CN109085331B - 一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种2,4‑二硝基甲苯毒性的检测方法，包括以下步骤：配制含有不同2,4‑二硝基甲苯浓度的培养液；用含有不同2,4‑二硝基甲苯浓度的培养液分别培养斑马鱼胚胎，进行多组为期5天的毒性试验，在所述毒性试验过程中，所述斑马鱼胚胎孵化成斑马鱼幼鱼；观察记录各组所述毒性试验过程中的斑马鱼胚胎的死亡率，观察记录各组斑马鱼幼鱼的幼鱼体长、卵黄囊宽、卵黄囊面积和幼鱼体表面积，以及各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态，测定各组斑马鱼幼鱼的脂类代谢相关基因表达和氧气运输相关基因表达的变化，判断2,4‑二硝基甲苯对斑马鱼胚胎及幼鱼的毒性作用。本发明提高了2,4‑二硝基甲苯毒性检测的直观性和准确性。

Description

一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法
技术领域
本发明涉及毒理学检测技术领域，特别涉及一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法。
背景技术
2,4-二硝基甲苯(2,4-dinitrotoluene，2,4-DNT)属于硝基苯类化合物家族，是聚氨酯泡沫、农药、橡胶和染料等生产过程的中间体，易经皮肤吸收引起中毒。2,4-DNT可以通过各种方式释放到环境中，是土壤和水体中硝基芳烃污染的主要组成之一。在我国松花江水体中已多次检出硝基苯类污染物，2,4-DNT因其具有“三致效应”已被列入环境优先检测污染物。一直以来，国内外有关2,4-DNT的毒性机制也在不断探索中，过去的研究主要集中于硝基化合物对哺乳动物生理生化的影响，在哺乳动物上的研究发现，暴露于高浓度的硝基化合物会导致溶血、贫血现象，而2,4-DNT主要的中毒症状是高铁血红蛋白血症以及与之相关的效应。根据相关文献，有学者研究了不同的硝基甲苯类化合物对大鼠的毒性，结果表明硝基甲苯类物质影响了大鼠肝脏中脂肪代谢，而且一步比较了不同的硝基甲苯类化合物对大鼠的毒性，发现了它们的共同特点是影响脂类代谢的过程，同时发现2,4-DNT在此类物质中毒性相对较强。
而当前关于有毒物质的毒性研究，科研人员多以大鼠、仓鼠、小白鼠等为试验对象，试验存在研究成本高，动物繁殖周期长、单次产仔数低而不易获得同质试验个体，而且不能直观展示活体组织器官病理变化，因此不利于应用为2,4-DNT毒性研究的毒理模型。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，旨在提高2,4-二硝基甲苯毒性检测的效率、直观性和准确性。
为实现上述目的，本发明提出一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，包括以下步骤：
S10、配制含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液；
S20、用含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液分别培养斑马鱼胚胎，进行多组为期5天的毒性试验，在所述毒性试验过程中，所述斑马鱼胚胎孵化成斑马鱼幼鱼；
S30、观察记录各组所述毒性试验过程中的斑马鱼胚胎的死亡率，观察记录各组斑马鱼幼鱼的幼鱼体长、卵黄囊宽、卵黄囊面积和幼鱼体表面积，以及各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态，测定各组斑马鱼幼鱼的脂类代谢相关基因表达和氧气运输相关基因表达的变化，判断2,4-二硝基甲苯对斑马鱼胚胎及幼鱼的毒性作用；
其中，所述斑马鱼胚胎包括野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎，所述斑马鱼幼鱼包括分别由野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎孵化而成的野生型斑马鱼幼鱼和转基因斑马鱼幼鱼。
优选地，步骤S10包括：
将丙酮与养殖用水混合，制成丙酮储备液；
将2,4-二硝基甲苯加入丙酮储备液中，通过超声波破碎获得2,4-二硝基甲苯母液；
取2,4-二硝基甲苯母液与养殖用水混合，制成含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液；
其中，所述养殖用水为曝气加热的自来水。
优选地，所述超声波破碎的超声波频率为20～25kHz，超声波破碎的时间为5～8min。
优选地，在步骤S20之前，还包括：
S11、将饲养在循环水养殖系统中的成年斑马鱼，按照雌雄比为1：2的比例移至产卵盒中，放入28℃的恒温箱中保温过夜，使斑马鱼自然交配后收集受精卵，作为斑马鱼胚胎；
其中，所述成年斑马鱼包括成年野生型斑马鱼和成年转基因斑马鱼，对应获得野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎。
