TWI777923B

TWI777923B - 岩藻糖苷酶抑制劑

Info

Publication number: TWI777923B
Application number: TW105124173A
Authority: TW
Inventors: 陶德Ｃ詹卡爾; 莎拉露意絲伊莎貝拉; 阿曼達安妮郭
Original assignee: 美商地平線罕見醫學製藥有限責任公司
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2022-09-21
Also published as: CA2992033A1; KR20180030699A; IL256662A; RU2765202C2; JP2021152078A; US20190077756A1; AU2020289858A1; WO2017019925A1; BR112018000961A2; ZA201800638B; EP3328832A1; JP2018522023A; JP6981961B2; AR105540A1; CN107848970B; US9951013B2; MX2018001315A; RU2018107143A; EP3328832B1; IL256662B

Abstract

本發明大體上係關於適用作岩藻糖苷酶酶類之抑制劑的化合物，且關於用如本文中所揭示之化合物來治療腫瘤或癌症，諸如肝功能失調及肝腫瘤(例如，肝細胞癌)的方法及組合物。

Description

岩藻糖苷酶抑制劑

[相關申請案之交叉引用]

本申請案主張2015年7月30日提交之美國臨時申請案第62/199,194號之權益，且所述申請案以全文引用之方式併入本文中。

已經注意到蛋白質糖基化在正常細胞與腫瘤細胞之間的差異且將其作為研發腫瘤選擇性抗體之依據(Hakomori,S.,Adv Exp.Med.Biol.,491：369-402,2001)。相對於正常肝細胞而言，已觀測到肝細胞癌(HCC)細胞會顯著且不適當地使其糖蛋白岩藻糖基化(Block,T.M等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A,102：779-84,2005；Comunale,M.A等人，J.Proteome Res.8：595-602,2009；Mehta,A.等人，Dis.Markers,25：259-65,2008；Noda,K.等人，Cancer Res.63：6282-9,2003；Norton,P.A.等人，J.Cell.Biochem.104：136-49,2008)。此等糖蛋白之大部分會在腫瘤溶酶體中死亡，在此情況下此等糖蛋白會發生降解。一份報告提出升高的溶酶體α-L-岩藻糖苷酶之血清含量對HCC具有預測性，其指示癌變前肝細胞為在生物合成路徑中適應增加量之糖蛋白的海藻糖基化之而導致此酶可能會受到上調(Giardina,M.G.等人，Cancer 83：2468-74,1998)。已對人類肝α-L-岩藻糖苷酶之催化機制進行過研究(White,W.J.等人，Biochim.Biophys.Acta.912：132-8(1987))。

例如因基因中之遺傳性突變所致的溶酶體α-L-岩藻糖苷酶(FUCAl)之失活會導致溶酶體儲積病(LSD)，其稱為岩藻糖苷儲積病(Willems,P.J.等人，Eur.J.Hum.Genet.7：60-7,1999；Intra,J.等人，Gene 392：34-46,2007)。表現有岩藻糖苷儲積病之患者展現出未降解物質之溶酶體積聚，因為所述患者無法以溶酶體方式降解經末端及核心岩藻糖基化之寡糖，且其存活期很少超過六年(Willems,P.J.等人，Am.J.Med.Genet.38：111-31,1991)。

美國專利5,240,707揭示α-甘露糖苷酶及岩藻糖苷酶抑制劑，其經推測適用作免疫調節劑及抗轉移劑。其他已知的岩藻糖苷酶抑制劑包含L-脫氧岩藻野尻黴素(L-deoxyfuconojirimycin；DFJ)(Winchester,B.等人，Biochem.J.265：277-82,1990)，其基於經典野尻黴素亞胺基糖結構且對溶酶體岩藻糖苷酶具有10nM之抑制常數。亦參見美國專利5,100,797，其揭示了基於脫氧岩藻野尻黴素(DFJ或DNJ)，例如β-L-同型岩藻野尻黴素，及經1-β-C取代之脫氧甘露野尻黴素之額外抑制劑。另一強效岩藻糖苷酶抑制劑為7員氮雜環庚烷類之一員((3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羥基氮雜環庚烷-3-羧酸，亦稱為「Faz」)。除了具有艾杜糖醛糖之羥基組態及羧基官能基，此新穎分子亦在低奈莫耳範圍內以一定效能抑制岩藻糖苷酶(Li,H.等人，Chembiochem 9：253-60,2008)。亦已研究具有胺之烷基修飾的亞胺基糖抑制劑(McCormack,P.L.等人，Drugs 63：2427-34；論述2435-6,2003；Bause,E.等人，FEBS Lett.278：167-70,1991)。岩藻糖苷酶抑制劑進一步描述於美國專利第5,382,709號、第5,240,707號、第5,153,325號、第5,100,797號、第5,096,909號及第5,017,704號、美國專利公開案第2011/0189084號及Wu等人，Angew.Chem.Int.Ed. 49：337-40(2010)中。

本發明大體上係關於用於治療腫瘤或癌症，包含肝功能失調，諸如肝細胞癌的化合物、組合物及方法。所涵蓋之組合物包括如本文中所揭示之化合物。

在一個態樣中，本發明提供一種式I化合物：

其中：X¹、X²及X³獨立地選自由OH、鹵基及O(C)OCH₃組成之群；R選自由C_1-3烷基及C_1-3鹵烷基組成之群；R¹選自由H、C_1-3烷基、OH、-CO₂C_1-3烷基組成之群；R²選自由以下組成之群：-NR^bC(O)R^a、-NR^bC(O)OR^a、-NR^bC(O)NR^cR^a、-NR^bC(O)SR^a、-C(O)R^a及-C(O)NR^bR^a；R^a為-C_0-3伸烷基-G；G選自由芳基、雜芳基、環烷基及雜環烷基組成之群；且R^b及R^c獨立地選自由H及C_1-3烷基組成之群。

在一些實施例中，X¹、X²及X³為OH。

在一些實施例中，R為甲基。

在一些實施例中，R¹為H。

在一些實施例中，R²為-NR^bC(O)R^a。

在一些實施例中，R²為-C(O)NR^bR^a。

在一些實施例中，R^b為H。

在一些實施例中，G選自由以下組成之群：視情況經取代之吲哚基、苯并噻吩基、茀基、茚基、二氫茚基及苯基。

在一些實施例中，G選自由以下組成之群：視情況經取代之苯基及

其中A為5、6、7、8、9或10員碳環或雜環系統。

在一些實施例中，G選自由以下組成之群：

R^d及R^e獨立地選自由以下組成之群：H、OR^f、NR^fR^g、C_1-3烷基及C_1-5環烷基；或R^d及R^e與其所連接之碳原子結合在一起形成C=O；R^f及R^g獨立地選自由H及C_1-3烷基組成之群；且Y選自由以下組成之群：NH、N-C_1-3烷基、S、SO、SO₂及O。

在一些實施例中，G選自由以下組成之群：

在一些實施例中，R^a選自由以下組成之群：

在一些實施例中，R^a為

在一些實施例中，式I化合物具有以下結構：

在一些實施例中，式I化合物具有以下結構：

在一些實施例中，化合物選自由以下組成之群：

在一些實施例中，化合物選自由以下組成之群：

在一些實施例中，化合物選自由以下組成之群：

在另一態樣中，本發明提供一種用於在有需要之個體中治療腫瘤或癌症之方法，所述方法包括投與治療有效量之如本文所述之化合物。在各種實施例中，化合物為以下化合物II或化合物III：

