados ao longo dos exemplos, são modelos aceites e que a demonstração da eficácia nestes modelos é uma previsão de eficácia nos seres humanos. A presente invenção será melhor entendida a partir dos detalhes experimentais que se seguem. Contudo, um especialista na matéria compreenderá rapidamente que os processos específicos e os resultados discutidos são meramente ilustrativos da presente invenção, tal como está descrita com mais detalhe nas reivindicações que se seguem.

Exemplo 22: Sintese do Antagonista de Adenosina A2a, compostos 1601, 1602 e 1603

Composto 26 Composto 27 Composto 28 Composto 1601

Dissolveu-se o composto 26 (10,93 g, 50,76 mmole), no seio de DMF (67 mL) . Adicionou-se, sequencialmente, clorídrato de 4-amidinopirídina (8,0 g, 50,76 mmole) e DBU (15,4 g, 101,5 mmole) e aqueceu-se a mistura reaccional para 85 °C. Passadas 22 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e eliminou-se a DMF ín vacuo. 172

Diluiu-se o óleo escuro com HC1 2 M (80 mL) . Deixou-se a mistura reaccional em repouso. Passadas 2 horas, arrefeceu-se a solução para 10 °C e filtrou-se. Lavou-se o sólido com água

fria e secou-se, para se obter 7,40 g de um sólido amarelo, composto 27 (69 %) . RMN do ΧΗ (200 MHz , DMSO-dg) δ 6,58 (s 1H), 7,27 (s, 1H( ), 8,53 (d, 2H, J = 5,6 Hz), 9,00 (d, 2H, J 5,2 Hz), 12,35 (s largo, 1H). EM (ES): 212,8 (M++l).

Diluiu-se o composto 27 (7,4 mmole, 29,8 mmole) no seio de POCI3 e aqueceu-se para 105 °C. Passadas 18 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e eliminou-se o POCI3 In vacuo. Diluiu-se óleo escuro e espesso com MeOH (75 mL) seguido de éter (120 mL). Filtrou-se o sólido vermelho amorfo e lavou-se com éter, para se obter 3,82 g de um sólido vermelho. O sólido impuro, o composto 28 é, aproximadamente, 80 % puro e utilizou-se sem mais purificação na reacção seguinte. RMN do 1H (200 MHz, DMS0-d6) δ 6,58 (s, 1H), 7,27 (s, 1H) , 8,53 (d, 2H, J = 5,6 Hz), 9,00 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 12,35 (s largo, 1H) . EM (ES) : 212,8 (M++l).

Composto 1601: Adicionou-se DMSO (5 mL) e D-prolinol (500 mg, 4,94 mmole) ao composto 28 (500 mg, 2,17 mmole). Aqueceu-se a mistura reaccional para 120 °C. Passadas 18 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e diluiu-se no seio de EtOAc e H20. Separaram-se as camadas e extraiu-se a camada aquosa com EtOAc (2x) . Lavaram-se as camadas orgânicas com H20 (2x), salmoura, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se, para se obter 200 mg de um sólido acastanhado. 0 sólido recristalizou no seio de EtOAc, para se obter 82 mg de um sólido acas l anhado (13 %) . RMN do XH (200 MHz, DMSO-dg) δ 2, 05 (m, 4H) , 3,43 (m, |_J 3,70-4,00 (m, 3H) , 4,50 (s largo , 1H) , 4,92 (s largo, 1H) , 6,62 (m, 1H) , 173 7,22 (m, 1H), 8,22 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 6,64 (d, 2H, J = 6,2

Hz), EM (ES): 296,0 (M++l), pf = 210-220 °C (decomp.).

Composto 1602: A cromatografia (sílica, CHCl3/MeOH 9:1), originou 10 mg de um sólido acastanhado (2 %) . RMN do ΧΗ (DMSO-de) δ 2,00-2,50 (m, 4H) , 4,05 (m, 1H) , 4,21 (m, 1H) , 6,71 (d, 1H, J = 3,2 Hz), 7,18 (d, 1H, J= 3,2 Hz), 8,37 (d, 2H, J = 4,8 Hz), 8,56 (d, 2H, J= 5,0 Hz). EM (ES) : 309,1 (M++l).

Composto 1603: A cromatografia (sílica, hexanos/EtOAc 20:1), originou 135 mg de um sólido acastanhado (53 %) . RMN do JH (DMSO-de) δ 2,00 (m, 4H) , 3,43 (s largo, 1H) , 3,74 (s largo, 2H) , 3,87 (s largo, 1H) , 4,49 (s largo, 1H), 4,93 (m, 1H) , 6,56 (m, 1H), 7,12 (m, 1H), 7,40 (m, 3H), 8,34 (m, 2H), 11,62 (s largo, 1H). EM (ES): 295,1 (M++l).

