TWI785563B

TWI785563B - 用以鑑別出適用精氨酸剝奪療法之患者的方法與套組

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Publication number: TWI785563B
Application number: TW110113431A
Authority: TW
Inventors: 陳鴻文; 劉慧芬; 葉昭廷; 朱育德; 周俊宏
Original assignee: 英屬開曼群島商北極星藥業集團股份有限公司
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2022-12-01
Also published as: TW202239969A

Abstract

本發明揭示一種用於鑑別癌症患者對精氨酸剝奪療法之反應性或不反應性的方法與套組。該方法包括藉由使用基於聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)之方法，測定源自患者之生物樣本中是否存在標的核酸的rs13338697之G/G基因型，其中當存在標的核酸的rs13338697之基因型為G/G時，代表該患者會對精氨酸剝奪療法有反應。

Description

用以鑑別出適用精氨酸剝奪療法之患者的方法與套組

本揭示內容係關於一種涉及用以鑑定與腫瘤相關之單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的方法和套組。具體是，本揭示內容係關於利用所鑑定之SNPs來預斷患有腫瘤之患者是否會對精氨酸剝奪療法有反應。

某些癌症可能無法自行合成特定胺基酸，而造成腫瘤內出現營養缺陷(auxotrophic)。故治療這類腫瘤方法之一即是剝奪特定外源性胺基酸使其無法補充腫瘤所需之營養而促使腫瘤細胞死亡。精氨酸剝奪(arginine deprivation)即是一種治療腫瘤的新穎方法。精氨酸可被包括精氨酸去亞胺酶(arginine deiminase，ADI)在內的數種酶於人體血液中降解而達到精氨酸剝奪之目的。儘管ADI是源自黴漿菌(mycoplasma)的一種微生物酶，但其在人體血液中對精氨酸仍具有高度親和力，且能催化精氨酸生成瓜氨酸(citrulline)和氨(ammonia)。瓜氨酸可以在表現精氨琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1，ASS1)的正常細胞中再循環，重新形成精氨酸，但腫瘤細胞中則無法再次合成精氨酸，因而促使腫瘤內部產生營養缺陷並進一步造成腫瘤細胞死亡。一種聚乙二醇化形式的ADI(ADI-PEG 20)已經被配製出來，且在臨床試驗中已顯示出ADI-PEG 20可藉由精氨酸剝奪療法來針對精氨酸營養缺陷型腫瘤。腫瘤對精氨酸剝奪療法的抗性通常是通過重新活化ASS1而開展的。

先前已知含有WW蛋白結構域的氧化還原酶(WW domain-containing oxidoreductase，WWOX)之基因在腫瘤中的表現與抑制腫瘤生長及/或侵襲有關。此外，人類基因體中的遺傳變異與特定癌症的治療反應及結果相關聯。舉例來說，已知在肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者中，某些基因的SNPs(如GALNT14基因中的rs9679162之T/T基因型及WWOX基因中的rs13338697之A/G基因型)與全身性化療後的腫瘤惡化時間(time-to-tumor progression，TTP)及總體存活率(overall survival,OS)相關(Lin et al.,Asia Pac J.Clin.Oncol.14(2)：e54-e63(2018))。

因此，在相關技術領域中亟需一種用於鑑定與WWOX基因相關SNPs的方法和套組，其中該些SNPs是用於鑑定適合精氨酸剝奪療法之腫瘤患者時合適的預期指標。

本揭示內容係基於或至少部分係基於發現WWOX基因中之基因多型性與患者體內的腫瘤(例如，HCC)對聚乙二醇化形式之ADI(ADI-PEG 20)相關療法有或無反應性所發展而成。因此，位於WWOX基因特定位置的SNPs基因型，可以預測患有腫瘤之患者是否會對精氨酸剝奪療法產生反應。

在一態樣中，本揭示內容係關於一種基於患者之WWOX基因型來鑑別患有腫瘤(例如，晚期HCC)之患者，對以精氨酸剝奪療法治療有無反應的方法。

對精氨酸剝奪療法有反應的腫瘤例子包含，但不限於，乳癌、腦瘤、大腸癌、頭頸部鱗狀上皮細胞癌、HCC、白血病(例如，急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML))、肺癌、黑色素瘤、間皮瘤(例如，惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM))、神經母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌和肉瘤。

根據本揭示內容的某些實施方式，該方法包含判斷患有HCC的患者是否具有rs13338697之G/G基因型。本發明之實施例提供之結果指出，在HCC患者中，帶有rs13338697之G/G基因型的HCC患者與接受ADI-PEG 20治療後有較長OS之間呈正相關，因此，rs13338697之G/G基因型的存在代表HCC患者將對精氨酸剝奪療法有反應。

可使用序列編號：1或2的正向引子與序列編號：3的逆向引子，藉由擴增包含前述多型性位點的標的核酸，來測定rs13338697之G/G基因型。

根據本揭示內容的實施方式，精氨酸剝奪療法包含向患者投予選自由二氟甲基鳥氨酸(Difluoromethylornithine，DFMO)、重組之精氨酸去亞氨酶(recombinant arginine deiminase，rADI)、重組之精氨酸酶(recombinant arginase，rArg)、重組體之精氨酸去羧酶(recombinant arginine decarboxylase，rADC)、聚乙二醇化形式的rADI、rArg或rADC及以上組合所組成的群組之藥劑。根據本揭示內容的較佳實施方式，在WWOX基因中具有rs13338697的G/G基因型的HCC患者對精氨酸剝奪療法有反應，該精氨酸剝奪療法包含向HCC患者投予聚乙二醇化形式的rADI(例如，ADI-PEG 20)。