优选地，在步骤S11中，所述成年斑马鱼在循环水养殖系统中的养殖方法为：养殖用水为曝气加热的自来水，养殖用水的水温为26～28℃，饲养过程中每天投喂饲养饵料，保持光照14h/黑暗10h的光照周期。
优选地，在步骤S30中，观察记录各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态的步骤，包括：
使用油红O对斑马鱼幼鱼进行染色，观测油红O在各组斑马鱼幼鱼卵黄中的显色分布，分析2,4-二硝基甲苯对斑马鱼幼鱼卵黄发育的影响。
优选地，在步骤S30中，观察记录各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态的步骤，包括：
观测绿色荧光蛋白在各组斑马鱼幼鱼肝脏中的表达强度，分析2,4-二硝基甲苯对斑马鱼幼鱼肝脏发育的影响。
优选地，步骤S30中：所述脂类代谢相关基因包括过氧化物酶体增殖激活受体-γ、过氧化物酶体增殖激活受体-α和酯酰辅酶A氧化酶。
优选地，步骤S30中：所述氧气运输相关基因包括低氧诱导因子1α、转铁蛋白a和血红素加氧酶。
本发明提供的技术方案中，以斑马鱼为试验对象进行2,4-二硝基甲苯的检测，饲养方便、养殖成本低且繁殖周期短，能够快速获得大量的同质个体，而且鱼体透明，易于观察中毒症状，可实时直观地观测鱼体各组织的病理变化，通过观测2,4-DNT对斑马鱼胚胎和幼鱼在发育过程中的卵黄代谢和吸收的影响，以及对斑马鱼脂类代谢相关基因表达和氧气运输相关基因表达的影响，来判定2,4-DNT对斑马鱼的毒性作用，提高了2,4-二硝基甲苯毒性检测的效率、直观性和准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例3中各组斑马鱼胚胎的死亡率计算结果图；
图2为实施例3中各组斑马鱼的幼鱼体表面积/卵黄囊面积比的计算结果图；
图3为实施例3中各组斑马鱼的幼鱼全长与卵黄囊宽度相关性的分析结果图；
图4为实施例3中各组斑马鱼经Oil red O染色受精3天后的幼鱼左视图；
图5为实施例3中2,4-DNT处理组受精后3天的转基因斑马鱼幼鱼的活体观测结果图；
图6为实施例3中2,4-DNT处理组受精后5天的转基因斑马鱼幼鱼的肝脏发育状态观测结果图；
图7为实施例3中各组斑马鱼的脂类运输相关基因apo表达的测定结果图；
图8为实施例3中各组斑马鱼的脂类运输相关基因fabp表达的测定结果图；
图9为实施例3中各组斑马鱼的脂类运输相关基因mtp表达的测定结果图；
图10为实施例3中各组斑马鱼的脂类代谢相关基因ppar-γ表达的测定结果图；
图11为实施例3中各组斑马鱼的脂类代谢相关基因ppar-α表达的测定结果图；
图12为实施例3中各组斑马鱼的脂类代谢相关基因acox表达的测定结果图；
图13为实施例3中各组斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因hif1α表达的测定结果图；
图14为实施例3中各组斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因tfa表达的测定结果图；
图15为实施例3中各组斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因ho表达的测定结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
2,4-二硝基甲苯(2,4-dinitrotoluene，2,4-DNT)属于硝基苯类化合物家族，是聚氨酯泡沫、农药、橡胶和染料等生产过程的中间体，易经皮肤吸收引起中毒，2,4-DNT主要的中毒症状是高铁血红蛋白血症以及与之相关的效应，例如，有研究表明，硝基甲苯类物质会影响大鼠肝脏中脂肪代谢，而且不同的硝基甲苯类化合物对大鼠的毒性的共同特点是影响脂类代谢的过程，同时发现2,4-DNT在此类物质中毒性相对较强。
基于2,4-DNT会影响动物体的肝脏脂肪代谢的现象，本发明提出一种2,4-DNT毒性的检测方法。在本发明提供的2,4-DNT毒性的检测方法的一实施例中，所述2,4-DNT毒性的检测方法包括以下步骤：
步骤S10、配制含有不同2,4-DNT浓度的培养液；
本实施例中，以纯度≥98％的2,4-DNT作为原料，配制含有不同2,4-DNT浓度的培养液，具体实施方法如下：以丙酮为溶剂，根据2,4-DNT的浓度梯度的设定，将适量2,4-DNT溶解于丙酮和曝气加热的养殖用水的混合液中，配制成含有不同2,4-DNT浓度的培养液，作为检测2,4-DNT毒性过程中用于饲养斑马鱼的培养液。
步骤S20、用含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养分别培养斑马鱼胚胎，进行多组为期5天的毒性试验，在所述毒性试验过程中，所述斑马鱼胚胎孵化成斑马鱼幼鱼；其中，所述斑马鱼胚胎包括野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎，所述斑马鱼幼鱼包括分别由野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎孵化而成的野生型斑马鱼幼鱼和转基因斑马鱼幼鱼。
