TWI764922B

TWI764922B - 非酒精性脂肪性肝病之非人類模式動物

Info

Publication number: TWI764922B
Application number: TW106129666A
Authority: TW
Inventors: 八重垣健; 石川博
Original assignee: 學校法人日本齒科大學
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2022-05-21
Also published as: TW201912024A

Abstract

本發明課題在於提供一種反映人類的臨床病理狀態之非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之非人類模式動物（NAFLD模式動物）。　　解決手段為藉由對非人類動物餵食以實質上不含蛋白質為特徵的膽鹼缺乏、L-胺基酸限定（choline-deficient, L-amino acid-defined, CDAA）飼料而予以飼養，來製作非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之非人類模式動物。

Description

非酒精性脂肪性肝病之非人類模式動物

[0001] 本發明係有關於非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之非人類模式動物及其製作方法。

[0002] 非酒精性脂肪性肝病（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease：NAFLD）是一種以脂肪肝為基本病變，儘管飲酒史不長，但仍會呈現與酒精性肝損傷類似之肝實質上的發炎或壞死、纖維化等組織變化之病狀。NAFLD基本上為無症狀，會隨著病狀態的惡化，而從脂肪肝經過脂肪性肝炎，甚而肝硬化轉移成肝癌。一般將NAFLD中的脂肪性肝炎稱為非酒精性脂肪性肝炎（Non-Alcoholic SteatoHepatitis：NASH）。尤其是近年來以肥胖或糖尿病等為背景的代謝症候群已成社會問題，NASH也被視為是代謝症候群之一。NAFLD及NASH可發現出肥胖、糖尿病、高血脂症及高血壓等的生活型態疾病作為其併發症，而就其臨床病狀的主要特徵，可舉出血中之丙胺酸轉胺酶（ALT）或玻尿酸濃度的上昇；相對於此，為血中之總膽固醇或白蛋白濃度的下降等。然而，NAFLD及NASH之發病機制仍有諸多不明之處，現況在於尚未確立其有效的治療法及治療藥。其原因的一部分在於，由於NAFLD及NASH係以人類的生活型態疾病為發病之基礎，而仍未確立供研究NAFLD及NASH之適當的非人類模式動物。　　[0003] 有可能對肝硬化、肝癌等致死性疾病治療有進展的NAFLD及NASH之病理狀態的解明，須開發出有效的治療法及治療藥，因此，便需要適當的NAFLD及NASH之非人類模式動物。　　迄今，已有人就NASH之模式動物加以報導（例如專利文獻1及2），但幾乎未有包括NASH之對於NAFLD之非人類模式動物，尤為大型動物的報導。在此種情況下，基於疾病治療進展之觀點，便進一步要求其基礎之NAFLD之非人類模式動物。尤其是，以確立人類的NAFLD之治療法及治療藥為目的，可謂要求生理學、解剖學及遺傳學上較接近人類的非人類動物之NAFLD模式。 [先前技術文獻] [專利文獻] 　　[0004] 　　[專利文獻1] 國際公開第2011/013247號　　[專利文獻2] 國際公開第2008/001614號