另外或可選擇地，精氨酸剝奪療法可更進一步向患者投予包括精氨酸類似物、細胞自噬(autophagy)抑制劑、化學治療劑、MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase(MAPK)kinase,MEK))抑制劑、腫瘤壞死因子相關之凋亡誘導配體(tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)、同功維生素(vitamer)或其組合。細胞自噬抑制劑的例子包括，但不限於，巴非黴素A1(bafilomycin A1)、硼替佐米(bortezomib)、氯喹(chloroquine，CQ)、羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)和奎那克林(quinacrine)。化學治療劑的例子包括，但不限於，5-氟尿嘧啶(5-fluororacil，5-FU)、順鉑(cisplatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、歐洲紫杉醇(docetaxel)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、阿黴素(doxorubicin)、胺甲蝶呤(methotrexate)和長春新鹼(vincristine)。精氨酸類似物的例子包括，但不限於，刀豆胺酸(canavanine)。MEK抑制劑的例子包括，但不限於曲美替尼(trametinib)(GSK1120212)、考比替尼(cobimetinib)(XL518)、比美替尼(binimetinib)(MEK162)、司美替尼(selumetinib)、PD-325901、CI-1040、PD035901、TAK-733和U0126。同功維生素的例子包括，但不限於活性葉酸(folinic acid)。

另外或可選擇地，該方法更包含測定rs6025211之T/T基因型，該基因型與接受精氨酸剝奪療法治療之HCC患者的TTP間呈現負相關，因此，存在rs6025211之T/T基因型代表HCC患者對精氨酸剝奪療法不會產生反應。

藉由使用序列編號：4的正向引子與序列編號：5或6的逆向引子，擴增包含前述多型性位點的標的核酸，來測定rs6025211之T/T基因型。

根據本揭示內容的某些實施方式，精氨酸剝奪療法包含向患者投予聚乙二醇化形式的rADI(例如，ADI-PEG 20)、活性葉酸、5-FU與奧沙利鉑的組合。

在另一態樣，本發明係關於一種用於預測患有腫瘤(例如，HCC)之患者是否會對精氨酸剝奪療法反應或不反應的套組。

對精氨酸剝奪療法有反應的腫瘤例子包含，但不限於，乳癌、腦瘤、大腸癌、頭頸部鱗狀上皮細胞癌、HCC、白血病(例如，AML)、肺癌、黑色素瘤、間皮瘤(例如，MPM)、神經母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌和肉瘤。

根據本揭示內容的較佳實施方式，患者患有HCC，且該套組包含一對適用於擴增在取自HCC患者生物樣本中包含WWOX基因之SNP的標的核酸的引子，其中該SNP包含rs13338697。具體是，該套組包括專用於測定rs13338697之G/G基因型的一第一引子對，其包含序列編號：1或2的一第一正向引子，以及序列編號：3的一第一逆向引子，其中rs13338697之G/G基因型的存在表示HCC患者者將對精氨酸剝奪療法(例如，聚乙二醇化之rADI)有反應。

另外或可選擇地，該套組更包括適於擴增包含rs6025211之SNP的標的核酸的額外引子。具體是，該套組更包括專用於測定rs6025211之T/T基因型的一第二引子對，其包含序列編號：4的一第二正向引子，以及序列編號：5或6的一第二逆向引子，其中rs6025211之T/T基因型的存在表示HCC患者者將不對精氨酸剝奪療法(例如，聚乙二醇化之rADI或合併聚乙二醇化之rADI、活性葉酸、5-FU及奧沙利鉑之組合)有反應。

該套組還包括位於套組上或與之相關的標籤或仿單(package insert)。具體而言，標籤或仿單提供使用者如何使用該套組的說明，並指明該套組係基於患者的WWOX基因型，來鑑別腫瘤病患者(例如，晚期HCC患者)是否會對精氨酸剝奪療法產生反應。

本發明之一或多個實施方式的細節將於以下的說明中闡述。由下列多個實施方式，以及申請專利範圍，本發明的其他特徵和優點將顯而易見。

所附圖式，其併入且構成說明書一部分，繪示本發明各態樣的不同實例系統、方法及其他例示說明的實施方式。以下本揭示內容的實施方式配合附隨圖式將更明顯易懂，其中：第1圖呈現接受精氨酸剝奪治療之患者，與OS相關之臨床病理因子及SNP基因型的分析。對按照(A)WWOX-rs13338697、(B)rs6025211與(C)GALNT14-rs9679162基因型分層之患者子群組進行卡普蘭-麥爾(Kaplan-Meyer)分析。以對數秩檢定(log-rank test)獲得P值，當P值<0.05則為顯著。

第2圖呈現接受精氨酸剝奪治療之患者，與TTR相關之SNP基因型的分析。對按照(A)WWOX-rs13338697、(B)rs6025211與(C)GALNT14-rs9679162基因型分層的患者子群組進行卡普蘭-麥爾分析。以對數秩檢定獲得P值，當P值<0.05則為顯著。

第3圖呈現接受精氨酸剝奪治療之患者，與TTP相關之臨床病理因素與SNP基因型的分析。對按照(A)WWOX- rs13338697、(B)rs6025211與(C)GALNT14-rs9679162基因型分層的患者子群組進行卡普蘭-麥爾分析。以對數秩檢定獲得P值，當P值<0.05則為顯著。

