TWI764859B - 腸病毒７１動物模式 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於腸病毒71(EV71)、動物模式之研發及候選抗EV71化合物之篩選。更具體而言，本發明係關於如下發現：業已適應於感染齧齒類動物細胞株之腸病毒71(EV71)病毒株，或在VP1中含有會致使免疫功能健全齧齒類動物中疾病之突變的經選殖衍生病毒。
Description
本申請案係關於2015年2月11日提出申請之美國臨時專利申請案第62/114,880號及2015年1月28日提出申請之美國臨時專利申請案第62/108,828號且主張其優先權。每一申請案之全部內容以引用方式併入本文中。
本申請案係與序列表以電子格式一起申請。序列表之標題為2577243TWSequenceListing.txt，其產生於2016年1月12日且其大小為32kb。序列表之電子格式中之資訊之全部內容以引用方式併入本文中。
本發明係關於腸病毒71(EV71)、動物模式之研發及候選抗EV71化合物之篩選。
本文用於闡釋本發明背景及尤其提供關於實踐之其他細節之情形之公開案及其他材料以引用方式併入本文中，且出於便利性在下文中按作者及日期提及且按作者字母順序列示於隨附參考書目中。
腸病毒71(EV71)係直徑大約為30nm之小非包膜病毒。病毒衣殼呈現二十面體對稱且包括60個相同單元(原聚體)，其中每一單元係由4個病毒結構蛋白VP1-VP4組成。衣殼環繞長7,450個核苷酸(nt)之單鏈正義RNA基因體核心。該基因體含有單一開發閱讀框，其編碼具有
2193個胺基酸(aa)之多蛋白且側接有745nt之長5'未轉譯區域(UTR)及85nt之較短3' UTR(其中在其3'末端處具有可變長度之多聚-A束)。將多蛋白分成三個區域，亦即P1、P2及P3。P1編碼4種病毒結構蛋白1A-1D(VP4、VP2、VP3及VP1)；P2及P3編碼7種非結構蛋白2A-2C及3A-3D[1-3]。主衣殼蛋白(VP1)基因之系統發生分析將EV71分成6種基因型(表示為A至F)[66]，且基因型B及C進一步細分成亞基因型B1至B5及C1至C5。
EV71主要在嬰兒及幼童中引起一系列臨床疾病，包含手足口病(HFMD)、無菌性腦膜炎、腦炎及類小兒麻痹癱瘓[4、5]。該病毒係在1969年於美國加利福尼亞州自患有急性腦炎之兒童首次分離，且隨後在1974年將其描述為腸病毒屬之新血清型。世界各地區報導具有或不具有神經學併發症的HFMD流行及死亡案例[7-20]。自1997年以來，EV71感染已成為亞太地區之重大公共健康負擔及常見流行病問題。在1997年於馬來西亞發生高度神經毒性EV71所致之HFMD爆發且導致48人死亡[21、22]，隨後在1998年於臺灣發生更大爆發，其中出現超過129,000個病例之HFMD、405例嚴重感染且78人因具有神經性心臟衰竭及肺水腫之急性腦幹腦脊髓炎而死亡[23-26]。在中國，在2008年記錄有488,955個HFMD病例且死亡126人[27]並在2009年增加至1,155,525個病例且死亡353人[28]。在2010年，中國經歷歷史上最大HFMD爆發，其中出現超過170萬個病例，27,000名患者患有嚴重神經學併發症，且905人死亡[29]。
類似於其他人類腸病毒，EV71不能感染除人類外之動物，但恒河猴及食蟹猴可以實驗方式被感染[30-32]。此主要係由於EV71與其用於脫殼及進入小鼠細胞中之受體之無效結合，該受體最近已被鑑別為清除劑受體種類B成員-2(SCARB2)蛋白質[47]。人類及鼠類SCARB2蛋白質僅展現84%之胺基酸序列一致性且由此顯示顯著結構
差異[49、67]，因此促進了非人類細胞對EV71感染之天然抗性之潛在病毒-受體不相容性。在病毒成功接合細胞表面上之SCARB2受體且解殼至細胞質中後，病毒RNA發生轉譯，從而使得表現各種病毒非結構蛋白質。病毒RNA隨後發生複製，包裝至衣殼中，且自由釋放至環境中以再感染健康細胞。
對病毒發病機制及針對其之特定治療劑之研發受阻於缺乏適宜小動物模式，此乃因EV71不能天然感染小齧齒類動物。已嘗試確立EV71感染及疾病之小鼠模式，其大部分係經由在幼小哺乳小鼠中藉由連續傳代進行病毒適應[33-39]。儘管一些模式能夠概述臨床病況之症狀，但尚未報導在2週齡或更大之免疫功能健全小鼠中會引起疾病。此外，除了免疫功能受損性干擾素受體缺陷AG129小鼠以外，人類及實驗猴中EV71感染之疾病及病理學之臨床特徵不會重現於小鼠中[35]。最近，已獲製可表現人類PSGL-1[68]及人類SCARB2[69、70]蛋白質之轉基因小鼠，但該等轉基因小鼠僅會展現對於EV71感染易感性之最低限度的改良。
由於RNA病毒借助其易錯複製及高突變率[40-42]的特性，其會複製成一群相關變體序列之群(稱為準種)[43、44]。其包括在某些環境中展現最高適應性之主要物種及由具有某一機率分佈之密切相關突變體序列之集合體構成之突變體組[44、45]。該等形式賦予了RNA病毒基因體可塑性，此反映在其能夠快速適應變化環境的能力。
尚未完全理解EV71感染引起致命神經學疾病之機制，由此已嘗試若干研究組以再現人類感染在實驗動物中之病理學，包含恒河猴及食蟹猴[114-120]、實驗室小鼠[112、121-129]及其他哺乳動物[130-133]。不幸的是，該等模式皆未展現在人類病例中所觀察到之全部神經學特徵，尤其係彼等可歸因於具有爆發性神經學肺水腫(NPE)之急性腦幹腦炎者[21、22、134-137]。實際上，即使在較準確地重現
EV71感染在人類中之體徵及症狀之實驗系統中，潛在機制亦與彼等賦予人類患者疾病者實質上不同。迄今為止，尚無單一動物模式令人信服地重現EV71誘導之NPE。主要區別在於EV71在人類患者中侷限於CNS組織[92-94、111]，而在動物模式中該病毒亦可在非神經組織(包含骨骼肌[33-36、38、98]及肝[119])中檢測到。儘管亦嘗試產生表現人類EV71受體蛋白PSGL-1(P-選擇蛋白糖蛋白配體-1)及SCARB2(S 66清除劑受體種類B成員2)之轉基因小鼠[68-70、47、138]，但該等模式皆未展現NPE，由此其鑑別用於人類患者之新穎措施之用途有限。
並不存在用於研究EV71感染動物中之感染及疾病進展或可用於篩選抗病毒化合物或抗病毒疫苗之適宜動物模式。期望研發用於該等目的之動物模式。
本發明係關於腸病毒71(EV71)、動物模式之研發及候選抗EV71化合物之篩選。更具體而言，本發明係關於如下發現：適於感染齧齒類動物細胞株之腸病毒71(EV71)病毒株，或在VP1中含有會致使免疫功能健全齧齒類動物及免疫功能受損性齧齒類動物中疾病之突變的經選殖衍生病毒。
另外，本發明係關於藉由使BALB/c小鼠感染適於感染NIH/3T3小鼠纖維母細胞之改質病毒株(例如EV71：TLLmv)來研發EV71誘導之神經學疾病之臨床真實模式。使用此方式，改質EV71用於在小鼠中誘導與神經學肺水腫有關之急性腦脊髓炎，其特徵在於肺腫脹及與模擬受感染肺相比器官重量有所增加。儘管不存在肺或心臟組織發炎、灶性出血及肺泡中之蛋白質性流體，但觀察到兒茶酚胺之高血清含量及腦幹、尤其延髓中之深度組織損害。該等數據顯示，該模式準確地再現人類EV71誘導之神經學肺水腫之體徵及症狀。
因此，在一態樣中，本發明係關於包括感染有能夠感染齧齒類動物之腸病毒71(有時在本文中稱為改質腸病毒71)之齧齒類動物之動物模式。在一實施例中，此一腸病毒71係齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71。在另一實施例中，此一腸病毒71係在VP1中含有突變之純系衍生病毒(CDV)。在一些實施例中，VP1中之突變使得CDV能夠使用齧齒類動物SCARB2蛋白質來感染齧齒類動物細胞。在一實施例中，齧齒類動物係免疫功能健全齧齒類動物。在另一實施例中，齧齒類動物係免疫功能受損性齧齒類動物。適於用作模式之動物較佳係哺乳動物，最佳地係便利之實驗室動物，例如兔、大鼠、小鼠及諸如此類。在一實施例中，動物係小鼠。在一些實施例中，小鼠係BALB/c小鼠。在另一實施例中，齧齒類動物細胞株係小鼠細胞株。在另一實施例中，小鼠細胞株係小鼠NIH/3T3細胞株。在另一實施例中，小鼠細胞株係小鼠Neuro-2a細胞株。在一實施例中，齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71係EV71：TLLm。在另一實施例中，齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71係EV71：TLLmv。在一實施例中，在VP1中含有突變之純系衍生病毒係CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]。該動物模式可用於研究病毒及人類疾病譜在動物模式中之全身性傳播。該動物模式亦可用於篩選抗病毒藥物及疫苗。
在另一態樣中，本發明提供使用在人類中所觀察之全譜之EV71誘導之神經學感染、疾病及病況來製備動物模式的方法。在一些實施例中，該方法包括使用本文所闡述之改質腸病毒71感染本文所闡述之齧齒類動物且將受感染齧齒類動物飼養長達約4週。在一些實施例中，擬感染之齧齒類動物之年齡介於約1週與約4週之間。在其他實施例中，將受感染齧齒類動物飼養約1週至約4週。在一些實施例中，齧齒類動物係本文所闡述之小鼠。在其他實施例中，藉由使用改質腸病毒71接種齧齒類動物來感染齧齒類動物。在一實施例中，接種係腹膜腔內(I.P.)接種。在另一實施例中，接種係肌內(I.M.)接種。在一些實
施例中，接種至齧齒類動物中之病毒劑量係介於約103與約107之間之中值細胞培養感染劑量(CCID50)。
在另一態樣中，本發明提供篩選抗病毒藥物之方法。根據此態樣，該方法包括下列步驟：提供動物測試群及動物對照群，其中每一群之動物係本文所闡述動物模式之動物；向測試群投與抗病毒藥物候選物；監測測試群及對照群中之疾病進展；比較測試群中之疾病進展與對照群中之疾病進展；及選擇相對於對照群減小測試群中之疾病進展之抗病毒藥物候選物。在一實施例中，在動物中篩選之前，首先在感染有齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71之測試齧齒類動物細胞株中篩選抗病毒藥物。在另一實施例中，在動物中篩選之前，首先在感染有在VP1中含有突變之純系衍生病毒(CDV)之測試齧齒類動物細胞株中篩選抗病毒藥物。
在另一態樣中，本發明提供篩選有效抗病毒疫苗之方法。根據此態樣，該方法包括下列步驟：提供動物測試群及動物對照群，其中每一群之動物係本文所闡述之動物模式之動物；向測試群投與抗病毒疫苗候選物；監測測試群及對照群中之疾病進展；比較測試群中之疾病進展與對照群中之疾病進展；及選擇相對於對照群減小測試群中之疾病進展之抗病毒疫苗候選物。在一實施例中，在動物中篩選之前，首先在感染有齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71之測試齧齒類動物細胞株中篩選抗病毒疫苗候選物。在另一實施例中，在動物中篩選之前，首先在感染有在VP1中含有突變之純系衍生病毒(CDV)之測試齧齒類動物細胞株中篩選抗病毒疫苗候選物。
圖1A-1O展示在各種靈長類動物細胞株之病毒感染後所觀察之致細胞病變效應(CPE)。在48hpi時觀察感染有1 MOI EV71：BS(圖1A、1D、1G、1J及1M)、EV71：TLLm(圖1B、1E、1H、1K及1N)或
EV71：TLLmv(圖1C、1F、1I、1L及1O)病毒之以下靈長類動物細胞之細胞單層之致細胞病變效應或死亡：RD細胞(圖A1-1C)、HeLa細胞(圖1D-1F)、HEp-2細胞(圖1G-1I)、Vero細胞(圖1J-1L)及COS-7細胞(圖1M-1O)。影像代表三個獨立實驗中之結果。
圖2A-2O展示感染有EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv之細胞株中之病毒抗原檢測。使用1 MOI各別病毒感染過夜接種之哺乳動物細胞株：HeLa(圖2A-2C)、HEp-2(圖2D-2F)、CHO-K1(圖2G-2I)、NRK(圖2J-2L)及TCMK(圖2M-2O)。在48hpi時收穫細胞，塗覆於鐵氟龍(Teflon)載玻片上且固定於冷丙酮中。使用泛腸病毒抗體探測細胞且使用FITC偶聯抗小鼠IgG染色。影像代表兩個獨立實驗。
圖3A-3D展示在NIH/3T3及Vero細胞中測定之EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv之生長動力學。在不同時間點收穫來自感染有1 MOI各別病毒之各種哺乳動物細胞之上清液且實施滴定並使用Reed及Muench方法進行列舉。圖3A：在Vero細胞中測定之EV71：BS病毒效價。圖3B：在NIH/3T3細胞中測定之EV71：TLLmv病毒效價。圖3C及3D：在NIH/3T3中測定之細胞EV71：TLLm病毒效價。未展示來自並不展現生產性感染之細胞株之生長曲線。
圖4A-4O展示在各種齧齒類動物細胞株之病毒感染後所觀察之致細胞病變效應(CPE)。在48hpi時觀察感染有1 MOI EV71：BS(圖4A、4D、4G、4J及4M)、EV71：TLLm(圖4B、4E、4H、4K及4N)或EV71：TLLmv(圖4C、4F、4I、4L及4O)病毒之以下齧齒類動物細胞之細胞單層之致細胞病變效應或死亡：NIH/3T3細胞(圖4A-4C)、Neuro-2A細胞(圖4D-4F)、TCMK細胞(圖4G-4I)、CHO-K1細胞(圖4J-4L)及NRK細胞(圖4M-4O)。影像代表來自三個獨立實驗之結果。
圖5A-5D展示藉由效價比測定之NIH/3T3中之EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv之病毒適應性評價。使用在NIH/3T3及Vero
細胞中單獨測定之病毒效價以log[(NIH/3T3細胞中之效價)/(Vero細胞中之效價)]來計算病毒適應性。自圖3A-3D中所展示之病毒效價值來計算(圖5A)EV71：BS、(圖5B)EV71：TLLmv及(圖5C及5D)EV71：TLLm之病毒適應性。未展示自並不展現生產性感染之細胞株獲得之病毒適應性分析。
圖6A及6B展示使用EV71：BS病毒RNA轉染NIH/3T3會誘導生產性感染。使用自NIH/3T3細胞(先前經自EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv提取之病毒RNA轉染)收穫之病毒上清液接種過夜接種之NIH/3T3及Vero細胞。圖6A：使用倒置光顯微鏡在24hpi下使細胞成像以觀察誘導之CPE。圖6B：在7dpi下收穫細胞，塗覆於鐵氟龍載玻片上，使用泛腸病毒抗體探測，且使用抗小鼠FITC偶聯抗體染色。
圖7A及7B展示在30℃下NIH/3T3及Vero細胞中之EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv之病毒適應性評價。在30℃下培育感染有EV71：BS(組a、d、g)、EV71：TLLm(組b、e、h)或EV71：TLLmv(組c、f、i)之過夜接種之(圖7A)NIH/3T3及(圖7B)Vero細胞且在光顯微鏡下使用相位對比在24hpi(組a-c)、48hpi(組d-f)及72hpi(組g-i)下觀察。所獲取影像代表兩個獨立實驗。
圖8A及8B展示在37℃下NIH/3T3及Vero細胞中之EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv之病毒適應性評價。在37℃下培育感染有EV71：BS(組a、d、g)、EV71：TLLm(組b、e、h)或EV71：TLLmv(組c、f、i)之過夜接種之(圖8A)NIH/3T3及(圖8B)Vero細胞且在光顯微鏡下使用相位對比在24hpi(組a-c)、48hpi(組d-f)及72hpi(組g-i)下觀察。所獲取影像代表兩個獨立實驗。
圖9A及9B展示在39℃下NIH/3T3及Vero細胞中之EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv之病毒適應性評價。在39℃下培育感染有EV71：BS(組a、d、g)、EV71：TLLm(組b、e、h)或EV71：TLLmv(組c、