斑马鱼是具有养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明等特点，是生命科学研究中一种重要的模式生物，有利于提高毒性检测的效率、直观性和准确性。选取发育正常的野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎，放置在循环水养殖系统中进行培养，所述循环水养殖系统中盛装有不同2,4-DNT浓度的培养液，保持水温为26～28℃，饲养过程中每天早晚定时投喂饲养饵料，保持光照14h/黑暗10h的光照周期，每12h换液一次，每次更换培养液总体积的2/3，并及时清除死亡个体。
所述饲养饵料包括热带小鱼饲料和红虫，所述热带小鱼饲料为市售的用于饲养热带小鱼的普通饲料；所述红虫通过以下方式饲养：将琼脂、奶粉和水按照0.5:2.5:7的质量比混合均匀，倒入锥形瓶中，在121℃的高压灭菌锅中灭菌20min，冷却后倒入深色的陶瓷盆(或陶瓷碗)中，再将小红虫放入其中进行饲养即可，需要投食时，可使用胶头滴管从陶瓷盆中吸取红虫向斑马鱼投食。通过同时投喂热带小鱼饲料和红虫，使得斑马鱼在试验过程的饮食习惯更贴近于在自然环境中生活时的状态，进而避免由于饲喂饵料营养成分不足等因素而导致影响毒性试验结果的准确性。
步骤S30、观察记录各组所述毒性试验过程中的斑马鱼胚胎的死亡率，观察记录各组斑马鱼幼鱼的幼鱼体长、卵黄囊宽、卵黄囊面积和幼鱼体表面积，以及各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态，测定各组斑马鱼幼鱼的脂类代谢相关基因表达和氧气运输相关基因表达的变化，判断2,4-二硝基甲苯对斑马鱼胚胎及幼鱼的毒性作用；
用含有不同2,4-DNT浓度的培养液分别培养斑马鱼胚胎，观察并记录各组斑马鱼胚胎的死亡数，计算斑马鱼胚胎(包括野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎)的死亡率。同时，继续用含有不同2,4-DNT浓度的培养液培养由斑马鱼胚胎孵化的斑马鱼幼鱼，观察并记录各组斑马鱼幼鱼(包括野生型斑马鱼幼鱼和转基因斑马鱼幼鱼)的形态特征，包括幼鱼体长、卵黄囊宽、卵黄囊面积和幼鱼体表面积，计算幼鱼体表面积/卵黄囊面积比，然后通过荧光解剖镜观测幼鱼的卵黄和肝脏的发育状态，分析2,4-DNT对斑马鱼幼鱼的形态、卵黄和肝脏发育的影响；取斑马鱼幼鱼的肝脏样品，测定其中脂类运输相关基因表达、脂类代谢相关基因表达和氧气运输相关基因表达，分析2,4-DNT影响斑马鱼脂类代谢的分子机制，判断2,4-DNT对斑马鱼的肝脏脂类代谢等功能的毒性作用。
其中，在步骤S30中，观察记录各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态的步骤，包括：使用油红O对斑马鱼幼鱼(包括野生型斑马鱼幼鱼和转基因斑马鱼幼鱼)进行染色，观测油红O在各组斑马鱼幼鱼卵黄中的显色分布，分析2,4-二硝基甲苯对斑马鱼幼鱼卵黄发育的影响。油红O(Oil red O)是中性脂类染料，在荧光解剖镜中显色为红色，通过观测Oilred O在斑马鱼幼鱼卵黄中的显色情况，可用于跟踪斑马鱼幼鱼卵黄的当前发育状态。
在本实施例中，所选用的转基因斑马鱼为转基因斑马鱼品系Tg(.7apo:GFP)，由武汉轻工大学水生生物实验室构建，其可以在卵黄囊和肝脏中特异表达绿色荧光蛋白，为研究2,4-DNT对斑马鱼肝脏的毒性作用提供了直接的证据。故而，在本实施例中，步骤S30中所述的观察记录斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态的步骤，包括：观测绿色荧光蛋白在斑马鱼幼鱼肝脏中的表达强度，通过绿色荧光蛋白在斑马鱼幼体肝脏内的表达来跟踪肝脏的当前发育状态，从而分析2,4-二硝基甲苯对斑马鱼幼鱼肝脏发育的影响。
其中，所述斑马鱼的脂类运输相关基因包括载脂蛋白(apoliporotein，apo)、脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，fabp)和微粒体甘油三酯转运蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，mtp)。
所述斑马鱼的脂类代谢相关基因包括过氧化物酶体增殖激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，ppar-γ)、过氧化物酶体增殖激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，ppar-α)和酯酰辅酶A氧化酶(acyl-coenzyme A oxidase，acox)。
所述斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因包括低氧诱导因子1α(hypoxia-induciblefactor-1 α，hif1α)、转铁蛋白a(transferrin a，tfa)和血红素加氧酶(heme oxygenase，ho)。