第4圖呈現在WWOX-rs13338697為G/G型和非G/G型之乳癌細胞中，ADI-PEG 20對細胞存活率的影響。以不同濃度的ADI-PEG 20(每毫升0到4.8微克)處理WWOX-rs13338697為G/G型和非G/G型之乳癌細胞為期72小時，並藉由細胞存活率分析(MTT assay)評估細胞存活率。數據代表了平均值±平均值標準誤差(mean±standard error of the mean(SEM))(n=3，*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001)。以雙尾(two-tailed)變異數分析(analysis of variance，ANOVA)獲得P值。

第5圖呈現在WWOX-rs13338697為G/G型和非G/G型之HCC細胞中，ADI-PEG 20對細胞存活率的影響。以不同濃度的ADI-PEG 20(每毫升0到12微克)處理WWOX-rs13338697為G/G型和非G/G型之HCC細胞為期72小時，並通過細胞存活率分析評估細胞存活率。數據代表了mean±SEM(n=3，*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001)。以雙尾ANOVA獲得P值。

第6圖呈現在WWOX-rs13338697為G/G型之HCC細胞中，ADI-PEG 20顯著地正調控WWOX表現且負調控ASS1表現。以不同濃度之ADI-PEG 20(每毫升0、0.75、1.5、3微克)處理24小時的WWOX-rs13338697 G/G型和非G/G型HCC細胞中，WWOX、 ASS1與β-肌動蛋白(β-actin)的代表性免疫墨點。對於所有獨立實驗，至少進行三次生物性三重覆(biological triplicates)分析。

以下提出之與所附圖式相關的實施方式旨在作為本揭示內容的說明，並非意圖代表本揭示內容可以被實施或運用的唯一形式。

1.定義

本揭示內容中「肝細胞癌」(hepatocellular carcinoma,HCC)是指源於肝細胞的惡性腫瘤。HCC是肝癌的一種。肝癌可能會因為缺乏纖維基質而產生出血和壞死。「晚期肝細胞癌」，是指無法以局部治療手段(例如，手術或放射治療)治癒的HCC。晚期HCC可能是指局部、晚期HCC，也可能是指轉移的HCC。「轉移的肝細胞癌」(metastatic hepatocellular carcinoma)是指由肝臟擴散到身體另一部分的HCC。晚期HCC也可能無法切除，也就是說，它已經擴散到周遭的組織，無法通過手術切除。

本揭示內容中「核酸」(nucleic acid)意指單股或雙股RNA、mRNA與包括cDNA和基因體DNA。除非另有指明，單股核酸序列的左端是5'端；單股核酸序列的右端是3'端。

本揭示內容中「多型性」(polymorphism)是指在不同基因體或個體之間或之中有兩個或更多個替代基因體序列或等位基因的發生。「多型性的」(Polymorphic)是指在群體中可以發現特定基因組序列的兩個或更多變異體的情況。「多型性位點」(polymorphic site)是發生變異的基因座。在本揭示內容的上下文中，「單核苷酸多型性」(single nucleotide polymorphism，SNP)是指一種變異，其發生於基因組(或其他共享序列)中單個核酸與物種成員間不同之時。本揭示內容中表列之SNP以國家生物技術資訊中心(美國)的dbSNP(single nucleotide polymorphism database，單核苷酸多型性資料庫)所指定的SNP識別號為參考，並且多型性位置處的變異體核酸被以反義(非編碼)股上的SNP標示。

本揭示內容中「引子」(primer)是指在核酸及用於核酸聚合反應的試劑(例如，DNA依賴性或RNA依賴性聚合酶)存在並於適當條件(例如，緩衝溶液、鹽、溫度與pH)下，能夠作為受模板引導的DNA合成之起始點的單股寡核酸。在本揭示內容中，將被擴增的序列稱為「標的核酸」。為了擴增雙股DNA，經常使用引子對(即，正向引子和逆向引子)，以便能夠擴增編碼股和非編碼股。根據一般操作，「正向引子」具有與標的核酸編碼股之上游序列實質相同的序列，使得正向引子可以與非編碼股雜交(hybridize)(或黏著(anneal))。另一方面，「逆向引子」具有與標的核酸編碼鏈之下游序列實質互補的序列，使得逆向引子可以與編碼鏈雜交(或黏著)。

本揭示內容中「精氨酸剝奪療法」(arginine deprivation therapy)是指化合物或試劑，其可去除外源性精氨酸對尿素循環已被打斷之癌細胞的供應，藉此阻止了癌細胞的生長且誘導細胞死亡。

與根據本發明用於測定癌症患者對治療(例如精氨酸剝奪療法)之反應性完成之方法/套組相關聯的用語「預測」(prediction)，意指預示或推斷患者是否會以正面的方式(例如患者是否將會對治療產生反應)或以負面的方式對治療有所反應的能力。在一實施方式中，預測與反應的程度有關。在另一實施方式中，預測係關於在治療後，患者是否將會存活或改善的機率，以及在一段期間內疾病是否復發及/或復發的機率。例如，本揭示內容的預測方法可在臨床上使用，透過對特定患者選擇最適當的治療方式，以做出治療決定。本揭示內容的預測方法在預期一患者是否會對治療方案，包括例如投予聚乙二醇化ADI(例如ADI-PEG 20)，產生良好反應上是有價值的工具，或在治療方案後，預期患者長期存活的可能性上也是有價值的工具。

