CN114916497B - 一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用，涉及医疗及毒理学评价技术领域。其包括：将非人目标动物采用含氟苯尼考溶液的培养水进行培养，培养期间连续更换非人目标动物的培养水。本发明提供的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，具有造模时间短、成功率高、且简单易行的技术优势，通过造模为非酒精性脂肪肝的治疗药物筛选以及致病机理等基础性研究提供良好的模型基础。

Description

一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及医疗及毒理学评价技术领域，具体而言，涉及一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法及应用。

背景技术

目前对于非酒精性脂肪肝的诱导多采用高脂饮食进行诱导，例如专利CN102106476B、专利CN103416608B，然而现有技术对于诱导肝脏脂肪变性机制尚不能清晰定位，而对于线粒体损伤所引起的非酒精性脂肪肝也未能得到很好的生物标志物诊断。基于此，提供一种非高脂饮食造模的非酒精性脂肪肝动物模型尤为关键。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种造模方法，该方法有利于缩短造模的时间，提高造模的成功率，可以较为简单方便的构建获得线粒体损伤机制的非酒精性脂肪肝疾病模型。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，该构建方法包括：将非人目标动物采用含氟苯尼考溶液的培养水进行培养，培养期间连续更换非人目标动物的培养水。

本发明所定义的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)指的是：除了酒精和其他明确的损肝因素所导致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。

发明人发现，通过含氟苯尼考的培养水对非人目标动物进行培养，可以获得线粒体损伤机制的非酒精性脂肪性肝动物模型，该动物模型表现为：损伤线粒体的数目显著上升，肝脏内的游离脂肪酸不能及时被线粒体利用进行β-氧化，而是被用于合成膜结构类磷脂、有毒性脂质神经酰胺和鞘脂及用于储存功能的甘油三酯，从而使肝脏细胞发生脂肪变性现象。肝脏组织中的甘油磷脂、神经酰胺、鞘脂等水平均呈显著上升趋势。

本发明提供的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，具有造模时间短、成功率高、且简单易行的技术优势，通过造模为非酒精性脂肪肝的治疗药物筛选以及致病机理等基础性研究提供良好的模型基础。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述非人目标动物选自斑马鱼。

斑马鱼(Zebrafish,Danio rerio)作为一种新兴模式生物，已被广泛应用在医学科学研究中。斑马鱼可应用于建立多种疾病模型，包括神经系统疾病模型，心血管系统疾病模型，免疫疾病和感染模型，肿瘤疾病模型，血液系统疾病模型等多个疾病研究领域。斑马鱼具有独特的生物学特征，使其成为一种非常重要的发育生物学模式动物：(1)斑马鱼成鱼体积小，性成熟的周期短，相比小鼠可大大缩短实验周期；(2)斑马鱼胚胎在早期发育时期透明，可通过组织特异性表达基因荧光追踪其各个器官发育过程；(3)繁殖能力很强，可获得大量胚胎，胚胎在体外发育迅速，小分子化合物渗透性强，可用于大规模疾病表型和药物筛选使用；(4)目前已完成斑马鱼的全基因组的测序，基因组与人类基因组高度保守，与人类参考基因组的比较表明，大约70％的人类基因在斑马鱼中都具有直系同源基因；(5)与其他实验生物小鼠和细胞进行药物筛选而耗时长、成本高缺点相比，利用斑马鱼进行药物筛选的给药方法更方便，具有耗时短、高通量、低成本的优点，可进行大规模疾病模型的建立和药物实验，更能比较准确的评估药物效果以及药物毒性。1-2周龄的斑马鱼脑含有数万个神经元，已具有成年动物的多种复杂行为模式和脑功能。斑马鱼生物习性好动，可接收多种外界感觉信息，具有捕食猎物、逃避天敌以及群聚生活等丰富的行为，可进行群聚和社交行为研究；同时，斑马鱼可产生自闭症的大部分临床指症，除了不能进行语言沟通外，斑马鱼具有类似人类的行为学特征，患有自闭症样疾病的斑马鱼可能出现社会交流行为削弱、存在防御行为、感知行为缺陷、焦虑、兴奋异常等异常表征。因此，斑马鱼已广泛应用于自闭症、精神分裂症、帕金森病、舞蹈病等神经精神系统疾病的机制研究中。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述培养水中氟苯尼考溶液的浓度为1-1.2mg/L。

