TWI780408B - 一種角膜植入之組合物及其用途與製備方法 - Google Patents

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Abstract

本申請提供一種角膜植入之組合物，包含：一膠原蛋白薄膜；及一近端腎小管細胞，貼附於該膠原蛋白薄膜。另外，本申請更提供一種角膜植入之組合物用於植入角膜內皮細胞受損之患者的用途及該角膜植入之組合物的製備方法。

Description

一種角膜植入之組合物及其用途與製備方法
本發明涉及一種自體細胞薄膜之組合物，特別是將自體近端腎小管細胞培養在膠原蛋白薄膜作為角膜植入之組合物。
全世界有超過1000萬人因眼角膜受傷或疾病而失明，2012年全球眼科醫材市場規模達348.2億美元，預估近年市場將達418億美元，而全世界每年約有20萬人接受角膜移植手術，一半原因是角膜內皮細胞喪失所造成。
角膜內皮細胞(Corneal Endothelial Cells)，主要幫助角膜排水，沒有再生功能，數量會因年齡、長期缺氧、疾病...等原因減少，當數量低至一定程度時便會對視力造成影響。角膜內皮細胞具有維持角膜正常含水量和透明度的功能，發生病變會造成角膜水腫和混濁進而影響視力。以往治療角膜內皮細胞失常的方法乃是需要藉由全層性角膜移植術，然而臨床上如偽水晶體水泡角膜病變或是原發角膜內皮細胞退化疾病等單純角膜內皮細胞的喪失問題，理論上只需要後層角膜移植術以置換掉有病變的角膜內皮層。和其他器官移植一樣，角膜移植也面臨器官來源短缺的問題。
目前角膜內皮細胞功能缺損可採用角膜內皮細胞層移植。彈力層撕去後角膜內皮細胞移植（Descemet Stripping Automated Endothelial Keratoplasty，DSAEK），在移植前會將捐贈者的角膜進行前處理，以刀切除角膜上皮及基質，保留部份後角膜基質及角膜內皮層，再經由小傷口移植進病患的眼內。由於傷口遠較全層角膜移植小，因此避免角膜散光、角膜縫線造成的併發症，部份文獻也指出術後排斥機率較全層角膜移植要低。然而，DSAEK手術移植進患者眼內的是厚度約為150µm，帶有角膜內皮和部份後角膜基質的移植物，有時會因為移植物的切割不平整，影響視力恢復，因此在DSAEK之後，又發展出後彈力層角膜內皮移植術(Descemet's membrane endothelial keratoplasty-DMEK)。
DMEK的移植厚度約為10-15µm，僅含角膜內皮層及Descemet’s層的移植物，不包含後角膜基質，患者術後視力恢復極佳。據統計在成功的手術後，大於八成的患者視力可到0.8以上，相較於DSAEK，DMEK可提供更好的視力品質。然而要移植厚度約為10-15µm的移植物進入患者眼內需要高度的技術。
姜宜妮於2017年公開之博士論文「近端腎小管細胞之組織工程研究」有探討近端腎小管細胞（Renal proximal tubule cells，RPTCs）的培養，並揭露了角膜內皮細胞和近端腎小管細胞一樣具有調控水分的功能並且都具有鈉鉀幫浦和水通道，其在兔模組上將自體近端腎小管細胞培養於幾丁聚醣和有機矽膜（PDMS）薄膜上植入修補受損的角膜內皮細胞。植入一周後，自體近端腎小管細胞仍在眼球中存活，但兔眼球在植入近端腎小管細胞/幾丁聚醣複合體後，眼球呈現不透明和腫脹的情況，而人類近端腎小管細胞在PDMS上培養的活性不佳。因此，目前仍需要一種安全、方便、易操作的角膜植入物，用於內皮細胞受損之患者的治療。
鑑於先前技術所存在之問題，本申請提供一種角膜植入之組合物，包含：一膠原蛋白薄膜；及一近端腎小管細胞，貼附於該膠原蛋白薄膜。
在一實施例中，該近端腎小管細胞於該膠原蛋白薄膜上之密度約為5 × 104 細胞/平方公分（cells/cm2 ）至5 × 106 細胞/平方公分（cells/cm2 ）。
在一實施例中，該膠原蛋白薄膜的直徑約為6毫米～10毫米，厚度約為120微米～200微米。
在一實施例中，該膠原蛋白薄膜的直徑約為8毫米，厚度約為160微米，且該近端腎小管細胞於該膠原蛋白薄膜上之密度約為5 × 105 細胞/平方公分（cells/cm2 ）。
另外，本申請更提供一種角膜植入之組合物用於植入角膜內皮細胞受損之患者的用途。較佳的，該近端腎小管細胞為該患者之自體近端腎小管細胞。較佳的，其係在角膜內皮細胞移植手術中的應用。