[0005] 因此，本發明係以提供一種NAFLD之非人類模式動物及其製作方法，以及用於其製作的飼料為目的。　　[0006] 本案發明人為了解決上述課題而致力進行研究。本案發明人等利用微迷你豬，透過餵食特定組成的膽鹼缺乏、L-胺基酸限定（CDAA）飼料，而以生理學、解剖學及遺傳學上較接近人類的微迷你豬，成功製作出NAFLD模式動物（模式豬），終至完成本發明。對於該模式豬，可看出血中之總膽固醇或白蛋白濃度的下降、丙胺酸轉胺酶（ALT）或天冬胺酸轉胺酶（AST）濃度的上昇、及肝促凝血活酶試驗（HPT）值的下降等NAFLD之特徵性的血中參數變化。　　[0007] 亦即，就本發明，具體可列示以下者：　　[1] 一種方法，其係包含對非人類動物餵食膽鹼缺乏、L-胺基酸限定（CDAA）飼料而予以飼養之步驟的製作非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之非人類模式動物的方法，其特徵為：　　前述CDAA飼料實質上不含蛋白質。　　[2] 如[1]之方法，其中前述非人類動物為選自由靈長類、齧齒類、食肉類及偶蹄類所成群組的哺乳類動物。　　[3] 如[1]或[2]之方法，其中前述非人類動物為豬。　　[4] 一種非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之非人類模式動物，其係藉由如[1]～[3]中任一項之方法所製作。　　[5] 一種非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之非人類動物模式，其係顯示以下觀察結果（1）～（6）的至少1項：　　（1）血中總膽固醇濃度的下降、　　（2）血中白蛋白濃度的下降、　　（3）肝促凝血活酶試驗（HPT）值的下降、　　（4）血中IV型膠原蛋白濃度的上昇、　　（5）血中丙胺酸轉胺酶（ALT）濃度的上昇、　　（6）血中玻尿酸濃度的上昇。　　[6] 一種實質上不含蛋白質之膽鹼缺乏、L-胺基酸限定（CDAA）飼料，其係為了使非人類動物引起非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）而使用。　　[0008] 根據本發明，可提供一種生理學、解剖學及遺傳學上較接近人類的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之非人類模式動物及其製作方法。又，根據本發明，可提供一種為了使非人類動物引起非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）而使用的飼料。