在各種實施例中，腫瘤或癌症為肝癌、乳癌、黑素瘤、肺癌、白血病、胰臟癌、胃癌、結直腸癌及頭頸癌。

在各種實施例中，化合物會減少個體中之腫瘤轉移。在另一實施例中，治療使得個體中之腫瘤尺寸減小。

在一些實施例中，腫瘤為肝腫瘤且為肝細胞癌、肝炎病毒感染、肝硬化、中毒性肝損傷及遺傳性血色素沉著症之結果。

在一相關實施例中，肝腫瘤為肝細胞癌之結果。

在另一實施例中，治療使得個體之血液中的α-胎蛋白含量相比於治療之前的含量有所降低。

在一些實施例中，化合物經靜脈內投與。在一相關實施例中，化合物經由肝動脈投與。在一些實施例中，以在0.02至2000mg/kg或0.1至100mg/kg範圍內之劑量投與化合物，例如1至1500mg/kg、10至1000mg/kg、25至500mg/kg、50至250mg/kg、75至200mg/kg、50至150mg/kg、60至130mg/kg、70至110mg/kg、75至100mg/kg、80至95mg/kg、85至90mg/kg、100至250mg/kg、120至230mg/kg、130至220mg/kg、140至210mg/kg、150至200mg/kg、160至190mg/kg、170至180mg/kg、約87.5mg/kg或約175mg/kg。

在一些實施例中，與第二藥劑組合投與化合物。在某些實施例中，第二藥劑選自由以下組成之群：化學治療劑、細胞毒性劑、放射性同位素、抗病毒劑、抗真菌劑、消炎劑及抗體。在一相關實施例中，化學治療劑選自由小紅莓及5-氟尿嘧啶組成之群。

在另一實施例中，第二藥劑為細胞毒性劑。在一些實施例中，細胞毒性劑選自由以下組成之群：鹽酸氮芥、環磷醯胺、異環磷醯胺、苯丁酸氮芥、美法侖(melphalan)、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、達卡巴嗪(dacarbazine)及鏈脲菌素。

在另一實施例中，第二藥劑為放射性同位素。在一些實施例中，放射性同位素選自由以下組成之群：¹³¹I、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、¹²⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²⁵⁵Fm、¹⁴⁹Tb、²²³Rd、²¹³Pb、²¹²Pb、²¹¹At、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、²²⁵Ac、¹⁸⁶Re、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga及^99mTc。

在一個實施例中，腫瘤與肝炎病毒感染相關聯，且第二藥劑為抗病毒劑。

亦涵蓋本文所揭示之前述化合物中之任一者在製備供用於治療本文所述之腫瘤或癌症中之任一者的藥物中之用途。亦涵蓋供用於治療腫瘤或癌症的包括如本文所述之化合物的組合物。亦涵蓋注射器，例如單次使用或預填充注射器；包括前述化合物中之任一者的無菌密封容器，例如，小瓶、瓶、器皿及/或套組或包裝，視需要伴以適合之使用說明書。

本文中所述的前述化合物中之任一者可與本領域中已知的或本文所述的適用作輔助療法以治療腫瘤或癌症之任何藥劑同時投與。亦涵蓋包括前述化合物中之任一者以及其他治療劑(例如，肝治療劑)之組合物。

應理解本文所述之各特徵或實施例或組合為本發明態樣中任一者的非限制性、例示性實例，且同樣意謂可與本文所述之任何其他特徵或實施例或組合進行組合。舉例而言，在以諸如「一個實施例」、「一些實施例」、「又一實施例」、「具體例示性實施例」及/或「另一實施例」之措辭描述的特徵中，此等類型之實施例中之每一者為特徵之非限制性實例，其意欲與本文所述之任何其他特徵或特徵組合進行組合而不必列舉出每一可能性組合。所述特徵或特徵組合適用於本發明態樣中之任一者。當揭示屬於範圍內的數值之實例時，涵蓋此等實例中任一者為可能之範圍端點，涵蓋在所述端點之間的任何及所有數值，且預想上端點及下端點之任何及所有組合。

圖1為展示與化合物II、III及IV一起培育之HepG2細胞之糖蛋白代謝中之擾動的圖。

圖2為展示24小時治療之後HepG2細胞中化合物II及IV之細胞毒性的圖。

圖3為展示48小時治療之後HepG2細胞中化合物II及IV之細胞毒性的圖。

本發明係關於化合物及所述化合物作為岩藻糖苷酶抑制劑(例如，作為抑制α-L-岩藻糖苷酶之活性以自糖蛋白分解岩藻糖殘基之化合物)之用途。本發明亦關於所述化合物治療腫瘤或癌症，諸如肝腫瘤，尤其肝細胞癌之用途。在不受本發明之理論約束的情況下，岩藻糖苷酶抑制劑誘導糖蛋白衍生之寡糖在溶酶體中積聚，類似於溶酶體儲積病在肝細胞中之影響，由此在細胞中誘發細胞毒性事件。

定義

除非上下文另外明確指示，否則如本文中及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「所述」包含複數個指示物。因此，例如提及「一種衍生物」，其包含複數個所述衍生物，且提及「一個患者」，其包含提及一或多個患者，諸如此類。

此外，除非另外說明，否則使用「或」意謂「及/或」。類似地，「包括(comprise/comprises/comprising)」及「包含(include/includes/including)」為可互換的且並不意欲為限制性的。

更應理解在各種實施例之描述使用術語「包括」之情況下，本領域中熟習此項技術者應理解在一些特定情況中，可使用措辭「主要由......組成」或「由......組成」來替代地描述實施例。

除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬之領域中一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。儘管類似或等效於本文所述之方法及材料的彼等方法及材料可用於實踐所揭示之方法及產品，但例示性方法、裝置及材料描述於本文中。

提供上文所論述且貫穿全文之文獻僅僅因為其公開於本申請案之申請日之前。不應將本文中之任何內容解釋為承認本發明人無權先於藉助於先前發明之此類揭示內容。在特別注意各文獻經引用用於之揭示內容之情況下，所述文獻以全文引用之方式併入本文中。

以下參考文獻為熟練的技術人員提供本發明中所用的多種術語之一般定義：Singleton等人，《微生物學及分子生物學辭典(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)》(第2版1994)；《劍橋科學及技術辭典(THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)》(Walker編，1988)；《遺傳學詞彙表(THE GLOSSARY OF GENETICS)》，第5版，R.Rieger等人(編),Springer Verlag(1991)；及Hale與Marham，《哈珀柯林斯生物學辭典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)》(1991)。

如本文所用，「治療有效量」或「有效量」係指化合物之足以引起症狀改善，例如相關醫學病狀得以治療、癒合、預防或改善，或此類病狀之治療、癒合、預防或改善之比率提高，通常在經治療患者群體中獲得統計學顯著改良的量。當參考單獨投與之個別活性成分時，治療有效劑量僅指所述成分。當指代組合時，治療有效劑量係指不論組合(包含連續或同時)投與之產生治療效果之活性成分之組合量。在一些實施例中，諸如關於脂肪肝病，治療有效量之化合物改善一或多種症狀，包含(但不限於)肝纖維化、肝臟脂肪含量、肝硬化之發生率或進程、肝細胞癌之發生率、諸如ALT及AST之肝臟轉胺酶含量增加、血清鐵蛋白增加、γ-麩胺醯轉化酶(γ-GT)之含量升高及血漿胰島素、膽固醇及三酸甘油酯之含量升高。

如本文所用，「肝腫瘤」包含產生在肝臟中或其上的或與肝臟物理相關之原發性腫瘤及/或贅瘤及/或轉移瘤。其亦包含轉移至體內其他處，但仍對本文所揭示之化合物有反應的肝腫瘤之轉移瘤。所述腫瘤及贅瘤之許多類型為已知的。原發性肝腫瘤包含肝細胞癌及本領域中已知的其他腫瘤。所述腫瘤通常為實體腫瘤或其為積聚定位於肝臟之擴散腫瘤。根據本發明之供用於治療的腫瘤或贅瘤可為惡性或良性的，且預先用化學療法、放射及/或其他治療進行治療。