在本揭示內容的上下文中，「反應性」(responsiveness)是指可測量的反應，包括完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩定(stable disease，SD)和疾病惡化(progressive disease，PD)。「完全緩解」是指所有目標病變完全消失而沒有任何殘留病變。應當注意的是，完全緩解並不必然代表著疾病已經治癒。「部分緩解」是指在任何目標病變均無發展，且總腫瘤質量減少

30%，此外無新病變的出現。「疾病穩定」的定義是目標病變總腫瘤質量減少<30%或增加<20%。「疾病惡化」是指目標病變總腫瘤質量增加

20%或出現新病變。患者沒有疾病惡化即達成疾病控制，因此，具有CR、PR和SD的患者被歸類為「有反應者」。反之，表現出PD的患者被稱為「無反應者」。

本揭示內容中「存活」(survival)是指存活的行為或事實。慣用語「總體存活」(overall survival，OS)是指相較於未接受過任何處置(naive)或未經治療的個體或患者而言，延長預期壽命。

本揭示內容中「腫瘤反應時間」(time-to-tumor response,TTR)定義為在達到CR或PR的患者群中，其自精氨酸剝奪療法(例如，ADI-PEG 20)開始到初次出現客觀腫瘤反應(腫瘤縮小

30%)的時間。

本揭示內容中「腫瘤惡化時間」(time-to-tumor progression,TTP)定義為從疾病(例如，HCC)的診斷日期或治療開始到疾病開始惡化或擴散到身體的其他部位的時間長度。在臨床試驗中，測量惡化時間是了解新療法效果如何的一種方法。

除非另有指示，否則「患者」(patient)或「個體」(subject)在本揭示內容中可以互換使用，並且是指任何動物。此動物可以是人類個體。個體可以是已經被鑑別為患有HCC，但尚未接受治療者。或者，個體可以是尚未被鑑定患有HCC或具有發展成HCC之風險，因此尚未接受治療者。

除非另有指示，否則「治療」(treat/treating/treatment)為在患者患有特定疾病或病況時所採取的一種用以降低疾病或病況嚴重程度，或其一或多種症狀嚴重程度，或阻滯或減緩疾病或病況惡化的行為。

儘管，用以界定本發明較廣泛範圍的數值範圍與參數均是約略值，但具體範例中提出的數值已盡可能精確地呈現。然而，任何數值本質上不可避免地包含特定誤差，其源於各檢測手段中所發現的標準偏差。並且，此處使用之用語「約」(about)通常是指一給定數值或範圍的10%、5%、1%或0.5%之內。或者，當由本領域中具有一般知識者考量時，用語「約」是指在可接受的平均值標準誤差之內。除操作/運作示例之外，或除非另有明確的說明，在此揭露之所有數字範圍、數量、數值與百分比，例如用以描述材料數量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他類似者，應被理解為在所有狀況下均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，在本揭示內容中與所附申請專利範圍中所提出之數字參數皆為約略值，且可視需求而變動。無論如何，每個數字參數應該至少就被反映之有效位數的數字，以及應用一般的捨、入計算技巧進行解釋。

除非前後文明確要求，否則於此使用的單數型(a、an與the)涵蓋其複數型用法。

2.用於測定腫瘤患者對精氨酸剝奪療法反應性的方法

長期以來，人們已經認知到癌症治療反應的多樣性，這主要歸因於癌症生物學中潛在的異質性，生理功能的變動程度以及患者遺傳輪廓(genetic profile)的差異。因此，本揭示內容的一個目的旨在提供癌症患者對精氨酸剝奪療法於客觀上有反應或無反應性相關的分子標記。一旦被鑑別，這些分子標記可用於提供癌症患者對精氨酸剝奪療法有反應性或無反應性的預後，藉此醫療從業人員可以基於預後結果為患者者選擇合適的治療方案。

腫瘤的實例包括，但不限於，乳癌、腦瘤、大腸癌、頭頸部鱗狀上皮細胞癌、HCC、白血病(例如，AML)、肺癌、黑色素瘤、間皮瘤(例如，MPM)、神經母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌和肉瘤。

根據本揭示內容的有效實施方式，篩選已經通過精氨酸剝奪療法過程之HCC患者的基因組。具體而言，在WWOX基因的SNP中鑑別出rs13338697以及基因間區段的SNP(rs6025211)。本揭示內容有效實施例所提供的分析顯示，rs13338697之G/G基因型與HCC患者對精氨酸剝奪療法的反應性呈正相關；而rs6025211之T/T基因型與HCC患者對精氨酸剝奪療法的反應性呈負相關。因此，本發明至少基於發現WWOX基因的一或多個SNP，適合作為可預示HCC患者對精氨酸剝奪療法(例如ADI-PEG 20)有或無反應性的分子標記。

鑑於前述內容，本揭示內容之一態樣係一種基於患者WWOX基因型，用以鑑定HCC患者(例如，晚期HCC)對精氨酸剝奪療法有或無反應的方法。

根據本揭示內容的實施例，方法包含由個體取得生物樣本(例如，血清樣本)；並且篩選生物樣本中WWOX基因的 rs13338697之G/G基因型。有效實施例的結果顯示，G/G基因型的存在與接受ADI-PEG 20單一藥物治療後較佳的OS間呈正相關，因此，在HCC患者中，rs13338697之G/G基因型的存在代表此HCC患者會對精氨酸剝奪療法產生反應。