f、i)之過夜接種之(圖9A)NIH/3T3及(圖9B)Vero細胞且在光顯微鏡下使用相位對比在24hpi(組a-c)、48hpi(組d-f)及72hpi(組g-i)下觀察。所獲取影像代表兩個獨立實驗。
圖10A-10L展示使用EV71：BS病毒RNA轉染鼠類細胞株NIH/3T3、Neuro-2A及TCMK以用於證實病毒複製。使用1000 CCID50 EV71：BS病毒(圖10A、10C及10E)感染過夜接種之NIH/3T3、Neuro-2A及TCMK細胞或使用等量病毒RNA(圖10B、10D及10F)轉染且在48hpi時收穫以用於病毒抗原檢測。在7dpi下收穫上清液中之病毒且在新鮮Vero(圖10G、10I及10K)及NIH/3T3細胞(圖10H、10J及10L)上傳代。收穫細胞且在48hpi時針對病毒抗原進行染色。
圖11A-11D展示EV71：TLLm及EV71：TLLmv之基因體中之適應性突變之VP1及VP2中之局部化。使用DeepView/SwissPDBviewer v3.7及EV71衣殼P1區域之3D結構(PDB ID 4AED)對在EV71：TLLm(圖11A及11C)及EV71：TLLmv(圖11B及11D)之VP1(圖11A及11B)及VP2(圖11C及11D)區域中所觀察之適應性突變進行建模。據觀察，突變主要局部化至所展示之蛋白質之表面暴露迴路中。
圖12展示自經EV71：BS病毒RNA轉染或感染有活病毒之細胞收穫之病毒上清液相對於Vero細胞中之效價在NIH/3T3細胞中的效價比。收穫來自使用病毒RNA轉染或感染有活病毒之NIH/3T3、Neuro-2A、Vero及TCMK之上清液且藉由Reed及Muench方法實施病毒列舉。展示在NIH/3T3細胞中測定之log(效價)相對於在Vero細胞中測定之效價之比率。3T3-TRANS：RNA轉染之NIH/3T3細胞；3T3-INF：病毒感染之NIH/3T3細胞。星號指示司徒登氏t測試(Student’s t-test)且p值<0.05。
圖13A及13B展示受感染動物之存活分析。觀察受感染動物且每天進行稱重。圖13A：展示在不同感染後天數時之死亡數之感染動物之Kaplan-Meier繪圖。圖13B：對體重變化進行繪圖以測定動物之一
般健康狀況。
圖14A-14D展示受感染動物之症狀及病況。大部分受感染動物顯示疾病症狀。圖14A：後肢(箭頭)癱瘓。圖14B：在驗屍後膨脹肺(箭頭)之肉眼解剖學。亦使用蘇木素(Hematoxylin)及曙紅(Eosin)將染色組織切片染色(圖14C(10×)及圖14D(20×))。黑色箭頭指向浸潤肺泡腔之黏液物質。
圖15A-15E展示，將病毒基因體RNA轉染至靈長類動物及齧齒類動物細胞中會得到存活病毒。圖15A：將自EV71：BS、EV71：TLLm或EV71：TLLmv提取之基因體RNA個別地轉染至Vero、NIH/3T3及Neuro-2a細胞(P0)中。收穫轉染上清液且接種於Vero或NIH/3T3細胞(P1)上以評價病毒後代之存活力。藉由致細胞病變效應(CPE)之觀察(圖15B)及病毒抗原之免疫螢光檢測(圖15C)來評價P0細胞之感染。類似地，藉由CPE誘導(圖15D)及所表現病毒抗原之免疫螢光檢測(圖15E)來評價來自EV71：BS RNA-轉染細胞之P1細胞的感染。
圖16A-16F展示，小鼠細胞適應性EV71：TLLm之衣殼-編碼區域促進了EV71：BS對小鼠細胞之生產性感染。圖16A：生成EV71：BS之全基因體之感染性cDNA純系，且使用來自EV71：TLLm衣殼之序列代替P1區域以生成嵌合病毒EV71：BS[M-P1]。圖16B：使用來自EV71：BS或EV71：BS[M-P1]之純系衍生病毒(CDV)感染細胞，且藉由溶解性致細胞病變效應(CPE)之誘導(圖16C)及病毒抗原表現(圖16D)評價感染。將上清液再接種於新鮮細胞上，且自獲得自受感染Vero之傳代(P1及P2)(圖16E)以及NIH/3T3(3T3)及Neuro-2A(N2a)細胞之傳代P1(圖16F)量測病毒效價。誤差槓指示SD。* p<0.05。
圖17A-17G展示，衣殼中之VP1-L169F胺基酸取代足以使得EV71：BS能夠進入鼠類細胞中。圖17A：藉由將VP1：K98E、E145A及L169F及VP2：S144T及K149I中之胺基酸取代納入全長EV71：BS基因體
中來生成各種突變體cDNA純系。對應於胺基酸取代之突變書寫於括號中。藉由評價溶解性致細胞病變效應(CPE)之誘導(圖17B及17C)及病毒抗原之表現(圖17D及17E)來監測純系衍生病毒(CDV)對各種細胞株之感染。測定來自受感染Vero細胞(圖17F)及NIH/3T3及Neuro-2a細胞(圖17G)之病毒效價以評價存活病毒後代之生成。誤差槓指示SD。
圖18A-18E展示，在衣殼中具有組合VP1胺基酸取代之EV71：BS病毒展現小鼠細胞之改良感染。圖18A：藉由將VP1及VP2中之胺基酸取代組合納入全長EV71：BS基因體中來生成各種突變體cDNA純系。對應於胺基酸取代之突變書寫於括號中。藉由評價致細胞病變效應(圖18B)、病毒抗原表現(圖18C)及來自受感染Vero(圖18D)及NIH/3T3(3T3)及Neuro-2a(N2A)細胞(圖18E)之病毒產量來監測純系衍生病毒(CDV)對各種細胞株之感染。未展示並無病毒產量之其他純系。誤差槓指示SD。
圖19A-19C展示，在衣殼中具有組合VP1-K98E、E145A、L169F胺基酸取代之EV71：BS病毒可在小鼠神經元細胞株Neuro-2a中穩定傳代。使純系衍生病毒在Neuro-2a及NIH/3T3細胞中傳代兩次。在每一傳代時，藉由病毒抗原表現之評價(圖19A)及在Vero細胞中量測之病毒效價(圖19B)來監測感染。誤差槓指示SD。* p<0.05；** p<0.005；*** p<0.0005。圖19C：測定代表性CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]之基因體序列以評價胺基酸取代K98E(A2734G)、E145A(A2876C)及L169F(C2947T)之證據。使用星號標記突變位點。
圖20A-20F展示，EV71：TLLmv利用SCARB2來感染靈長類動物及鼠類細胞。將固定於鐵氟龍載玻片上之NIH/3T3細胞(圖20A)及Vero細胞(圖20B)與鼠類SCARB2(mSCARB2)抗血清一起預培育會抑制EV71：TLLmv結合，如藉由減小之螢光信號所測定。使用Imaris成像軟
體量測膜上之螢光強度(n=100)。NSP(非特異性兔血清)。在接種於NIH/3T3細胞上之前將EV71：TLLmv與mSCARB2(圖20C)或人類SCARB2(hSCARB2)(圖20D)之重組可溶性蛋白質一起預培育會減小病毒感染嚴重程度，如藉由免疫螢光分析所評價。在EV71：TLLmv感染之前將活NIH/3T3細胞與hSCARB2(圖20E)或mSCARB2(圖20F)抗血清一起預培育會減小培養上清液中之病毒效價。* p<0.05；** p<0.005；*** p<0.0005。
圖21A-21D展示，將Neuro-2A細胞與鼠類SCARB2兔抗血清一起培育會減小CDV突變體感染之嚴重程度。藉由評價致細胞病變效應(CPE)之誘導(圖21A及21C)及在感染後7天時之病毒產量(圖21B及21D)來監測在使用CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F](圖21A及21B)或CDV：BS[M-P1](圖21C及21D)感染之前與兔mSCARB2抗血清一起預培育之細胞中的感染嚴重程度。誤差槓指示SD；* p<0.05；** p<0.005。 CPE程度 ：1(0-25%細胞死亡)，2(25-50%)，3(50-75%)，4(75-100%)。
圖22a-22c展示，EV71：TLLmv係三種改質病毒株中最具毒性者，如藉由1週齡BALB/c小鼠中嚴重疾病之誘導所證實。圖22a：自感染(腹膜腔內；I.P.)有EV71：BS(n=6)、EV71：TLLm(n=5)或EV71：TLLmv(n=7)之小鼠收集之血清中之中和抗體效價，如在觀察期結束時所評價。圖22b及22c：使用106 CCID50(中值細胞培養感染劑量)之EV71：BS、EV71：TLLm或EV71：TLLmv經由I.P.途徑(圖22b)或肌內(I.M.)途徑(圖22c)接種之小鼠之Kaplah-Meier存活曲線。使用t測試(對不等方差進行Welch校正)(圖22a)或Mantel-Cox時序測試(圖22b及22c)測定統計學顯著性。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005。
圖23a-23h展示，小鼠中之EV71：TLLmv感染之特徵在於類似於人類疾病譜之急性嚴重疾病。圖23a及23b：1週齡小鼠中之EV71：TLLmv
感染之劑量依賴性致死率。圖23a：經腹膜腔內注射不同劑量之EV71：TLLmv之6齡幼崽之Kaplan-Meier存活曲線。圖23b：中值人道終點(HD50)等於3.98×103 CCID50之病毒劑量。圖23c：經由腹膜腔內或肌內途徑接種EV71：TLLmv之1週齡小鼠之Kaplan-Meier存活曲線。圖23d：接種106 CCID50之病毒劑量之小鼠中由EV71：TLLmv感染誘導之年齡-及途徑依賴性致死率。圖23e及23f：在晚期疾病小鼠中所觀察之臨床體徵，其中之一些呈現為後肢(灰色箭頭)及/或前肢癱瘓。其他小鼠亦在軀幹(黑色箭頭)上展現小無毛病灶。圖23g及23h：經由腹膜腔內途徑(圖23g)或肌內途徑(圖23h)接種EV71：TLLmv之1週齡小鼠之疾病分類。
圖24a-24e展示，BALB/c小鼠中之EV71：TLLmv感染之嚴重程度取決於宿主年齡、病毒劑量及投與途徑。圖24a及24b：藉由腹膜腔內途徑(圖24a)或肌內途徑(圖24b)向8-10隻小鼠群接種106 CCID50之病毒且測定不同年齡群之動物之Kaplan-Meier存活曲線。圖24c及24d：在觀察期結束時自經由腹膜腔內途徑(圖24c)或肌內途徑(圖24d)接種之不同年齡小鼠收集之血清中之中和抗體效價；1週(對於腹膜腔內n=7；對於肌內n=4)、2週(n=5,n=7)、3週(n=4；n=8)及4週(n=4；n=6)。圖24e：自接種(腹膜腔內)不同劑量EV71：TLLmv之小鼠收集之血清中之中和抗體效價；CCID50 102(n=5)、103(n=4)、104(n=4)、105(n=5)或106(n=7)。藉由Mantel-Cox時序測試(圖24a及24b)或t測試(對不等方差進行Welch校正)(圖24c、24d及24e)測定統計學顯著性。*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005。
圖25a-25k展示種類IA小鼠中之EV71誘導之神經學肺水腫(NPE)之體徵。圖25a-25d：自模擬感染小鼠(圖25a)或呈現疾病種類IA(圖25b)、種類IB(圖25c)或種類II(圖25d)體徵之EV71：TLLmv感染小鼠獲得之肺之代表性肉眼病理學。影像展示俯視圖及側視圖。應注意，圖
25b中之肺具有顯著不完全塌陷(白色箭頭)。圖25e：自模擬感染小鼠(n=4)或呈現疾病種類IA(n=8)、種類IB(n=9)或種類II(n=4)體徵之EV71：TLLmv感染小鼠收穫之肺之濕重對比。(圖25f-25i：使用蘇木素與伊紅(H&E)染色之肺組織切片(5μm)之代表性影像。展示自模擬感染小鼠(圖25f)或呈現疾病種類IA(圖25g)、種類IB(圖25h)或種類II(圖25i)體徵之EV71：TLLmv感染小鼠獲得之肺之低-及高放大率影像。應注意，在肺泡腔中存在粉紅色蛋白質性流體(圖25g中之星號，高放大率)，其中之一些亦填充有紅血球(圖25g中之灰色箭頭，高放大率)。圖25j及25k：如在模擬感染小鼠(n=9)或呈現疾病種類IA(n=8)、種類IB(n=9)或種類II(n=3)體徵之EV71：TLLmv感染小鼠中測定之腎上腺素(adrenaline/epinephrine)(圖25j)及去甲腎上腺素(noradrenaline/norepinephrine)(圖25k)之血清含量。誤差槓指示SEM。藉由Mann-Whitney測試(圖25e)或t測試(對不等方差進行Welch校正)(圖25j及25k)測定統計學顯著性。*p<0.05,**p<0.005。
圖26a及26b展示在種類IA小鼠之肺及心臟組織中不存在病毒複製或發炎。圖26a：源自各個感染有EV71：TLLmv之小鼠群之肺組織切片(5μm)之代表性影像，該肺組織切片經蘇木素與伊紅(H&E)進行染色以用於組織病理學檢驗，或使用針對EV71抗原(EV71 IHC)之兔血清進行標記以用於病毒抗原局部化。圖26b：針對H&E及EV71 IHC進行處理之心臟組織切片(5μm)之代表性影像。
圖27a-27d展示繪示在種類IA及種類IB小鼠腦之不同區域中EV71抗原及病毒誘導之病灶之局部化及分佈的代表圖。指示小腦皮質(CTX)(圖27a、27b及27c)、下丘腦(HY)(圖27a及27b)、海馬體(HP)(圖27b及27c)、丘腦(TH)(圖27b)、中腦(MB)及腦橋(P)(圖27c)及小腦(CBX)及延髓(MY)(圖27d)。因此，標記檢測到病毒抗原及病理學病灶之區。較大斑點指示較強信號/病灶大小。自brainstars.org1且在
Creative Commons of Japan下下載模板影像。自交互性小鼠腦部地圖(http colon slash slash mouse dot brain-map dot org slash static slash atlas)[113]獲得腦組織冠狀切片圖。
圖28a-28n展示，小鼠中之EV71：TLLmv感染與神經組織破壞及深度病毒複製有關。圖28a-281：使用蘇木素及伊紅(H&E)染色或使用針對EV71抗原之兔血清(EV71 IHC)免疫染色之腦組織切片(5μm)之代表性影像。切片係源自呈現疾病種類IA(左組圖)或種類IB(右組圖)之體徵之小鼠。腦中之病理學病灶包含水腫(虛線框)、浸潤細胞(圖28k中左組圖之左上四分之一中之對角線區及右下四分之一中之對角線區)、噬神經細胞作用(在圖28a-28c之左組圖中)、神經退化(黑色星號)及浦肯野細胞(Purkinje cell)退化(灰色星號)。(圖28m及28n：來自疾病種類IA(圖28m)或種類IB(圖28n)小鼠之脊髓冠狀切片之代表圖。突出顯示檢測到病毒抗原及病理學病灶之區。較大斑點大小指示較大深度信號/病灶。V，腹部側；D，背部側。
圖29a-29c展示種類IA小鼠之後腦之其他區中之EV71抗原及病毒誘導之病灶。圖29a：使用蘇木素及伊紅(H&E)(用於組織病理學檢驗)或針對EV71抗原之兔血清(EV71 IHC)(用於病毒抗原局部化)染色之齒狀核之代表性影像。在插圖中放大展示加框區。圖29b：來自種類I小鼠之尾部腦幹之代表性影像。影像繪示小腦皮質(CBX)及延髓(MY)。亦標記最後區(AP；星號)及孤束核(NTS；虛線圓)以用於參照。指示檢測到病毒抗原及病理學病灶之區。較大斑點代表較強信號/病灶大小。自brainstars.org1下載模板影像且在Creative Commons of Japan下獲得許可。自小鼠腦地圖(http colon slash slash mouse dot .brain-map dot org slash static slash atlas)[113]獲得腦組織冠狀切片圖。圖29c：來自種類IA小鼠之髓質之繪示AP及NTS中之H&E及EV71 IHC染色圖案的代表性影像。
圖30a-30f展示來自模擬感染小鼠(健康對照)之神經組織之組織學切片。使用蘇木素與伊紅(H&E)(用於組織病理學檢驗)或針對EV71抗原之兔血清(EV71IHC)(用於病毒抗原局部化)染色之正常小鼠組織切片(5μm)之代表性影像。腦切片展示海馬體中之CA3椎體神經元(圖30a)、下丘腦(圖30b)及丘腦(圖30c)中之網狀神經元、導水管周圍灰質中之神經元(圖30d)、小腦皮質中之浦肯野細胞層(圖30e)。應注意正常浦肯野細胞形態(圖30e之左組圖中之黑色星號)及延髓中之網狀神經元(圖30f)。