如本文所用，「腫瘤」或「贅瘤」或「癌症」包含原發性腫瘤及/或轉移瘤。腫瘤包含例如卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌或胃癌及其轉移至肝臟之瘤。

「治療」係指預防性治療或治療性治療。在某些實施例中，「治療」係指出於治療或預防目的，向個體投與化合物或組合物。

「治療性」治療為出於減輕或消除病理學病徵或症狀之目的，向展現彼等病徵或症狀之個體投與治療。病徵或症狀可為生物化學、細胞、組織學、功能或生理、主觀或客觀的。

「預防性」治療為出於降低患病狀的風險之目的，向未展現疾病之病徵或僅展現疾病之早期病徵之個體投與治療。本發明之化合物或組合物可作為預防性治療提供以減少患病狀之可能性或以使病狀 (若患有)之嚴重性降至最低。

「診斷」意謂鑑定病理學病狀之存在、程度及/或性質。診斷方法在其特異性及選擇性方面有所不同。雖然特定診斷方法可能提供不出病狀之確定診斷，但若所述方法提供輔助診斷之正向指示，則其為足夠的。

「醫藥組合物」係指適合於個體動物(包含人類及哺乳動物)之醫藥用途的組合物。醫藥組合物包括治療有效量之本發明化合物，視情況包括其他生物學活性劑，且視情況包括醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一實施例中，醫藥組合物涵蓋包括活性成分及構成載劑之惰性成分的組合物，以及直接或間接由任何兩種或兩種以上成分之組合、複合或聚集或由一種或一種以上成分的解離或由一種或一種以上成分的其他類型之反應或相互作用而產生的任何產物。因此，本發明之醫藥組合物涵蓋藉由將本發明化合物與醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑摻和而製得之任何組合物。

「醫藥學上可接受之載劑」係指標準醫藥載劑、緩衝劑及其類似者中之任一者，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、5%右旋糖水溶液及乳液(例如，油/水或水/油乳液)。賦形劑之非限制性實例包含佐劑、黏合劑、填充劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、助滑劑、甜味劑、調味劑及著色劑。適合之醫藥載劑、賦形劑及稀釋劑描述於《雷明頓醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(第19版，Mack Publishing Co.,Easton,1995)中。較佳醫藥載劑視投與活性劑之預期模式而定。典型投與模式包含經腸(例如，經口)或非經腸(例如，皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內注射；或局部、經皮或經黏膜投與)。

「醫藥學上可接受之鹽」為可調配成用於醫藥用途之化合物的鹽，其包含(但不限於)金屬鹽(例如，鈉、鉀、鎂、鈣等)及氨或有機胺之鹽。

如本文所使用，「醫藥學上可接受」或「藥理學上可接受」意謂不為生物學上或其他方面所不期望之物質，亦即，可在不導致任何非期望之生物影響情況下或在不以有害方式與含有其之組合物之任何組分或與存在於個體身體上或體內之任何組分相互作用之情況下向個體投與之物質。

如本文所用，術語「單位劑型」係指適合作為用於人類及動物個體之單一劑量之物理離散單位，各單位含有以足以視情況結合醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑或媒劑而產生所需作用之量計算的預定數量之本發明化合物。本發明之新穎單位劑型之規格視所用特定化合物及將達到之效果及與主體中之各化合物相關之藥效學而定。

如本文所用，術語「個體」涵蓋哺乳動物。哺乳動物的實例包含(但不限於)哺乳動物類別的任何成員：人類、非人類靈長類(諸如黑猩猩及其他猿類及猴類物種)；農畜，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔、狗及貓；實驗室動物，包含嚙齒動物，諸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及其類似動物。術語並不指示特定年齡或性別。在各種實施例中，個體為人類。在各種實施例中，個體為兒童或青年。

α-L-岩藻糖苷酶

正常情況下，α-L-岩藻糖苷酶(Genbank寄存編號NP_000138)(以引用之方式併入本文中)會在溶酶體中參與長糖鏈(寡糖)之裂解。當缺乏所述酶時，糖鏈會發生積聚且最終會導致岩藻糖苷儲積病之臨床特徵。岩藻糖苷儲積病為一種由缺乏α-L-岩藻糖苷酶且糖岩藻糖在組織中積聚所導致之常染色體隱性溶酶體儲積病。參見，例如Johnson等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.133：90-7,1986。不同表型包含諸如以下之臨床特徵：呈嚴重早期形式之神經退化、生長遲緩、內臟肥大(visceromegaly)及癲癇；呈較長存活形式之粗略面部特徵、彌漫性體血管角質瘤(angiokeratoma corporis diffusum)、痙攣及精神運動發育延緩。

可使用基因測試偵測岩藻糖苷儲積病以鑑定岩藻糖苷酶基因中之突變。亦藉由岩藻糖苷儲積病患者之尿液中的岩藻糖基化蛋白質之含量存在升高來診斷岩藻糖苷酶(Michalski等人，Eur J Biochem.201：439-58,1991)。

在肝細胞癌中已偵測到α-L-岩藻糖苷酶之含量升高且提出作為HCC之標誌物(Giardina等人，Cancer 70：1044-48,1992)。

岩藻糖苷酶抑制劑

本發明提供干擾醣鍵之岩藻糖苷酶水解的酶活性之化合物。化合物具有如式I中所提供之結構：

其中：X¹、X²及X³獨立地選自由OH、鹵基及O(C)OCH₃組成之群；R選自由C_1-3烷基及C_1-3鹵烷基組成之群；R¹選自由H、C_1-3烷基、OH、-CO₂C_1-3烷基組成之群；R²選自由以下組成之群：-NR^bC(O)R^a、-NR^bC(O)OR^a、-NR^bC(O)NR^cR^a、-NR^bC(O)SR^a、-C(O)R^a、及-C(O)NR^bR^a；R^a為-C_0-3伸烷基-G；G選自由芳基、雜芳基、環烷基及雜環烷基組成之群；且R^b及R^c獨立地選自由H及C_1-3烷基組成之群。

在一些情況下，X¹、X²及X³為OH，R為甲基，及/或R¹為H。在一些情況下，R²為-NR^bC(O)R^a或-C(O)NR^bR^a。在一些情況下，R^b 為H。

適合之G基團包含(但不限於)視情況經取代之吲哚基、苯并噻吩基、茀基、茚基、二氫茚基及苯基。舉例而言，G基團包含視情況經取代之苯基及

其中A為5、6、7、8、9或10員碳環或雜環系統。

G基團亦包括(但不限於)：

其中R^d及R^e獨立地選自由以下組成之群：H、OR^f、NR^fR^g、C_1-3烷基及C_1-5環烷基；或R^d及R^e與其所連接之碳原子結合在一起形成C=O；R^f及R^g獨立地選自由H及C_1-3烷基組成之群；且Y選自由以下組成之群：NH、N-C_1-3烷基、S、SO、SO₂及O。

G基團之實例包括(但不限於)以下：

R^a基團之實例包括(但不限於)以下：

在一些情況下，式I化合物具有以下結構：

在一些情況下，式I化合物具有以下結構：

適合之化合物包括(但不限於)：

化合物之實例亦包括(但不限於)：

使用方法、醫藥組合物及投藥

可藉由將化合物溶解、懸浮或乳化於含水或無水溶劑，諸如植物油或其他類似油、合成脂族酸甘油酯、高級脂族酸之酯或丙二醇中；且若需要，伴以習知添加劑，諸如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑來將所述化合物調配成注射製劑。