在可选的实施方式中，上述培养水中氟苯尼考溶液的浓度为1mg/L，1.1mg/L或1.2mg/L。

发明人发现，在上述浓度下，可以维持较高的造模成功率，且花费的造模时间较短，总共仅需要35-38d。

在一种可选的实施方式中，可以预先配制氟苯尼考的丙酮溶液，配制为一定浓度，然后在培养水中加入氟苯尼考的丙酮溶液，保持培养水中氟苯尼考溶液的浓度为1-1.2mg/L即可。

例如：在第8d时，在3L的培养水中加入150μL浓度为20mg/mL的氟苯尼考的丙酮溶液，配制成为含氟苯尼考浓度为1mg/L的培养水。

在本发明应用较佳的实施方式中，取3-4月龄的斑马鱼培养至第7-8d后，置于含氟苯尼考溶液的培养水中进行培养。

在本发明应用较佳的实施方式中，每日采用半数换水的方式对培养容器内的培养水进行更换，即每日弃去培养容器中一半体积的培养水，并新添加含浓度为1-1.2mg/L的氟苯尼考溶液的培养水，新增的培养水的体积为培养容器体积的一半。

通过半数换水的方式，对培养容器内的培养水进行更新，从而保持较高的造模成功率。在一种可选的实施方式中，培养容器包括不限于：鱼缸、鱼盆、鱼箱、鱼室等。培养容器的体积大小可以根据培养鱼的数目需要进行自适应调整。

需要说明的是，上述培养水均为曝气培养水。

在本发明应用较佳的实施方式中，培养期间正常饲喂，培养至35-38d。例如培养至第35d，第36d，第37d，第38d等。

上述培养时间是按照待造模斑马鱼从第0d开始计算，至第1-8d置于含氟苯尼考溶液的培养水中进行培养，培养至35-38d。

在本发明应用较佳的实施方式中，培养水的培养条件为：水温：28±0.5℃，pH7.0-8.0，电导率500-800μS/cm，溶解氧5-8mg/L。

发明人发现，在上述培养条件下可以维持斑马鱼较高的存活率。

为了判断是否造模成功，可以通过采样肝脏细胞或组织进行线粒体损伤数目统计、脂滴数目统计、甘油磷脂水平统计、神经酰胺水平统计、鞘脂水平统计、HE染色分析或甘油脂代谢、鞘脂代谢及甘油磷脂代谢相关通路的调控基因表达分析。若出现如下任何一项的现象，则判断造模成功：

线粒体损伤数目明显提升，脂滴数目显著增加、肝脏组织中的甘油磷脂、神经酰胺、鞘脂等水平均呈显著上升趋势，相应的甘油脂代谢、鞘脂代谢及甘油磷脂代谢相关通路的调控基因呈显著上调趋势。

本发明还提供了一种由非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法得到的非酒精性脂肪肝动物模型在早期分子筛查药物、筛选治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述非酒精性脂肪肝是指：线粒体损伤所引起的非酒精性脂肪肝。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述线粒体损伤表现为如下至少一种症状：组织病理学切片出现脂质空泡化现象、斑马鱼肝脏中脂滴数目显著上升(或斑马鱼肝脏中脂滴数目大于5个)、线粒体损伤数目显著增加(或大于总观察线粒体数目的20％)、磷脂、神经酰胺和鞘脂水平显著上升。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，具有造模时间短，成功率高，且简单易行，通过造模为非酒精性脂肪肝的治疗药物筛选以及致病机理等基础性研究提供良好的模型基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为模型评价技术路线图；