本发明提供的技术方案中，以斑马鱼为试验对象进行2,4-二硝基甲苯的检测，饲养方便、养殖成本低且繁殖周期短，能够快速获得大量的同质个体，而且鱼体透明，易于观察中毒症状，可实时直观地观测鱼体各组织的病理变化，通过观测2,4-DNT对斑马鱼胚胎和幼鱼在发育过程中的卵黄代谢和吸收的影响，以及对斑马鱼脂类代谢相关基因表达和氧气运输相关基因表达的影响，分析了2,4-DNT影响斑马鱼脂类代谢的分子机制，进而判定2,4-DNT对斑马鱼的毒性作用，提高了2,4-二硝基甲苯毒性检测的效率、直观性和准确性。
可选地，步骤S10包括：
S11、将丙酮与养殖用水混合，制成丙酮储备液；
以丙酮作为溶解2,4-DNT的溶媒剂，提高2,4-DNT在所述培养液中的溶解性，首先需要将丙酮制备成丙酮储备液，具体做法如下：将丙酮与养殖用水混合，制备成丙酮的体积浓度为10％的丙酮溶液，作为丙酮储备液，放置于4℃、避光条件下保存备用。
S12、将2,4-DNT加入丙酮储备液中，通过超声波破碎获得2,4-DNT母液；
向丙酮储备液中加入2,4-DNT，通过超声波破碎后摇匀，制成2,4-DNT浓度为200mg/mL的2,4-DNT母液，放置于4℃、避光条件下保存备用。其中，所述超声波破碎的超声波频率为20～25kHz，超声波破碎的时间为5～8min。
S13、取2,4-DNT母液与养殖用水混合，制成含有不同2,4-DNT浓度的培养液。
按照预设的2,4-DNT浓度梯度，将适量的2,4-DNT母液与养殖用水混合，配制成含有不同2,4-DNT浓度的培养液，用于检测2,4-DNT毒性试验过程中饲养斑马鱼的培养液，使斑马鱼暴露在含有不同浓度2,4-DNT的环境中，其中，在步骤S11和S13中，所述养殖用水为曝气加热的自来水。通过上述方法配制含有不同2,4-DNT浓度的培养液，制备方法简单，且2,4-DNT的溶解效果好，浓度控制准备，其浓度误差可控制在0.03％以内。
优选地，在步骤S20之前，还包括获取斑马鱼胚胎的步骤S11，具体操作方法如下：将饲养在循环水养殖系统中的成年斑马鱼，按照雌雄比为1：2的比例移至产卵盒中，放入28℃的恒温箱中保温过夜，使斑马鱼自然交配后收集受精卵，将受精卵清洗后放入28.5℃的恒温箱中培养，在受精后6h的原肠胚时期，清除未受精胚胎，选取受精正产的胚胎作为进行毒性试验的斑马鱼胚胎；其中，所述成年斑马鱼包括成年野生型斑马鱼和成年转基因斑马鱼，对应获得野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎。
在步骤S11中，所述成年斑马鱼在循环水养殖系统中的养殖方法为：养殖用水为曝气加热的自来水，养殖用水的水温为26～28℃，饲养过程中每天投喂饲养饵料，保持光照14h/黑暗10h的光照周期。所述饲养饵料同样包括热带小鱼饲料和红虫，通过同时投喂热带小鱼饲料和红虫，使得斑马鱼在试验过程的饮食习惯更贴近于在自然环境中生活时的状态，进而避免由于饲喂饵料营养成分不足等因素而导致影响毒性试验结果的准确性。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1获取斑马鱼胚胎
(1)将野生型AB系斑马鱼(购自国家斑马鱼资源中心)和转基因斑马鱼品系Tg(.7apo:GFP)(由武汉轻工大学水生生物实验室构建)饲养在循环水养殖系统中，养殖用水为曝气加热的自来水，水温控制在26～28℃，保持光照14h/黑暗10h的光照周期，饲养过程中每天早晚定时投喂饲养饵料，投食后清除粪便及残饵，其中，饲养饵料为热带小鱼饲料(购自北京疯狂水草公司)和红虫，红虫的饲养方法为：将琼脂、奶粉和水按照0.5:2.5:7的质量比混合均匀，倒入锥形瓶中，在121℃的高压灭菌锅中灭菌20min，冷却后倒入深色的陶瓷盆中，再将小红虫放入其中进行饲养，需要投食时，使用胶头滴管从陶瓷盆中吸取红虫向斑马鱼投食。
(2)将成年野生型斑马鱼和成年转基因斑马鱼分别按照1:2的雌雄比转入产卵盒中，放入28℃的恒温箱中保温过夜，第二天早上收集受精卵，清洗后放入28.5℃的恒温箱中培养，在受精后6h的原肠胚时期，清除未受精胚胎，选取受精正产的胚胎作为进行毒性试验的斑马鱼胚胎。
实施例2不同2,4-DNT浓度的培养液的配制
(1)丙酮储备液的配置：将丙酮(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)与曝气加热的自来水混合，配制成丙酮的体积浓度为10％的丙酮溶液，作为丙酮储备液，放置于4℃、避光条件下保存备用；
(2)2,4-DNT母液的配置：取丙酮储备液，向其中加入2,4-DNT(纯度≥98％，Sigma公司)，使用超声波破碎仪，在20～25kHz频率下破碎处理8min后，充分摇匀，配成2,4-DNT浓度为200mg/mL的2,4-DNT母液,放置于4℃、避光条件下保存备用；