化合物可在經由吸入給藥之氣溶膠調配物中使用。本發明化合物可調配成可接受之加壓推進劑，諸如二氯二氟甲烷、丙烷氮氣及其類似者。

用於注射或靜脈內投與之單位劑型可包括組合物中之化合物，所述組合物為在無菌水、無菌生理鹽水或另一醫藥學上可接受之無菌載劑中的溶液。

在實際使用中，本文所述之化合物可作為活性成分根據習知醫藥混配技術與醫藥載劑組合成緊密混雜物。載劑可視投藥(例如口服或非經腸(包含靜脈內))所需之製劑形式而採取多種形式。

就經皮投藥途徑而言，藥物經皮投藥之方法揭示於《雷明頓醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(第17版，Gennaro等人編，Mack Publishing Co.,1985)中。經皮或皮膚貼片為一種適用於本發明之方法的經皮傳送化合物之手段。貼片較佳提供諸如DMSO之吸收增強劑以增加化合物之吸收率。用於經皮藥物遞送之其他方法揭示於美國專利第5,962,012號、第6,261,595號及第6,261,595號中。所述專利中之每一者以全文引用之方式併入本文中。

醫藥學上可接受之賦形劑，諸如媒劑、佐劑、載劑或稀釋劑均可在市面上購得。此外，醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、潤濕劑及其類似者均可在市面上購得。

技術人員應易於瞭解，劑量可隨特定化合物、症狀之嚴重程度及個體對副作用之易感性而變化。給定化合物之較佳劑量可易於由本領域中熟習此項技術者藉由多種手段確定，包含(但不限於)在患者、測試動物中及活體外進行之劑量反應及藥代動力學評定。

在此等態樣中之每一者中，儘管在任何給定情況下之最適合之途徑將部分視治療病狀之性質及嚴重程度及活性成分之性質而定，但組合物包含(但不限於)適用於口服、經直腸、表面、非經腸(包含皮下、肌肉內及靜脈內)、經肺(經鼻或經頰吸入)或經鼻投藥之組合物。例示性投藥途徑為口服及靜脈內途徑。組合物可適宜地以單位劑型存在且藉由藥劑學技術中熟知的任何方法來製備。

可將本發明之組合物包囊於或附著至病毒外膜或微脂粒或併入至細胞中來進行投與。微脂粒為通常為球形且常呈脂質之微胞顆粒。脂質體為由雙層膜形成之微脂粒。適合之微脂粒包含(但不限於)單層微脂粒及多層脂質微脂粒或脂質體。可使用標準技術由廣泛範圍之脂質或磷脂化合物，諸如卵磷脂、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、鞘磷脂、醣脂、神經節苷脂等來製得所述微脂粒及脂質體，諸如描述於例如美國專利第4,394,448號中之微脂粒及脂質體。所述微脂粒或脂質體可用於以胞內方式投與化合物且將化合物遞送至目標器官。亦可使用包囊來達成相關組合物之控制釋放(參見例如美國專利第5,186,941號)。

可使用將化合物遞送至血液流中之任何投藥途徑。較佳地，以非經腸形式投與組合物，最佳靜脈內投與。在一些實施例中，經由門靜脈投與組合物。頸靜脈內及頸動脈內注射亦為適用的。可局部或區域性地投與組合物，諸如腹膜內或皮下或肌肉內。在一個態樣中，與適合之醫藥稀釋劑或載劑投與組合物。

投與劑量將視個體需要、所需效果、所用活性劑及所選投藥途徑而定。化合物之較佳劑量在約0.2pmol/kg至約25nmol/kg範圍內，且尤佳劑量在2至250pmol/kg範圍內；或者，化合物之較佳劑量可在0.02至2000mg/kg或0.1至100mg/kg範圍內，例如1至1500mg/kg、10 至1000mg/kg、25至500mg/kg、50至250mg/kg、75至200mg/kg、50至150mg/kg、60至130mg/kg、70至110mg/kg、75至100mg/kg、80至95mg/kg、85至90mg/kg、100至250mg/kg、120至230mg/kg、130至220mg/kg、140至210mg/kg、150至200mg/kg、160至190mg/kg、170至180mg/kg、約87.5mg/kg或約175mg/kg。

本發明化合物適用於對動物，例如哺乳動物中，且特定言之對人類進行治療性、預防性及診斷性干預。

本發明方法可用於治療多種不同疾病病狀。可用本發明化合物治療之特定疾病病狀會有所變化。因此，影響肝臟且可藉由本發明之方法治療的疾病病狀包含細胞增殖性疾病，諸如贅生性疾病、自體免疫疾病、激素異常疾病、退行性疾病、老年疾病及可引起肝臟腫瘤生長之類似疾病。

治療意謂涵蓋與化合物之投藥相關的對個體之任何有益結果，其包含降低獲取疾病之可能性；預防疾病；減緩、遏止或逆轉疾病之進展或改善與使主體受折磨的疾病病狀相關之症狀，其中改善或受益用於廣義地指至少降低與經治療之病理性病狀相關之參數(例如症狀，諸如與其相關之炎症及疼痛)之量值。因此，治療亦包含以下情況：其中病理性病狀或至少與其相關之症狀得到完全抑制，例如防止發生或停止，例如終止，使得主體不再患有病理性病狀，或至少表徵所述病理性病狀之症狀。

癌症

本文預期岩藻糖苷酶之抑制劑適用於治療經測定對用岩藻糖苷酶抑制劑進行之治療具有敏感性之癌症。本文預期方法適用於鑑定對用岩藻糖苷酶抑制劑進行之治療具有抗性的癌症。例示性癌症包含(但不限於)腎上腺皮質癌、AIDS相關癌症、AIDS相關淋巴瘤、肛門癌、肛門直腸癌、肛管癌、附件癌、兒童小腦星形細胞瘤、兒童大腦星形細胞瘤、基底細胞癌、皮膚癌(非黑素瘤)、膽道癌、肝外膽管癌、肝內膽管癌、膀胱癌、泌尿膀胱癌、骨與關節癌、骨肉瘤及惡性纖維組織細胞瘤、腦癌、腦腫瘤、腦幹神經膠瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經膠瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、小腦幕上原始神經外胚層瘤、視覺路徑及下丘腦神經膠瘤(visual pathway and hypothalamic glioma)、乳癌(包含三陰性乳癌)、支氣管腺瘤/類癌、類癌瘤、胃腸癌、神經系統癌、神經系統淋巴瘤、中樞神經系統癌、中樞神經系統淋巴瘤、宮頸癌、兒童癌症、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓白血病、慢性骨髓增生病、結腸癌、結直腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、淋巴贅瘤、蕈樣真菌病、賽謝症候群(Seziary Syndrome)、子宮內膜癌、食道癌、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞瘤、肝外膽管癌、眼癌、眼內黑素瘤、視網膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌(gastric/stomach cancer)、胃腸類癌瘤、胃腸道基質腫瘤(GIST)、生殖細胞瘤、卵巢生殖細胞瘤、妊娠期滋養細胞腫瘤神經膠瘤、頭頸癌、肝細胞(肝)癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、眼內黑素瘤、眼癌、胰島細胞瘤(內分泌胰臟)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、腎臟癌、腎癌、喉癌、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓白血病、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓白血病、毛細胞白血病、唇癌及口腔癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、AIDS相關淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、沃爾丹斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstram macroglobulinemia)、神經管胚細胞瘤、黑素瘤、眼內(眼)黑素瘤、梅克爾細胞癌(merkel cell carcinoma)、惡性間皮瘤、間皮瘤、轉移性鱗狀頸癌、口癌、舌癌、多發性內分泌瘤症候群、蕈樣真菌病、骨髓發育不良症候群、骨髓發育不良/骨髓增生病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、多發性骨髓瘤、慢性骨髓增生病、鼻咽癌、神經母細胞瘤、口部癌、口腔癌、口咽癌症、卵巢癌、卵巢上皮癌、低惡性潛能卵巢瘤、胰臟癌、胰島細胞胰臟癌、鼻副竇及鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽部癌、嗜鉻細胞瘤、松果體母細胞瘤及小腦幕上原始神經外胚層瘤、垂體瘤、漿細胞贅瘤/多發性骨髓瘤、胸膜肺母細胞瘤、前列腺癌、直腸癌、腎盂及輸尿管癌、移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、尤文氏家族肉瘤腫瘤(ewing family of sarcoma tumor)、軟組織肉瘤、子宮癌、子宮肉瘤、皮膚癌(非黑素瘤)、皮膚癌(黑素瘤)、梅克爾細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃(stomach/gastric)癌、小腦幕上原始神經外胚層腫瘤、睪丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤及胸腺癌、甲狀腺癌、腎盂與輸尿管及其他泌尿器官之移行細胞癌、妊娠期滋養細胞腫瘤、尿道癌、子宮內膜子宮癌、子宮肉瘤、子宮體癌、陰道癌、外陰癌及威姆氏腫瘤(Wilm's Tumor)。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：黑素瘤、結直腸癌、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、卵巢癌及肺癌。