Composto 1605: Em 50 mL de RFB, dissolveu-se 60 mg de sal de cloridrato de 2-(4 ' -piridil)-4-cloropirimidinopirrolo, no seio de 2 mL de DMSO anidro. Adicionou-se sal de ATF de 3-(R)-hidroxi-(D)-prolínol (380 mg) e 500 mg de bicarbonato de sódio. Fez-se passar pela mistura uma corrente de azoto gasoso durante 5 minutos e aqueceu-se para 130 °C. Passadas 2 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e eliminou-se o DMSO in vacuo. Dividiu-se o resíduo entre EtOAc (15 mL) e uma solução aquosa de bicarbonato de sódio saturado (15 mL). Separou-se a camada orgânica e lavou-se com salmoura (15 mL) e secou-se sobre Na2S04. Após a eliminação do dissolvente, purificou-se o produto impuro por meio de CCF preparativa TLC (CH2Cl2/MeOH = 95/5), para se obter 35 mg (50 %). RMN do 3H (200 MHz, CDC13) δ 2,3-2,5 (1H), 3,4-3,8 (3H), 4,4-4,6 (2H) , 6,4 (1H); 7,1 (1H); 8,2 (d, 2H) ; 8,7 (d, 2H); 11,0 (1H). EM (ES): 312 (M++l). 174

Exemplo 23: Síntese do Antagonista de Adenosina Az*/ composto 1601

Composto 28 Composto 29 Composto 1606

Tratou-se o composto 28 (200 mg) com DMF (30 mL), (éster de metilo de dimetíIglicina) (73 mg de sal de cloridrato no seio de 2 mL de água) e 500 mg de bicarbonato de sódio. Passadas 18 horas, eliminou-se o DMF in vacuo. Dividiu-se o resíduo entre EtOAc (30 mL) e uma solução aquosa de bicarbonato de sódio saturado (15 mL) . Lavou-se a camada orgânica com salmoura (15 mL) , secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se. A cromatografia (sílica, hexanos/EtOAc 10:4), originou 150 mg do produto puro, o composto 29 (69 %). RMN do 1H (200 MHz, CDC13) , δ 1,4 (s, 6H) , 3,8 (s, 3H); 3,9 (s, 2H); 6,4 (s, 1H); 7,4-7,5 (m, 3H) ; 8,4 (m, 2H); 9,8 (s, 1H).

Composto 1606: 0 processo é o mesmo que para o composto 1605 (72 %). RMN do ΧΗ (200 MHz, CDC13) , δ 1,3 (s, 6H) , 1,7-1,9 (m, 2H) ; 2,05-2,30 (m, 2H) ; 3,6-4,1 (m, 11H) ; 4,80-4,95 (m, 1H) ; 6,4 (s, 1H); 7,4-7,6 (m, 3H); 8,3-8,4 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 10 (s, 1H). EM (ES): 424,0 (M++l).

Os compostos que se seguem podem ser sintetizados da mesma maneira.

Composto 1600: (51 %). EM (ES): 326,0 (M++l). 175

Composto 1607: RMN do (200 MHz, CDC13) , δ 1,40-1 O CO (m, 5H), 2,80-3,50 (m, 3H) , 4, 60-4,80 (m, 3H) , 6,66 (d, 1H, J = 6,2 Hz), 7,26 (m, 1H) , 8,21 (d, 2H, J= 6,3 Hz) , 8,65 (d, 2H, J= 5,8 Hz), 11,90 (s, 1H) . EM (ES): 310,1 (M++l).

Composto 1608: (64 %). RMN do (200 MHz, DMSO-d6) , δ 1,75 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 3,56 (m, 6H), 7,23-7,41 (m, 5H) , 8,00 (s largo, 1H) , 8,23 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 8,63 (d, 2H, J = 5,4 Hz), 8,82 (s largo, 1H), 11,56 (s largo, 1H). EM (ES): 444,0 (M++l).

Composto 1604: RMN do ΧΗ (200 MHz, CD3OD) δ 3, 40 (m, 4H) , 4,29 (m, 4H) , 6,99 (s, 1H) , 7,5-7,2 (m, 3H) , 7, 90 (d, 2H) , 8,39 (d, 2H) , 8,61 (d, 2H) . EM (ES) : 357,0 (M++l). QUADRO 16

Compostos Selectivos do Receptor de Adenosina A2a * pelo menos 5 vezes mais selectivos do que os outros três sub-tipos.