(3)按照预设浓度梯度，将适量2,4-DNT母液与养殖用水混合，配制成含有不同2,4-DNT浓度的培养液，其浓度梯度分别为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L和12mg/L。
实施例3斑马鱼胚胎的2,4-DNT暴露试验
将实施例1获得的斑马鱼胚胎放置在循环水养殖系统中培养，循环水养殖系统中盛装有不同2,4-DNT浓度的培养液，保持水温为26～28℃，饲养过程中每天早晚定时投喂饲养饵料，保持光照14h/黑暗10h的光照周期，每12h换液一次，每次更换培养液总体积的2/3，并及时清除死亡个体。
试验分为8组进行，包括一个空白组(Control)、一个丙酮助溶剂组(Acetone)和6个2,4-DNT处理组，空白组的培养液为养殖用水(不含有丙酮和2,4-DNT)，丙酮助溶剂组的培养液为丙酮浓度为0.05mL/L的养殖用水，6个2,4-DNT处理组的培养液中2,4-DNT的浓度分别为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L和12mg/L；每组4个平行(每个平行30个胚胎)，包括3组野生型斑马鱼胚胎和1组转基因斑马鱼胚胎。连续培养5天，统计斑马鱼胚胎的死亡率，观察记录斑马鱼幼鱼的幼鱼体长、卵黄囊宽、卵黄囊面积和幼鱼体表面积，以及斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态，测定斑马鱼幼鱼的脂类代谢相关基因表达和氧气运输相关基因表达的变化，测定方法及结果如下：
(1)斑马鱼胚胎死亡率
斑马鱼胚胎死亡率的统计结果如图1所示。由图1可知，受精后24h到72h，2,4-DNT处理组的死亡率较低，受精后96h，2,4-DNT处理组的死亡率开始增加，受精后120h，10mg/L和12mg/L的2,4-DNT处理组的死亡率继续增高，分别为60％和69％，在120h，通过SPSS对2,4-DNT浓度和死亡率的线性回归分析，得到2,4-DNT对斑马鱼幼鱼120h-LC50(半数致死浓度LC50为引起一半斑马鱼死亡的AFB1浓度)为9.59mg/L，95％置信区间为8.89～10.44mg/L。
(2)斑马鱼幼鱼的形态学分析
取各试验组受精3天和5天后的斑马鱼幼鱼，使用200mg/L的MS-22将斑马鱼幼鱼麻醉后，在相同放大倍数下，分别拍照记录斑马鱼幼鱼的形态(俯视图)，发现2,4-DNT处理的受精后3天的幼鱼出现体表色素生成减少，卵黄囊堆积，围心腔水肿，晶状体突出，下颌不能闭合，鱼鳔发育不全，游泳能力差等症状。
用IS Capture软件统计斑马鱼幼鱼的幼鱼全长、卵黄囊宽、卵黄囊面积和幼鱼体表面积，并计算幼鱼体表面积/卵黄囊面积比、以及幼鱼全长和卵黄囊宽度的相关性，计算结果如图2和图3所示，图2为斑马鱼幼鱼的幼鱼体表面积/卵黄囊面积比的计算结果，图3为斑马鱼幼鱼的幼鱼全长和卵黄囊宽相关性结果。其中，图2中，上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
就卵黄囊的宽度而言，2,4-DNT处理的幼鱼比空白组组偏大，由图2中斑马鱼幼鱼的幼鱼体表面积/卵黄囊面积比的计算结果可知，6mg/L和8mg/L的2,4-DNT处理组的斑马鱼幼鱼的幼鱼体表面积/卵黄囊面积比显著低于对照组(P<0.05)。由图3分析可知，幼鱼全长和卵黄囊宽度具有相关性，采用双变量pearson参数统计方法得出卵黄囊宽度和全长之间的相关系数为-0.586，在0.01水平上是显著相关的，即卵黄囊宽度越大，幼鱼全长越小。
(3)斑马鱼幼鱼的卵黄发育状态
随机抽取各试验组受精3天后的斑马鱼幼鱼20尾，放入到六孔板中，每孔依次加入10mL去离子水，用胶头滴管吹气清洗一到两次，在用胶头滴管将幼鱼转移到1.5mL干净的离心管中，并做好标记。用0.5mL的注射器吸尽去离子水，随后用移液枪加入1mL的4％的多聚甲醛作为固定剂，盖紧管盖，保证幼鱼充分接触固定剂，再将离心管放入4℃冰箱，一小时后更换4％的多聚甲醛，4℃冰箱固定过夜。
将固定好的幼鱼每组随机取出3～4条染色参照Schlombs的方案染色。先用体积浓度分别为20％、40％、60％的异丙醇溶液漂洗，每个浓度漂洗两次，每次漂洗5min，如果在漂洗的过程中观察到幼鱼身体变形，说明幼鱼脱水过度，应该按实际情况减少漂洗的次数和时间。待幼鱼在60％异丙醇漂洗完毕后，将漂洗液完全吸出，加入约2mL的浓度为0.3％的Oil Red O工作液置于摇床室温染色2.5h左右，再用60％、40％、20％异丙醇依次漂洗脱色，每个浓度漂洗脱色2次，每次脱色5min。在此过程中应该注意每次漂洗完，应在解剖镜下观察脱色的情况，控制下一步的脱色时间和次数，待脱色完成后然后将幼鱼转移至PBS缓冲液(约2mL)中，于解剖镜下拍摄幼鱼左侧观的图像。
其中，4％的甲醛固定液的配制方法为：准确称取8g多聚甲醛粉末，加一定体积(＜200mL)PBS，于60℃缓慢溶解，期间加入少量NaOH促溶，充分溶解后定容至200mL，待冷却至室温，分装后于-20℃冻存。