再者，本申請提供一種角膜植入之組合物的製備方法，包含以下步驟：提供一患者之近端腎小管細胞；將該近端腎小管細胞種入底部置有一膠原蛋白薄膜的細胞培養容器中；及培養約5～10天以獲得該角膜植入之組合物。
在一實施例中，該近端腎小管細胞係取自該患者之腎臟組織，並經擴增培養而獲得。
在一實施例中，該近端腎小管細胞以約5 × 104 的細胞數種入底部置有該膠原蛋白薄膜的細胞培養容器中，培養7天後在膠原蛋白薄膜上達到約5 × 105 細胞/平方公分（cells/cm2 ）的密度。
在以下闡述本發明之細節，描述僅為例示性的方法及材料，但不以之為限，其他本文中所描述類似或等效之方法及材料來實施或測試本發明，皆應視為本申請所涵蓋的範圍。在本說明書及隨附申請專利範圍中，除非上下文另外清楚指出，否則包括單數形式亦包括複數。除非另有定義，否則本文中使用之所有技術及科學術語，具有與熟習本發明所屬技術之一般人員的通常理解相同之含義。
本發明之優點及特徵以及達到其方法將參照例示性實施例及附圖進行更詳細地描述而更容易理解。然而，本發明可以不同形式來實現且不應該被理解僅限於此處所陳述的實施例。相反地，對所屬技術領域具有通常知識者而言，所提供的此些實施例將使本揭露更加透徹與全面且完整地傳達本發明的範疇，且本發明將僅為所附加的申請專利範圍所定義。如本文中所使用的，術語”及/或”包含任何及所有一或多相關所列物件的組合。
除非另外定義，所有使用於本文的術語(包含科技及科學術語)具有與本發明所屬該領域的技術人士一般所理解相同的意思。將更可理解的是，例如於一般所使用的字典所定義的那些術語應被理解為具有與相關領域的內容一致的意思，且除非明顯地定義於本文，將不以過度理想化或過度正式的意思理解。如本說明書所記載者，範圍數值係作為說明在該範圍內的各個及每一個數值的簡略表示，在該範圍內的任何數值可被選作為該範圍的端值。
本申請提供一種角膜植入之組合物，包含：一膠原蛋白薄膜；及一近端腎小管細胞，貼附於該膠原蛋白薄膜。
在一實施例中，該近端腎小管細胞於該膠原蛋白薄膜上之密度約為5 × 104 細胞/平方公分（cells/cm2 ）至5 × 106 細胞/平方公分（cells/cm2 ）。
在一實施例中，該膠原蛋白薄膜的直徑約為6毫米～10毫米，厚度約為120微米～200微米。
在一實施例中，該膠原蛋白薄膜的直徑約為8毫米，厚度約為160微米，且該近端腎小管細胞於該膠原蛋白薄膜上之密度約為5 × 105 細胞/平方公分（cells/cm2 ）。
另外，本申請更提供一種角膜植入之組合物用於植入角膜內皮細胞受損之患者的用途。較佳的，該近端腎小管細胞為該患者之自體近端腎小管細胞。較佳的，其係在角膜內皮細胞移植手術中的應用。
再者，本申請提供一種角膜植入之組合物的製備方法，包含以下步驟：提供一患者之近端腎小管細胞；將該近端腎小管細胞種入底部置有一膠原蛋白薄膜的細胞培養容器中；及培養約5～10天以獲得該角膜植入之組合物。
在一實施例中，該近端腎小管細胞係取自該患者之腎臟組織，並經擴增培養而獲得。
在一實施例中，該近端腎小管細胞以約5 × 104 的細胞數種入底部置有該膠原蛋白薄膜的細胞培養容器中，培養7天後在膠原蛋白薄膜上達到約5 × 105 細胞/平方公分（cells/cm2 ）的密度。
實施例1-近端腎小管細胞的取得
人類檢體取自於患有腎臟腫瘤並經醫師評估需進行腎臟摘除手術的病人，過程中所取下之腎臟組織，在不影響病理診斷下收集檢體及收集檢體之大小，選取腎實質的部位，以手術剪刀與鑷子將檢體剪裁為一立方公分的大小，採集3塊保存於Hanks'平衡鹽溶液(HBSS)，並放置於4℃。而動物試驗之檢體以相同方法取自該動物之自體腎臟。
將檢體以PBS清洗乾淨後剪成小塊，放入微量離心管（eppendorf）中再用小剪刀剪成碎泥。將檢體組織放在10公分培養盤（10cm dish）中，以60毫克的膠原蛋白酶（collagenase）溶於20毫升含Ca2+ 的Hanks平衡鹽溶液（Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS），在37℃下分解檢體組織30分鐘，並用針筒沖散顆粒後，將液體全部吸至50毫升離心管，加入30毫升的HBSS以1000rpm離心4分鐘。移除上清液後，加入10毫升的HBSS將顆粒沖散，使用250微米的篩網過濾，並以1000 rpm離心4分鐘。再次移除上清液，加入30升生之45% Percoll溶液（Pharamacia Biotech）沖散顆粒，以14500 rpm、4℃，離心30分鐘。