图2为H&E染色结果图；

图3a为斑马鱼肝脏细胞的脂滴电镜图；

图3b为斑马鱼肝脏细胞的脂滴数目统计图；

图4a为损伤线粒体的电镜图；

图4b为损伤线粒体的数目统计图；

图5为斑马鱼肝脏组织中的甘油磷脂水平统计结果图；

图6为斑马鱼肝脏组织中的神经酰胺水平统计结果图；

图7为斑马鱼肝脏组织中的鞘脂水平统计结果图；

图8为甘油脂代谢、鞘脂代谢及甘油磷脂代谢相关通路的调控基因表达水平分析图；

图9为0.1mg/L氟苯尼考诱导下的斑马鱼肝病理切片；

图10为脂滴积累结果图(说明：FF-L:0.1mg/L；FF-H:1mg/L)；

图11为线粒体损伤数目统计结果图(说明：FF-L:0.1mg/L；FF-H:1mg/L)；

图12为对比例1中斑马鱼肝脏组织中的甘油磷脂水平统计结果图；

图13为对比例1中斑马鱼肝脏组织中的鞘脂水平统计结果图；

图14为对比例1中斑马鱼肝脏组织中的神经酰胺水平统计结果图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，其包括如下步骤：

1.随机选取3月龄成年斑马鱼30条为一组进行造模，在具一定条件(水温：28±0.5℃，pH 7.0-8.0,电导率500-800μS/cm，溶解氧5-8mg/L)的3L培养水中进行恒温适应性培养至7d，在第8d时加入150μL浓度为20mg/mL的氟苯尼考丙酮溶液，配制成为含氟苯尼考浓度为1mg/L的培养水，后每日采取半数换水的方式对鱼缸内的培养水进行更新，即每日弃去1.5L鱼缸内培养水并新加入曝气培养水1.5L，同时加入75μL浓度为20mg/mL的氟苯尼考丙酮溶液，混匀以确保药物暴露期间每日3L培养水中氟苯尼考浓度均为1mg/L，继续培养，期间每日进行正常丰年虾活饵喂养2次，脱壳丰年虾饲料1次。造模时间持续至35d。

2.在第36d对上述造模斑马鱼采用冰浴麻醉后，在光学显微镜下对其肝脏进行解剖，并进行后续模型评价。

3.模型评价采用三部分内容(H&E染色、透射电镜扫描及组学技术联合分析)进行综合评价以确定造模成功与否(技术路线如图1所示)。

实验例1

本实验例对实施例1提供的造模斑马鱼采用冰浴麻醉后，在光学显微镜下对其肝脏进行解剖，进行H&E染色。

H&E染色结果参照图2所示，结果表明，采用1mg/L氟苯尼考对斑马鱼进行28天水环境暴露后，斑马鱼肝脏部位出现明显的脂质空泡化现象，表明肝细胞出现脂肪变性现象。对照组为相同培养时间下，未进行氟苯尼考处理组。

实验例2

采用透射电镜扫描对斑马鱼肝脏细胞进行观察，结果参照图3a，图3b，图4a，图4b所示。

结果表明，采用1mg/L氟苯尼考对斑马鱼进行28天水环境暴露后，斑马鱼肝脏细胞出现明显的脂滴数目增加现象(图3a、3b)；此外，损伤线粒体的数目也显著增加(图4a、4b)。分别对其数目进行计数(n＝3)，并采用SPSS进行统计学差异分析，p值小余0.05认为其具有统计学意义差异。

实验例3

本实验例进行脂质组学分析。

本实验例对实施例1提供的造模斑马鱼采用冰浴麻醉后，在光学显微镜下对其肝脏进行解剖。每5条斑马鱼的肝脏组织混合在一起作为一个样本(n＝6)保存至-80℃冰箱，直至分析，期间避免反复冻融。脂质组学样本的前处理方法为：每50mg肝脏样本加入1.5ml预冷的甲醇/水(1:1)溶液，涡旋混匀后在0℃下进行超声匀浆10分钟(每运行5秒，间歇10秒)。随后采用16000g在4℃下进行离心10分钟，弃去上清液后，在固体沉淀中继续加入1.5ml预冷的二氯甲烷/甲醇(3:1)，涡旋混匀后在0℃下进行超声匀浆10分钟(每运行5秒，间歇10秒)。采用16000g在4℃下进行离心10分钟，取上清液进行氮吹，后采用120μL甲醇/水(1:1)溶液复溶，上机，进行代谢物测定。