圖31a-31e展示其他神經組織中之EV71：TLLmv誘導之病理學及病毒抗原分佈。使用蘇木素與伊紅(H&E)(用於組織病理學檢驗)或針對EV71抗原之兔血清(用於免疫組織化學分析)(EV71 IHC)染色之小鼠組織切片(5μm)之代表性影像。自EV71：TLLmv感染或模擬感染小鼠獲得腦組織。腦冠狀切片繪示運動皮質椎體神經元(圖31a)、腦橋灰色神經元(圖31b)及來自頸椎(圖31c)、胸椎(圖31d)及腰椎(圖31e)之脊髓冠狀切片。應注意運動皮質中之顯著細胞浸潤(圖31a中之左組圖之右下四分之一)及神經元壞死(圖31a之第二組圖中之黑色星號)。在各別插圖中放大展示圖31c-31e中之加框區。
本發明係關於腸病毒71(EV71)、動物模式之研發及候選抗EV71化合物之篩選。更具體而言，本發明係關於如下發現：適於感染齧齒類動物細胞株之腸病毒71(EV71)病毒株，或在VP1中含有會致使免疫功能健全齧齒類動物及免疫功能受損性齧齒類動物疾病之突變的經選殖衍生病毒。該等EV71病毒株有時在本文中稱為改質腸病毒71。
另外，本發明係關於藉由使BALB/c小鼠感染適於感染NIH/3T3小鼠纖維母細胞之改質病毒株(例如EV71：TLLmv)來研發EV71誘導之神經學疾病之臨床真實模式。使用此方式，改質EV71用於在小鼠中誘
導與神經學肺水腫有關之急性腦脊髓炎，其特徵在於肺腫脹及與模擬受感染肺相比器官重量有所增加。儘管不存在肺或心臟組織發炎、灶性出血及肺泡中之蛋白質性流體，但觀察到兒茶酚胺之高血清含量及腦幹、尤其延髓中之深度組織損害。該等數據顯示，該模式準確地再現人類EV71誘導之神經學肺水腫之體徵及症狀。
因此，在一態樣中，本發明係關於包括感染有能夠感染齧齒類動物之腸病毒71(有時在本文中稱為改質腸病毒71)之齧齒類動物之動物模式。在一實施例中，此一腸病毒71係齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71。在另一實施例中，此一腸病毒71係在VP1中含有突變之純系衍生病毒(CDV)。在一些實施例中，VP1中之突變使得CDV能夠使用齧齒類動物SCARB2蛋白質來感染齧齒類動物細胞。在一實施例中，齧齒類動物係免疫功能健全齧齒類動物。在另一實施例中，齧齒類動物係免疫功能受損性齧齒類動物。適於用作模式之動物較佳係哺乳動物，最佳地係便利之實驗室動物，例如兔、大鼠、小鼠及諸如此類。在一實施例中，動物係小鼠。在另一實施例中，齧齒類動物細胞株係小鼠細胞株。在另一實施例中，小鼠細胞株係小鼠NIH/3T3細胞株。在另一實施例中，小鼠細胞株係小鼠Neuro-2a細胞株。在一實施例中，齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71係EV71：TLLm。在另一實施例中，齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71係EV71：TLLmv。在一實施例中，在VP1中含有突變之純系衍生病毒係CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]。該動物模式可用於研究病毒及人類疾病譜在動物模式中之全身性傳播。該動物模式亦可用於篩選抗病毒藥物及疫苗。
視需要製備動物模式。製備齧齒類動物細胞株適應性EV71病毒株之大量標準化原料，滴定且保持於深度冷凍器(-80℃)中。使「標準化」(基於統計學計算)數量之齧齒類動物(例如BALB/c小鼠或NSG
小鼠)感染標準化效價之病毒株以產生動物模式。本發明動物模式在感染後發生神經學症狀(類似於彼等可在人類中發生者)。如本文中所展示，改質腸病毒71(例如齧齒類動物細胞株適應性EV71病毒株)影響腦及小鼠中所顯現之各種神經學疾病。
在一些實施例中，齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71係EV71：TLLm。EV71：TLLm係衍生於人類EV71 BS病毒株在NIH/3T3小鼠細胞株中連續傳代最少60個循環後。在一實施例中，將EV71：TLLm在2015年1月12日在布達佩斯條約(Budapest Treaty)之條款下寄存於位於中國武漢430072之武漢大學之中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection)處且給予寄存號碼CCTCC V201437。在另一實施例中，若使用病毒RNA序列(基因庫登錄號：KF514879；SEQ ID NO：1)合成病毒RNA，則可使用高等反向基因學回收EV71：TLLm。用於高等反向基因學之技術在業內已眾所周知[84-87]。
在另一實施例中，齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71係EV71：TLLmv。EV71：TLLmv係源自EV71：TLLm在NIH/3T3小鼠細胞株中再進行40個循環之另一傳代。在一實施例中，將EV71：TLLmv在2015年1月12日在布達佩斯條約之條款下寄存於位於中國武漢430072之武漢大學之中國典型培養物保藏中心出且給予寄存號碼CCTCC V201438。在另一實施例中，若使用病毒RNA序列(基因庫登錄號：KF514880；SEQ ID NO：2)合成病毒RNA，則可使用高等反向基因學回收EV71：TLLmv。用於高等反向基因學之技術在業內已眾所周知。
在另一實施例中，改質腸病毒71係在衣殼蛋白VP1中具有突變之純系衍生病毒(CDV)，該圖標使得改質腸病毒71能夠使用齧齒類動物SCARB2蛋白質來感染齧齒類動物細胞。藉由使用熟習此項技術者已知或如本文所闡述之技術製備全長基因體cDNA純系來製備在VP1中具有突變之改質腸病毒71。使用定點誘變或CRISPR技術來製備腸病
毒71之VP1或其他蛋白質中之突變(例如參見PCT公開案第WO2014/127287號)。自cDNA純系使用熟習此項技術者已知或如本文所闡述之技術來製備活病毒(純系衍生病毒(CDV))。然後測試具有不同突變或突變集合之CDV感染齧齒類動物細胞之能力。另一選擇為，然後測試具有不同突變或突變集合之CDV結合齧齒類動物SCARB2蛋白質之能力以作為初始篩選。可使用任一適宜腸病毒71病毒株來產生在VP1中具有突變之CDV。突變數及具體突變可針對每一病毒株有所變化以產生足以在靶齧齒類動物細胞中產生深度感染之CDV。因此，可產生多種可感染若干、許多或所有類型之齧齒類動物(例如小鼠)細胞株之齧齒類動物有毒EV71病毒株。在一實施例中，用於產生在VP1中具有突變之CDV之EV71病毒株係腸病毒71 BS病毒株。在一實施例中，改質腸病毒71係CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]。
在另一態樣中，本發明提供使用在人類中所觀察之全譜之EV71誘導之神經學感染、疾病及病況來製備動物模式的方法。在一些實施例中，該方法包括使用本文所闡述之改質腸病毒71感染本文所闡述之齧齒類動物且將受感染齧齒類動物飼養長達約4週。在一實施例中，改質腸病毒71係EV71：TLLmv。在另一實施例中，改質腸病毒71係EV71：TLLm。在另一實施例中，改質腸病毒71係CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]。在一些實施例中，擬感染之齧齒類動物之年齡介於約1週與約4週之間。在其他實施例中，擬感染齧齒類動物之年齡介於約1週與約3週之間。在其他實施例中，擬感染齧齒類動物之年齡介於約1週與約2週之間。在一實施例中，擬感染齧齒類動物之年齡約為1週。在另一實施例中，擬感染齧齒類動物之年齡約為2週。在另一實施例中，擬感染齧齒類動物之年齡約為3週。在一些實施例中，將感染齧齒類動物飼養約1週至約4週。在其他實施例中，將感染齧齒類動物飼養約1週至約3週。在其他實施例中，將感染齧齒類
動物飼養約1週至約2週。在一實施例中，將感染齧齒類動物飼養約1週。在另一實施例中，將感染齧齒類動物飼養約2週。在另一實施例中，將感染齧齒類動物飼養約3週。在另一實施例中，將感染齧齒類動物飼養約4週。在一些實施例中，齧齒類動物係免疫功能健全齧齒類動物。在一些實施例中，齧齒類動物係本文所闡述之小鼠。在一實施例中，免疫功能健全小鼠係BALB/c小鼠。在一些實施例中，齧齒類動物係免疫功能受損性齧齒類動物。在一些實施例中，齧齒類動物係本文所闡述之小鼠。在一實施例中，免疫功能受損性小鼠係NSG小鼠。在其他實施例中，藉由向齧齒類動物接種改質腸病毒71來感染齧齒類動物。在一實施例中，接種係腹膜腔內(I.P.)接種。在另一實施例中，接種係肌內(I.M.)接種。在一些實施例中，接種至齧齒類動物中之病毒劑量係介於約103與約107之間之中值細胞培養感染劑量(CCID50)。在其他實施例中，接種至齧齒類動物中之病毒劑量係介於約103與約106之間之CCID50。在一實施例中，接種至齧齒類動物中之病毒劑量係介於約4×103與約106之間之CCID50。在另一實施例中，接種至齧齒類動物中之病毒劑量係介於約104與約106之間之CCID50。在另一實施例中，接種至齧齒類動物中之病毒劑量係介於約105與約106之間之CCID50。在一實施例中，接種至齧齒類動物中之病毒劑量係約106之CCID50。
以此方式製得之動物模式係展現表面效度之EV71神經感染之真實小鼠模式，亦即，該等動物顯示可在人類患者中由EV71感染誘導之全譜神經學疾病(包含NPE)所觀察之全部範圍臨床體徵。此動物模式亦顯示關於疾病之肉眼及組織病理學特徵(其極其類似於彼等報導於致命人類病例中者)之建構效度。此新活體內模式代表用於鑑別EV71神經病發病機制中之關鍵事件、用於剖析EV71誘導之NPE之機制、研發新穎治療方式及潛在抗病毒療法及用於實施新穎疫苗之臨床前評估之有效工具。
在另一態樣中，本發明提供篩選抗病毒藥物之方法。根據此態樣，該方法包括下列步驟：提供動物測試群及動物對照群，其中每一
群之動物係本文所闡述動物模式之動物；向測試群投與抗病毒藥物候選物；監測測試群及對照群中之疾病進展；比較測試群中之疾病進展與對照群中之疾病進展；及選擇相對於對照群減小測試群中之疾病進展之抗病毒藥物候選物。在一實施例中，在動物中篩選之前，首先在感染有齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71之測試齧齒類動物細胞株中篩選抗病毒藥物。在另一實施例中，在動物中篩選之前，首先在感染有在VP1中含有突變之純系衍生病毒(CDV)之測試齧齒類動物細胞株中篩選抗病毒藥物。
在另一態樣中，本發明提供篩選有效抗病毒疫苗之方法。根據此態樣，該方法包括下列步驟：提供動物測試群及動物對照群，其中每一群之動物係本文所闡述之動物模式之動物；向測試群投與候選抗病毒疫苗；監測測試群及對照群中之疾病進展；比較測試群中之疾病進展與對照群中之疾病進展；及選擇相對於對照群減小測試群中之疾病進展之候選抗病毒疫苗。在一實施例中，在動物中篩選之前，首先在感染有齧齒類動物細胞株適應性腸病毒71之測試齧齒類動物細胞株中篩選候選抗病毒疫苗。在另一實施例中，在動物中篩選之前，首先在感染有在VP1中含有突變之純系衍生病毒(CDV)之測試齧齒類動物細胞株中篩選候選抗病毒疫苗。
根據本發明方法，製備齧齒類動物細胞株適應性EV71病毒株之大量標準化原料，滴定且保持於深度冷凍器(-80℃)中。另一選擇為，製備在VP1病毒株中含有突變之純系衍生病毒(CDV)之大量標準化原料，滴定且保持於深度冷凍器(-80℃)中。使「標準化」(基於統計學計算)數量之動物(例如BALB/c小鼠或NSG小鼠)感染標準化效價之病毒株。將候選抗病毒藥物或抗病毒疫苗以不同標準化劑量在出現病況之前(用於分析預防性效應)或在病況發作時(用於分析藥物之治療性效應)投與受感染齧齒類動物。在一實施例中，使用易受齧齒類
動物細胞株適應性EV71病毒株之溶細胞性感染影響之組織培養細胞株(例如彼等闡述於本文中者，包含彼等闡述於實例中者)實施抗EV71化合物之高通量活體外篩選。在另一實施例中，使用易受在VP1病毒株中含有突變之純系衍生病毒(CDV)之溶細胞性感染影響之組織培養細胞株(例如彼等闡述於本文、包含實例中者)實施抗EV71化合物之高通量活體外篩選。使用業內熟知之技術實施活體外篩選。然後在活體內於本文所闡述之動物模式中篩選來自活體外篩選之所選有前景化合物。
如實例2-8中所展示，人類EV71分離物(EV71：BS)之連續傳代生成能夠感染活體外培養之齧齒類動物細胞株之病毒株。使用源自NIH/Swiss小鼠胚胎[46]之小鼠黏附纖維母細胞細胞株NIH/3T3適應人類EV71病毒株以感染齧齒類動物細胞。闡述兩種該NIH/3T3適應性病毒株-EV71：TLLm及EV71：TLLmv，其中EV71：TLLm代表適應過程之早期(傳代數：60)且EV71：TLLmv代表晚期(傳代數：100)。基於病毒誘導之CPE之出現、高效價值之量測及病毒抗原之陽性檢測(經由免疫染色)，將細胞中之病毒誘導之感染分類為生產性或非生產性。生產性感染展現陽性病毒抗原檢測以及高病毒效價，不論是否觀察到CPE。另一方面，非生產性感染之特徵在於在截止分析限值下之不可量測病毒效價，不論病毒抗原檢測及/或CPE之觀察如何。
儘管臨床分離物EV71：BS僅感染靈長類動物細胞株，但EV71：TLLm生產性感染靈長類動物及齧齒類動物細胞株。值得注意的是，儘管EV71：TLLm病毒已成功地達成感染齧齒類動物細胞之能力，對NIH/3T3細胞之適應程度較不明顯。使用Vero細胞測得之病毒效價遠高於在NIH/3T3細胞中所測得者，如藉由相對複製率(RRR)分析中之負值所指示(圖5C及5D)。另外，EV71：TLLm成功地感染Vero細胞，從而在不同培育溫度下產生全CPE，而其在受感染NIH/3T3中僅可在
37℃下達成全CPE(表1)。在獲得EV71：TLLmv病毒之小鼠細胞中進一步適應會產生對小鼠細胞顯示較高適應程度之病毒株(圖5B)，但此係以縮小容許宿主細胞之範圍為代價。EV71：TLLmv並不如針對小鼠細胞一般有效地感染靈長類動物細胞株，但其展現產生在較寬溫度範圍下培育之NIH/3T3細胞之全CPE之成功感染(表1)。然而，與前身EV71：TLLm相比，EV71：TLLmv似乎喪失了進入猴腎COS-7細胞以及人類HeLa及Hep-2細胞中且加以複製之能力(圖3B-3C；圖2B-2C、2E-2F及2H-2I)。其亦喪失了在倉鼠CHO-K1及大鼠NRK細胞內有效複製之能力(圖3B-3D；圖2K-2L及2N-2O)。該等觀察指示，病毒在NIH/3T3細胞中之另一傳代會增加在小鼠細胞中之適應程度且代價為損失在其他來源細胞株中之感染能力。
儘管不可能指出何種胺基酸取代適用於小鼠NIH/3T3宿主細胞，但病毒全基因體測序可闡明潛在適應性機制。所鑑別之大部分胺基酸取代位於P1(衣殼)及RNA聚合酶(3D區域)蛋白質中(表2、3)，從而表明在宿主細胞進入及複製中具有可能改變之病毒蛋白活性。P1區域中之突變累積預計係來自EV71：TLLm及EV71：TLLmv病毒株感染新宿主細胞之所獲取能力。衣殼蛋白形成與病毒一起經由病毒受體(其最近鑑別為清除劑受體種類B成員2(SCARB2)[47]且日後描述為EV71[48]之主要病毒脫殼受體，且亦用於人類腸病毒A(HEV-A)物種之一些成員)引發與允許宿主細胞之相互作用之結構環境。人類SCARB2蛋白質與其他靈長類動物共有大約99%之序列一致性。另一方面，小鼠SCARB2蛋白質與靈長類動物蛋白質[49]相比展現15%序列相異性，從而暗示與靈長類動物SCARB2具有顯著結構差異且或許促進齧齒類動物細胞對原始EV71感染之不順從性。似乎可能的是，病毒衣殼中之適應性突變可致使病毒勝任於結合小鼠細胞受體且使得新穎宿主成功地進入及感染。