在各種實施例中，腫瘤或癌症為肝癌、乳癌、黑素瘤、肺癌、白血病、胰臟癌、胃癌、結直腸癌或頭頸癌。

肝功能失調

本發明所涵蓋之肝病或肝功能失調包含(但不限於)下文所論述之彼等病症。肝細胞癌或肝細胞瘤為世界第五大最常見癌症且發病率一直在不斷攀升。致瘤肝細胞保留有高LRP1表現水準。肝細胞癌對化學療法反應不佳，因為腫瘤細胞顯示高抗藥率且因為所用化學療法因全身性(靜脈內)投藥所致尤其在心臟及腎臟中具有嚴重毒性。

肝炎為針對肝臟炎症之通用術語。肝炎可為急性或慢性且包含急性或慢性肝臟衰竭，例如因病毒(例如，A、B、C、D或E型肝炎或非ABCDE、CMV、EB(Epstein-Barr))、真菌、立克次體或寄生蟲感染、酒精、化學毒素、藥物(例如乙醯胺苯酚、胺碘酮、異菸肼、氟烷、氯丙嗪、紅黴素)、代謝型肝病(例如，威爾遜氏病(Wilson's disease)、α1-抗胰蛋白酶缺乏)、癌症、特發性自體免疫肝病、肝硬化(例如原發性膽汁性肝硬化)、膽道阻塞所致。由A、B及/或C型肝炎病毒導致之肝臟感染可引起緩慢進行性肝病進而導致肝臟衰竭。急性肝炎感染最常由A型肝炎所致。B型肝炎及C型肝炎感染可在體內存留且變成長期存在之感染(慢性)。C型肝炎可導致包含肝硬化及癌症之重大病狀。

所涵蓋的可使用本文所揭示之化合物治療的額外肝功能失調或病狀包含與肝脂織炎、膽汁鬱積、肝硬化、中毒性肝損傷(例如，因藥物毒性或環境毒性所致，諸如黃黴毒素B1相關癌症)及遺傳性血色素沉著症相關或由其引起之腫瘤。

預期使本文所揭示之化合物與第二藥劑組合來進行對患有肝腫瘤之個體的投藥，所述第二藥劑包含(但不限於)化學治療劑、細胞毒性劑、放射性同位素、抗病毒劑、抗真菌劑、消炎劑、抗體及其他適用於治療肝腫瘤或其他與肝腫瘤發展相關之肝病的療法。

用於與本文所揭示的治療肝癌之化合物組合向HCC患者投與的候選藥物包含(但不限於)：5-氟尿嘧啶、小紅莓(阿德力黴素)、絲裂黴素C、順鉑、表阿黴素、道諾黴素、依託泊苷(etoposide)及表1中所闡明之其他化學治療劑、阿丹弗(adefovir)、拉米夫定(lamivudine)、因提弗(entecavir)、利巴韋林(ribavirin)、干擾素α、聚乙二醇化干擾素α-2a、干擾素α-2b及其他抗病毒劑、維生素E、熊去氧膽酸及其他用於治療肝功能失調之藥劑。其他藥劑展示於下表1中。

適用於治療腫瘤之細胞毒素劑包含(但不限於)鹽酸氮芥、環磷醯胺、異環磷醯胺、苯丁酸氮芥、美法侖、白消安、噻替派、卡莫司汀、洛莫司汀、達卡巴嗪及鏈脲菌素。

適用於治療腫瘤之放射性同位素包含(但不限於)¹³¹I、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、¹²⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²⁵⁵Fm、¹⁴⁹Tb、²²³Rd、²¹³Pb、²¹²Pb、²¹¹At、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、²²⁵Ac、¹⁸⁶Re、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga及^99mTc。

預期供用於方法中之抗體包含用於治療癌症及其他病症之抗體，包含(但不限於)抗表皮生長因子受體(EGFR)(西妥昔單抗(cituximab)、帕尼圖單抗(panitumamab))抗血小板衍生生長因子受體α(PDGFRα)、抗磷脂醯肌醇蛋白3(GPC3)及其他適用於治療癌症或已轉移至肝臟及身體其他部位之癌症的抗體。

套組

作為額外態樣，本發明包含以有助於實踐本發明之方法對其加以使用之方式封裝的套組，所述套組包括一或多種本文所述之化合物或組合物。在一個實施例中，此類套組包含本文所述之化合物或組合物(例如，包括單獨化合物或與第二藥劑之組合的組合物)，其封裝在貼有標籤的諸如密封瓶或器皿之容器中，或包含於描述化合物或組合物在實踐方法中之用途的封裝體中。較佳地，以單位劑型形式封裝化合物或組合物。套組可進一步包含適用於根據特定投藥途徑投與組合物之裝置。較佳地，套組含有描述組合物用途之標籤。

雖然已結合本發明之特定實施例描述本發明，但先前描述以及在其之後之實例意欲說明而並非限制本發明之範疇。在本發明之範疇內的其他態樣、優點以及修改對於本領域中熟習此項技術者將為顯而易見的。

實例 實例1 化合物之合成

可根據以下方法，使用起始試劑之適合變體來製備本文所揭示之化合物。鑒於以下教示且使用典型有機化學技術，本領域中熟習此項技術者可合成如本文中所揭示之化合物。

中間體A之合成：如流程1中所示由D-葡萄糖製備中間體A。

中間體A之去苄化作用產生化合物13，其可轉化為經保護之化合物14a。

式I化合物之合成：如流程2中所示，由化合物13藉由轉化成烯胺(化合物16)，之後與合適之活性羧酸偶合來製備式I化合物。

如流程3中所示，亦由化合物13藉由轉化成硫代內醯胺(化合物29)，之後與合適之α-溴醯胺(化合物3')偶合且轉化成式I化合物來製備式I化合物。

實例2 活體外岩藻糖苷酶抑制

藉由製備50mM磷酸-檸檬酸(pH 4.5)、5mM MgCl₂、640nM 4-甲基傘形基-α-L-岩藻哌喃糖苷(4MU-FUC)、1ng/mL rhFUCA1(研發系統)及以下化合物II、化合物III或化合物IV之反應混合物來評定岩藻糖苷酶抑制：

將反應(100μL)在37℃下保溫30分鐘，且隨後用600mM之相同體積的檸檬酸-碳酸緩衝液(pH 9)淬滅。藉由360nm下之激發及 450nm下之發射來量測螢光。結果提供於下表2中。