根據本揭示內容的實施方式，藉由聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)相關的方法，可以測定rs13338697之G/G基因型，其包含藉由在PCR反應中使用序列編號：1或2的正向引子及序列編號：3的逆向引子，來擴增包含前述基因多型性位點之標的核酸。具體而言，所選的引子對將在雜交條件下，在包含該SNP(即，G/G基因型)之位點，與該標的核苷酸之被擴增部分雜交，而且，rs13338697之G/G基因型的存在表示HCC患者將對精氨酸剝奪療法表現出正向反應(即，較佳的OS)。

根據本揭示內容的實施方式，精氨酸剝奪療法包括向患者(例如，HCC患者)投予一藥劑，其係選自由DFMO、rADI、rArg、rADC、聚乙二醇化形式之rADI、rArg或rADC、及以上組合所組成的群組。根據本揭示內容的較佳實施方式，在WWOX基因中具有rs13338697之G/G基因型的HCC患者，對精氨酸剝奪療法有反應，其包含對HCC患者以每週18mg/m²或36mg/m²的劑量投予聚乙二醇化形式的rADI(例如，ADI-PEG 20)，直到疾病惡化或發生不可接受的不良事件(adverse event)或符合其他退出試驗的條件為止。

另外或可選擇地，精氨酸剝奪療法更可包括向患者投予精氨酸類似物、細胞自噬抑制劑、化學治療劑、MEK抑制劑、 TRAIL、同功維生素或其組合。細胞自噬抑制劑的例子包括，但不限於，巴非黴素A1、硼替佐米、CQ、HCQ、3-MA和奎那克林。化學治療劑的例子包括，但不限於，5-FU、順鉑、阿糖胞苷、歐洲紫杉醇、奧沙利鉑、阿黴素、甲氨蝶呤和長春新鹼。精氨酸類似物的例子包括，但不限於刀豆胺酸。MEK抑制劑的例子包括，但不限於曲美替尼(GSK1120212)、考比替尼(XL518)、比美替尼(MEK162)、司美替尼、PD-325901、CI-1040、PD035901、TAK-733和U0126。同功維生素的例子包括，但不限於活性葉酸。在部分實施方式中，精氨酸剝奪療法為ADI-PEG 20與TRAIL的組合。在其他實施方式中，精氨酸剝奪療法為ADI-PEG 20與順鉑的組合。在其他實施方式中，精氨酸剝奪療法為ADI-PEG 20與阿糖胞苷的組合。在其他實施方式中，精氨酸剝奪療法為ADI-PEG 20與U0126的組合。在某些實施方式中，精氨酸剝奪療法為ADI-PEG 20與歐洲紫杉醇的組合。在其他實施方式中，精氨酸剝奪療法為ADI-PEG 20、活性葉酸、5-FU與奧沙利鉑的組合。在其他實施方式中，精氨酸剝奪療法為rArg與3-MA的組合。在其他實施方式中，精氨酸剝奪療法為rArg與CQ的組合。

另外或可選擇地，該方法更包含測定生物樣本中標的核酸的rs6025211之T/T基因型。本揭示內容實施例結果顯示，rs6025211之T/T基因型與ADI-PEG 20相關療法間呈現負相關，其中不利之TTP與利用精氨酸剝奪療法治療的HCC患者體內之rs6025211之T/T基因型的存在相關聯。

根據本揭示內容的實施方式，藉由使用序列編號：4的正向引子及序列編號：5或6的逆向引子，擴增包含前述基因多型性位點的標的核酸，來測定rs6025211之T/T基因型。具體而言，所選的引子對將在雜交條件下，在包含該SNP(即，T/T基因型)之位點，與該標的核酸之被擴增部分雜交，而且，rs6025211之T/T基因型的存在表示HCC患者將不會對精氨酸剝奪療法有反應，其中，與沒有rs6025211之T/T基因型的患者相比，發現較短的TTP與rs6025211的T/T基因型的存在彼此呈現正相關。

或者，可以藉由其他習知技術及其等效物來測定在WWOX基因中特定位點之基因型。已知技術的例子包括，但不限於限制性片段長度多型性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)分析、核酸侵入分析(invader assay)、單核苷酸引子延伸(single nucleotide primer extension)、TaqMan分析、動態等位基因專一性雜交(dynamic allele-specific hybridization，DASH)、分子信號分析(molecular beacon assay)、直接定序、電泳、溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis)和單鏈構象多型性(single-stranded conformation polymorphism，SSCP)分析。

3.用於測定癌症患者對精氨酸剝奪療法之反應性的套組

鑑於前述內容，本揭示內容之另一態樣乃針對一套組，其用於鑑別來自癌症患者(例如，HCC患者)之生物樣本中標的核酸的SNP，以用於患者是否會對精氨酸剝奪療法有反應之預後。

根據本揭示內容的實施方式，該套組可用於鑑別患有腫瘤(像是乳癌、腦瘤、大腸癌、頭頸部鱗狀上皮細胞癌、HCC、白血病(例如，AML)、肺癌、黑色素瘤、間皮瘤(例如，MPM)、神經母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌和肉瘤)之患者的標的核酸的一或多個SNP之存在與否。

一般說來，標的核酸可以是收集自患者的臨床樣本，例如血清樣本。該套組可包含用於擴增包含WWOX基因之至少一個多型性位點之標的序列的物質，以及用於鑑定在該多型性位點之基因型的工具。