衣殼蛋白突變之映射指示，病毒P1區域中之大部分所鑑別胺基酸取代位於蛋白質之暴露區域中(圖11A-11D)，具體而言位於VP1表面之B-C、D-E、E-F及G-H迴路中。VP1殘基150-180具有接合SCARB2蛋白質之病毒衣殼峽穀。定中心於Gln-172處之此區域含有位於胺基酸163-177處之較大VP1中和表位[32]。EV71：TLLm及EV71：TLLmv皆在VP1峽穀之E-F迴路中展現取代E167D及L169F(圖11A-11B)，其基因座先前尚未報導。靠近SCARB2停泊位點之其他顯著胺基酸取代包含B-C迴路內中之N104D及G-H迴路中之S241L，其位於距Gln-172 20Å半徑內。先前已報導，與K244E有關之VP1 S241L突變係源於CHO細胞株適應性EV71之小鼠傳代[50]。發現此突變與VP2 K149I之組合與5天小鼠幼崽中之無毒表型有關。然而，據報導，VP1 241處自Leu至Ser之回復突變係源於NOD/SCID小鼠腦組織中之適應且發現與小鼠有毒表型有關。VP1 E145A突變(其遠離SCARB2停泊位點且位於D-E迴路中)係用於賦予感染鼠類細胞之能力之另一候選者。先前已報導VP1 145突變[34、37]且單一E145A突變在NOD/SCID小鼠中產生毒性[51]。C4基因型EV71之VP1中之另一突變Q145E與5天齡小鼠中之毒性有關[52]。VP2中之小鼠細胞適應性突變、尤其彼等位於殘基136-150之中和表位內者[53]亦可有助於感染齧齒類動物細胞之病毒能力。在EV71：TLLm中觀察到VP2 E-F迴路中之兩種取代(圖11C)，而在EV71：TLLmv中存在三種取代(圖11D)。先前並未闡述該等突變，但E-F迴路中VP2 149處之附近基因座已在文獻中提及[34、50、54]且闡述為PSGL-1過表現細胞中傳代之適應性突變[55]。
為探究P1區域突變在結合用於宿主細胞進入之病毒受體中之可能作用，將EV71：BS病毒RNA轉染至鼠類細胞中。將EV71：BS RNA直接引入小鼠細胞細胞質中會在NIH/3T3細胞中產生生產性感染，如藉由如在Vero細胞中所分析在培養上清液中所觀察之病毒誘導之CPE及
可量測病毒效價所表明(圖12)。然而，將病毒上清液再接種於新鮮NIH/3T3細胞上不能誘導生產性感染(圖6A)且未檢測到病毒抗原(圖S4H)。類似地，將EV71：BS RNA轉染至Neuro-2A細胞中(而非直接病毒感染)產生Neuro-2A細胞中之陽性抗原染色(圖10C及10D)及可量測病毒效價(圖12)。在新鮮Vero及NIH/3T3細胞上傳代之病毒上清液在Vero中產生陽性抗原染色(圖10I)，但在NIH/3T3細胞中不能(圖10J)。該等數據指示，避免需要用於宿主細胞進入之受體接合會產生成功感染且在NIH3T3及Neuro-2A細胞中產生病毒後代。該等數據亦證實，人類EV71：BS不能成功地經由鼠類細胞受體進入小鼠NIH/3T3及Neuro-2A細胞中。此外，該等數據表明，EV71：TLLm及EV71：TLLmv基因體之P1區內之突變賦予病毒有效受體接合及由此宿主細胞進入之能力。
亦在P2及P3區域中觀察到若干胺基酸突變，其編碼對於宿主細胞蛋白質轉譯結構中之病毒複製及劫持至關重要之病毒蛋白[56]。該等適應性突變可用於最佳化小鼠細胞內之EV71基因體複製及轉譯。單獨之病毒3D蛋白質在EV71：TLLmv中累計具有8種胺基酸取代且在EV71：TLLm中累計具有4種胺基酸取代，且兩種病毒株各自在3B中展現1種突變且各自在3C中展現2種突變。將病毒RNA直接接種至TCMK細胞中可解釋病毒之非結構蛋白質中之適應性突變之可能作用。儘管TCMK細胞已展示可允許進行EV71：TLLm及EV71：TLLmv感染(圖3B及3D；圖4Q及4R)，但將EV71：BS病毒RNA轉染至TCMK細胞中並不產生成功感染。在受感染細胞及轉染細胞中並未檢測到病毒抗原信號(圖10E-10F)，且病毒上清液在新鮮NIH/3T3及Vero細胞上之傳代並不產生陽性病毒抗原檢測(圖10K及10L)。此外，在受感染細胞及轉染細胞中並無可分析病毒效價(圖12)。該等數據表明，除衣殼區中之突變外，需要P2及P3區域內之突變(其係發現於EV71：TLLm及EV71：TLLmv
中)來成功地感染TCMK細胞。
據信，此係首次報導最初源於人類臨床試樣且成功地獲得在小鼠細胞株中連續傳代後生產性感染若干齧齒類動物細胞株之能力之EV71病毒株。在RNA複製期間之相對較高突變率產生用作用於未來適應可能之表型特徵基因庫的變體基因體，且由此以準種分佈形式進行複製[57、58]會產生RNA病毒基因體之動態可塑性，從而賦予變化環境之適應性[59、60]。儘管先前已報導感染乳鼠[34、37、38、51]及其他齧齒類動物(例如沙鼠)[39]之EV71，但尚未報導生產性感染活體外培養之齧齒類動物細胞。此情形可能係由於與表型及宿主範圍[58]之重大變化有關之高基因障壁。有趣的是，此係首次報導EV71之共有全基因體序列內之大量適應性突變。儘管先前記載之小鼠適應性EV71報導在基因體中具有小於10個胺基酸取代[34、38、51]，但據報導，在EV71：TLLm中具有21個胺基酸取代且在EV71：TLLmv中具有36個胺基酸取代，其遠大於先前所鑑別適應性突變之最大數量[37]。該等情形表明，小鼠組織中病毒之較少傳代[34、36、37]可能不足以打破基因障壁且成功地適應病毒以感染所培養小鼠細胞。而是，可能需要成百之連續傳代，如在此研究中所觀察。
最近使用以下證據來闡釋EV71之宿主細胞限制：EV71利用清除劑受體種類B成員-2(SCARB2)作為其用於宿主細胞進入[47]及胞內體中之病毒脫殼[72]之功能受體。人類及鼠類SCARB2蛋白質僅展現84%胺基酸序列一致性[67]，從而表明兩種蛋白質之間具有結構差異。此論述可闡釋，EV71臨床分離物一般不能感染小鼠源細胞，且一般抵抗小鼠及其他齧齒類動物獲得EV71實驗感染，此使得研發EV71感染之小動物模式之工作更加複雜。儘管具有此病毒-受體不相容性，然而，已展示，在經由病毒RNA轉染至細胞中來繞開初始感染階段(亦即受體調介之細胞進入)時，一些鼠類細胞支持EV71感染。
EV71：BS並不感染Neuro-2a及NIH/3T3細胞[71]，但病毒基因體RNA之轉染使得可表現EV71蛋白質，誘導溶解性致細胞病變效應(CPE)，且產生存活病毒後代。類似地，活病毒先前已在將脊髓灰白質炎病毒RNA轉染至哺乳動物細胞中後生成[73-75]，但所用細胞(HeLa)已知允許進行脊髓灰白質炎病毒感染。在實驗中，非允許小鼠神經元Neuro-2a及纖維母細胞NIH/3T3細胞顯示支持病毒複製且在將EV71：BS RNA轉染至細胞質中後生成活病毒後代，從而表明鼠類細胞之內部環境含有EV71感染所需之宿主因子且支持完成病毒感染循環，且EV71蛋白質在鼠類胞質溶膠中具有功能性。該等發現亦暗示，在病毒接種後不存在NIH/3T3及Neuro-2a細胞感染可能係由於受體調介之宿主細胞進入及脫殼(其主要係衣殼蛋白之功能)之缺陷。該等結果類似於先前觀察(上文或[71])且使得可假設EV71：BS衣殼蛋白中之某些胺基酸取代可使得其能夠結合其受體，由此產生病毒進入及脫殼，且隨後感染小鼠細胞。兩種獨特工具-小鼠細胞株(NIH/3T3)適應性EV71病毒株(EV71：TLLm及EV71：TLLmv)及兩種小鼠細胞株(Neuro-2a及NIH/3T3)提供探究此假設之機會。
展現EV71：TLLm衣殼蛋白但表現EV71：BS非結構蛋白質(CDV：BS[M-P1])之嵌合純系衍生病毒之感染表型證實，「小鼠細胞進入表型」可由源自小鼠細胞株適應性EV71病毒株之衣殼蛋白賦予。該等嵌合CDV之行為類似於小鼠細胞適應性EV71病毒株且在Vero以及NIH/3T3及Neuro-2a細胞中誘導生產性感染，且具有完成病毒感染循環(亦即生成存活病毒後代)之直接證據。此外，在EV71：BS VP1中引入胺基酸取代K98E、E145A及L169F且在VP2中引入S144T及K149I之誘變產生鼠類細胞之有限感染。僅具有EV71：TLLm P1區域代替之CDV(CDV：BS[M-P1])及具有組合胺基酸取代VP1-K98E/E145A/L169F之CDV(CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F])可成功地
在Neuro-2a及NIH/3T3細胞中傳代以在所得培養上清液中產生存活病毒後代。含有其他胺基酸取代(個別地或以各種組合)之其餘CDV展現在鼠類細胞中之有限進入(產生一個複製循環)，如藉由觀察到CPE及在接種細胞中檢測到病毒抗原所證實。活病毒後代不存在於受感染細胞培養上清液中，此乃因其在健康小鼠細胞上之再接種不能誘導感染。尚不清楚導致不能在感染有該等CDV之細胞培養上清液中產生存活病毒後代之原因，但一種可能為在突變後所得衣殼之結構不穩定性。據推測，所引入胺基酸可能與構成蛋白質之其他胺基酸不相容，由此影響整個衣殼蛋白摺疊且改變衣殼結構。此假設強調衣殼蛋白組裝之複雜性，其中4種病毒蛋白(VP1-4)協同性地相互作用以生成功能衣殼。因此，可使得病毒能夠結合新受體之胺基酸取代亦可具有災難性後果，尤其在其不注意地去穩定衣殼複合物(因與蛋白質中之其他胺基酸殘基不相容)時。
實例10-17中所展示之結果揭示，需要三種VP1取代：K98E、E145A及L169F且其足以結合其在小鼠細胞上之受體且使得能夠達成EV71進入。儘管先前尚未在文獻中提及VP1-169殘基，但先前涉及VP1-98及VP1-145殘基作為用於結合白血球上之人類PSGL-1受體蛋白質之標記物[76]。基因庫中所公開EV71臨床分離物之1,702 VP1序列之分析證實了突變體組合VP1 98E/145A(其僅出現於5種分離物中(資料庫之0.3%))之存活力(縱然稀有)。另一方面，在EV71 VP1序列之審查資料庫中並未觀察到VP1-169F變體，從而證實其極度稀有。CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]可在Neuro-2a細胞上穩定傳代且持續產生活病毒後代，同時保留引入病毒基因體中之突變三個傳代，從而表明此病毒至少在Neuro-2a細胞中係存活且穩定的。因此，將該三個殘基：VP1 98E、145A及169F引入其他EV71臨床分離物中可使得能夠感染鼠類細胞，但此有待證實。
類似於在先前發現EV71利用清除劑受體種類B成員-2(SCARB2)蛋白質作為其用於胞質溶膠中之宿主細胞進入及脫殼之受體[47、72、77]，數據亦顯示，小鼠細胞適應性EV71：TLLmv利用小鼠SCARB2(mSCARB2)來感染鼠類細胞。病毒直接在活體外結合重組可溶性mSCARB2，且將活病毒與蛋白質一起在接種於健康細胞上之前預培育會減小細胞感染之嚴重程度。此外，藉由結合針對mSCARB2之多株抗體來阻斷宿主細胞上mSCARB2之自由表面會減小固定細胞上之病毒結合且抑制活細胞的感染。結果亦展現EV71：TLLmv結合至人類SCARB2(hSCARB2)蛋白質(病毒使用其來感染靈長類動物細胞)。EV71：TLLmv對靈長類動物細胞之結合及感染亦藉由針對hSCARB2之抗體阻斷。儘管本文所呈現之數據僅展示EV71：TLLmv，但結果亦擴展至EV71：TLLm。EV71：TLLmv係源自EV71：TLLm在NIH/3T3c細胞中之另一傳代，且在兩種小鼠細胞株適應性EV71病毒株之間僅觀察到較少胺基酸取代。因此，該等情況指示，EV71：TLLm及EV71：TLLmv利用細胞mSCARB2來感染齧齒類動物細胞。
類似地，CDV：BS[M-P1]及CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]利用mSCARB2來感染鼠類細胞。將Neuro-2a細胞與mSCARB2抗血清一起預培育會阻斷病毒之細胞感染，一如由與對照相比減小之CPE誘導及較低病毒效價所證實。最新數據展示，SCARB2結合至EV71峽穀會觸發「口袋因子」(衣殼峽穀內穩定化成熟病毒體且假設為EV71中之神經鞘胺醇之脂質[78])之釋放，從而引起以下一系列事件：病毒脫殼：衣殼擴展(以形成135-S或A-顆粒)、VP1N-末端及VP4自5倍軸衣殼接點擠壓至胞內體膜中及病毒基因體RNA釋放至宿主細胞細胞質中[78-81]。最新人類SCARB2晶體結構數據亦揭示跨越整個蛋白質之脂質隧道[67]，其在將β-葡糖腦苷脂酶遞送至溶酶體中之SCARB2功能之背景中並無相關性，但Dang等人[72]提出其用作用於在SCARB2結合期
間去除及輸送來自衣殼峽穀之神經鞘胺醇之導管。SCARB2胺基酸殘基140-151(其序列在人類蛋白質與鼠類蛋白質之間極為不同)係用於EV71之主要結合位點[49]。此相同區域用作控制SCARB2脂質隧道之打開及閉合(在病毒脫殼期間由酸性pH觸發之事件)之閘。VP1-169殘基係位於衣殼峽穀內，且很可能直接用於SCARB2結合。在此位置中自白胺酸至苯丙胺酸之劇烈變化會改變峽穀結構，從而使得與鼠類SCARB2蛋白質更佳配合。另一方面，VP1 98及145殘基係位於環繞衣殼峽穀之邊緣中且除SCARB2結合外具有另一功能。該等情形僅係假設，且需要解析鼠類SCARB2蛋白質之結構且比對與病毒衣殼之相互作用以闡明三種VP1胺基酸取代可賦予「小鼠細胞進入表型」之確切機制。
據信，此係誘導生產性感染天然非允許鼠類細胞之EV71衣殼定點突變之首次科學探究。先前研究嘗試經由選擇性病毒適應(如在活動物中傳代以生成具有小鼠中改良感染特徵之突變體之情形下[34、37、38、82])或細胞改變(藉由異位表現人類SCARB2蛋白質[47、69、70、83])來克服病毒宿主限制。EV71與鼠類SCARB2之不相容性通常會引起小鼠對EV71感染之抗性，由此阻礙了EV71感染之小鼠模式之研發。此很可能亦闡釋使用野生型或小鼠適應性病毒株之EV71感染之大部分小鼠模式為何不能概述嚴重人類感染中所觀察之疾病譜[34、37、38]。另一方面，表現人類SCARB2之轉基因小鼠展現較廣泛EV71感染之特徵且無需病毒之小鼠適應，但全譜人類疾病仍不能清楚地再現[69、70]。本文證實，EV71中之某些胺基酸取代使得其能夠感染鼠類細胞，此提供了理解使得小鼠細胞株適應性EV71：TLLm及EV71：TLLmv能夠有效地感染所培養齧齒類動物細胞之分子機制之第一步驟。另外，其可提供另一生成EV71感染之小鼠模式之方式以研究詳細發病機制且再現在人類感染中所看到之全譜神經學疾病。
在實例22-25中首次顯示，接種小鼠細胞適應性腸病毒71(EV71)之幼小BALB/c小鼠展現與神經學肺水腫(NPE)有關且極其類似於在受感染人類患者中所觀察之病況之急性腦脊髓炎。使用適應性病毒株EV71：TLLmv攻擊之動物在腦之椎體及椎體外區域中顯示不同程度之病毒誘導之組織損害，其呈現為癱瘓、共濟失調及顫抖且與在EV71感染之致命病例中所鑑別之CNS局部化病況一致[91-95]。此外，一些小鼠顯示與自主神經功能障礙一致之呼吸性窘迫。基於在安樂死時之疾病呈現，動物可易於分成4組：種類IA、種類IB、種類II及存活者。儘管存活者並不呈現疾病體徵，但種類II中之小鼠展現持續性鬆弛性癱瘓及嚴重體重損失，而種類IA及種類IB小鼠另外患有通常在3-7DPI內死亡之急性神經學疾病。種類IA小鼠亦展現並非由鬱血性心力衰竭或肺炎所致之特定嚴重呼吸性窘迫。而是，種類IA中之動物在尾部腦幹、尤其髓質中展現深度組織損害且展現高血清含量之兒茶酚胺，此強烈表明該等小鼠中所觀察之呼吸體徵係神經學肺水腫(NPE)之結果。來自種類IA小鼠之肺與彼等來自其他組者之肉眼病理學對比揭示在驗屍時具有不完整肺塌陷以及顯著增加之肺濕重，此很可能係源於肺泡腔中之出血及流體洩漏。該等特徵極其類似於彼等在非病毒誘導之NPE之實驗動物模式及具有爆發性NPE之致命人類病例中所觀察者[96、97]。實際上，種類IA動物之組織病理學分析另外揭示肺泡腔中填充有蛋白質性及紅血球填充滲出液之病灶區，此與致命人類病例中之觀察一致[21、98-100]。
肺水腫(PE)通常定義為肺中水含量之血管外增加(48)且可基於心臟學或神經性來源進行再分。因種類IA小鼠心臟組織展現正常組織學且缺乏疾病之明顯體徵，故能夠排除心臟學PE，且在肺薄壁組織中不存在病毒複製或發炎可排除病毒誘導之直接組織傷害。而是，在種類IA小鼠中檢測到兒茶酚胺之高血清含量，從而強烈指示此展現神經
學PE(NPE)，此先前已證實係由藉由嚴重交感神經放電誘導之兒茶酚胺風暴所致[96、101]。在此情況下，自主神經系統功能障礙觸發兒茶酚胺風暴，從而產生全身性及肺血管收縮。此導致血容量自體循環移位至肺循環，最終經由流體靜力學機制或因直接肺內皮傷害而導致肺泡腔中之血漿洩漏及出血[101-104]。儘管近年來已研發非病毒誘導之NPE之若干實驗動物模式(綜述可參見Sedy[103]及Davison[104])，但本發明係首次僅使用EV71感染即成功地誘導肺水腫之經典體徵。因此，新模式代表了尋求可限制EV71感染且預防在人類患者中發作爆發性NPE之抗病毒療法及治療方案之重大進步。儘管肺水腫亦可由因應於EV71感染之宿主細胞介素風暴誘導[105-107]，但數據強烈表明，EV71誘導之NPE之主要機制並不涉及大規模發炎性反應且代之以與特定腦區域中之組織損害有關。