結果表明化合物II、化合物III及化合物IV有效抑制岩藻糖苷酶活性。

實例3 用經標記之岩藻糖進行之代謝標記

藉由使HepG2細胞在無岩藻糖苷酶抑制劑之情況下或在化合物II、化合物III或化合物IV情況下(參見實例2)生長24小時，且隨後添加四乙酸(3S,4R,5R,6S)-6-乙炔基四氫-2H-哌喃-2,3,4,5-四酯、含有代替5'-甲基之炔烴部分的預乙醯化之岩藻糖類似物(Click-iT^TM岩藻糖炔烴(Click-iT^TM Fucose Alkyne),Molecular Probes,Eugene,Oregon)額外48小時來檢定糖蛋白代謝中之擾動。固定、滲透、洗滌細胞且用Alexa Fluor 488疊氮化物(Alexa Fluor 488 Azide)染色以正交標記併有岩藻糖類似物之糖蛋白。隨後使用Guava 6HT-2L流式細胞儀(ThermoFisher)分析細胞之螢光。結果提供於圖1及表3中，且表明用化合物II及化合物IV治療後細胞中之岩藻糖基化物質的含量升高，其與岩藻糖苷酶抑制一致。結果亦表明在用化合物III治療之細胞中岩藻糖基化物質之含量降低，表明海藻糖基化可能得到抑制。此外，在使用健康纖維母細胞代替HepG2細胞之類似檢定中，其表明用化合物II進行之治療對岩藻糖基化物質之含量的影響極小。

實例4 HepG2細胞中之細胞毒性

為評定化合物在細胞中之細胞毒性，將HepG2細胞以1.5e4細胞/孔一式三份地接種於初代細胞培養液(Minimum Essential Media)、10% FBS及2mML-麩醯胺酸之96孔培養盤中。使塗鋪細胞恢復48小時。隨後用含有化合物II或化合物IV之稀釋液(參見實例2)的相同培養基替換培養基，培育24或48小時，且進行XTT檢定以量測存活率(ATCC)。結果提供於圖2及圖3中且顯示，相比於化合物II，化合物IV在較高抑制劑濃度下展示降低之細胞毒性。

實例5 化合物II之細胞毒性

複合細胞毒性檢定：為評定化合物II(參見實例2)在癌症及正常細胞中之細胞毒性，使細胞在RPMI1640、10% FBS、2mM L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉或在37℃下5% CO₂之潮濕氛圍中的特定培養基中生長。在384孔培養盤中接種細胞且在37℃下5% CO₂之潮濕氛圍中培育。在細胞接種之後24小時添加化合物II。同時，生成0時間未處理之細胞培養盤。

72小時培育期之後，固定細胞且用經螢光標記之抗體及核染料染色，使得可對細胞核、凋亡細胞及有絲分裂細胞進行觀測。使用抗活性半胱天冬酶-3抗體偵測凋亡細胞。使用抗磷酸-組蛋白-3抗體偵測有絲分裂細胞。

使化合物II連續稀釋3.16倍且檢定超過9種濃度。使用GE Healthcare IN Cell Analyzer 1000進行自發螢光顯微術，且用4×物鏡收集影像。

資料分析：使用InCell分析器1000 3.2獲得十二位tiff影像且用Developer Toolbox 1.6軟體加以分析。使用非線性回歸將資料擬合至S形4點、4參數一個位點劑量反應模型來計算EC₅₀及IC₅₀值，其中：y(擬合)=A+[(B-A)/(1+((C/x)^D))]。使用基於軟體(AIM)之自定義資料簡化引擎MathIQ進行曲線擬合、EC₅₀/IC₅₀計算且生成報告。

複合細胞毒性檢定使用基於細胞影像之分析技術，其中固定細胞且用經螢光標記之抗體及核染料染色以觀測細胞核及凋亡細胞及有絲分裂細胞。使用抗活性半胱天冬酶-3抗體偵測凋亡細胞。使用抗磷酸-組蛋白-3抗體偵測有絲分裂細胞。藉由併入之核染料的信號強度來量測細胞增殖。細胞增殖檢定結果稱為相對細胞數。為測定細胞增殖終點，使用下式將細胞增殖資料結果轉變成對照百分比(POC)：POC=相對細胞數(化合物孔)/相對細胞數(媒劑孔)×100。

相對細胞數IC₅₀為最大可能性反應之50%時的測試化合物濃度。相對細胞數EC₅₀為曲線拐點處或有效反應之一半時的測試化合物濃度(擬合曲線解之參數C)。GI₅₀為降低一半所觀測到之增長而所需之濃度。此為抑制位於未處理細胞與接種於孔中之數量的細胞之間的中間位置之增長的濃度(0時間值)。

0時間未處理之培養盤用於測定72小時檢定時段內之加倍量：72小時內之加倍數=LN[細胞數(72小時結束點)*細胞數(0時間)]/LN(2)

各生物標記物之結果相對於標準化為各孔中之相對細胞數的媒劑背景成倍增加。

活性半胱天冬酶-3標記物標記早期至晚期凋亡之細胞。結果展示為凋亡細胞相對於標準化為各孔中之相對細胞數的媒劑背景成倍增加。引起半胱天冬酶-3信號之5倍誘導的測試化合物之濃度指示顯著凋亡誘導。濃度高於相對細胞數IC₉₅之孔自半胱天冬酶-3誘導分析消除。

磷酸-組蛋白-3標記物標記有絲分裂細胞。結果展示為有絲分裂細胞相對於標準化為各孔中之相對細胞數的媒劑背景成倍誘導。當有絲分裂細胞信號相對於背景之誘導倍數為約1時，對於細胞週期「無影響」。磷酸-組蛋白-3信號相對於媒劑背景增加兩倍或兩倍以上指示顯著測試化合物誘導之有絲分裂阻斷。

當細胞毒性水準小於所量測之相對細胞數IC₉₅時，磷酸-組蛋白-3信號減少兩倍或兩倍以上可僅表明G1/S阻斷。當在高於相對細胞數IC₉₅之濃度下觀測到磷酸-組蛋白-3信號減少兩倍或兩倍以上時，有絲分裂細胞數之減少最可能係由於較一般細胞毒性作用而非真G1/S期阻斷所致。濃度高於相對細胞數IC₉₅之孔自磷酸-組蛋白-3分析消除。

此等研究之結果提供於下表4中且顯示抑制細胞中之溶酶體岩藻糖苷酶的化合物II對多種腫瘤細胞株，包含結腸及前列腺細胞株具有毒性。結果亦表明化合物II誘導一些正常(非腫瘤)原始細胞株之生長停滯但並不會將其殺死。

實例6 化合物II之藥代動力學及生物分佈

為評定化合物II(參見實例2)在小鼠血漿中之藥代動力學，以1mg/kg之劑量靜脈內投與化合物II。在投藥之後不同時間點至24小時時量測化合物II濃度，且結果提供於下表5中。

BQL=低於定量限<1.0ng/ml

---=不適用

為評定化合物II(參見實例2)在小鼠肝臟及結腸中之生物分佈，以1mg/kg之劑量靜脈內投與化合物II。在投藥之後1小時及8小時時量測化合物II濃度，且結果提供於下表6及表7中。

此等結果表明岩藻糖苷酶抑制劑自小鼠血漿之快速清除，但反映化合物在組織，尤其結腸中之分佈。

實例7 人類肝細胞癌之原位模型中之活體內功效

為評定活體內之化合物，使用人類肝細胞癌之原位模型。原位腫瘤模型由將人類肝癌細胞株HepG2植入裸鼠中產生且使腫瘤細胞在活體內生長。

使用10隻小鼠/組及兩個劑量療程來進行功效研究。以175mg/kg之劑量每日一次持續3週(QD×21)或以87.5mg/kg之劑量每日兩次持續3週(BID×21)藉由口服管飼(po)投與化合物II(參見實例2)。向對照動物投與媒劑(100μL)。