176

177

A presente invenção baseia-se também em compostos que se ligam selectivamente ao receptor de adenosina A3, e por isso servem para tratar de doenças associadas com o receptor de adenosina A3 em indivíduos, por meio da administração a esses 178 indivíduos de uma quantidade efectiva sob o ponto o ponto de vista terapêutico desses compostos. A doença a ser tratada está associada, por exemplo, com asma, hipersensibilidade, rinite, febre dos fenos, enjoo do soro, vasculite alérgica, dermatite atópica, dermatite, psoriase, eczema, fibrose pulmonar idiopátíca, clorecistite eosinofílica, inflamação crónica das vias aéreas, síndromas de hipereosinofílicos, gastroenterites eosinofílicas, edema, urticária, doença miocárdica eosinofílica, angioedema episódico com eosinofilia, doenças inflamatórias da bexiga, colite ulcerosa, granulomatose alérgica, carcinomatose, granuloma eosinofílico, histiocitose familiar, hipertensão, desgranulação dos mastóides, tumor, hipoxia cardíaca, isquémia cerebral, diurese, insuficiência renal, distúrbios neurológicos, distúrbios mentais, distúrbios cognitivos, isquémia miocárdica, broncoconstrição, artrite, doenças auto-imunitárias, doença de Crohn, doença de Grave, diabetes, esclerose múltipla, anemia, psoriase, distúrbios da fertilidade, lúpus eritematoso, feridas de reperfusão, diâmetro arteriolar do cérebro, libertação de mediadores alérgicos, escleroderma, ataque cardíaco, isquémia global, distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares, distúrbios renais, distúrbios inflamatórios, distúrbios gastrointestinais, distúrbios oculares, distúrbios alérgicos, distúrbios respiratórios ou distúrbios ímunológicos. A presente invenção também tem por objecto um composto com a estrutura 179

180

os símbolos R5 e R6 representam, independentemente, átomos de H, grupos alquilo ou arilo substituídos ou insubstituídos, em que o substituinte, quando presente, é tal como se definiu antes,

em que quando o símbolo Ri representa

181 e o simbolo R6 representa um átomo de H; e um composto com a estrutura geral:

em que os símbolos Ri, R2 e o átomo de azoto em conjunto, representam

os símbolos R5 e Re representam, independentemente, átomos de H, grupos alquilo ou arilo substituídos ou ínsubstituídos, em que o substituinte, quando presente, é tal como se definiu antes, 182 em que os símbolos Ri, R2 e o átomo de azoto em representam conjunto,

‘N ΛΑΑΑι

I símbolo Re o símbolo R5 representa um grupo fenilo e o representa um átomo de H; azoto em em que quando os símbolos Ri, R2 e o átomo de conjunto, representam

'OH r e o símbolo Re representa um átomo de H; e azoto em em que quando os símbolos Ri, R2 e o átomo de conjunto, representam 183 HO.

os símbolos FU e Rg representam, ambos, átomos de H. A presente invenção também tem por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina A3 numa célula, in vitro, que compreende o contacto da referida célula com os compostos mencionados antes.

Num enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1/00) 184

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura

HjC •0

HjC

MN

(Composto 1701)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

HaC\^S

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 185

CH

(Composto 1704)

(Composto 1705)

Num outro enquadramento do estrutura: omposto, o composto tem a 186

HO

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 187

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

HO

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1707)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: ΗΝ ο ΝΗ

(Composto 1708)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1709)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 189 π2ν. .0

(Composto 1710)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1712)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1713( 190

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura

Num outro estrutura: enquadramento do composto, o composto tem a

HO

(Composto 1714)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

191

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 192

(Composto 1711)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

HO

(Composto 1703)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: HO,

N

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 193 HO,

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

(Composto 1716)

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: h3c

194

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

HaC

\

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: NH,

(Composto 1717(

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura: 195

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

196

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura

Num outro enquadramento do composto, o composto tem a estrutura:

A presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de qualquer um dos compostos mencionados antes, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença associada com o receptor de adenosina A3 num indivíduo.

Num enquadramento, o indivíduo é um mamífero.

Num outro enquadramento, o mamífero é um ser humano. 197

Num outro enquadramento, o referido receptor de adenosina A3 está associado com um distúrbio do sistema nervoso central, um distúrbio cardiovascular, asma, hipersensibilidade, rinite, febre dos fenos, enjoo do soro, vasculite alérgica, dermatite atópica, dermatite, psoriase, eczema, fibrose pulmonar idiopática, clorecistite eosinofílica, inflamação crónica das vias aéreas, síndromas de hipereosinofílicos, gastroenterites eosinofílicas, edema, urticária, doença miocárdica eosinofílica, angioedema episódico com eosínofilia, doenças inflamatórias da bexiga, colite ulcerosa, granulomatose alérgica, carcinomatose, granuloma eosinofílico, histiocitose familiar, hipertensão, desgranulação dos mastóides, tumor, hipoxia cardíaca, isquémia cerebral, diurese, insuficiência renal, distúrbios neurológicos, distúrbios mentais, distúrbios cognitivos, isquémia miocárdica, broncoconstrição, artrite, doenças auto-imunitárias, doença de Crohn, doença de Grave, diabetes, esclerose múltipla, anemia, psoriase, distúrbios da fertilidade, lúpus eritematoso, feridas de reperfusão, diâmetro arteriolar do cérebro, libertação de mediadores alérgicos, escleroderma, ataque cardíaco, isquémia global, distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares, distúrbios renais, distúrbios inflamatórios, distúrbios gastrointestinais, distúrbios oculares, distúrbios alérgicos, distúrbios respiratórios ou distúrbios imunológicos.