根據本揭示內容的較佳實施方式，該套組包含用於擴增包含患者WOXX基因之rs13338697的標的核酸的第一引子對。例如，可以在PCR反應中，藉由序列編號：1或2的正向引子以及序列編號：3的逆向引子，來擴增包含有rs13338697的標的核酸，其中所選的引子對將在雜交條件下，在包含該SNP(即，G/G基因型)之位點，與該標的核酸之被擴增部分雜交。根據本揭示內容的實施例，rs13338697之G/G基因型的存在表示HCC患者將對精氨酸剝奪療法表現出正向反應(即，較佳的OS)。

在某些實施方式中，標的核酸可能包含一個多型性位點；而在其他實施方式中，標的核酸可包含兩個或更多的多型性位點。此情況下，套組可更進一步包含用於擴增標的核酸中rs6025211的SNP之第二引子對。具體而言，該第二引子對是用於擴增生物樣本中包含rs6025211之T/T基因型的標的核酸。藉由使用序列編號：4的正向引子和序列編號：5或6的逆向引子來擴增rs6025211之T/T基因型，其中，所選的引子對將在雜交條件下，在包含T/T基因型之位點，與該標的核酸之被擴增部分雜交。本揭示內容實施例的結果表明，rs6025211之T/T基因型與精氨酸剝奪療法呈負相關，其中接受過精氨酸剝奪療法治療之癌症患者體內rs6025211之T/T基因型之存在與不利的TTP具有關聯性。

根據本揭示內容的實施方式，rs6025211之T/T基因型的存在表示HCC患者將不會對精氨酸剝奪療法有反應，其中，與沒有rs6025211之T/T基因型的患者相比，發現較短的TTP與rs6025211的T/T基因型的存在呈正相關。

視狀況而定地，該套組可以包括用於說明結果的說明書。該說明書可以印刷或電子形式被包括在套組中。或者，藉由提供連結或網址的方式來提供使用者經由對位於網路或外部站點存取該說明書。網站可以是公眾均可使用的或有防護的網站。尤其是，該說明書可以說明在特定位置特定基因型之存在，可預示患者腫瘤(例如，HCC)的CR或PR。在一實施方式中，所述特定位置之特定基因型包含WWOX基因的rs13338697之G/G基因型。視狀況而定地，在特定位置之特定基因型包含rs6025211的T/T基因型。

現在將參考以下實施例，更具體地描述本發明，該等實施例是出於說明之目的而提供，並非出於限制之目的。儘管以下皆使用常規方法進行，本領域之技術人員仍可使用其他替代地程序、方法或技術完成本發明。

實施例

材料與方法

細胞培養

分別從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得人類HCC細胞株，包括J7、Huh7、HepG2和Mahlavu細胞，以及人類乳腺癌細胞株，包括BT20、MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MDA-MB-468和MCF-7。其中，J7、BT20、MDA-MB-231、MDA-MB-435s和MDA-MB-468細胞株屬於WWOX-rs13338697之G/G基因型(WWOX GG型)；而Huh7、HepG2、Mahlavu和MCF-7細胞株為WWOX-rs13338697之非G/G基因型(WWOX非GG型)。

J7、Huh7、Mahlavu與MDA-MB-468細胞株培養於添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1%青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin，P/S)的達爾伯克氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)，並於5% CO₂的37℃加濕培養箱中進行養育。HepG2細胞株培養於添加10% FBS和1%P/S的最低必需培養基α(Minimum Essential Medium α，MEM α)中，並於具5% CO₂的37℃加濕培養箱中進行養育。BT20 和MCF-7細胞株培養於添有10% FBS和1%P/S的羅斯威爾帕克紀念研究所培養基1640(Roswell Park Memorial Institute-1640，PRMI-1640)中，並於5% CO₂的37℃加濕培養箱中進行養育。MDA-MB-231和MDA-MB-435s細胞株培養於添加10%FBS和1% P/S的DMEM/F12中，並於5% CO₂的37℃加濕培養箱中進行養育。

MTT分析

MTT分析是一種比色分析，其測量在活細胞中，還原溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)，一種黃色的四唑，成為紫色甲

(formazan)的酵素活性。這樣的還原反應只發生於活細胞中；因此，MTT分析一般被用來評估細胞的存活力與增殖。簡言之，在進行後續程序至少16小時前，於96孔盤的每一個孔洞中接種3×10³個細胞。以指定劑量的ADI-PEG 20處理細胞一到三天。隨後，將MTT染料(Bio basic，美國)添加到96孔盤的每一孔洞中，並進行反應3小時。藉由測量每一孔洞在590nm處的吸光度來評估相對細胞存活力，並使用未經ADI-PEG 20處理的孔洞所獲得的吸光度進行標準化。

免疫墨點(西方墨點法)

收取未處理及經ADI-PEG 20處理的細胞，並裂解後取得總細胞蛋白萃取物。使用BCA蛋白分析套組(賽默飛世爾，沃爾瑟姆市，麻薩諸塞州)測定蛋白質濃度。將蛋白質萃取物注入至十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳中以分子量大小將蛋白分離後，進一步將膠體中之蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上。以專一性一級抗體和結合山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的二級抗體來標定PVDF膜上的蛋白後，再以增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)套組(密理博公司，比爾里卡鎮，馬薩諸塞州)使特定蛋白質信號可被偵測。該發光信號可藉由曝露在X光底片上來獲取影像。