隨後評定動物之體重及腫瘤體積變化，且結果提供於下表8及表9中。

化合物II在兩種給藥療程之動物模型中均顯示出腫瘤體積有效減小，其中87.5mg/kg每日兩次劑量觀測到減小較多。此等資料支持了岩藻糖苷酶抑制劑對於靶向患有肝癌或其他肝臟病狀之人類中的腫瘤細胞之適用性。

實例8 化合物之特徵

除了上述實例以外，亦可藉由領域內已知的其他檢定，包含(但不限於)下文所述之之檢定來量測本文中化合物之活性。

HepG2細胞中之生物化學功效：最初衍生自HCC腫瘤之HepG2細胞會產生經超岩藻糖基化之糖蛋白。為評定化合物在肝細胞中之生物化學功效，使用標準條件培養HepG2細胞且在多孔盤中僅用緩衝液、一或多種已知岩藻糖苷酶抑制劑或測試化合物進行培育。隔夜培育之後，用冷PBS沖洗細胞且藉由在50mM檸檬酸鈉(pH 4.8)中凍融來使其裂解。藉由離心澄清細胞裂解物且根據製造商協定使用4-甲基傘形基-α-L-岩藻糖檢定(可購自Sigma-Aldrich，參照PMID 2137330)檢定岩藻糖苷酶活性。亦使用標準程序檢定β-葡糖醛酸酶含量以對細胞數目及溶酶體功能進行標準化。

HepG2細胞中之功能性功效研究：在12孔盤中以1×10⁵細胞/孔接種HepG2細胞且使其恢復24小時。隨後將細胞與測試化合物一起培育72小時。隨後藉由MTT增生檢定來評定細胞狀態。

預期抑制HepG2細胞中之岩藻糖苷酶活性將引起岩藻糖基化蛋白質在細胞中積聚，導致細胞死亡或至少減緩或終止細胞增殖。

原位腫瘤異種移植物模型中之功能性功效：在如先前所述(Ong,L.C等人，Mol.Imaging Biol.11：334-42(2009)；Aihara,A.等人，J.Hepatol.52：63-71(2010))之原位肝內異種移植物模型中檢定化合物之功效。簡言之，用合適麻醉劑，例如氯胺酮、安定或其組合來麻醉6-8週之重度聯合免疫缺乏(SCID)小鼠，且經由中線切開腹部進行上中線剖腹術來暴露小鼠之門靜脈。隨後使用規格為30之針頭在一分鐘過程內將10⁶ HepG2細胞之懸浮液注射至門靜脈中。隨後縫合切口且使動物保持溫暖直至完全蘇醒。

為量測化合物治療之功效，使用合適之放射性標記藥劑，諸如2-脫氧-2-(F-18)-氟-D-葡萄糖(¹⁸F-FDG)進行正電子發射斷層攝影術(PET)(Ong,L.C.等人，Mol.Imaging Biol.11：334-42(2009))以經由無創法追蹤HepG2誘發之腫瘤在經治療及對照小鼠中之進展。亦在活體內藉由經治療及對照動物中腫瘤區域之組織學分析來量測化合物治療之功效。

亦在原位腫瘤模型中檢定溶酶體儲積病指標，包含溶酶體、尿液及血液中之葡萄糖胺聚糖(GAG)含量的量測。

預期相比於未接受化合物之個體，投與化合物將減小腫瘤尺寸或減緩腫瘤生長之進展。亦預期如藉由GAG檢定所量測，投與化合物將增加攝取化合物之細胞的溶酶體中的岩藻糖基化蛋白質之含量。

實例9 化合物之特徵

除了上述實例以外，亦可藉由領域內已知的其他動物模型，包含(但不限於)下文所述之動物模型來量測本文中化合物之活體內活性。

皮下腫瘤異種移植物模型中之功能性功效：在皮下異種移植物模型中檢定化合物之功效。可使用6-8週之重度聯合免疫缺乏(SCID)小鼠藉由用合適麻醉劑，例如氯胺酮、安定或其組合麻醉，且隨後用合適之以下細胞之懸浮液注射來獲得適合之皮下異種移植物模型：諸如針對肝細胞癌之Huh-7、SK-Hep1、HA22T/VGH或PLC/PRF 5細胞；針對乳癌之BT-474、MDA-MB-453、MCF-7或MDA-MB-231細胞；針對肺癌之NCI-H460、A549、NCI-1703或NCI-H226細胞；針對胃癌之SNU-1、NCI-N87、TMC-1、TSGH或TSGH-S3細胞；針對急性骨髓白血病之MV4-11、RS4-11或MOLM-13細胞；針對結腸癌之COLO 205或HT-29細胞；針對鼻癌之RPMI2650細胞；針對胰臟癌之PANC1或MIA-PaCa 2細胞；針對頭頸癌之RPMI-2650、Detroit 562、FaDu或HSC-3細胞；及針對甲狀腺癌之TT細胞。隨後縫合切口且使動物保持溫暖直至完全蘇醒。

為量測化合物治療之功效，使用合適之放射性標記藥劑，諸如2-脫氧-2-(F-18)-氟-D-葡萄糖(¹⁸F-FDG)進行正電子發射斷層攝影術(PET)(Ong,L.C.等人，Mol.Imaging Biol.11：334-42(2009))以經由無創法追蹤經誘發之腫瘤在經治療及對照小鼠中之進展。亦在活體內藉由經治療及對照動物中腫瘤區域之組織學分析來量測化合物治療之功效。

亦在皮下腫瘤模型中檢定溶酶體儲積病指標，包含溶酶體、尿液及血液中之葡萄糖胺聚糖(GAG)含量的量測。

原位腫瘤異種移植物模型中之功能性功效：在原位異種移植物模型中檢定化合物之功效。可使用6-8週之重度聯合免疫缺乏(SCID)小鼠藉由用合適麻醉劑，例如氯胺酮、安定或其組合麻醉，，且隨後用合適之以下細胞之懸浮液噴射來獲得適合之原位異種移植物模型：諸如針對肝細胞癌之Huh-7、PLC/PRF/5或BNL 1ME A.7R.1-luc細胞；源自患者(例如，針對源自患者之異種移植物(PDX)模型之肝細胞癌患者)之細胞；針對頭頸癌之Detroit 562或HSC-3細胞；及針對黑素瘤之B16-F10細胞。隨後縫合切口且使動物保持溫暖直至完全蘇醒。

此外，可藉由在有免疫能力的同基因型C57BL/6小鼠之後腳掌中接種B16-F10-luc2鼠黑素瘤細胞來獲得黑素瘤之自發性淋巴型癌轉移模型。

實例10 活體內化合物之投與

HCC為經診斷出的第5大最常見惡性腫瘤，且全世界每年造成接近500,000人死亡。手術移除、移植及物理破壞腫瘤組織為治療之第一選擇，但僅5%至10%的表現患有腫瘤之患者適用於此等方法(Ribero,D.等人，Expert Rev.Anticancer Ther.6：567-579(2006)；Lau,W.Y.等人，J.Am.Coll.Surg.202：155-168(2006)；Lin,X.D.等人，Hepatobiliary Pancreat.Dis.Int.5：16-21(2006))。此外，全身性化學療法得到15%至20%之低反應率，此皆係因為化學治療劑之毒性及腫瘤細胞抗性(Chan,J.Y.等人，Life Sci.67：2117-2124(2000)；Plosker,G.L.等人，Drugs 45：788-856(1993))。