As doenças associadas com os receptores de adenosina Ai, A2a, A2 b e A3 estão descritos nas patentes de invenção WO 99/06053 e WO-09822465, WO-097Q5138, WO-09511681, W0-09733879, na patente de invenção japonesa JP-09291089, na patente de invenção norte-americana PCT/US98/16053 e na patente de invenção norte-americana U.S. N°. 5.516.894, sendo o seu conteúdo total incorporado aqui como referência. 198 A presente invenção também tem por objecto um pró-fármaco, solúvel em água, de um qualquer dos compostos mencionados antes, em que o referido pró-fármaco, solúvel em água, que é metabolizado, in vivo, num fármaco activo, que inibe selectivamente o receptor de adenosina A3.

Num enquadramento do pró-fármaco, o referido pró-fármaco é metabolizado in vivo por hidrólise catalizada por esterase. A presente invenção também tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende o pró-fármaco e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção também tem por objecto um processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina A3 numa célula, in vitro, que compreende o contacto da referida célula com qualquer um dos compostos mencionados antes.

Num enquadramento do presente processo, o composto é um antagonista do referido receptor de adenosina A3.

Num outro enquadramento da composição farmacêutica, a referida composição farmacêutica é uma formulação sistémica. A presente invenção também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva de um qualquer dos compostos 199 mencionados antes, para o fabrico de um medicamento, para o tratamento para um distúrbio gastrointestinal num indivíduo.

Num enquadramento, o referido distúrbio é diarreia.

Num outro enquadramento, o indivíduo é um ser humano.

Num outro enquadramento, o composto é um antagonista dos receptores de adenosina A3. A presente invenção tem ainda por objecto a utilização de uma quantidade efectiva de um qualquer dos compostos mencionados antes, para o fabrico de um medicamento, para o tratamento de distúrbios respiratórios num indivíduo.

Num enquadramento, σ referido distúrbio é asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, rinite alérgica ou um distúrbio do trato respiratório superior.

Num outro enquadramento, o indivíduo é um ser humano.

Num outro enquadramento do presente processo, o composto é um antagonista do referido receptor de adenosina A3. A presente invenção também tem por objecto, a utilização de uma quantidade efectiva de um qualquer dos compostos mencionados antes, para o fabrico de um medicamento, para o tratamento de distúrbios oculares num indivíduo.

Num outro enquadramento, o referido distúrbio é agudo ou crónico.

Lisboa, 18 de Outubro de 2006 200

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto com a estrutura geral

um caracterízado pelo facto de o símbolo Rx representar grupo

1 ο

e ο símbolo R2 representar um átomo de H; ou NR1R2 em conjunto representarem um grupo

em que o símbolo R3 representa um grupo fenilo substituído ou insubstituído, pirrolo, tiofeno, furano, tiazole, imidazole, triazole, pirazole, piridina, 2(1H)~ piridona, 4(1H)-piridona, pirazina, pirimidina, piri-dazina, isotiazole, isoxazole, oxazole, tetrazole, naftilo, tetralina, benzofurano, benzotiofeno, 2,3-di-hidroindole, ΙΗ-indole, indolilo, benzopirazole, 1,3-benzodioxole, benzoxazole, purina, coumarina, cromona, quinolilo, tetra-hidroquinolina, isoquínolína, benzimidazole, quinazolina, pteridina, 2(1H)-quinolona, 1(2H)-isoquinolona, 1,4-benzisoxazina, benzotiazole, quínoxalina, quinolino-N-óxido, isoquinolino-N-óxido, quinoxalino-N-óxido, quinazolino-N-óxido, benzoxazina, ftalazina ou cinolina; em que o símbolo R5 representa um átomo de H, um grupo CH3? alquilo substituído ou insubstituído, arilo ou. fenilo, 3 ou

0 ι e em que o símbolo R6 representa um átomo de H, um grupo CH3, alquilo substituído ou insubstituído, cicloalquilo, em que o substituinte, quando presente, representa um átomo de halogéneo, um grupo hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi , alcoxicarboniloxí, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fospinato, ciano, amino, acilamino, amidino, imino, sulfidrilo, alquíltio, ariltio, tio- carboxilato, sulfato, sulfonato, sulfamoílo, sulfona- mido, nitro, trifluorometilo, azido, heterociclilo ou alquilarilo, ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, OH

em que, quando o símbolo Ri representa um grupo 4 o símbolo R3 representa um grupo fenilo;o símbolo R5

representa um grupo e o símbolo R6 representa um átomo de H; em que o símbolo X representa um átomo de O ou S; e em que, quando o símbolo Fq representa um grupo

o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo fenilo; e o símbolo R6 representa um átomo de H; em que quando o símbolo Ri representa um grupo

o símbolo R3 representa um grupo 4-clorofenilo; os símbolos R5 e R6 representam, cada um, um átomo de H; 5 em que, quando o símbolo Ri representa um grupo

os símbolos R5 e R6 representam, cada um, independentemente, um átomo de H ou um grupo alquilo; v ^.o HN ou em que, quando o símbolo Ri representa um grupo o símbolo R3 representa um grupo fenilo; e os símbolos R5 e R6 representam ambos átomos de H, o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo

e o símbolo Rê representa um átomo de H, ou o símbolo R3 representa um grupo 4-piridilo; 6 2. o símbolo FU representa um grupo CH3 e o símbolo R6

representa um grupo Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura geral: CH,

em que o símbolo R3 tem o significado definido na reivindicação 1; em que os símbolos R5 e R6 representam, cada um, independentemente, átomos de H ou grupos alquilo. 3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: ÇH3