與NPE誘導有關之腦區域稱為觸發區，其涵蓋下丘腦室旁及背內側核[101、103]及腹外側及背部髓質(包含NTS及AP區域)[96、104、108-110]。EV71誘導之NPE先前歸因於腦幹組織之深度損害[21、22、93、111]，且在新穎鼠類模式中於腦幹及脊髓中檢測到病毒抗原及深度損害。儘管種類IA及種類IB小鼠展現病灶及病毒抗原在腦幹及脊髓中之類似分佈以及血清兒茶酚胺之相當上調，但可藉由腦病灶之減小數量及嚴重程度及/或NTS、髓質網狀核(MdRN)及髓質AP區、小腦中之齒狀核及前下丘腦之背內側核中的較低病毒抗原強度來闡釋在種類IB動物中不存在NPE。由此提出，腦幹組織之急性、嚴重破壞、尤其彼等與血管舒縮區有關者在EV71感染宿主中引起拿兒茶酚胺風暴，且此可進展成NPE(若已知觸發區遭受足夠損害)。
總而言之，本發明係展現表面效度之EV71神經感染之真實小鼠模式[112]，亦即該等動物顯示整個範圍可在藉由人類患者之EV71感染誘導之全譜神經學疾病(包含NPE)中觀察到之臨床體徵。藉由視像
(包括兩個不同種類IA小鼠之兩個視像片段)來獲得呈現種類IA疾病體徵之EV71：TLLmv感染小鼠之標誌性觀察。兩個動物皆不能自動扶正且處於昏迷狀態。呈現為呼吸急促且具有亞前緣凹入之嚴重呼吸性窘迫在第一小鼠中較為明顯。在第二小鼠中看到喘息、亞前緣凹入及自鼻孔發出泡狀流體。藉由一個種類1B小鼠之視像來獲得呈現種類IB疾病體徵之EV71：TLLmv感染小鼠中之標誌性觀察。該動物不能自動扶正且處於麻木狀態。亦觀察到右肢之同側癱瘓及左後肢之持久性顫抖。此模式亦顯示關於疾病之肉眼及組織病理學特徵(其極其類似於彼等在致命人類病例中所報導者)之建構效度。此新活體內模式代表用於鑑別EV71神經病發病機制中之關鍵事件、用於剖析EV71誘導之NPE之機制、研發新穎治療方式及潛在抗病毒療法及用於實施新穎疫苗之臨床前評估之有效工具。
除非另外指示，否則本發明實踐採用熟習此項技術者熟知之化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、基因學、免疫學、細胞生物學、細胞培養及轉基因生物學之習用技術。例如參見Maniatis等人，1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)；Sambrook等人，1989, Molecular Cloning，第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)；Sambrook及Russell，2001, Molecular Cloning，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)；Green及Sambrook，2012, Molecular Cloning，第4版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)；Ausubel等人，1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons，包含定期更新)；Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford)；Russell, 1984, Molecular biology of plants: a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y.)；Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)；Guthrie及Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991)；Harlow及Lane，1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編輯，1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames及S. J. Higgins編輯，1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss公司，1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；論文Methods In Enzymology (Academic Press公司，N.Y.)；Methods In Enzymology，第154及155卷(Wu等人編輯), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及Walker編輯，Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯，1986)；Riott, Essential Immunology，第6版，Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988；Fire等人，RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge, 2005；Schepers, RNA Interference in Practice, Wiley-VCH, 2005；Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology, DNA Press, 2003；Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowa, NJ, 2004；Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application, CRC, 2004。
藉由參照下列實例來闡述本發明，該等實例係以闡釋方式提供且並不意欲以任何方式來限制本發明。利用業內熟知之標準技術或下
文具體闡述之技術。
實例1
用於實例2-8之材料及方法
細胞株及病毒株：此研究中所使用之所有細胞株皆係購自美國組織典型培養物保藏中心(American Tissue Type Culture Collection，ATCC, USA)。使用以下各種哺乳動物細胞株來實施研究：人類腺癌細胞株HeLa(CCL-2)及HEp-2(CCL-23)及橫紋肌肉瘤RD(CCL-136)；非洲綠猴腎Vero(CCL-81)及Vervet猴腎纖維母細胞COS-7(CRL-1651)；小鼠神經胚細胞瘤Neuro2A(CCL-131)、胚胎纖維母細胞NIH/3T3(CRL-1658)及腎上皮TCMK(CCL-139)；倉鼠卵巢上皮樣CHO-K1(CCL-61)及正常大鼠腎上皮NRK(CRL-6509)。
預先自感染有EV71之已故患者之腦幹分離人類EV71 BS病毒株(EV71：BS)。使病毒在Vero細胞中傳代4個循環，然後儲存於-80℃下直至進一步使用為止。自EV71：BS病毒株經由連續傳代(>60個循環)在小鼠NIH/3T3細胞中衍生小鼠細胞(NIH/3T3)適應性EV71：TLLm病毒株。使EV71：TLLm病毒株在NIH/3T3細胞中進一步傳代(40個循環)以生成小鼠細胞適應性有毒病毒株(EV71：TLLmv)。
細胞株維持及病毒感染：除非另外陳述，否則將所有細胞株在補充有10%(v/v)胎牛血清(FBS, i-DNA Singapore)及0.22%(w/v)碳酸氫鈉(NaHCO3, Sigma Aldrich, USA)之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM, Gibco, USA)中生長且在37℃及5% CO2下培育。在維持培養基(DMEM，補充有1% FBS及0.22% NaHCO3)中培育所有感染細胞。
將細胞(2.5-5.0×105個細胞/孔)在組織培養液處理之6孔板(Nunc, Fisher Scientific)中接種過夜，使用500μl病毒懸浮液(MOI 1)感染，且在30℃、37℃或39℃下培育2小時。將細胞在無菌磷酸鹽緩衝鹽水
(PBS, pH 7.4)溶液中洗滌兩次，然後添加新鮮維持培養基(DMEM, 1% FBS)。每天觀察受感染細胞中不同溶解性致細胞病變效應(CPE)之出現。
對於病毒生長動力學研究而言，將含有受感染細胞之板在-80℃下於以下不同時間點進行冷凍：在感染後0、6、12、24、36、48及54小時(hpi)。使板經受三個循環之冷凍及解凍，且收穫裂解物且藉由劇烈渦旋使其澄清，隨後在1,500×g下離心10分鐘。將澄清上清液在-80℃下儲存於冷凍小瓶(Nuhc, Fisher Scientific)中直至進一步使用為止。
對於溫度適應分析而言，將接種之Vero及NIH/3T3細胞在30℃、37℃及39℃下培育且每天觀察CPE之出現。在48hpi時收穫各別培養上清液且在-80℃下於冷凍小瓶中儲存直至進一步使用為止。
使用親代EV71：BS或衍生NIH/3T3適應性EV71病毒株在1之MOI(感染複數)下感染各種哺乳動物細胞株(亦即RD、HeLa及HEp-2(人類)、Vero及COS-7(猴)、NIH/3T3、Neuro-2A及TCMK(小鼠)、CHO-K1(倉鼠)及NRK細胞(大鼠))且在37℃下培育10天。每天觀察培養液中CPE之出現。
病毒效價及相對複製率(RRR)：對病毒上清液實施終點滴定且在NIH/3T3及Vero細胞中分析。使用Reed及Muench方法[61]及Reed及Muench計算公式[62]列舉病毒效價。簡言之，將NIH/3T3(1×104個細胞/孔)及Vero細胞(4×103個細胞/孔)在96孔板中接種過夜。將解凍至室溫之冷凍病毒在無菌1%去氧膽酸鈉(Sigma Aldrich, USA)中稀釋(10-1)，且劇烈混合15分鐘以解聚病毒。在維持培養基中對解聚病毒實施10倍連續稀釋，且將100μl來自先前10-3稀釋之經稀釋病毒添加至細胞之每一孔上。在37℃下培育板且每天在倒置光學顯微術下觀察不同CPE之出現。病毒效價報告為每體積之50%細胞培養感染劑量
(CCID50/ml)。
為評價EV71：TLLm及EV71：TLLmv在NIH/3T3細胞中之適應程度，使用NIH/3T3及Vero細胞對自先前受感染靈長類動物及齧齒類動物細胞株收穫之病毒上清液實施病毒效價分析。使用下式計算用於量測NIH/3T3及Vero細胞中之相對複製率(RRR)之效價比：RRR=log(A/B)
其中A係在NIH/3T3細胞中分析之病毒效價，且B係在Vero細胞中分析之病毒效價。
藉由免疫螢光分析進行之病毒抗原檢測：對於並不展現顯著CPE之感染細胞而言，實施免疫螢光(IF)染色以驗證感染。將細胞在72hpi時胰蛋白酶化，在無菌PBS中洗滌兩次，且塗覆於鐵氟龍載玻片(Erie, USA)上。將載玻片在生物安全櫃內部風乾且UV處理15分鐘以鈍化活病毒，然後在4℃下於冷丙酮中固定10分鐘。使用泛腸病毒抗體(Merck Millipore, USA)探測載玻片，且隨後使用與0.01%(w/v)伊文思藍複染劑(Evan’s blue counter stain)混合之FITC偶聯小鼠IgG(DAKO Cytomation, Denmark)探測。
使用EV71病毒RNA轉染細胞：利用自4×106 CCID50病毒提取之病毒RNA使用Lipofectamine 2000(Life technologies, USA)遵循製造商方案轉染在24孔板中過夜接種之Vero及NIH/3T3細胞(3×104個細胞/孔)。使用病毒RNA套組(Qiagen, Germany)提取來自EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv之RNA且與Lipofectamine 2000在37℃下於細胞上一起培育6小時。每天觀察經轉染細胞中CPE之出現。在7dpi時，自受感染細胞收穫上清液且在新接種Vero及NIH/3T3細胞上傳代。每天觀察細胞中CPE之出現，且在7dpi時，將細胞胰蛋白酶化且處理以用於免疫螢光病毒抗原檢測。
EV71病毒株之全基因體測序及基因定位：使用病毒RNA套組
(Qiagen, Germany)提取EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv病毒株之病毒RNA且使用Superscript II(SII-RT, Life Technologies, USA)逆轉錄。使用GoTaq Green(Promega, USA)及EV71引子(引子序列可在需要時獲得)擴增所獲得cDNA。使用PCR清潔套組(Geneaid Biotech, Taiwan)純化擴增子且選殖至pZero2載體(Lifetech, USA)中。自卡那黴素(Kanamycin)板選擇純系，接種至LB培養液(50μg/ml卡那黴素)中且在37℃下過夜生長以用於使用QiaSpin Miniprep套組(Qiagen, Germany)提取質體。隨後藉由BigDye終止子方法(Applied Biosystems, USA)使用相同引子對質體進行測序。使用BioEdit v7.0.9.0[63]針對EV71 Singapore分離物3799-SIN-98(基因庫登錄號：DQ341354.1)之全基因體序列比對所獲得500-bp片段序列以重構EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv之全基因體序列。使用Deepview/Swiss pdbviewer 3.7版(http colon slash slash expasy dot org slash spdbv slash)及SWISS-MODEL伺服器[64、65]實施EV71：TLLm及EV71：TLLmv之動子之分子建模
實例2
可允許由EV71：BS感染之靈長類動物細胞株(而非齧齒類動物細胞株)
此研究中所使用之所有靈長類動物細胞株皆可允許由EV71：BS病毒感染。人類RD細胞以及猴Vero及COS-7細胞在感染後48小時(hpi)內展現全溶解性致細胞病變效應(CPE)(圖1A、1J及1M)，且在固定受感染細胞中檢測到病毒抗原(圖2A-2L；針對RD、COS-7及Vero細胞之數據未展示)。自各種受感染細胞株之上清液收穫之病毒之生長動力學曲線證實在RD、Vero及COS-7細胞中發生生產性感染(圖3A)。自RD及Vero細胞收穫之病毒達到3×109 CCID50/ml之終點效價，而來自COS-7之病毒效價為106 CCID50/ml(圖3A)。EV71：BS並不在HeLa及Hep-2細胞中誘導全CPE(圖1D及1G)，且所得病毒效價在分析截止限
值內不可量測。然而，藉由間接免疫螢光染色在HeLa細胞(圖2a)及Hep-2細胞(圖2D)中檢測到病毒抗原，從而指示在細胞中達成成功病毒進入，但無效或缺陷性複製可產生不可量測之病毒效價。
所測試之所有齧齒類動物細胞株經測定皆不允許EV71：BS感染。在感染後不存在細胞之溶解性CPE(圖4A、4D、4G、4J及4M)，來自上清液之病毒效價不可量測，且在接種細胞中不能檢測到病毒抗原(圖2G、2J及2M；圖10A、10C及10E)。
實例3
小鼠細胞(NIH/3T3)適應性EV71：TLLm病毒生產性感染靈長類動物及齧齒類動物細胞株
在NIH/3T3小鼠細胞株中連續傳代EV71：BS最小60個循環後衍生EV71：TLLm。所測試之所有靈長類動物及齧齒類動物細胞株(除NRK細胞外)可允許由EV71：TLLm生產性感染。在RD、Vero及COS-7(圖1B、1K及1N)以及NIH/3T3及Neuro-2A細胞(圖4B、E)中在48hpi時觀察到全CPE。在自所有受感染細胞株(除NRK外)收穫之上清液中可量測到高病毒效價(圖3C及3D)，且藉由間接免疫螢光分析測試受感染細胞之病毒抗原為陽性(圖2B、2E、2H、2K及2N)。在NRK細胞中未觀察到全CPE及可量測病毒效價(圖4N；圖3D)，但可檢測到病毒抗原(圖2K)，從而指示藉由EV71：TLLm在NRK細胞中達成成功病毒進入，但無效病毒複製可產生不可量測之病毒效價。