[0010] 本發明係提供一種發生非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之非人類模式動物（以下亦稱「本發明之模式動物」）。　　[0011] 本發明之模式動物可例如藉由對非人類動物餵食後述之特定組成的膽鹼缺乏、L-胺基酸限定（CDAA）飼料而予以飼養來製作。　　[0012] 為了製作本發明之模式動物而使用的非人類動物（以下亦稱「本發明中所使用之非人類動物」），只要是一般作為實驗動物使用的非人類動物則不特別限制，較佳為非人類脊椎動物，更佳為非人類哺乳動物，再更佳為偶蹄類動物。作為本發明中所使用之非人類動物，具體而言可例示豬、迷你豬、微迷你豬等。本發明中所使用之非人類動物較佳為迷你豬或微迷你豬，特佳為微迷你豬。作為市售之微迷你豬，可舉出例如Fuji Micra股份有限公司製之微迷你豬（系統：Fuji Micromini Pig）。　　[0013] 本發明中所使用之非人類動物亦可與人類同樣地具有肥胖、糖尿病、高血脂症或高血壓等的生活型態疾病。當本發明中所使用之非人類動物具有生活型態疾病時，該非人類動物所具有之生活型態疾病的種類可為1種，亦可為2種以上。此等生活型態疾病可因遺傳而先天性地具有，亦可為後天罹患者。　　[0014] 本發明中所使用之膽鹼缺乏、L-胺基酸限定（CDAA）飼料（以下亦稱「本發明中所使用之飼料」）係以實質上不含蛋白質為特徵。所稱「實質上不含蛋白質」，具體而言，係指蛋白質相對於飼料全體的含量較佳為未達1×10^-7 重量%，更佳為未達1×10^-8 重量%，特佳為0重量%。　　[0015] 本發明中所使用之飼料的組成，只要滿足上述之蛋白質含量的範圍，可使本發明中所使用之非人類動物誘發NAFLD之症狀則不特別限制，例如，可配合本發明中所使用之非人類動物的種類適宜設定。例如，只要以習知膽鹼缺乏、L-胺基酸限定（CDAA）飼料之組成為基本，來設定本發明中所使用之飼料的組成即可。設定本發明之飼料的組成來製作該飼料，只要是本業者，可參照本說明書之記載及周知之資訊或技術，例如美國RESEARCH DIETS公司製A15022101及A02082002B等而容易地實施之。本發明中所使用之飼料可基於周知之資訊或技術來製作，亦可為上述市售品經應用・改良者。　　[0016] 於本發明之方法中，對本發明中所使用之非人類動物開始餵食本發明中所使用之CDAA飼料的時間點，只要可誘發NAFLD則不特別限制，例如可依據非人類動物的種類或併發症的有無來適宜設定。例如，當本發明中所使用之非人類動物具有糖尿病等的生活型態疾病時，較佳為發生生活型態疾病後才開始攝取飼料。又，該飼料的攝取量，只要可誘發NAFLD則不特別限制，例如可依據本發明中所使用之非人類動物的種類、大小或體重等適宜設定。例如採用微迷你豬時，每1天之該飼料的攝取量為300g左右。又，使用該飼料作為餌來飼養的時間，只要可誘發NAFLD則不特別限制，例如可依據本發明中所使用之非人類動物的種類適宜設定。例如採用微迷你豬時，係以通常為6週以上，較佳為8週以上，更佳為12週以上地使用該飼料作為餌來飼養為佳。如此，透過使用本發明中所使用之飼料來飼養，可誘發非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。再者，例如採用微迷你豬時，要是以該飼料持續飼養的話，約14週以後便會累積腹水而終至死亡。　　[0017] 此外，於本發明之方法中，所稱「餵食飼料而予以飼養」，不限於餵食本發明中所使用之CDAA飼料本身的情形，亦包含個別餵食該CDAA飼料之各成分的情形。又，只要可誘發NAFLD，則亦可併用其他的飼料。　　[0018] 可藉由本發明之方法製作的NAFLD模式動物可充分反映NAFLD，尤為人類之NAFLD的特徵性臨床病理狀態，而且，該模式動物可看出與人類之NAFLD相同的緩慢病狀惡化。從而，可藉由本發明之方法製作的NAFLD模式動物極有用於外推至人類。又，僅使其攝取飼料，即可誘發NAFLD症狀，製作甚為簡便。　　[0019] 本發明之模式動物係顯示選自以下（1）～（6）的至少1項之觀察結果：　　（1）血中總膽固醇濃度的下降、　　（2）血中白蛋白濃度的下降、　　（3）肝促凝血活酶試驗（HPT）值的下降、　　（4）血中IV型膠原蛋白濃度的上昇、　　（5）血中丙胺酸轉胺酶（ALT）濃度的上昇、　　（6）血中玻尿酸濃度的上昇。　　此外，於本說明書中，有將上述觀察結果（1）～（6）總合稱為「NAFLD之觀察結果」。　　[0020] 上述觀察結果（1）～（6）中，所稱「下降」或「上昇」，各觀察結果所屬之參數，與使用不會引起NAFLD之飼料所飼養的正常個體之「標準值」相比發生「下降」或「上昇」之意。詳言之，可基於針對各觀察結果與「標準值」相比時之統計學上的顯著差異來判斷。此外，各觀察結果中，就統計解析手法而言，可適宜選擇使用周知之統計解析手法；作為統計解析手法，例如，若為多群間之檢定時可舉出ANOVA；就本發明而言，則較佳使用Bonferroni之多重比較。上述檢定法中P值未達0.05實係判斷為可看出「下降」或「上昇」。另一方面，當P值為0.05以上時則可判斷為無法看出「下降」或「上昇」。又，作為不會引起NAFLD之飼料，亦即一般飼料，可舉出例如固態飼料MP-A（Oriental Yeast工業股份有限公司製）等。此外，使用一般飼料來飼養時，無法看出NAFLD之觀察結果或病理狀態係屬實驗動物販售者及研究者等的本業者間所共同認知者，因此，在製作本發明之模式動物上，探討上述各觀察結果所屬之參數隨時間經過的變化量之顯著性可謂極佳者。 [實施例] 　　[0021] 以下，根據實施例詳細地說明本發明，惟本發明不受此等實施例所限制，於本發明之範圍內可實施種種變更。　　[0022] ＜實施例1：NAFLD之非人類模式動物的製作＞　　利用微迷你豬，按以下程序製作NAFLD之非人類模式動物。　　[0023] 自Fuji Micra股份有限公司購入約7個月大（體重約10kg）的公微迷你豬（系統：Fuji Micromini Pig），針對6個個體，在自然換氣、溫度：20±5℃、相對濕度：55±25%、照明週期：7：00～19：00為亮、19：00～7：00為暗的飼養環境下，以一般飼料之固態飼料MP-A（Oriental Yeast股份有限公司製，所含膽鹼：0.29%，所含粗蛋白質：15.3%）為飼料，每日餵食300g來進行馴養。此外，飼料餵食係於每天8：00左右進行。　　[0024] 將使用之一般飼料MP-A的主要成分之組成示於表1。　　[0025]