7 4 . Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

caracterizado
5. Composto, de acordo com a reivindicação 3 pelo facto de ter a estrutura:

caracterizado
6. Composto, de acordo com a reivindicação 3, pelo facto de ter a estrutura: 8
7. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: CHj
8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 9
9. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura geral:

em que o símbolo R3 tem o significado definido na reivindicação 1; em que os símbolos R5 e R6 representam, independentemente, átomos de H ou grupos alquilo.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

10
11. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: '""MH

em que o símbolo R3 tem o significado definido na reivindicação 1; em que o símbolo X representa um átomo de oxigénio ou de enxofre.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: NH

13. Composto, de acordo caracterizado pelo facto com a reivindicação de ter a estrutura: 11,
14. Utilização de um composto, de acordo com as reivindicações 2, 8, 9 ou 11, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento útil para o tratamento de uma doença associada com um receptor de adenosina A* num individuo, que tenha necessidade desse tratamento.
15. Utilização, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de o referido receptor de adenosina Αχ estar associado com doenças cognitivas, insuficiência renal, arritmias cardíacas, epitélio respiratório, libertação do transmissor, sedação, vasoconstrição, bradícárdia, inotropia e dromotropia cardíaca negativa, broncoconstrição, quimiotaxia neutrofílica, condição de refluxo ou condição ulcerosa.
16. Processo para a inibição da activídade de um receptor de adenosina Αχ numa célula, ín vitro, caracterizado pelo facto de compreender o contacto da referida célula com um composto, de acordo com as reivindicações 2, 8, 9 ou 11.
17. Utilização, de- acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de a referida doença ser asma, 12 doença pulmonar obstrutiva crónica, rinite alérgica ou um distúrbio dc tracto respiratório superior.
18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 2, 8, 9 ou 11, um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, pelo menos um de um esteróide, um agonista β2, um glicocorticóide, um antagonista de leucotrieno ou um agonista anti-colinérgico.
19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico, de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 2, 8, 9 ou 11 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. *
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo facto de a referida quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico ser eficaz para o tratamento de asma, rinite alérgica ou doença pulmonar obstrutiva crónica.
21. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura geral:

na qual NRiR2 representa um grupo (D)-2-aminocarbonil-N-pirrolidinilo, (D)-2-hidroximetil-N-pirrolidínilo, (D)- 13 2-hidroximetil-trans-4-hidroxi-N-pirrolidinilo ou N-piperazinilo; em que o símbolo R3 tem o significado definido na reivindicação 1; em que o símbolo R5 representa um átomo de H, um grupo fenilo ou

O em que o símbolo R6 representa um átomo de H, um grupo alquilo ou cicloalquilo.
22. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura geral:

em que NRiR2 representa um grupo 3-hidroximetil-N-piperidinilo; em que o símbolo R3 representa um grupo 4-piridilo; em que o símbolo R5 representa um átomo de h ou um grupo alquilo; e 14 23. em que o símbolo Rg representa um átomo de H ou um grupo alquilo. 21, Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
24. Composto, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
25. Composto, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

15 26. Composto, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 26.

27 . Composto, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

28. Composto, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: na

16
29. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
30. Composto, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

30,
31. Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

17
32. Composto, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
33. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura geral:

em que o símbolo R5 representa um átomo de H ou um grupo metilo.
34. Composto, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 18 35.

Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 33,
36. Utilização de um composto, de acordo com as reivindicações 21, 22 ou 33, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento útil para o tratamento de uma doença associada com um receptor de adenosina A2a num indivíduo, que necessite desse tratamento.
37. Utilização, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo facto de o referido receptor de adenosina A2a estar associado com a actividade locomotora, a vasodilatação, a inibição de plaquetas, a geração de superóxidos neutrófilos, distúrbios cognitivos, demência senil ou doença de Parkinson. 19
38. Utilização, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo facto de o composto tratar as referidas doenças por estimulação de adenilato ciclase.
39. Processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina A2a numa célula, in vitro, caracterizado pelo facto de compreender o contacto da referida célula com um composto de acordo com das reivindicações 21, 22 ou 33.
40. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico do composto de acordo com as reivindicações 21, 22 ou 33 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
41. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo facto de a referida quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico ser eficaz para tratar a doença de Parkinson e doenças associadas com a actividade locomotora, a vasodilatação, a inibição de plaquetas, a geração de superóxidos neutrófilos, distúrbios cognitivos ou a demência senil.
42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um qualquer dos compostos de acordo com as reivindicações 21, 22 ou 33, um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, pelo menos, um melhorador de dopamina.
43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um qualquer dos compostos de acordo com as reivindicações 21, 22 ou 33, um veículo aceitável sob o· 20 ponto de vista farmacêutico e, pelo menos, um agente citotóxico.
44. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um qualquer dos compostos de acordo com as reivindicações 21, 22 ou 33, um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, pelo menos um de agonista de prostaglandina, agonista muscarínico ou antagonista de β-2 .
45. Processo de preparação de um composto, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo de compreender as etapas de a) reacção de

em que o símbolo P representa um grupo de protecção eliminãvel; b) tratamento do produto da etapa da alínea a) em condições de ciclização para se obter