浓度为0.3％的Oil Red O工作液的配制方法为：准确称取0.1g的Oil red O干粉溶于20mL异丙醇，制成浓度为0.5％的Oil red O储存液，于4℃避光保存；然后向30mL的Oilred O储存液中加入20mL的ddH2O，微热助溶，新鲜过滤，制得浓度为0.3％的Oil Red O工作液。
PBS缓冲液包括以下浓度的组分：137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/LNa2HPO4，和2mmol/L KH2PO4；制备方法为：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，调pH值至7.4，定容至1L；蒸汽灭菌(至少20min)，保存于室温。
体积浓度为20％、40％、60％的异丙醇溶液分别由20mL、40mL和60mL的异丙醇溶解于PBS缓冲液中混合制得。
幼鱼左侧观的图像拍摄结果如图4所示。图4中，图4A和图4B分别为空白组(Control)和丙酮助溶剂组(Acetone)，图4C至图4F依次为2mg/L、4mg/L、6mg/L和8mg/L的2,4-DNT处理组，图4A至图4F中颜色较深(接近于黑色)的部分即为Oil Red O的显色部分。由于卵黄中含有大量的脂类，因此卵黄囊显示为深红色，空白组幼鱼的卵黄囊、头部、心脏、鳔、血管及肌节间均有ORO显色，而2,4-DNT处理组幼鱼的卵黄囊中ORO显色较深。
然后，取2,4-DNT处理组受精后3天的转基因斑马鱼幼鱼Tg(.7apo:GFP)，在荧光解剖镜下进行活体观察，观察结果如图5所示，图5中，图5A和图5B分别为空白组和丙酮助溶剂组，图5C至图5F依次为2mg/L、4mg/L、6mg/L和8mg/L的2,4-DNT处理组，图5A’至图5F’分别为图5A至图5F中某一尾斑马鱼的放大图，图5A至图5F、图5A’至图5F’中颜色较亮的部分(接近于白色)即为荧光蛋白显色部分。图5中的观测结果表明2,4-DNT处理组的幼鱼表现出卵黄吸收障碍，其结果与图4中的结果一致，且随着2,4-DNT浓度的升高，卵黄囊的染色加深，表现出明显的剂量-效应关系。这些结果显示2,4-DNT导致了斑马鱼发生卵黄吸收障碍。
(4)斑马鱼幼鱼的肝脏发育状态
肝脏是机体物质代谢和外源异生物质进行生物转化的重要器官。2,4-DNT也主要通过肝脏代谢转化。在生态毒理学研究中，肝组织的形态学和结构的变化常常作为毒理研究的观测指标。本实施例中借助于基因修饰的斑马鱼，通过绿色荧光蛋白刻出肝脏的形态结构，在2,4-DNT的暴露实验中，观测到2,4-DNT对肝脏的发育状态的影响。
取各组斑马鱼受精5天后的转基因斑马鱼，在荧光解剖镜下进行活体观察，观测绿色荧光蛋白的表达和分布，观测结果如图6所示；从各组转基因斑马鱼中挑选一尾，分别拍摄其左侧观、右侧观和背侧观的图像(未图示)。
图6中，图6A和图6B分别为空白组(Control)和丙酮助溶剂组(Acetone)，图6C至图6F依次为2mg/L、4mg/L、6mg/L和8mg/L的2,4-DNT处理组，图6A至图6F中颜色较亮的部分(接近于白色)即为荧光蛋白显色部分。由图6A和图6B可以看出斑马鱼胚胎受精后5d的幼鱼的肝脏可分为左右两叶，左叶偏大，右叶偏小；空白组和丙酮助溶剂组的幼鱼的肝脏无明显差异。进一步观察斑马鱼幼鱼的左侧观、右侧观和背侧观，发现经2,4-DNT处理的斑马鱼幼鱼，随着2,4-DNT浓度的升高，幼鱼肝脏荧光亮度逐渐减小，8mg/L的2,4-DNT处理组中部分幼鱼甚至检测不到肝脏荧光信号，说明2,4-DNT抑制了肝脏的生长发育，为2,4-DNT对斑马鱼肝脏的毒理作用提供了直接的在体证明。
(5)斑马鱼的脂类代谢、氧气呼吸调节相关基因表达的影响
其中，斑马鱼的脂类运输相关基因包括apo、fabp和mtp；斑马鱼的脂类代谢相关基因包括ppar-γ、ppar-α和acox；斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因包括hif1α、tfa和ho。其中，ppar-α是配体激活核转录调节因子，能过调节脂肪酸的摄取、活化以及转运；ppar-γ能通过够诱导载脂蛋白、氧化酶系与脂蛋白脂酶等，从而促进脂质的氧化分解；acox是脂肪酸β-氧化的第一限速酶。
各组斑马鱼胚胎暴露5天后，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取各组斑马鱼幼鱼的肝脏样品总RNA，NanoDrop2000(Thermo Scientific)测定总RNA浓度，且A260/A280比值在1.8～2.0之间；同时采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，28S、18S和5SRNA条带清晰可见，且28S核糖体RNA的条带亮度是18S核糖体RNA的2倍。各样品分别取1μg总RNA用
Figure BDA0001715475840000131