招募患者

此研究使用了接受精氨酸剝奪治療之患者的血清樣本。納入本研究的患者已被診斷為晚期HCC，並且先前已在台灣參加了ADI-PEG 20的臨床試驗(NCT01287585)。具體而言，患者接受ADI-PEG 20單一藥物治療(每週劑量18mg/m²，直到疾病惡化或發生不可接受的不良事件或符合其他退出試驗的條件為止)使用去連結(de-linked)的樣本和臨床病理參數進行事後分析(post hoc analysis)。

治療結果評估

OS期間起算自隨機納入患者之日，至不論其原因死亡之日，或無法定期追蹤之日止。根據反應評估標準(Response Evaluation Criteria)以實質固態標準(Solid Tumors criteria)評估客觀的腫瘤反應(Eisenhauer et al,Eur J Cancer 2009,45,228-247)。在任何目標病變中沒有惡化，且腫瘤體積減少

30%，且沒有出現新病變即定義為有反應。TTR之期間為隨機納入患者之日起，至腫瘤反應之日止，並於退出試驗之日設限。疾病惡化定義為目標病變總腫瘤增加

20%或出現新病變。TTP的期間起算自隨機納入患者之日，至疾病惡化之日，並於最後一次放射學評估之日進行設限。

SNP基因型分型

使用小量DNA抽取套組(QIAamp DNA mini kit，QIAGEN公司，馬里蘭州，美國)，按照製造商提供的說明從血清樣本中分離細胞外游離的基因體DNA。使用表1中列出的引子進行半巢式(semi-nested)PCR。根據製造商提供的程序，使用PCR產物純化套組(EasyPrep Gel & PCR extraction kit，圖爾思生物科技公司)純化PCR產物。接著以桑格氏定序法(Sanger’s sequencing)進行純化的PCR產物之基因型分型。

統計分析

以比率(%)表示二元化的數據，並使用卡方檢定(χ2 test)或費雪精確檢定(Fisher’s exact test)進行比較。參數數據表示為平均值±標準差(mean±standard deviation(SD))，並以兩次抽樣的t檢定(t-test)進行比較。以中位數(範圍)表示非參數數據或非常態分佈的數據，並以曼-惠特尼檢定(Mann-Whitney test)進行比較。單變量和多變量Cox比例風險模型(Cox proportional hazard models)用於估計與臨床和基因型變數相關的生存率。分類後，採用卡普蘭-麥爾(Kaplan-Meyer，KM)方法估計群組間的生存概率，並採用對數秩檢定比較生存率。p<0.05被認為具有統計學意義。使用統計軟體(SPSS(18.0版)或Prism(8.0版))執行統計分析。

實施例

實施例1 本研究中患者的基準特徵

本研究共納入113名施以ADI-PEG 20治療的晚期HCC患者。表2概述了該等患者的基準臨床參數和基因型特徵。

實施例2 在接受精氨酸剝奪療法之晚期HCC患者的臨床病理因素及SNP基因型與OS、TTR和TTP的相關性

使用Cox比例風險模型執行分析後，再進行KM分析，以調查是否有任何列於表2的基準特徵與SNP基因型的參數，與被招募之患者的OS、TTR及TTP相關。

單變數分析顯示，相較於腫瘤數量>4的患者，腫瘤數量≦4的患者具有較長的OS(平均OS，10.6個月[95% CI：8.5到12.7]對比於6.2個月[95%信賴區間(Confidence interval，CI)：5到7.3]；P=0.001)。而且，相較於WWOX-rs13338697之非G/G基因型的患者，具WWOX-rs13338697之G/G基因型的患者具有較長的OS(平均OS，15.1個月[95% CI：6.7到23.4]對比於8.1個月[95% CI：6.8到9.3]；P=0.025)(表3)。此外，在接受精氨酸剝奪療法的患者身上，這兩個因素對OS來說是獨立的預測指標(經調整的P值分別為0.003及0.045)。隨後以KM分析證實該發現，這顯示在這些患者中，腫瘤數量與WWOX-rs13338697之基因型可以做為預測OS的獨立因素(第1圖小圖(A))。然而，rs6025211與GALNT14-rs9679162的基因型對OS來說並無預測性上的價值(第1圖小圖(B)與(C))。

為了了解在被招募之患者中這些因素是否與TTR和TTP相關，還進行了類似的分析。不幸的是，不論是使用COX比例風險模型(表4)或KM分析(第2圖)，發現任何參數均與TTR不相關。

然而，有趣的是，在COX比例風險模型中使用單變數分析發現了腫瘤數目及rs6025211之T/T基因型與TTP相關(表5，P值分別為0.011及0.021)。當與腫瘤數量≦4的患者比較時，腫瘤數量 >4的患者與較短的TTP相關聯(平均TTP，2.1個月[95% CI：1.7到2.5]對比於3.8個月[95% CI：2.8到4.8])。就rs6025211基因型而言，當與非T/T基因型的患者比較時，T/T基因型的患者具有較短的TTP(平均TTP，2.0個月[95% CI：1.3到2.6]對比於3.3個月[95% CI：2.6到4.0])。使用COX比例風險模型的多變數分析更顯示，在患者身上這兩個因素對TTP來說是獨立的預期指標(P值分別為0.007及0.012)。藉由使用腫瘤數量(P=0.0076)或rs6025211之T/T基因型(當相比於非T/T基因型時，P=0.0151)對這些患者(第3圖)進行KM分析，揭示了患者之明顯的分層(stratification)。並未發現與其他SNP基因型之相關聯(第3圖)。