21 c) tratamento do produto da etapa da alínea b) em condições apropriadas para se obter

d) tratamento do produto clorado da etapa da alínea c) primeiro com dimetilamino e formaldeído, depois com N-metíl-benzilamina e finalmente com NH2Ri para se obter

em que o símbolo Ri representa um grupo acetamido-etilo; em que o símbolo R3 representa um grupo 4-piridilo; em que o símbolo R5 representa um átomo de H ou um grupo metilo; em que o símbolo R6 representa um grupo N-metil-N-benzilaminometilo.
46. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura geral

na qual o símbolo Ri representa 22

os símbolos R5 e Re representam, independentemente, átomos de H, grupos alquilo ou arílo substituídos ou ínsubstítuídos, 23 em que o substituinte, quando presente, tem o significado definido na reivindicação 1, em que quando o símbolo Ri representa HN y o símbolo Rs representa um grupo

e o símbolo R6 representa um átomo de H.
47. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

KN,
48. Composto, de acordo com a reivindica.ção 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 24 H,C HjC •O HN
49. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: h3c.

HN NH

-CH,
50. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: CH3 MH O ^ NH

25
51. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 52.

Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 46, HO
53. Composto, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

26
54. Composto, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: MO, 55.

Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 52,
56. Composto, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: HO
57. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 27

ο ΝΗ
58. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
59. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
60. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 28
61. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura 1:
62. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura;
63. Composto, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo facto de ter a estrutura;

29
64. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: HO
65. Composto, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
66. Composto, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
67. Composto, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

30
68. Composto, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
69. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ter a estrutura geral:

em que os símbolos Ri, R2 e o átomo de azoto, em conjunto, representam grupos

31 em que os símbolos R5 e Rs representam, independentemente, átomos de H, grupos alquilo ou arilo substituídos ou insubstítuidos, em que o substituinte, quando presente, tem o significado definido na reivindicação 1, em que os símbolos Ri, R2 e o átomo de azoto, em conjunto, representam um grupo

o símbolo R5 representa um grupo fenilo e o símbolo R6 representa um átomo de H; em que, quando os símbolos Rx, R2 e o átomo de azoto, em conjunto, representam grupos

a

o símbolo R5 representa um grupo e o símbolo R6 representa um átomo de H; e 32 em que, quando os símbolos Fq, 1½ e o átomo de azoto, em conjunto, representam um grupo

‘N *ww» J os símbolos R5 e R6 representam ambos átomos de H.
70. Composto, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: HO
71. Composto, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: N
72. Composto, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 3 3
73. Composto, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado peio facto de ter a estrutura: HO. O

74 . Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 69,

Composto, de caracterizado pe acordo com a reivindicação o facto de ter a estrutura: 74, 34 75. \ h3c o

74,
76. Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de ter a estrutura: H,C
77. Composto, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:

Composto, de acordo caracterizado pelo facto com a reivindicação de ter a estrutura: 77, 35 78

19. Composto, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado peio facto de ter a estrutura:
80. Composto, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo facto de ter a estrutura:
81. Composto, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo facto de ter a estrutura: 3 6

82. 80, rHn rom a reivindicação Composto, de acorcl do ter a estrutura: caracterizado pelo ta°

83. ^ ^ , . rom a reivindicação 1, caracterizado Composto, de acordo CUIU pelo facto de ter a estrutura.