實例4
小鼠細胞(NIH/3T3)適應性EV71：TLLmv病毒生產性感染齧齒類動物細胞株，但不能生產性感染所有靈長類動物細胞株
EV71：TLLmv病毒株係源自EV71：TLLm在NIH/3T3細胞中再進行40個循環之另一傳代。EV71：TLLmv在少數細胞株-RD、Vero、NIH/3T3、Neuro-2A及TCMK細胞中引起溶解性CPE(圖3B)，且僅在
RD、NIH/3T3及Neuro-2A細胞中觀察到全CPE(圖1C；4C、F)。亦注意到，TCMK、CHO-K1及NRK細胞可允許感染且不會進展至全CPE(圖4I、L、O)，如藉由受感染細胞中之陽性病毒抗原檢測所展示(圖2L、2O及2R)。
另一方面，據觀察，靈長類動物細胞株HeLa、Hep-2及COS-7不允許EV71：TLLmv感染，如藉由不存在CPE(圖1F、1I及1O)、不可量測病毒效價(圖3B)及陰性病毒抗原檢測(圖2C、2F，且數據未展示)所展示。
實例5
EV71：TLLmv病毒對NIH/3T3細胞展現較高適應程度，而EV71：TLLm更適於在Vero細胞中複製
藉由計數Vero及NIH/3T3細胞中之病毒效價來測定在不同時間點自受感染細胞收穫之上清液中活性之病毒。使用相對繁殖率(RRR)(藉由獲取在NIH/3T3中分析之病毒效價值對在Vero中分析之效價值之比率來計算)作為對NIH/3T3細胞之病毒適應程度之替代量度。親代EV71：BS病毒針對RD、Vero及COS-7顯示較高負RRR值(圖5A)，從而指示在Vero細胞中分析之病毒效價遠遠超過在NIH/3T3細胞中分析之效價。無法測定其他細胞株之相對繁殖率值，此乃因不能量測病毒效價。另一方面，EV71：TLLmv病毒展現正RRR值，除在Vero細胞中繁殖之病毒外(圖5B)。正RRR值指示與Vero細胞相比在NIH/3T3細胞中具有更有效複製及由此之較高效價值。針對自Vero細胞收穫之EV71：TLLmv測定之負RRR值與所觀察緩慢生長動力學(圖3B)及較低病毒效價一致。EV71：TLLm展現負RRR值(圖5C及5D)，但等級小於EV71：BS之RRR值。此表明，儘管EV71：TLLm可生產性感染少數齧齒類動物細胞株，但其仍較NIH/3T3細胞更適於在Vero中複製。
實例6
EV71：TLLm較EV71：TLLmv對變化溫度展現更佳適應性
在不同溫度-30℃、37℃及39℃下培育感染有親代EV71：BS及衍生NIH/3T3適應性EV71：TLLm及EV71：TLLmv病毒株之Vero及NIH/3T3細胞以測定病毒溫度改變或變化之適應性。EV71：BS顯示最受限適應性，其中僅在37℃下培育之Vero細胞中觀察到全CPE(圖8B；表1)。EV71：TLLmv顯示中等適應性，此係基於在37℃下於Vero細胞中(圖S2B)及在37℃及39℃下於NIH/3T3細胞中(圖8A、圖9A；表1)觀察到全CPE誘導。另一方面，EV71：TLLm顯示最大適應性，其中其在所有培育溫度下於Vero細胞中誘導全CPE(圖7B、圖8B、圖9B)，但僅在37℃下於NIH/3T3細胞中誘導全CPE(圖8A；表1)。
實例7
EV71：TLLm及EV71：TLLmv之病毒基因體因對NIH/3T3細胞之適應而累積多個錯義突變
對EV71：BS、EV71：TLLm、EV71：TLLmv之病毒RNA實施Sanger測序以測定共有基因體序列且鑑別源自NIH/3T3細胞中之適應過程之可能適應性突變。基因體中代表主要準種群體之共有序列已寄存於GenBank, NCBI(National Center for Biotechnology Information)中。針對EV71：BS(基因庫登錄號：KF514878；SEQ ID NO：3)比對EV71：TLLm(基因庫登錄號：KF514879；SEQ ID NO：1)之全基因體序列揭示60種核苷酸突變，其中之21種產生胺基酸取代(表2)。另一方面，在EV71：TLLmv(基因庫登錄號：KF514880；SEQ ID NO：2)與EV71：BS之基因體之間發現83種突變，其中具有36種胺基酸取代。大部分錯義突變位於P1(衣殼蛋白基因)區中(表2)，尤其位於VP1蛋白質基因內(表3)。
在P2及P3區域內亦觀察到胺基酸變化，大部分尤其位於RNA依賴性RNA聚合酶(3D區域)中。EV71：TLLm獲得4種胺基酸變化，其大部分位於酶之手掌及拇指結構域中(表4)。另一方面，EV71：TLLmv累積8種胺基酸變化，大部分亦位於聚合酶之手掌及拇指結構域中。在基因體之5'未轉譯區(UTR)中亦觀察到核苷酸突變。除鹼基變化外，在EV71：TLLm中發現1-鹼基插入，而在EV71：TLLmv 5'UTR中觀察到4-bp插入及20-bp缺失(表2及3)。另一方面，在EV71：TLLm之VP3及3A區域以及EV71：TLLm及EV71：TLLmv之3'UTR中未觀察到胺基酸取代。
突變係基於與參考EV71：BS基因體之比對。
突變係基於與參考EV71：BS基因體之比對。
實例8
將EV71：BS病毒RNA轉染至鼠類細胞中會產生生產性感染，但病毒後代不能再感染相同小鼠細胞
經病毒RNA轉染之Vero及NIH/3T3細胞在轉染後7天(dpt)展現全CPE(數據未展示)。在經EV71：BS之病毒RNA轉染之NIH/3T3細胞中檢測到病毒抗原(圖10B)，但在實施病毒感染之NIH/3T3細胞中未檢測到(圖10A)。再接種於新鮮Vero及NIH/3T3細胞上之病毒上清液僅在Vero而非在NIH/3T3細胞中產生生產性感染(100% CPE)(圖6A)，且病毒抗原檢測證實了Vero細胞而非NIH/3T3中之感染(圖6B)。
實例9
用於實例10-17之材料及方法
質體、病毒、細菌及細胞株：編碼鼠類SCARB2 cDNA(pMD18-mSCARB2)之質體(基因庫登錄號：NP_031670.1)係購自Sino Biological公司(Beijing, China)。用於在大腸桿菌(E. coli)細胞中重組表現可溶性mSCARB2蛋白質之pQE30載體(Qiagen, Germany)係來自Dr. Kian Hong Ng(Temasek Lifesciences實驗室，Singapore)之慷慨饋送禮物。使用低拷貝數質體pACYC177(New England Biolabs, Singapore)生成編碼EV71之全長cDNA之質體。表現T7聚合酶之質體構築體(pCMV-T7pol)係來自Dr. Peter McMinn of University of Sydney, New South Wales之慷慨饋送禮物。用於純系衍生病毒之片段測序之質體pZero-2係購自Invitrogen(Life Technologies, USA)。
此研究中所使用之臨床分離物EV71：BS(基因庫登錄號：KF514878)、EV71：TLLm(基因庫登錄號：KF514879.1)及EV71：TLLmv(基因庫登錄號：KF514880.1)闡述於上文或前文中。
此研究中所使用之所有細胞株-非洲綠猴腎Vero(CCL-81)、小鼠神經胚細胞瘤Neuro-2a(CCL-131)及纖維母細胞NIH/3T3(CRL-1658)細胞皆係購美國組織培養物保藏中心(ATCC®, USA)。如上文或先前所闡述來生長細胞並維持。
使用大腸桿菌細胞BL21病毒株(New England Biolabs, Singapore)
來進行較高程度之蛋白質表現，使用TOP10病毒株(Life Technologies, USA)來進行個別純系之片段測序，且使用XL-10 Gold ultracompetent 病毒株(Stratagene, USA)來生成全長基因體cDNA純系。
EV71：BS全長基因體cDNA純系、衣殼-嵌合純系及VP1/VP2突變體純系之構築：藉由兩步驟選殖生成EV71：BS cDNA純系。病毒RNA提取(Qiagen Viral RNA套組，Germany)及cDNA轉化(Life Technologies Superscript-II RT, USA)已闡述於上文或前文中。使用引子對： EV71_BamHI-PfF 及 EV71_Pf-AatIIR (表5)(其含有用於選殖至質體pACYC177中之BamHI及AatII限制位點)擴增編碼5'UTR及P1區域之基因體近端片段。使用引子對 EV71_HindIII-DF 及 EV71_D-BamHIR (其亦含有用於選殖之HindIII及BamHI限制位點)擴增編碼P2、P3及3'UTR之遠端片段。近端片段在5'UTR上游含有T7聚合酶啟動子區域以促進轉錄。在使用EagI及AatII消解後，近端片段接合至遠端片段，且產生全長EV71：BS純系。
為使用EV71：TLLm之P1代替EV71：BS之P1區域，在5'UTR與P1(引子對 SDM_MluIF 及 SDM_MluI-R )之間之邊界內改造MluI限制位點。擴增EV71：TLLm之P1 cDNA序列(引子對 MluI-TLLm-P1F 及 EagI-TLLm-P1R )，使用MluI及EagI消解，且選殖至具有近端片段之構築體中。如所闡述，此改質近端片段隨後接合至遠端片段。
為生成在VP2及VP1蛋白質中具有胺基酸取代之純系，在接合至遠端片段之前於近端片段中實施定點誘變。使用特異性引子對 VP2_G1385C-F 及 VP2_G1385C-R 將VP2 S144T(nt G1385C)胺基取代引入近端片段中。亦以類似方式使用不同引子對生成VP2 S144T(nt G1385C)、VP1K98E(nt A2734G)、E145A(nt A2876C)及E167D(nt C2947T)(表5)。
「小鼠細胞進入表型」之評價：為生成活病毒，利用表現T7 RNA聚合酶之另一構築體(pCMV-T7pol)使用Lipofectamine 2000(Life
Technologies, USA)遵循製造商推薦方案將cDNA純系共轉染至Vero細胞中。在轉染後7-10天收穫轉染上清液，且如上文或先前所闡述以1 MOI接種於上過夜接種之細胞株上[71]。將細胞與病毒上清液在37℃下一起培育1小時且使用PBS洗滌兩次，然後將培養基更換為新鮮DMEM(1% FBS)。
為評價感染表型，記錄溶解性致細胞病變效應(CPE)誘導之進展，且在不同時間點獲取影像。亦收穫受感染細胞且如上文或先前所闡述加以處理以用於病毒蛋白之免疫螢光檢測[71]。簡言之，將黏附細胞胰蛋白酶化且與來自培養上清液之丸化細胞組合，在無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌兩次，且固定於鐵氟龍載玻片上。將固定細胞與泛腸病毒單株抗體(Merck Millipore, USA)一起培育且使用標準FITC偶聯抗小鼠IgG抗體檢測。亦收穫受感染細胞培養上清液，使其澄清，且實施連續稀釋以使用Reed及Muench方法進行病毒效價測定[61]。在已知效價時，使上清液在新鮮接種之NIH/3T3及Neuro-2a細胞上以1 MOI傳代，且同樣使用本文所闡述之方法評價感染表型。
可溶性SCARB2蛋白質之重組蛋白質表現及SCARB2兔抗血清之產生：使用引子對 pQE-mSCARB2F 及 pQE-mSCARB2R 擴增編碼小鼠SCARB2之細胞外結構域(aa Arg27-Thr 432)之質體pMD18-mSCARB2以引入BamHI及HindIII限制位點，從而促進pQE30蛋白質表現載體中之選殖。將該等純系轉變成BL21大腸桿菌細胞，且使用1mM IPTG過夜誘導蛋白質表現。對所收穫細胞實施溶菌酶(1mg/ml)消解，且使用Ni-NTA管柱(Qiagen®, Germany)純化粗製提取物。將澄清裂解物在1ml 50% Ni-NTA漿液中於4℃及輕微振動下培育過夜。將蛋白質在洗滌緩衝液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM咪唑，pH 8.0)中洗滌5次且使用洗脫緩衝液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM咪唑，pH 8.0)洗脫。
使用1.4μg與弗羅因德氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)(Sigma-Aldrich®)混合之經純化小鼠SCARB2蛋白質在第0天對兩隻健康雄性兔實施免疫化。在第21、42、63、84及105天注射含有0.8μg與弗羅因德氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)(Sigma-Aldrich®)混合之抗原之加強劑量。在第117天藉由心臟穿刺實施末端放血，且將所收集血液在4℃下培育過夜，然後在3,000rpm下離心30分鐘。收集澄清血清且儲存於-20℃下直至進一步使用為止。藉由Temasek Lifesciences Laboratory Institution Animal Care and Use Committee(TLL-IACUC)[批准號：047/12]批准SCARB2兔抗血清之產生。
使用鼠類SCARB2蛋白質之病毒競爭分析：實施活體外結合分析以證實EV71：TLLmv與小鼠及人類SCARB2蛋白質之相互作用。在無菌鐵氟龍塗覆載玻片(Erie, USA)上過夜接種NIH/3T3細胞(6000個/孔)。在病毒接種之前，將100 MOI EV71：TLLmv與各種濃度之重組小鼠SCARB2(mSCARB2)或人類SCARB2(hSCARB2)蛋白質(4.0μg、2.0μg、1.0μg、0.5μg、0.25μg、0.125μg及0μg)一起在37℃下於振動平臺中培育2小時。每天觀察受感染細胞之CPE體徵且在感染後48小時固定於純丙酮(4℃, 10分鐘)。使用泛腸病毒抗體(Merck Millipore®, USA)對固定細胞實施免疫螢光分析。使用正立螢光顯微鏡(Nikon, Japan)對載玻片實施成像。
病毒-SCARB2結合分析：在固定細胞上實施抗體調介之SCARB2阻斷分析以評價遮蔽細胞表面SCARB2蛋白質是否影響結合病毒結合。固定(4% PFA，25分鐘，室溫)在鐵氟龍載玻片上培養之NIH/3T3及Vero細胞，且使用存於PBS中之5% BSA在37℃下阻斷1小時。將載玻片在37℃下於針對mSCARB2產生之多株兔血清(1：100)中培育1小時。對於陰性對照而言，將細胞與針對塞弗病毒(Saffold Virus)L蛋
白產生之多株兔血清一起培育。在PBS中洗滌載玻片，然後與活EV71：TLLmv(1000 MOI)在37℃下一起培育1小時且使用泛腸病毒抗體探測並使用FITC偶聯Ab檢測。使用Zeiss LSM 510 Meta倒置共聚焦雷射顯微鏡(Zeiss, Germany)使載玻片成像，且使用Imaris(BitPlane Scientific Software, Germany)成像軟體量測螢光強度。使用Prism GraphPad 6.01版(GraphPad Software公司，USA)實施螢光強度差之統計學分析。
使用兔抗SCARB2多株血清分析對病毒感染之細胞保護：亦在活細胞上實施抗體調介之SCARB2阻斷分析以評價其對細胞感染之效應。將過夜接種之NIH/3T3細胞(1×104個細胞/孔，在96孔板中)與針對小鼠或人類SCARB2蛋白質產生之兔多株血清之兩倍連續稀釋液(1：20至1：640)在37℃下一起培育1小時。隨後使用100 MOI EV71：TLLmv或純系衍生病毒突變體CDV：BS[M-P1]及CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]將細胞在37℃下接種1小時。將細胞在PBS中洗滌兩次，然後更換為新鮮DMEM(1% FBS)。每天觀察細胞之CPE體徵，且在感染後3天(dpi)收穫受感染細胞培養上清液。使用先前病毒解聚過程藉由如先前所述在室溫下於1%去氧膽酸鈉中劇烈渦旋15分鐘來對上清液實施病毒滴定[6、71]。使用Reed及Muench方法列舉病毒效價[61]且使用感染性計算公式報導為CCID50/ml[62]。