[0026] 一週左右的馴養期間結束後，以實質上不含蛋白質的CDAA飼料（RESERCH DIETS公司製A15022101）為飼料，每日餵食300g，在同一飼養環境下，為期16週藉由自由攝取飼料來進行飼養。此外，飼料餵食係於每天8：00左右進行。　　[0027] 將使用之CDAA飼料的主要成分之組成示於表2。　　[0028]

[0029] 就其詳細結果係於後述，透過餵食實質上不含蛋白質的CDAA飼料而予以飼養，可製作可外推至NAFLD的NAFLD微迷你豬。　　[0030] ＜實施例2：NAFLD之非人類模式動物的臨床病理狀態的探討＞　　針對如上述飼養之各微迷你豬群，進行NAFLD的臨床病理狀態的探討。作為NAFLD的臨床病理狀態，係以診斷人類之NAFLD的指標為參考，而設定以下項目（1）～（6）（NAFLD之觀察結果）。　　（1）血中總膽固醇濃度的下降、　　（2）血中白蛋白濃度的下降、　　（3）肝促凝血活酶試驗（HPT）值的下降、　　（4）血中IV型膠原蛋白濃度的上昇、　　（5）血中丙胺酸轉胺酶（ALT）濃度的上昇、　　（6）血中玻尿酸濃度的上昇。　　[0031] （a）測定方法　　實施例1中所記載之使用一般飼料MP-A之一週左右的馴養期間，無法看出NAFLD之病理狀態。從而，針對馴養期間結束後的微迷你豬6個個體，進行抽血而得到血清，並使用所得血清試料，針對以下（1）～（6）之各項目進行測定，以其測定值作為「標準值」；　　（1）血中總膽固醇濃度、　　（2）血中白蛋白濃度、　　（3）肝促凝血活酶試驗（HPT）值、　　（4）血中IV型膠原蛋白濃度、　　（5）血中丙胺酸轉胺酶（ALT）濃度、　　（6）血中玻尿酸濃度。　　[0032] 上述（1）～（6）之各項目的測定係使用以下手法及套組等來進行：　　（1）就血中總膽固醇濃度，係採用膽固醇脫氫酶（UV）法來測定。　　（2）就血中白蛋白濃度，係採用濁度測定法（BCP改良法）來測定。　　（3）就肝促凝血活酶試驗（HPT）值，係採用凝固時間測定來測定。　　（4）就血中IV型膠原蛋白濃度，係採用Type IV collagen ELISA kit, ACB（Funakoshi股份有限公司製）來測定。　　（5）就血中丙胺酸轉胺酶（ALT）濃度，係採用JSCC標準化對應法來測定。　　（6）就血中玻尿酸濃度，係採用乳膠凝聚免疫比濁法來測定。　　[0033] 接著，對馴養期間結束後的微迷你豬6個個體，以實質上不含蛋白質的CDAA飼料（RESEARCH DIETS公司製A15022101）為飼料進一步進行飼養，開始餵食實質上不含蛋白質的CDAA飼料後為期16週，每2週進行抽血而得到血清。使用所得血清試料，針對上述（1）～（6）各項目進行測定。　　[0034] （b）測定結果　　將各個體之標準值、與以實質上不含蛋白質的CDAA飼料開始飼養後到16週為止之上述（1）～（6）項目隨時間經過的變化示於表3。　　[0035]