由於腎小管細胞層數量很少，在看到細胞分層後先取一滴在顯微鏡下觀察找到腎小管所在的分層後，置入15毫升離心管中，加入10毫升的HBSS以800 rpm離心4分鐘。移除上清液後，加入10毫升的細胞培養基（HPTC）沖散顆粒，種入塗佈有膠原蛋白的10公分培養盤，在37 °C、5% CO2 的培養箱中培養10天左右以獲得約7~9 × 106 的近端腎小管細胞。又，經擴增後之近端腎小管細胞，可使用0.05% 胰蛋白酶/EDTA將細胞收集並進行繼代培養。
實施例2-角膜植入之組合物的製備
將直徑大小8毫米且厚度約160微米的膠原蛋白薄膜，以PBS清洗2次後，放置48孔盤的底部，且上方壓O型環以防止薄膜浮起。將利用實施例1方法所取得的近端腎小管細胞，以5 × 104 的細胞數種入含膠原蛋白薄膜的孔洞中，在37 °C、5% CO2 的培養箱中培養7天後，得到貼附有約5 × 105 細胞/平方公分（cells/cm2 ）之近端腎小管細胞的膠原蛋白薄膜。
實施例3-動物試驗
將利用實施例2方法所取得的角膜植入之組合物，以彈力層撕去後角膜內皮細胞移植（Descemet Stripping Automated Endothelial Keratoplasty，DSAEK）手術的標準操作方法，植入豬的角膜中。圖1～圖4分別顯示了試驗1～試驗4的結果，並將試驗1～試驗4的結果分別評估植入後的透明度（1到4分，1分最模糊，4分最透明）、紅腫程度（1到3分，1分最不紅腫，3分最紅腫）及貼附程度（0到2分，分別為無貼附、部分貼附和全貼附），評估結果彙整如下表1： 表1
  透明度 紅腫程度 貼附程度
試驗1 4 1 2
試驗2 4 1 2
試驗3 4 1 2
試驗4 3 1 2
另外，將試驗1之角膜冷凍切片進行ZO-1、鈉鉀ATP酶（Na/K ATPase）及N-鈣粘蛋白（N-cadherin）的免疫螢光染色，來檢視近端腎小管細胞的活性，如圖5A～圖5C所示，近端腎小管細胞在植入後的120天仍然存活。又，將試驗2之角膜冷凍切片進行鈉鉀ATP酶（Na/K ATPase）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、ZO-1及GLUT1的免疫螢光染色，如圖6A～圖6D所示，同樣發現近端腎小管細胞在植入後的120天仍然存活。
從圖1～圖4以及表1可看出，本申請的角膜植入之組合物，在植入角膜後透明度佳，紅腫程度低且可完全貼附，且從圖5～圖6顯示，近端腎小管細胞貼附於膠原蛋白薄膜在植入後可持續存活且活性良好。同時，膠原蛋白薄膜可加強貼附並在植入後會被逐漸被吸收，留下近端腎小管細胞取代角膜內皮細胞，而使用自體近端腎小管細胞做移植也不會有排斥問題，因此，本申請之角膜植入之組合物，可作為自體細胞薄膜醫材，取代原受損角膜內皮細胞，進而恢復角膜內皮細胞之功能性。
無
［圖1A］為試驗1於植入後第0天之結果。 ［圖1B］為試驗1於植入後第7天之結果。 ［圖1C］為試驗1於植入後第30天之結果。 ［圖1D］為試驗1於植入後第60天之結果。 ［圖1E］為試驗1於植入後第90天之結果。 ［圖2A］為試驗2於植入後第0天之結果。 ［圖2B］為試驗2於植入後第3天之結果。 ［圖2C］為試驗2於植入後第7天之結果。 ［圖2D］為試驗2於植入後第30天之結果。 ［圖2E］為試驗2於植入後第60天之結果。 ［圖2F］為試驗2於植入後第90天之結果。 ［圖3A］為試驗3於植入後第0天之結果。 ［圖3B］為試驗3於植入後第3天之結果。 ［圖3C］為試驗3於植入後第7天之結果。 ［圖3D］為試驗3於植入後第30天之結果。 ［圖3E］為試驗3於植入後第60天之結果。 ［圖3F］為試驗3於植入後第90天之結果。 ［圖4A］為試驗4於植入後第0天之結果。 ［圖4B］為試驗4於植入後第3天之結果。 ［圖4C］為試驗4於植入後第7天之結果。 ［圖4D］為試驗4於植入後第30天之結果。 ［圖4E］為試驗4於植入後第60天之結果。 ［圖4F］為試驗4於植入後第90天之結果。 ［圖5A］為試驗1之ZO-1染色結果。 ［圖5B］為試驗1之鈉鉀ATP酶染色結果。 ［圖5C］為試驗1之N-鈣粘蛋白染色結果。 ［圖5D］為試驗1的陰性對照組。 ［圖6A］為試驗2之鈉鉀ATP酶染色結果。 ［圖6B］為試驗2之N-鈣粘蛋白染色結果。 ［圖6C］為試驗2之ZO-1染色結果。 ［圖6D］為試驗2之GLUT1染色結果。。