1st Stand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反转录合成第一链cDNA。实时荧光定量PCR(qPCR)采用Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒(Roche)，扩增体系为10.0μL，其中SYBR Premix Ex Taq 5μL，正反向引物(10μmol/L)各0.2μL，ROXreference Dye II 0.2μL，nuclease-free water 3.4μL，cDNA模板1μL。各个基因的引物序列见下表1所示。反应在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行。qPCR反应程序95℃预变性10min，95℃变性15s，退火温度反应30s，72℃延伸30s并检测荧光信号，共40个循环；反应结束后进入溶解曲线阶段，溶解曲线温度设置为60～95℃，每隔5s升温0.5℃，检测引物特异性。每个样品做三个平行对照，内参基因为β-actin，用2-ΔΔCт法比较目的基因表达量的相对变化。
表1实时荧光定量PCR引物序列
引物名称Primer 引物序列Primer sequences
zppargF3 CGCAGGCTGAGAAGGAGAAGC
zppargR3 CATGTATCTGCAGTTGATCATC
zpparaF1 CATCACCAGAGAGTTTCTGAAG
zpparaR3 GCGGCGTTCACACTTATCGTAC
zacoxF AAGGACATCGAGCGAATGATG
zacoxR ACTATAAAAGAGTGGAGGCCG
apoF1 ATGAAGCTGACATTCGCTCTC
apoR1 TAGTGCTGGCTCAACTGCAG
zfabpF ATGGCCTTCAGCGGGACGTGG
zfabpR TGAGCTTCTTGCCGTCCATAG
zmtpF ATGAACATTTACGGTCAGAGC
zmtpR CACCACATTGATAGGATCTCC
zhif1aF GTCAGCAAGAGCATGGGCCTC
zhif1aR GAAGAACCTTCCACGTCGCAG
zhoF GCGGCAGAGAACACTGGCAGT
zhoR CTGCACTGCTGGGTGGTCTGC
ztfaF GAAGGTCCTGCTCATCTCTTTG
ztfaR CAGATAATTATTTAGTCCACCAG
zhbaF GAGTCTCTCTGCCAAAGACAAAG
zhbaR CGATTTTGCTGACAGCCTCAGC
zactinbF1 CATGGATGAGGAAATCGCTGC
zactinbR1 GTTAGTCACAATACCGTGCTC
斑马鱼的脂类运输相关基因表达的测定结果如图7至图9所示，图7至图9依次为apo、fabp和mtp表达的测定结果；斑马鱼的脂类代谢相关基因表达的测定结果如图10至12所示，图10至图12依次为ppar-γ、ppar-α和acox表达的测定结果。图7至图12中，CON表示空白组，ACE表示丙酮溶媒剂组；平均数上标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。
分析图7至图9可知，在参与脂类运输的基因中，丙酮处理组与空白组相比较无明显变化，随着2,4-DNT浓度升高，与空白对照组相比，apo在肝脏中的表达明显下调，8mg/L处理组与空白组差异极显著，下调了45％(P<0.05)。fabp在肝脏中的相对表达量下降更加明显，且具有剂量效应，2mg/L、4mg/L、6mg/L和8mg/L处理组分别下调了34％，70％，78％和83％，与空白对照组差异显著(P<0.05)。与空白处理组相比，2,4-DNT显著上调了mtp的表达(P<0.05)。
如图10至图12所示，在参与脂类氧化代谢的基因中，ppar-γ的表达量呈上升趋势，与空白对照组相比，2mg/L组没有明显变化。4mg/L、6mg/L和8mg/L处理组ppar-γ的表达量显著上调(P<0.05)。2,4-DNT明显抑制了ppar-α的表达，与空白对照组相比2mg/L处理组ppar-α表达量显著下调(P<0.05)，4mg/L、6mg/L和8mg/L处理组ppar-α表达量显著下调(P<0.05)。与ppar-α类似，acox表达量呈下降趋势，2,4-DNT处理组均与对照组存在显著差异(P<0.05)。
2,4-DNT显著下调了脂类运输有关基因apo、fabp的表达，但mtp的表达量呈上身趋势，而在参与脂类代谢调控的基因中ppar-γ的表达量有所上调，ppar-α和acox表达量显著下调。ppar-α缺乏或表达受抑制，可引起下游脂类代谢基因转录水平降低，因此apo、fabp、acox的表达量下调，可能是2,4-DNT抑制ppar-α的结果。而ppar-γ的活化促进进脂质的氧化代谢。
斑马鱼的氧气呼吸调节相关基因表达的测定结果如图13至图15所示，图13至图15依次为hif1α、tfa和ho表达的测定结果，图13至图15中，CON表示空白组，ACE表示丙酮溶媒剂组；平均数上标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。