實例10
將EV71：BS基因體RNA轉染至小鼠神經元Neuro-2a及纖維母細胞NIH/3T3細胞中會生成存活病毒後代
先前已證實鼠類纖維母細胞NIH/3T3及神經胚細胞瘤Neuro-2a細胞不允許EV71：BS感染，而Vero細胞可以(上文或[71])。兩種病毒株EV71：TLLm及EV71：TLLmv(皆源自EV71：BS)成功地進入該等鼠類細胞內且加以複製。為測定EV71：BS基因體是否可在該等非允許細胞中進
行複製，提取來自EV71：BS之基因體RNA且轉染至Vero、NIH/3T3及Neuro-2a細胞中。類似地，將來自EV71：TLLm及EV71：TLLmv之基因體RNA轉染至該等三個細胞株中以用於對比。為評價所生成病毒後代之存活力，隨後將轉染上清液再接種於新鮮細胞上(圖15A)。
將所有三個病毒株之基因體RNA轉染至Vero細胞中會在經轉染細胞單層中產生溶解性致細胞病變效應(CPE)(圖15B)。在死亡細胞中亦觀察到病毒抗原表現(圖15C)，從而指示成功病毒複製。自EV71：TLLm或EV71：TLLmv病毒RNA至NIH/3T3及Neuro-2a細胞單層之轉染觀察到類似結果(圖15B及15C)。另一方面，EV71：BS RNA至NIH/3T3及Neuro-2a細胞之轉染使得一些展現病毒抗原表現之細胞死亡，但並不產生細胞單層之全CPE。來自NIH/3T3及Neuro-2a細胞之EV71：BS轉染上清液在新鮮Vero細胞上之另一傳代會誘導細胞單層之全裂解(圖15D)且在死亡細胞中檢測到病毒抗原(圖15E)。然而，轉染上清液在新鮮NIH/3T3細胞上之傳代不會產生CPE(圖15D)，且不會產生病毒抗原表現(圖15E)。
實例11
小鼠細胞株適應性EV71：TLLm之衣殼-編碼P1區域負責在鼠類NIH/3T3及Neuro-2a細胞中之成功病毒進入
先前分析表明，EV71：TLLm及EV71：TLLmv之衣殼蛋白可負責在NIH/3T3及Neuro-2a細胞中之成功進入(上文或[71])。為證實此結論，藉由標準反向基因學生成EV71：BS基因體之全長cDNA純系。隨後使用EV71：TLLm P1之基因序列代替EV71：BS之全長cDNA純系之P1(衣殼)區域以生成嵌合質體純系(圖16A)。將EV71：BS cDNA純系轉染至Vero細胞中以生成純系衍生病毒(CDV：BS)。類似地，轉染嵌合純系以生成展現EV71：TLLm之衣殼蛋白且表現EV71：BS之非結構蛋白質之CDV：BS[M-P1]。將該等CDV再接種於各種細胞株上以評價感染表型
(圖16B)。
EV71：BS純系衍生病毒(CDV：BS)在Vero細胞中而非在NIH/3T3及Neuro-2a細胞中誘導CPE，而CDV：BS[M-P1]在所有三種細胞株中於接種後48小時(hpi)誘導CPE(圖16C)。感染有CDV：BS[M-P1]而非CDV：BS之鼠類細胞使得在死亡細胞中檢測到病毒抗原(圖16D)。為評價存活病毒後代在第一傳代(P1)中之產生及釋放，將來自受感染細胞之澄清培養上清液再接種於相同細胞株之新鮮單層上，且在72hpi時量測病毒產量。CDV：BS及CDV：BS[M-P1]在Vero細胞上之傳代展現高病毒效價，且在另一傳代(P2)之後觀察到顯著效價增加(圖16E)。同時，CDV：BS[M-P1]而非CDV：BS之傳代(P1)在NIH/3T3及Neuro-2a細胞中產生高病毒產量(圖16F)。
實例12
EV71：BS衣殼中之VP1-L169F胺基酸取代使得病毒能夠進入鼠類細胞中且誘導有限感染
小鼠細胞適應性EV71：TLLm之衣殼蛋白使得EV71：BS能夠進入鼠類細胞中，且關注賦予此新穎表型之特異性殘基之身份。關於EV71：BS及小鼠細胞適應性EV71病毒株之多蛋白序列比對之對比之先前數據展示，在VP1及VP2蛋白質中存在多種可涉及宿主細胞上之病毒受體接合之胺基酸取代(上文或[71])。該等殘基包含VP1 K98E、E145A及L169F以及VP2 S144T及K149I。為測定何種該等胺基酸取代係小鼠細胞進入所需，經由標準定點誘變將產生該等胺基酸取代之個別突變引入EV71：BS全長cDNA純系中(圖17A)。將該等改質cDNA純系獨立地轉染至Vero細胞中以生成純系衍生病毒(CDV)，且將所收穫上清液接種於新鮮接種之Vero、NIH/3T3及Neuro-2a細胞上以評價感染表型。
感染有所有突變體純系衍生病毒(CDV)之Vero細胞皆展現100%
CPE，但僅彼等具有VP1胺基酸取代之CDV-CDV：BS VP1 [K98F]、CDV：BS VP1 [E145A]及CDV：BS VP1 [L169F]在Neuro-2a細胞中產生100% CPE(圖17B及17C)。在感染有在VP1(CDV：BS VP1 )及VP2(CDV：BS VP2 )中含有胺基酸取代之CDV之Vero及Neuro-2a細胞中檢測到病毒抗原表現，但僅感染有CDV：BS VP2 之NIH/3T3細胞展現病毒抗原表現(圖17D及17E)。此外，感染有所有突變體CDV之Vero細胞皆產生可量測病毒效價(圖17F)，從而表明具有病毒存活力，但僅CDV：BS VP1 [L169F]在受感染NIH/3T3及Neuro-2a細胞之培養上清液中生成可量測病毒效價(圖17G)，如在Vero細胞中所分析。然而，來自感染有CDV：BS VP1 [L169F]之NIH/3T3及Neuro-2a細胞之培養上清液在健康鼠類細胞上之另一傳代不能誘導感染。
實例13
鼠類細胞中之有效生產性感染需要在VP1處之組合胺基酸取代
為評價組合VP1及VP2中之胺基酸取代是否亦可使得EV71：BS能夠進入小鼠細胞中，生成具有胺基酸取代之各種組合之EV71：BS之全長基因體cDNA純系(BS VP2 [S144T/K149I]、BS VP1 [K98E/E145A]、BS VP1 [K98E/E145A/L169F]及BS[VP1/VP2])(圖18A)。將質體純系獨立地轉染於Vero細胞上，且使用所得上清液接種Vero、NIH/3T3及Neuro-2a細胞以評價感染表型。
所有所分析CDV(除CDV：BS VP2 [S144T/K149I]外)在Vero及Neuro-2a細胞中誘導CPE(圖18B)。在所有感染有各種CDV之細胞中亦檢測到病毒抗原，但在比較鼠類細胞株時，免疫染色較Neuro-2a在NIH/3T3細胞中更為明顯(圖18C)。在感染有所有CDV之Vero細胞之培養上清液中可量測到高病毒效價(圖18D)，但僅CDV：BS VP1 [K98E/E145A]及CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]在受感染NIH/3T3及Neuro-2a細胞之培養上清液中產生可量測病毒效價(圖
18E)，如在Vero細胞中所分析。
實例14
在VP1 K98E、E145A及L169F處具有組合胺基酸取代之EV71：BS病毒可成功地在小鼠Neuro-2a細胞中傳代
4種純系衍生病毒分離迄今為止已使得EV71：BS能夠進入所培養小鼠細胞株：CDV：BS[M-P1]、CDV：BS VP1 [L169F]、CDV：BS VP1 [K98E/E145A]及CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]中且感染其。為鑑別何種該等CDV可穩定感染小鼠細胞多個循環，將病毒上清液在相同細胞株中傳代兩次，亦即自Neuro-2a至新鮮Neuro-2a細胞。藉由評價CPE誘導及病毒抗原表現以及存活病毒後代之產生來監測感染。
僅CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]及CDV：BS[M-P1]可成功地在Neuro-2a細胞中連續傳代，如藉由檢測到病毒抗原(圖19A)及可量測病毒效價所顯示(圖19B)。在第2及第3傳代中觀察到陽性染色，且與第一傳代相比在第2傳代中記錄病毒效價增加。另一方面，僅CDV：BS[M-P1]能夠在NIH/3T3細胞中誘導病毒抗原之表現(圖19A)，但未檢測到存活病毒後代。源自Neuro-2a細胞中之第三傳代之CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]之基因體測序展現所引入胺基酸突變並無變化(圖19C)。
實例15
小鼠細胞株適應性病毒株EV71：TLLmv在活體內及活體外結合SCARB2蛋白質
最近證實，EV71利用清除劑受體種類B成員-2(SCARB2)蛋白質作為其用於宿主細胞進入之受體[47]。為證實小鼠細胞株適應性EV71病毒株是否在小鼠細胞感染期間亦利用SCARB2，實施競爭性病毒結合分析。首先，將在鐵氟龍塗覆載玻片中過夜生長且使用4%多聚甲
酸輕微固定之NIH/3T3及Vero細胞與針對小鼠SCARB2蛋白質(mSCARB2)之兔血清一起培育，然後在活體外與活EV71：TLLmv結合。使用泛腸病毒單株抗體以螢光發生檢測結合細胞，且量化螢光強度。將NIH/3T3細胞與抗mSCARB2血清一起預培育使得顯著減小EV71：TLLmv結合(圖20A)，此在將細胞與非特異性血清(NSP)一起預培育時未觀察到。使用Vero細胞觀察到類似結果(圖20B)。
在第二實驗中，將活EV71：TLLmv與重組可溶性SCARB2蛋白質一起培育，然後接種於接種NIH/3T3細胞上，且藉由結合泛腸病毒單株抗體之螢光加標籤評價感染。將病毒與可溶性mSCARB2一起預培育會以劑量依賴性方式減小細胞感染之嚴重程度(圖20C)。在預培育中使用人類SCARB2(hSCARB2)蛋白質時，獲得類似結果(圖20D)。
實例16
藉由將小鼠細胞與針對SCARB2蛋白質產生之血清一起預培育來阻斷EV71：TLLmv細胞感染
為評價藉由阻斷EV71：TLLmv與SCARB2之相互作用是否減小細胞感染，將所接種NIH/3T3細胞與各種稀釋度之SCARB2蛋白質抗血清一起培育，然後使用活EV71：TLLmv接種，且藉由量測活病毒後代之效價來評價感染。將細胞與低稀釋度之hSCARB2抗血清(1：20至1：80)一起預培育會與對照相比劑量依賴性地顯著減小病毒效價(圖20E)。在將細胞與mSCARB2抗血清一起預培育時，獲得類似結果(圖20F)。
實例17
CDV：BS[M-P1]及CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]利用鼠類SCARB2蛋白質作為其進入鼠類細胞中之功能受體
CDV：BS[M-P1]及CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]皆穩定感染小鼠Neuro-2a細胞。為測定該等CDV(例如小鼠細胞適應性EV71：TLLmv病
毒株)是否亦利用mSCARB2減小病毒進入及脫殼，將Neuro-2a細胞與mSCARB2抗血清一起培育，然後使用CDV突變體感染。在感染有CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F](圖21A)或CDV：BS[M-P1](圖21B)之細胞中觀察到溶解性CPE之劑量依賴性減小。在感染後7天(dpi)滴定培養上清液揭示，與SCARB2抗血清一起預培育之細胞中之CDV：BS VP1 [K98E/E145A/L169F]病毒效價與對照相比並無顯著差異(圖21C)。另一方面，相對於對照，在與血清一起預培育之CDV：BS[M-P1]感染細胞中檢測到顯著病毒效價減小(圖21D)。
實例18
用於實例19之材料及方法
動物模式：為測定小鼠細胞適應性病毒株(EV71：TLLm及EV71：TLLmv)之動物感染表型，使用106 CCID50之病毒感染5-6天齡Balb/c小鼠且觀察疾病症狀及神經學併發症。追蹤動物最長28天，然後將動物處死且收集血清以用於檢測EV71特異性抗體。
實例19
Balb/c小鼠中之小鼠細胞株適應性EV71(EV71：TLLm及EV71：TLLmv)之神經毒性研究
在感染有EV71：TLLm之免疫功能健全動物(n=7)中，兩隻(29%)在感染後8天死於嚴重且持續(>24小時)之癱瘓(圖13A)。在其他存活小鼠中，5隻(5/7, 71.4%)展現顫抖及共濟失調，5隻在一個或兩個後肢中展現輕癱，且4隻(4/7, 57.1%)在一個或兩個後肢中展現暫時性癱瘓。另一方面，感染有EV71：TLLmv之動物展現疾病之更嚴重臨床表現。十分之九(90%)之受感染動物在感染8天內死於疾病(圖13A)，其中6/9(66.7%)之死亡出現於感染後第4天內。所呈現之其他症狀包含顫抖(5/10, 50%)、在一個或兩個後肢中輕癱(6/10, 60%)及在一個或兩個後肢中癱瘓(5/10, 50)。儘管感染有EV71：TLLm之小鼠與模擬感染動
物相比體重似乎並無差異，但感染有EV71：TLLmv之小鼠在感染之前10天內展現顯著體重減小(圖13B)。更有趣的是，在EV71感染小鼠中觀察到新穎症狀，其中癱瘓動物(圖14A，箭頭)呈現具有明顯亞前緣凹入之呼吸急促。此外，6/9(66.7%)之死亡者在安樂死之前呈現此症狀。在驗屍時，亦觀察到在打開胸腔(在收集肺及心臟組織時驗屍中之正常程序)時肺不能萎縮(圖14B，箭頭)，從而表明存在肺水腫。組織之組織學檢驗揭示肺之肺泡腔中之肺水腫及出血之特徵(圖14C)，且較高放大率影像展示存在均質蛋白質性物質(圖14D，箭頭)。
亦使用免疫功能受損性小鼠(例如NSG小鼠)實施此實例。獲得類似結果，只是疾病之嚴重程度較大且死亡率較高。
實例20
篩選候選抗EV71化合物
使用已展示易受EV71：TLLm或EV71：TLLmv病毒株之溶細胞性感染影響之小鼠NIH/3T3細胞株對候選抗EV71化合物實施高通量活體外篩選。然後在動物模式中於活體內測試來自活體外篩選之所選有前景化合物。為達成活體內篩選，使用標準化效價之自小鼠細胞株適應性EV71病毒株(EV71：TLLm及EV71：TLLmv)之標準化原料(製備，滴定且保持於深度冷凍器(-80℃)中)獲取之病毒株感染標準化(基於統計學計算)數量的BALB/c小鼠。在出現用於分析候選化合物之潛在預防性效應之病況之前或在發作用於分析候選化合物之潛在治療性效應之病況之後，將候選抗EV71化合物以各種標準化劑量投與受感染小鼠。
實例21
用於實例22-25之材料及方法
小鼠及病毒株：成年BALB/c小鼠係購自InVivos(Singapore)，且進行交配以獲得幼崽。用於接種之EV71病毒株包含EV71：BS、EV71：TLLm及EV71：TLLmv，其細節及特徵已闡述於本文中。
道德聲明：動物程序係由Institutional Care and Use of Animal Committee(IACUC)of Temasek Lifesciences Laboratory批准(批准號：TLL-14-023)。藉由經由腹膜腔內途徑注射90mg/kg戊巴比通(pentobarbitone)來對垂死之受感染動物實施安樂死。遵循由The Institutional Care and Use of Animals Committee(IACUC)of University of California San Francisco設定之導則及標準程序來實施神經學檢驗。用於安樂死之導則包含先前設定導則[34]：(1)損失>20%之最大記錄體重，(2)癱瘓持續>48小時，(3)沒有進食或不能進食，(4)不能自動扶正，及(5)呈現為不省人事或昏迷之意識變態。觀察幼崽總共28天，且藉由腹膜腔內注射戊巴比通來對在整個此時段內存活之動物實施安樂死。
動物處實及感染：使用EV71：TLLmv(劑量為106 CCID50)藉由腹膜腔內或肌內注射接種8隻不同年齡(6、14、21或28天齡)小鼠之組。為測定EV71：TLLmv之最佳劑量，使用不同劑量之病毒(106、105、104、103或102 CCID50)經由腹膜腔內途徑攻擊6天齡幼崽組(n=8/組)。在感染後第一週期間，每天兩次觀察受感染動物之疾病呈現。如上文所闡述對垂死動物及彼等存活於觀察期中者實施安樂死。經由心臟穿刺使用26G針實施末端採血。