舉例而言，小紅莓為高效對抗多種腫瘤之癌症化學治療劑，且尤其對經歷快速生長之細胞，包含腫瘤細胞具有毒性。然而，顯著的肝臟及心臟毒性及血液細胞生成之遏制會限制小紅莓在治療肝細胞癌中之用途(Danesi,R.等人，Clin.Pharmacokinet.41：431-444(2002))。此外，肝細胞癌細胞轉化為抗藥型之比率顯示較高(Hu,Y.等人，Int.J.Oncol.25：1357-1364(2004))。

一種療法之替代方法會利用放射。舉例而言，當前正處於測試中之新型肝癌治療涉及將經放射性物質(⁹⁰Y)標記之微觀玻璃珠注射至肝臟主動脈中，所述放射性物質自主動脈傳送至灌注腫瘤組織之小血管中。放射隨後破壞腫瘤組織。然而，血液自肝動脈至肺部之顯著分流會妨礙玻璃珠在許多患者中之使用。玻璃珠顯著回流進入進給胃腸道之動脈中亦可引起嚴重副作用。因此，腫瘤組織之療法的有效遞送需要一種較具指向性之方法，所述方法不會依賴於將在血管中受到截留之大型物質。

為評定活體內之化合物，使用人類肝細胞癌之原位模型。

為在動物中生成原位腫瘤，將人類肝癌細胞株植入裸鼠、大鼠或其他合適動物中且使腫瘤細胞在活體內生長。適用於原位模型之HCC細胞株包含(但不限於)上述彼等細胞株，諸如Hep3B、HepG2、SK-Hep1、HA22T/VGH、PLC/PRF/5及Huh-7。HCC之原位腫瘤模型為本領域中已知的且描述於例如Okubo等人(J Gastroenterol Hepatol.2007 22：423-8)；Armengol等人(Clin Cancer Res.2004 10：2150-7)；及Yao等人(Clin Cancer Res.2003 9：2719-26)中。

為首先確定活體內投與化合物及對照之劑量範圍，使用接受化合物(例如，至多200毫克/公斤/天)之5隻小鼠/組進行小劑量範圍研究。每日靜脈內或腹膜內投與測試藥劑持續兩週(QD×14)且在研究終點測試受試動物之體重、任何臨床觀測及臨床病理學及組織病理組織學之變化。

為進行功效研究，使用8至10隻小鼠/組，且向接受人類HCC細胞之動物及對照動物投與3個測試劑量範圍之上述化合物。靜脈內或腹膜內投與測試藥劑且以合適頻率，例如每日一次持續4週(QD×28)、每日一次持續3週(QD×21)或每日一次持續2週(QD×14)投與。隨後使用本領域中已知之技術來評定受試動物之體重、臨床觀測及活體內功效量測(諸如腫瘤體積)、肝臟病理組織學及一般臨床病理學之任何變化。

化合物在活體內降低肝細胞癌細胞之生長的能力表明化合物有效遞送至肝臟細胞中而產生可量測之生物學作用。動物模型中之有效腫瘤死亡的論證表明化合物有效靶向患有肝癌或其他肝臟病狀之人類中的腫瘤細胞。

針對測試生物分佈及療法功效的另一肝細胞癌(HCC)相關動物模型為經土拔鼠肝炎病毒(WHV)感染之東部土拔鼠(Tennant,B. C.等人，Gastroenterology 127：S283-293(2004))。幾乎所有在新生時就已感染病毒之土撥鼠在24個月之中值間隔內便患上HCC。中值預期壽命為30個月，然而經WHV感染之土撥鼠並未患有肝硬化(存在於大部分HCC患者中之病狀)。土拔鼠肝炎病毒與人類B型肝炎病毒在結構、遺傳學、傳送方法、感染過程及至肝細胞癌之進展方面有所相似。在強調此模型之重要性方面存在明顯之相似性。與人類相似，暴露於肝炎病毒的所有土撥鼠之一半以上在出生不久之後便患上慢性感染，且幾乎所有經慢性感染之土撥鼠在暴露之後大約20至28個月便患上肝細胞癌。其餘經接種之新生土撥鼠通常患有急性肝炎，但將產生對於病毒之抗體且有所恢復。17%與25%之間的此等「經恢復」之動物在暴露之後29至56個月之間患上HCC。自肝炎感染明顯恢復之後患上HCC亦發現於人類中。

為測定化合物對肝腫瘤細胞之有效性，在土拔鼠HCC模型中研究對照及測試化合物之攝取及毒性。在一個實施例中，使用大約1.5至2歲的六隻經慢性感染之土撥鼠及四隻未感染之土撥鼠。

適用化合物將通常展現以下特徵：1)不會對已受損之肝臟功能造成不利影響，2)肝臟及惡性肝臟組織進行可量測攝取，3)且當攝取時，對腫瘤細胞具有毒性且引起腫瘤消退。

亦在腫瘤模型中檢定溶酶體儲積病指標，包含溶酶體、尿液及血液中之寡糖含量的量測。

如上述例示性實例中所闡述的本發明中之許多修改及變體預期為本領域中熟習此項技術者所想到。因此，本發明應僅受如隨附申請專利範圍中所呈現之所述限制的限定。

Claims

一種式I化合物，
其中：X¹、X²及X³各為OH；R為C_1-3烷基；R¹為H；R²選自由-NR^bC(O)R^a及-C(O)NR^bR^a組成之群； R^a為
；且 R^b為H。
如請求項1之化合物，其中R為甲基。
如請求項1之化合物，其中R²為-NR^bC(O)R^a。
如請求項1之化合物，其中R²為-C(O)NR^bR^a。
如請求項1之化合物，其中所述式I化合物具有以下結構：
如請求項1之化合物，其中所述式I化合物具有以下結構：
如請求項1之化合物，其中所述化合物選自由以下組成之群：
如請求項1之化合物，其中所述化合物選自由以下組成之群：
如請求項1之化合物，其中所述化合物選自由以下組成之群：
一種如請求項1至9中任一項之化合物之用途，其係用於製備用以在有需要之個體中治療腫瘤或癌症之藥物，其中所述腫瘤或癌症為肝癌。
如請求項10之用途，其中所述化合物會減少個體中之腫瘤轉移。
如請求項10之用途，其中所述腫瘤為肝細胞癌、肝炎病毒感染、肝硬化、中毒性肝損傷或遺傳性血色素沉著症之結果。
如請求項12之用途，其中所述腫瘤為肝細胞癌之結果。
如請求項10之用途，其中所述治療使得所述個體中腫瘤尺寸減小。
如請求項10之用途，其中所述治療使得所述個體之血液中的α-胎蛋白含量相比於治療之前的含量有所降低。
如請求項10之用途，其中所述化合物經由靜脈內投與。
如請求項16之用途，其中所述化合物經由肝動脈投與。
如請求項10之用途，其中所述藥物進一步包含第二藥劑，或與第二藥劑組合使用。
如請求項18之用途，其中所述第二藥劑選自由以下組成之群：化學治療劑、細胞毒性劑、放射性同位素、抗病毒劑、抗真菌劑、消炎劑及抗體。
如請求項19之用途，其中所述化學治療劑選自由小紅莓及5-氟尿嘧啶組成之群。
如請求項19之用途，其中所述第二藥劑為細胞毒性劑。
如請求項21之用途，其中所述細胞毒性劑選自由以下組成之群：鹽酸氮芥、環磷醯胺、異環磷醯胺、苯丁酸氮芥、美法侖、白消安、噻替派、卡莫司汀、洛莫司汀、達卡巴嗪及鏈脲菌素。
如請求項19之用途，其中所述第二藥劑為放射性同位素。
如請求項23之用途，其中所述放射性同位素選自由以下組成之群：¹³¹I、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、¹²⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²⁵⁵Fm、¹⁴⁹Tb、²²³Rd、²¹³Pb、²¹²Pb、²¹¹At、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、²²⁵Ac、¹⁸⁶Re、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga及^99mTc。