綜上所述，WWOX-rs13338697之G/G基因型與rs6025211之T/T基因型可以獨立於臨床病理參數，像是腫瘤數量，來預測精氨酸剝奪療法的結果。

使用中位數作為參數資料的臨界值。OS：整體存活率；HR(hazard ratio)：風險比率；CI：信賴區間；N：患者人數。*：P值得自COX比例風險模型的單變數分析。^#：P值得自以腫瘤數量和rs13338697-GG作為共變數，進行的COX比例風險模型的多變數分析。所有小於0.05的P值均被認為是顯著的。

實施例3 ADI-PEG 20抑制WWOX-rs13338697之G/G基因型癌細胞生長

於本實施例中，藉由MTT分析評估ADI-PEG 20對癌細胞(包括WWOX-rs13338697之G/G基因型與非G/G基因型)存活率的影響。結果呈現於第4及5圖。

相較於那些具有WWOX-rs13338697之非G/G基因型的乳癌細胞株(像是MCF-7細胞株)，發現到ADI-PEG 20對具有WWOX-rs13338697之G/G基因型的乳癌細胞株(包括BT20、MDA-MB-231、MDA-MB-435s、及MDA-MB-468細胞株)之生長能力具有強大的抑制作用(第4圖)。在HCC細胞中也發現了類似的結果，其中WWOX-rs13338697之G/G基因型的HCC細胞株(像是J7細胞株)，對於施用ADI-PEG 20展現出比非G/G基因型的HCC細胞株(像是Huh7、HepG2及Mahlavu細胞株)更佳的反應性(第5圖)。此外，發明人意外地發現到，施以高劑量ADI-PEG 20(每毫升12微克)之 Huh7細胞株的細胞存活率高於低劑量ADI-PEG 20處理(例如每毫升0.75、1.5、3或6微克)之細胞株，這表示非G/G基因型之HCC細胞可能對ADI-PEG 20治療具有抗藥性。

綜上所述，這些結果證實了WWOX-rs13338697之G/G基因型癌細胞比非G/G基因型癌細胞對ADI-PEG 20治療有更好的反應。

實施例4 在WWOX-rs13338697之G/G基因型癌細胞中，ADI-PEG 20增進WWOX之表現並降低ASS1之表現

在本實施例中，於WWOX-rs13338697之G/G基因型與非G/G基因型的癌細胞中，檢驗ADI-PEG 20對WWOX和ASS1蛋白表現之影響。結果呈現於第6圖。

相較於非G/G基因型的HCC細胞株(像是Huh7、HepG2及Mahlavu細胞株)，發現到施以ADI-PEG 20會大幅增加WWOX-rs13338697之G/G基因型的HCC細胞株(像是J7細胞株)之WWOX蛋白表現量。且對比之下，相較於非G/G基因型的HCC細胞株(例如Huh7、HepG2及Mahlavu細胞株)，施以ADI-PEG 20會抑制WWOX-rs13338697之G/G基因型的HCC細胞株(例如J7細胞株)之ASS1蛋白的表現量(第6圖)。此外，發明人亦發現到，施以ADI-PEG 20會上調HepG2及Mahlavu細胞株中ASS1的表現量，這明顯表示非G/G基因型之HCC細胞對ADI-PEG 20的治療具有抗藥性。此實施例的結果證實了，在WWOX-rs13338697之G/G基因型癌細胞中，ADI-PEG 20透過增加WWOX和減少ASS1蛋白表現進而抑制癌細胞生長。

綜上所述，本揭示內容確認了WWOX-rs13338697在接受精氨酸剝奪療法之患者身上是OS的獨立預期指標。另外發現到rs6025211是精氨酸剝奪療法的TTP預期指標。

以上之說明書應被理解為，其中的實施例僅以示例方式揭露，且所屬技術領域中具有通常知識者有能力進行各種修改。以上之說明書、示例和數據提供了對本發明的示例性實施例之結構與使用的完整描述。儘管以上之說明書已經以相當程度的特殊性或參照一個或多個單獨的實施方式描述了本發明的各種實施例，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本揭示內容之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾。

               序列表
          <![CDATA[<110> 北極星藥業集團]]>
          <![CDATA[<120> 用以鑑別出適用精氨酸剝奪療法之患者的方法與套組]]>
          <![CDATA[<130> P4166-TW_說明書(20210405)]]>
          <![CDATA[<160> 9]]>
          <![CDATA[<170> BiSSAP 1.3.6]]>
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          <![CDATA[<400> 9]]>
          tccctcctac tgaacctctc c                                              21

Claims

一種在患有肝細胞癌之個體的生物樣本中鑑別一標的核酸之單核酸多型性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，以預斷該個體是否會對精氨酸剝奪療法有反應的方法，該方法包含：以一聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)相關之方法，在該生物樣本中測定該標的核酸之rs13338697是否存在一G/G基因型；其中，該標的核酸之rs13338697的該G/G基因型之存在代表該肝細胞癌個體對精氨酸剝奪療法有反應。
如請求項1所述之方法，其中該標的核酸係藉由在該基於PCR之方法中，以一具有序列編號：1或2之序列的正向引子，以及一具有序列編號：3之序列的逆向引子擴增而得。