[0036] （c）測定結果的比較　　針對上述（1）～（6）各項目，將比較以一般飼料MP-A飼養（馴養）一週左右之時間點的測定值（標準值）、與餵食實質上不含蛋白質的CDAA飼料後至16週為止之每2週的測定值的結果示於表4。　　[0037]

[0038] 表4中，以朝上箭號或朝下箭號表示者係指相對於6個個體之標準值的平均值，測定值的平均值上昇或下降之意。一根箭號係指相對於標準值的平均值，測定值的平均值上昇或下降10%以上；二根箭號係指上昇或下降30%以上；三根箭號則指上昇或下降50%以上。又，連字符係指未達10%之上昇或下降。　　[0039] 由表3及表4所示結果，對於所有使用實質上不含蛋白質的CDAA飼料所飼養之6個個體之微迷你豬，皆可看出血中之白蛋白濃度、總膽固醇濃度及肝促凝血活酶試驗（HPT）值顯著下降。另一方面，可看出血中之IV型膠原蛋白濃度、丙胺酸轉胺酶（ALT）濃度及玻尿酸濃度顯著上昇。　　[0040] （d）肝臟組織之活檢　　針對6個個體之微迷你豬中的1個個體（個體編號：3），取出肝臟組織而得到活檢照片。將活檢照片示於第1圖。　　[0041] 第1圖之活檢照片中，灰色所示部分係表示肝細胞，白色的微小粒狀部分則表示脂肪（脂肪小滴）。在根據本發明之方法所得之微迷你豬的肝臟組織中，發生了在正常的肝臟組織中無法看出之大量的脂肪（脂肪小滴）向肝細胞之沉積，由活檢照片亦可看出NAFLD之觀察結果。　　[0042] 由以上可知，使用實質上不含蛋白質的CDAA飼料所飼養之微迷你豬，在開始攝取該飼料後的第6～12週顯示出NAFLD的臨床病理狀態。尤其是在開始攝取飼料後的第10～12週，反映出大部分人類之NAFLD的特徵性病理狀態，確認出透過餵食實質上不含蛋白質的CDAA飼料而予以飼養，可製作可外推至人類之NAFLD的NAFLD模式動物。使用此種實質上不含蛋白質的CDAA飼料所飼養之小鼠，可看出與人類之NAFLD相同的緩慢病狀惡化，因此，茲認為本發明之NAFLD模式動物係適於NAFLD之病理狀態的解析。再者，實質上不含蛋白質的CDAA飼料，茲認為係為了使非人類動物引起非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）而使用。 [產業上可利用性] 　　[0043] 根據本發明，可製作顯示與人類相同臨床病理狀態的非酒精性脂肪性心疾患（NAFLD）之非人類模式動物。透過利用該非人類模式動物，可開發出人類之NAFLD的治療方法及治療藥。

[0009] 第1圖為藉由本發明之方法所得的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之模式動物（微迷你豬）的肝臟組織的活檢照片。

Claims

一種模式豬的製作方法，其係包含對豬餵食膽鹼缺乏、L-胺基酸限定(CDAA)飼料而予以飼養之步驟的製作非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)之模式豬的方法，其特徵為：蛋白質相對於前述CDAA飼料全體的含量為未達1×10^-7重量%。
一種實質上不含蛋白質之膽鹼缺乏、L-胺基酸限定(CDAA)飼料的用途，其係為了使豬引起非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)而使用，蛋白質相對於前述CDAA飼料全體的含量為未達1×10^-7重量%。