Utilização de um composto, de acordo com as reivindicações 46, 58, 69 ou 83, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento útil para o tratamento de uma doença associada com o receptor 37 84 . de adenosina A3 num indivíduo que necessite desse tratamento.
85. Utilização, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo facto de o receptor da referida adenosina A3 estar associado com asma, hipersensibilidade, rinite, febre dos fenos, enjôo do soro, vasculite alérgica, dermatite atópica, dermatite, psoriase, eczema, fibrose pulmonar idíopática, clorecístite eosinofílica, inflamação crónica das vias aéreas, síndromas hipereosinofílicos, gastroenterites eosínofilicas, edema, urticária, doença miocárdica eosinofílica, angíoedema episódico com eosinofilia, doenças inflamatórias do intestino, colite ulcerosa, granulomatose alérgica, carcinomatose, granuloma eosinofílico, histiocitose familiar, hipertensão, desgranulaçáo dos mastóides, tumor, hipoxia cardíaca, ísquémía cerebral, diurese, insuficiência renal, distúrbios neurológicos, distúrbios mentais, distúrbios cognitivos, isquémia miocárdica, broncoconstrição, artrite, doenças auto-imunitárias, doença de Crohn, doença de Grave, diabetes, esclerose múltipla, anemia, psoriase, distúrbios da fertilidade, lúpus eritematoso, feridas de reperfusão, diâmetro arteriolar do cérebro, libertação de mediadores alérgicos, escleroderma, ataque cardíaco, isquémia global, distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares, distúrbios renais, distúrbios inflamatórios, distúrbios gastrointestinais, distúrbios oculares, distúrbios alérgicos, distúrbios respiratórios ou distúrbios imunológicos.
86. Pró-fármaco solúvel em água, caracterizado pelo facto de o referido pró-fármaco solúvel em água ser rrietabolizado, in vivo, para produzir um composto de acordo com as 38 reivindicações 2, CO (O H1 f—1 21, 22, 33 , 46, 58, 69 ou 83 . 87. Pró-fármaco, de acordo com a rei .vindicação 86, caracterizado pelo facto de 0 referido pró-fármaco ser metabolizado, in vivo, por hidrólise catalisada por esterase.
88. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender o pró-fármaco, de acordo com a reivindicação 86 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
89. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 88, caracterizada pelo facto de a referida composição farmacêutica ser uma formulação oftálmica.
90. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 88, caracterizada pelo facto de a referida composição farmacêutica ser uma formulação para injecção periocular, retrobulbar ou intraocular.
91. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 88, caracterizada pelo facto de a referida composição farmacêutica ser uma formulação sistémica.
92. Processo para a inibição da actividade de um receptor de adenosina A3 numa célula, in vitro, caracterizado pelo facto de compreender o contacto da referida célula com um composto de acordo com as reivindicações 46, 58, 69 ou 83. 39
93. Processo, de acordo com as reivindicações 16, 39 ou 92, caracterizado pelo facto de a célula ser uma célula humana.
94. Utilização de um composzo, de acordo com as reivindicações 46, 58, 69 ou 83, caracterizada pelo facto de se destinar à produção de um medicamento útil para o tratamento de um distúrbio gastrointestinal num indivíduo.
95. Utilização, de acordo com a reivindicação 94, caracterizada pelo facto de o referido distúrbio ser diarreia.
96. Utilização de um composto, de acordo com as reivindicações 46, 58, 69 ou 83, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento útil para o tratamento de distúrbios respiratórios num indivíduo.
97. Utilização, de acordo com a reivindicação 96, caracterizada pelo facto de o referido distúrbio ser asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, rinite alérgica ou um distúrbio do tracto respiratório superior.
98. Utilização de um composto, de acordo com as reivindicações 46, 58, 69 ou 83, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento útil para o tratamento de distúrbios oculares num indivíduo.
99. Utilização, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo facto de o referido distúrbio 40 compreender um problema da retina ou na parte superior do nervo óptico.
100. Utilização, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo facto do referido distúrbio ser agudo ou crónico.
101. Utilização, de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo facto de o referido distúrbio ser o resultado de glaucoma, edema, isquémia, hipoxia ou trauma.
102. Utilização, de acordo com as reivindicações 14, 17, 36, 84, 94, 96 ou 98, caracterizada pelo facto de o indivíduo ser um ser humano.
103. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um qualquer dos compostos de acordo com as reivindicações 46, 58, 69 ou 83, um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, pelo menos um de agonista de prostaglandina, agonista muscarínico ou um antagonista de β-2.
104. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender uma quantidade efectiva, sob o ponto de vista terapêutico, do composto de acordo com as reivindicações 46, 58, 69 ou 83 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
105. Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicação 104, caracterizada pelo facto de a referida quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico ser efectiva para tratar um distúrbio respiratório ou um distúrbio gastro-intestinal. 41
106. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo facto de o distúrbio gastrointestinal ser diarreia.
107. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo facto de o distúrbio respiratório ser asma, rínite alérgica ou uma doença pulmonar obstrutiva crónica.
108. Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 40 ou 104, caracterizada pelo facto de a referida composição farmacêutica ser uma formulação oftálmica.
109. Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 19, 40 ou 104, caracterizada pelo facto de a referida composição farmacêutica ser uma formulação para injecção periocular, retrobulbar ou intraocular.
110. Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 19, 40 ou 104, caracterizada pelo facto de a referida composição farmacêutica ser uma formulação sistémica.
111. Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 19, 40 ou 104, caracterizada pelo facto de a referida composição farmacêutica ser uma solução de irrigação cirúrgica.
112. Processo de preparação do composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender as etapas de a) reacção de 42

em que o símbolo P representa um grupo de protecção eliminável; b) tratamento do produto da etapa da alínea a) , condições de ciclização, para se obter em

c) tratamento do produto da etapa da alínea b) em condições apropriadas para se obter