分析图13至图15可知，与空白对照组相比，各浓度2,4-DNT处理组肝脏中hif1αmRNA均显著上调(P<0.05)。tfa mRNA表达量有上升趋势，2,4-DNT处理组与空白处理组差异显著(P<0.05)，但2mg/L、4mg/L、6mg/L处理组之间无显著差异(P>0.05)。ho mRNA表达量有所上调，与空白处理组相比，2mg/L处理组差异不显著(P>0.05)，4mg/L、6mg/L和8mg/L处理组ho分别显著上调了1.8倍(P<0.05)，2倍(P<0.05)和2,2倍(P<0.05)。
2,4-DNT可诱导高铁血红蛋白血症，此外2,4-DNT还可以使红细胞膜表面脂质过氧化导致溶血，而2,4-DNT的这些作用都会影响机体氧气运输，造成机体功能型缺氧。而低氧可诱导hif1α水平的增高，任何能使机体产生氧化应激的因素都能诱导ho的表达。此外，红细胞膜脂质过氧化过程中所生成的自由基，也会诱导tfa表达量升高。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、配制含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液；
S20、用含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液分别培养斑马鱼胚胎，进行多组为期5天的毒性试验，在所述毒性试验过程中，所述斑马鱼胚胎孵化成斑马鱼幼鱼；
S30、观察记录各组所述毒性试验过程中的斑马鱼胚胎的死亡率，观察记录各组斑马鱼幼鱼的幼鱼体长、卵黄囊宽、卵黄囊面积和幼鱼体表面积，以及各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态，测定各组斑马鱼幼鱼的脂类运输相关基因表达、脂类代谢相关基因表达和氧气运输相关基因表达的变化，判断2,4-二硝基甲苯对斑马鱼胚胎及幼鱼的毒性作用；
其中，所述斑马鱼胚胎包括野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎，所述斑马鱼幼鱼包括分别由野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎孵化而成的野生型斑马鱼幼鱼和转基因斑马鱼幼鱼；
步骤S30中：所述脂类运输相关基因包括载脂蛋白、脂肪酸结合蛋白和微粒体甘油三酯转运蛋白，所述脂类代谢相关基因包括过氧化物酶体增殖激活受体-γ、过氧化物酶体增殖激活受体-α和酯酰辅酶A氧化酶，所述氧气运输相关基因包括低氧诱导因子1α、转铁蛋白a和血红素加氧酶。
2.如权利要求1所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，步骤S10包括：
将丙酮与养殖用水混合，制成丙酮储备液；
将2,4-二硝基甲苯加入丙酮储备液中，通过超声波破碎获得2,4-二硝基甲苯母液；
取2,4-二硝基甲苯母液与养殖用水混合，制成含有不同2,4-二硝基甲苯浓度的培养液；
其中，所述养殖用水为曝气加热的自来水。
3.如权利要求2所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，所述超声波破碎的超声波频率为20～25kHz，超声波破碎的时间为5～8min。
4.如权利要求1所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，在步骤S20之前，还包括：
S11、将饲养在循环水养殖系统中的成年斑马鱼，按照雌雄比为1：2的比例移至产卵盒中，放入28℃的恒温箱中保温过夜，使斑马鱼自然交配后收集受精卵，作为斑马鱼胚胎；
其中，所述成年斑马鱼包括成年野生型斑马鱼和成年转基因斑马鱼，对应获得野生型斑马鱼胚胎和转基因斑马鱼胚胎。
5.如权利要求4所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，在步骤S11中，所述成年斑马鱼在循环水养殖系统中的养殖方法为：养殖用水为曝气加热的自来水，养殖用水的水温为26～28℃，饲养过程中每天投喂饲养饵料，保持光照14h/黑暗10h的光照周期。
6.如权利要求1所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，在步骤S30中，观察各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态的步骤，包括：
使用油红O对斑马鱼幼鱼进行染色，观测油红O在各组斑马鱼幼鱼卵黄中的显色分布，分析2,4-二硝基甲苯对斑马鱼幼鱼卵黄发育的影响。
7.如权利要求6所述的2,4-二硝基甲苯毒性的检测方法，其特征在于，在步骤S30中，观察记录各组斑马鱼幼鱼的肝脏和卵黄的发育状态的步骤，包括：
观测绿色荧光蛋白在各组斑马鱼幼鱼肝脏中的表达强度，分析2,4-二硝基甲苯对斑马鱼幼鱼肝脏发育的影响。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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