Claims (9)

  1. 一種角膜植入之組合物，包含：一膠原蛋白薄膜；及一近端腎小管細胞，貼附於該膠原蛋白薄膜；其中該近端腎小管細胞於該膠原蛋白薄膜上之密度約為5×104細胞/平方公分(cells/cm2)至5×106細胞/平方公分(cells/cm2)。
  2. 如請求項1之組合物，其中該膠原蛋白薄膜的直徑約為6毫米~10毫米，厚度約為120微米~200微米。
  3. 如請求項1之組合物，其中該膠原蛋白薄膜的直徑約為8毫米，厚度約為160微米，且該近端腎小管細胞於該膠原蛋白薄膜上之密度約為5×105細胞/平方公分(cells/cm2)。
  4. 一種如請求項1~3任一項之組合物用於植入角膜內皮細胞受損之患者的用途。
  5. 如請求項4之用途，其中該近端腎小管細胞為該患者之自體近端腎小管細胞。
  6. 如請求項4之用途，其係在角膜內皮細胞移植手術中的應用。
  7. 一種如請求項1~3任一項之組合物的製備方法，包含以下步驟：提供一患者之近端腎小管細胞；將該近端腎小管細胞種入底部置有一膠原蛋白薄膜的細胞培養容器中；培養約5~10天以獲得該角膜植入之組合物。
  8. 如請求項7之製備方法，其中該近端腎小管細胞係為該患者之腎臟組織於體外擴增培養而獲得。
  9. 如請求項7之製備方法，其中該近端腎小管細胞以約5×104的細胞數種入底部置有該膠原蛋白薄膜的細胞培養容器中，培養7天後在膠原蛋白薄膜上達到約5×105細胞/平方公分(cells/cm2)的密度。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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期刊 Terryn S, Jouret F, Vandenabeele F, et al. A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes Am J Physiol Renal Physiol 293: F476–F485 2007 *
期刊 姜宜妮 近端腎小管細胞之組織工程研究 國立臺灣大學醫學 工程學研究所博士論文 上架日2017/10/20 摘要, 第4-6章; *

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