* d) tratamento do produto clorado da etapa da alínea c) com NH2R1R2, para se obter

em que o símbolo Rx representa 43

ΗΝ_ ο ρ Ν. --

ΗΝ. ΗΝ, *

ΗΝ. Λ3

ΗΝ y ΝΗ

44

e o símbolo R2 representa um átomo de H; ou NRiR2 em conjunto representa grupos 45

em que o símbolo R3 tem o significado definido na reivindicação 1; em que o símbolo R5 representa um átomo de H, um grupo CH3, alquilo substituído ou insubstituído, arilo ou fenilo, em que o substituinte, quando presente, tem o significado defino na reivindicação 1

46 em que o símbolo X representa um átomo de O ou S; e em que o símbolo R6 representa um átomo de H, um grupo CH3, alquilo substituído ou insubstituído, cícloalquilo ou -N

/ em que, quando o símbolo Ri representa um grupo OH

o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo

e o símbolo Re representa um átomo de H; em que o símbolo X representa um átomo de O ou S; m que, quando o símbolo Ri representa um grupo 47 .0 ΗΝ

ο símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo fenilo e o símbolo Re representa um átomo de H; em que, quando o símbolo Ri representa um grupo

NH * o símbolo R3 representa um grupo 4-clorofenilo; os símbolos R5 e R6 representam, cada um, um átomo de H; em que, quando o símbolo Ri representa

os símbolos R5 e R6 representam, cada um, indepen-dentemente, um átomo de H ou um grupo alquilo; em que, quando o símbolo Rx representa um grupo 48

o símbolo R3 representa um grupo fenilo; e os símbolos R5 e Re representam ambos átomos de H ou o símbolo R3 representa um grupo fenilo; o símbolo R5 representa um grupo

e o símbolo R6 representa um átomo de H ou o símbolo R3 representa um grupo 4-piridilo; o símbolo R5 representa um grupo CH3 e o símbolo D representa um grupo 113.

as Utilização de um composto, de acordo com reivindicações 2, 8, 9 ou 11, caracterizada pelo fact o de se de se destinar ao fabrico de um medicamento útil papa tratamento de uma doença associada com um receptor adenosina Ai num indivíduo que necessita des tratamento, em que a doença associada com o receptor <ge adenosina Ai é anti-diurese, bradicárdia, bronquite, broncoconstrição, doença de Alzheímer, arritmias 49 cardíacas, hipoxia cardíaca, hipertensão, inflamação, inotropia cardíaca negativa e dromotropia cardíaca negativa, insuficiência renal, sedação ou está associada com a libertação do transmissor, epitélio respiratório, contracção do músculo liso que está subjacente ao epitélio respiratório, vasoconstrição ou desgranulaçào de mastócitos.
114. Utilização do composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 2, 8, 9 ou 11, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento útil para melhorar a memória de um indivíduo.
115. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 21, 22 ou 33, caracterizada pelo facto de se destinar à produção de um medicamento útil para o tratamento de uma doença associada com um receptor de adenosína num indivíduo que necessite desse tratamento, em que a doença associada com o receptor de adenosina R2a, é a doença de Parkinson ou o glaucoma.
116. Composto, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de quando NRiR2 em conjunto forma um anel de 2-aininocarbonil-pirrolidina, o símbolo R3 representa um grupo fenilo substituído ou piridina ínsubstituída, em que o substituinte representa um átomo de halogéneo, um grupo hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, aril-carboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarboníio, alcoxicarbonílo, arnino-carbonílo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fospinato, ciano, amino, alquílamino, dialquílamino, 50 arilamino, diarilamino, alquilarilamino, aciiamino, alquilcarbonilamino, arilcarboniiamino, carbamoilo, ureído, amidino, imino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfato, sulfonato, sulfamoílo, sulfo-namido, nitro, trifluorometilo, azido, heterociclilo ou aiquilarilo.
117. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 46, 58, 69 ou 83, caracterizada pelo facto de se destinar à produção de um medicamento útil para o tratamento de uma doença associada com um receptor de adenosina A3 num indivíduo que necessite desse tratamento, em que a doença associada com o receptor de adenosina A3, é isquémia miocárdica, bronquite ou broncoconstrição.
118. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 46, 58, 69 ou 83, caracterizada pelo facto de se destinar à produção de um medicamento útil para o tratamento de uma inflamação ocular associada com o receptor de adenosina A3 num indivíduo.
119. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 46, 58, 69 ou 83, caracterizada pelo facto de se destinar à produção de um medicamento útil para o tratamento de uma doença associada com um receptor de adenosina A3 num indivíduo que necessite desse tratamento, em que a doença associada com o receptor de adenosina A3, está associada com a desgranulação dos mastócitos.
120. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 46, 58, 69 ou 83, caracterizada pelo facto de se destinar à produção de um medicamento útil 51 para o tratamento de uma doença associada com um receptor de adenosína A3 num indivíduo que necessite desse tratamento, em que a doença associada com um receptor de adenosina Ã3 é asma, qlaucoma, retincpatia, ísquémía ocular ou degeneração macular. Lisboa, 18 de Outubro de 2006