代谢产物的分析使用高效液相色谱系统与Therom QExactive高分辨质谱相结合进行ddMS2扫描。数据分析与通路鉴定采用Progenesis QI软件进行峰提取和峰对齐并采用LipidMaps等脂质在线数据库进行物质鉴定及多元统计分析。

结果表明，采用1mg/L氟苯尼考对斑马鱼进行28天水环境暴露后，斑马鱼肝脏组织中的甘油磷脂(图5)、神经酰胺(图6)、鞘脂(图7)等均呈显著上升趋势。转录组学富集分析结果表明，甘油脂代谢、鞘脂代谢及甘油磷脂代谢相关通路的调控基因(图8)也呈现显著上调的趋势。由于线粒体损伤的出现，肝脏内的游离脂肪酸不能及时被线粒体利用进行β-氧化，而是用以合成膜结构类磷脂、有毒性脂质神经酰胺和鞘脂及用于储存功能的甘油三酯，从而使肝脏细胞发生脂肪变性现象。

对比例1

与实施例1含氟苯尼考浓度为1mg/L的培养水进行造模不同，本对比例采用含氟苯尼考浓度为0.1mg/L的培养水进行诱导，其他的步骤同实施例1相同，区别仅在于，氟苯尼考浓度为0.1mg/L。

结果表明，与采用1mg/L的氟苯尼考进行诱导结果相比，组织病理学切片中出现脂质空泡化现象不明显(附图9)，透射电镜结果表明，尽管也出现了显著的线粒体损伤数目显著增加(附图11)但脂滴积累数目无显著改变(附图10)，进一步进行脂质组学结果分析则发现，磷脂(附图12)、鞘脂(附图13)、神经酰胺(附图14)的含量则无显著改变。

实验例4

造模成功率：在进行造模后，每个浓度随机选取3条斑马鱼进行组织病理学切片观察(n＝3)，1mg/L的浓度下均出现大小不均一的脂质空泡现象；随机选取3条斑马鱼进行透射电镜观察(n＝3)，1mg/L的浓度下均出现脂滴积累现象和线粒体损伤，分别对其数目进行统计后取平均值作图，组间引起的误差线如图3b、4b所示。后脂质组分析每个样本为染毒组随机选取5条斑马鱼肝脏混合作为1个样本，对照组和处理组各6个样本(n＝6)；转录组分析每个样本为染毒组随机选取5条斑马鱼肝脏混合作为1个样本，对照组和处理组各3个样本(n＝3)，综上结果来看，造模成功率较高且较为稳定。

结合以上结果，表明斑马鱼形成线粒体损伤机制的非酒精性脂肪肝动物模型建模成功。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法，其特征在于，其包括：取3-4月龄的斑马鱼培养至第7-8d后，置于含氟苯尼考溶液的培养水中进行培养，培养期间连续更换非人目标动物的培养水，所述培养水中氟苯尼考溶液的浓度为1-1.2mg/L；所述培养水的培养条件为：水温：28±0.5℃，pH 7.0-8.0，电导率 500-800 μS/cm，溶解氧5-8mg/L；

每日采用半数换水的方式对培养容器内的培养水进行更换，即每日弃去培养容器中一半体积的培养水，并新添加含浓度为1-1.2mg/L的氟苯尼考溶液的培养水，新增的所述培养水的体积为所述培养容器体积的一半；培养期间正常饲喂，培养至35-38d；

非酒精性脂肪肝是指线粒体损伤所引起的非酒精性脂肪肝：所述线粒体损伤所引起的非酒精性脂肪肝为如下至少一种症状：组织病理学切片出现脂质空泡化现象、斑马鱼肝脏中脂滴数目显著上升、线粒体损伤数目显著增加、磷脂、神经酰胺和鞘脂显著上升。

2.如权利要求1所述的非酒精性脂肪肝动物模型的构建方法得到的非酒精性脂肪肝动物模型在早期分子筛查药物、筛选治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

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