驗屍、肉眼病理學觀察及組織收集：使用標準方案對實施安樂死之動物進行驗屍以收穫器官。亦實施肉眼病理學檢驗且在IACUC批准下獲取照片。使用無菌PBS將肺表面沖洗兩次，且然後在濾紙上吸乾，隨後量測濕重。將用於組織學研究之所收穫器官在4℃下於10%中性緩衝福爾馬林(formalin)(NBF)中儲存1週。
測定：組織病毒負載。使用鐵氟龍研杵浸軟冷凍組織且重構於1ml DMEM(1% FBS)中。然後將試樣混合1小時且離心兩次(20g, 30min, 4℃)以去除組織碎屑且獲得澄清病毒。將病毒試樣在1%去氧膽
酸鈉中解聚[88]，然後連續稀釋10倍且轉移至NIH/3T3細胞上。每天觀察受感染細胞之致細胞病變效應(CPE)，且使用泛腸病毒單株抗體(Merck Millipore, USA)將細胞染色[88]。列舉病毒效價且報導為每g組織之CCID50。
用於組織學分析之組織處理：將固定組織在一系列增加濃度之70%、95%及100%乙醇中去水。將組織在更換兩次之乙醇及更換三次之Histoclear II(Electron Microscopy Sciences, USA)中培育，且最後使用更換四次之融化石蠟浸潤。所有培育皆係在室溫、輕微搖動及100rpm下實施1小時。在設定於65℃之烘箱中實施石蠟浸潤。使用切片機將石蠟包埋組織塊切片(5μm)，載於聚離胺酸塗覆載玻片上，在42℃下乾燥過夜，且然後儲存於室溫下直至進一步使用為止。
組織切片之染色：藉由在更換兩次之Histoclear II中培育來將組織切片去蠟且然後在100%、95%、70%及50%之降低濃度乙醇中緩慢再水合。在染色之前，將載玻片在PBS中培育10min。藉由首先使用Harris蘇木素(Sigma Aldrich, USA)沖洗載玻片且在室溫(RT)下培育15分鐘來實施蘇木素及伊紅(H &E)染色。然後在水中沖洗載玻片，在1%酸醇(95%乙醇、1% HCl)中去染色，浸泡於0.2% NH4OH中，且在水中沖洗10分鐘，隨後在伊紅溶液中複染。接下來，將載玻片在95%乙醇中去染色，藉由更換三次之無水乙醇及更換兩次之Histoclear II中去水。最後將組織置於DPX安裝流體(Sigma Aldrich, USA)中。
免疫組織化學：在去蠟及再水合後，藉由在96℃下於組織學等級微波烘箱及檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中培育30分鐘來對載玻片實施熱誘導抗原修復。將載玻片經3小時冷卻至室溫且隨後使用5%正常豬血清在室溫下阻斷1小時。未經進一步洗滌，然後將載玻片在4℃下於含有針對EV71之多株抗體之兔血清(來自Dr. Hiroyuki Shimizu of NIID, Japan之慷慨饋送禮物)中培育過夜。然後將載玻片在含有0.05%
Tween-20之Tris-緩衝鹽水(pH 7.4)(TBS-T)中洗滌5次，且在TBS中沖洗兩次，然後藉由在室溫下經1小時添加3% H2O2來將內源性過氧化酶驟冷。隨後將載玻片在TBS中洗滌兩次，然後與豬-抗兔Ig-HRP(Dako Cytomation, Denmark)一起在室溫下培育1小時。在洗滌之後，在二胺基聯苯胺(DAB)受質中培育載玻片，且使用蘇木素複染。
在組織切片中定位病毒抗原及病毒誘導之病灶：自www dot brainstars dot org下載小鼠腦之代表性冠狀切片之模板影像[89]。該等影像可在Creative Commons of Japan之許可下自由使用及修改。在模板影像上標記所觀察病灶及病毒抗原。使用冠狀切片之小鼠腦地圖(www dot mouse dot brain-map dot org slash static slash atlas)鑑別受影像腦區域[90]。類似地，使用胸部脊髓之代表性冠狀切片作為用於脊髓圖之模板。然後在模板影像上標記繪示病毒抗原及病毒誘導之病灶之存在之區。
血清兒茶酚胺含量之量測：藉由在驗屍期間垂死動物之心臟穿刺來收集血樣。藉由在3000g、4℃下離心凝固血樣30分鐘來獲得血清，然後儲存於-20℃下直至使用2-CAT(A-N)ELISA套組(Labor Diagnostika Nord, Germany)根據製造商方案測定兒茶酚胺含量為止。
統計學分析：產生所有圖形且使用用於Windows之GraphPad Prism(6.01版)(GraphPad Software, USA, www dot graphpad dot com)實施統計學分析。
由病毒株EV71：TLLm及EV71：TLLmv誘導之感染表型之對比：使用106 CCID50劑量之EV71：BS、EV71：TLLm或EV71：TLLmv經由腹膜腔內(I.P.)或肌內(I.M.)途徑接種6天齡BALB/c幼崽之組(n=10隻小鼠/組)。在接種後第一週期間每天兩次觀察動物之疾病體徵且如已闡述在檢測到臨界體徵時實施安樂死。
來自受感染小鼠之血清中之中和抗體含量之量測：藉由心臟穿
刺在驗屍時於凝結之前在室溫下來收集血樣且藉由在3000g、4℃下離心20分鐘來獲得血清。將試樣儲存於-20℃下直至進一步分析為止。分析冷凍原料之隨機試樣之中和抗體效價。在96孔板中製備血清之兩倍連續稀釋液(1：20至1：1280)且與100 CCID50病毒混合。將混合物在37℃下培育1小時，然後添加NIH/3T3細胞(6,000個細胞/孔)。將板在37℃下培育數天且在第4-10天之間觀察CPE。使用Reed及Muench方法測定中和抗體效價(報告為單位/ml血清)。
實例22
鼠類宿主中之改質EV71病毒株之感染動力學
腸病毒71(EV71)誘導之神經學疾病及病況之當前動物模式僅部分地複製人類疾病。由此旨在使用小鼠細胞(NIH/3T3)適應性病毒株EV71：TLLm及EV71：TLLmv(可生產性感染齧齒類動物及靈長類動物細胞株)研發疾病病理學之臨床真實模式[88]。首先，藉由評價經由腹膜腔內(I.P.)途徑感染有病毒之1週齡BALB/c小鼠中之疾病病理學來評價EV71：TLLm及EV71：TLLmv與親代病毒株EV71：BS相比之相對毒性。儘管在所有接種動物中皆觀察到血清轉化，但僅感染有EV71：TLLm或EV71：TLLmv之小鼠進展至致死疾病(圖22a及22b)。類似地，在經由替代肌內(I.M.)途徑投與適應性病毒株時，該等病毒株同樣涉及相對於親代病毒株EV71：BS宿主存活率有所減小(存活率為57%；圖22c)。在綜合考慮腹膜腔內及肌內感染途徑時，接種之後之中值存活時間為在感染後4天(DPI)(對於EV71：TLLmv感染)及7 DPI(對於EV71：TLLm感染)(x 2 =6.840；p=0.0089)。總而言之，該等數據指示，小鼠細胞適應性病毒株EV71：TLLmv與最大致死程度有關，且由此用於所有後續實驗中。
接下來，評價用於進一步模式研發之最佳病毒劑量、接種途徑及小鼠年齡。首先，經證實，EV71：TLLmv感染小鼠中之疾病嚴重程
度取決於病毒劑量；在接種106之中值細胞培養感染劑量(CCID50)之動物中觀察到最小存活率(圖23a)且中值人道終點(HD50)等於3.98×103CCID50(圖23b)。然後評估動物年齡及感染途徑對宿主存活之影響；注射EV71：TLLmv之1週齡小鼠之存活曲線並不由接種途徑顯著影響(圖23c)，但幼小動物展現其存活始終弱於年長動物，不論病毒注射位點如何(圖23d)。僅在年長動物中可分辨感染途徑對疾病嚴重程度之任何效應；而3週齡小鼠完全抵抗腹膜腔內感染，一些動物並不在經由肌內途徑之病毒注射中存活(圖24a及24b)。在所有自感染存活之小鼠中皆檢測到血清轉化，包含彼等並不展現任何疾病體徵者(圖24c、24d及24e)。該等數據顯示，EV71：TLLmv誘導在中1-3週齡小鼠中致死之急性且嚴重之感染。在本文所測試之條件中，疾病嚴重程度在使用106 CCID50之病毒劑量注射至腹膜腔或肌肉組織中之1週齡小鼠中最大。
實例23
EV71：TLLmv感染小鼠中之疾病進展
大部分接種EV71：TLLmv之1週齡小鼠易患疾病且展現神經學病況之多數臨床體徵。受感染動物展現共濟失調、局部或全身顫抖、不穩定步態及短暫性或持續性肢體輕癱及癱瘓直至安樂死時為止。基於臨床表現，患病動物可易於分成4組(表6)。存活者包含在28天觀察期期間之任一時點並不表現垂死之小鼠。種類I動物在3-7 DPI之後立即呈現嚴重體徵，包含不能自動扶正及不省人事或昏迷。此組中之所有小鼠皆展現痙攣性肢體輕癱及/或癱瘓(前肢、後肢或二者)，但一些動物並無呼吸症狀(種類IB)，其他動物另外其特徵在於呼吸性窘迫之體徵，包含呼吸急促、打嗝、喘息及亞前緣凹入(種類IA)。藉由視像(包括兩個不同種類IA小鼠之兩個視像片段)來獲得呈現種類IA疾病體徵之EV71：TLLmv感染小鼠之標誌性觀察。兩個動物皆不能自動扶正且
處於昏迷狀態。呈現為呼吸急促且具有亞前緣凹入之嚴重呼吸性窘迫在第一小鼠中較為明顯。在第二小鼠中看到喘息、亞前緣凹入及自鼻孔發出泡狀流體。藉由一個種類1B小鼠之視像來獲得呈現種類IB疾病體徵之EV71：TLLmv感染小鼠中之標誌性觀察。該動物不能自動扶正且處於麻木狀態。亦觀察到右肢之同側癱瘓及左後肢之持久性顫抖。最後，種類II小鼠在7 DPI之後呈現感染體徵，包含肢體持續性鬆弛性癱瘓(持續時間>48小時)(圖23e)以及嚴重體重損失(>20%最大體重)。在所有疾病種類中，一些受感染動物在其背部顯示無毛病灶或禿斑且持續數天(圖23f)。腹膜腔內接種EV71：TLLmv之大部分幼患可歸類為種類I(圖23g)；種類IA動物佔19.3%(n=11；特定呼吸體徵)，而種類IB動物佔43.9%(n=25；並無明顯呼吸體徵)。種類II4動物僅代表12.3%(n=7)之受感染幼患，且存活者佔所有受感染小鼠之24.5%(n=14)。在經由肌內途徑接種之幼患中觀察到疾病分類之間之類似分佈模式(圖23h)。總而言之，該等數據指示，感染有EV71：TLLmv之小鼠展現反映人類患者中所觀察之全譜疾病之神經學及呼吸症狀的可變發病率及嚴重程度。
實例24
呈現種類IA體徵之小鼠中之神經學肺水腫
進一步探究在種類IA小鼠中所觀察之呼吸性窘迫是否為病毒誘導之肺水腫(PE)之體徵。對比種類IA、種類IB及種類II小鼠之間之肉眼肺病況揭示，種類IA肺溶脹，在屍體剖檢時不完全塌陷(圖25a-25d)，且相對於來自其他組之肺顯示增加之濕重(圖22E)。對比來自假接種(圖25f)及種類IA肺之肺組織切片揭示出血之病灶區及僅在受感染動物之肺泡腔中累積蛋白質性及紅血球填充流體(圖25g)。該等病理學特徵不存在於種類IB及種類II小鼠之肺中(圖25h及25i)。此外，發現在自任一小鼠組收集之肺中並無發炎性浸潤物或病毒抗原之證據(圖26a)。類似地，每一種類受感染小鼠中心臟肌肉之組織化學分析亦不能揭示發炎性浸潤物、心臟肌肉壞死或病毒抗原之任一證據(圖26b)。總而言之，該等數據顯示，種類IA小鼠中之明顯呼吸性窘迫可能不能歸因於肺炎或鬱血性心力衰竭。由此應致力於測定在此群中所觀察之PE是否為神經學來源，因此接下來量測兒茶酚胺之血清含量以測定神經遞質濃度是否在具有呼吸體徵之EV71：TLLmv感染小鼠(種類IA)中有所調節。使用此方式，據觀察，腎上腺素(adrenaline/epinephrine)及去甲腎上腺素(noradrenaline/norepinephrine)之血液濃度在種類IA小鼠中顯著高於彼等在種類II小鼠或模擬受受感染動物中所檢測者(圖25j及25k)。該等數據強烈指示，種類IA小鼠在死亡之前展現EV71誘導之神經學肺水腫(NPE)。
實例25
種類IA、種類IB及種類II小鼠中之EV71：TLLmv病毒趨神經性
接下來，評價來自每一疾病組之動物之腦及脊髓中EV71：TLLmv及病毒誘導之病灶之分佈以鑑別可有助於選擇性研發僅種類IA小鼠中NPE的因素。種類IA及種類IB中之大部分在所評價之所有CNS區域中動物展現病毒抗原之遍在染色(檢測到>10種陽性神經元)及輕度病理學病灶(觀察到>5種病灶)(表7)。與之相比，患有種類II疾病之5隻小鼠中僅1隻在感覺皮質、海馬體、間腦、中腦、延髓或腰部脊髓中展現病毒抗原及/或病灶。在除CNS外之所測試任一組織中不能檢測到病毒抗原(除經由肌內途徑接種之後之骨骼肌外；數據未展示)。
在比較種類IA及種類IB小鼠之間之CNS病況時，據觀察，組織病灶及病毒抗原侷限於海馬體、間腦、中腦、小腦及髓質內之相同區中，但在患有種類IA疾病之動物中病況更為嚴重(表7及圖27a-27d)。實際上，在與種類IB小鼠進行比較時，種類IA中之動物在海馬體之CA3神經元中顯示更深度神經元退化、吞噬作用及壞死(圖28a及28b)。種類IA鼠亦在下丘腦中展現強烈病毒抗原染色且伴有顯著組織發炎及神經元壞死，而該等病理學特徵在種類IB動物中有限(圖28c及28d及圖27b)。類似地，種類IA小鼠亦在丘腦之腹側後部複合物(圖28e及28f及圖27b)、中腦相關組織(包含導水管周圍灰色(PAG)物質、中腦網狀區及運動相關上丘)(圖28g及28h及圖27c)以及小腦之浦肯野細胞及齒狀核(圖28i及28j、圖27d及圖29a)中呈現更嚴重病毒誘導之病理學及病毒抗原強度之特徵。
在兩個疾病組(種類IA及種類IB)中，在延髓(圖28k及281)、尤其在中間網狀核(IRN)、小細胞性網狀核(PARN)及三叉神經脊束核(sptV)之運動相關區(圖27d及圖29b)中檢測到涉及神經元損害及組織發炎之病毒抗原及病理學病灶之最深度分佈。然而，僅種類1A小鼠在髓質網狀核(MdRN)、孤束核(NTS)及最後區(AP)之腹部及背部區域中展現病毒抗原及組織病灶(圖29b及29c)。為進行對比，亦展示來自模擬感染小鼠之海馬體、下丘腦、丘腦、中腦、小腦及髓質之代表性影像(圖30a-30f)。與之相比，種類IA及種類IB小鼠關於運動皮質、自體感覺皮質、腦橋或脊髓灰質之腹側角內之組織病灶或病毒抗原染色之分佈、局部化或程度並無區別(圖28m及28n、圖27a-27c及圖31a-31e)，此與NPE係由病毒觸發之特定腦區損害引起而非由所有組織中EV71誘導之病況之均勻增加的觀點一致。
除非本文另外指示或上下文明顯矛盾，否則在闡述本發明之上下文(尤其在下文申請專利範圍之上下文)中所用之術語「一(a及an)」
及「該(the)」及類似指示物均應解釋為涵蓋單數與複數二者。除非另外說明，否則術語「包括」、「具有」、「包含」及「含有」應理解為開放性術語(亦即，意指「包含但不限於」)。除非本文另外指示，否則本文所列舉之數值範圍僅意欲作為個別提及此範圍內之每一單獨值之速記方法，並且每一單獨值係如同在本文中個別列舉一般併入本說明書中。除非本文另外指示或上下文另外明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適宜順序實施。除非另外闡明，否則本文所提供之任何及所有實例或實例性語言(例如「例如(such as)」)僅意欲更佳地闡釋本發明且並不對本發明範圍施加限制。本說明書中之任何語言均不應解釋為指示任何未主張要素對於本發明實踐係必不可少的。
本文闡述本發明之實施例，其包含發明者已知之用於實施本發明之最佳模式。彼等熟習此項技術者在閱讀上述說明後可瞭解彼等實施例之各種變化形式。發明者期望熟習此項技術者適當採用該等變化形式，且發明者期望本發明可以不同於本文具體闡述之方式實施。因此，本發明包含適用法律所允許之本文隨附申請專利範圍中所引述標的物之所有修改形式及等效形式。此外，除非本文另外指示或上下文另外明顯矛盾，否則在其所有可能之變化中，上述元素之任何組合均涵蓋於本發明中。
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<213> 小家鼠
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Claims (6)
- 一種篩選抗病毒藥物之方法，其包括：(a)提供小鼠測試群及小鼠對照群，其中每一群之該等小鼠包括含有經感染改質腸病毒71(EV71)之小鼠之EV71神經感染小鼠模式，其中該改質EV71為EV71：TLLmv，其(i)已寄存於食品工業發展研究所且給予寄存號碼BCRC 970074；或(ii)已使用自SEQ ID NO：2合成該病毒RNA序列之高等反向基因學回收，其中測試群中之該等小鼠及對照群中之該等小鼠係藉由將介於105與106之間之中值細胞培養感染劑量(CCID50)之該改質EV71注射至該等小鼠之腹膜腔內或肌肉組織而感染，且其中該等經感染之小鼠展現與神經學肺水腫有關之急性腦脊髓炎，其特徵在於灶性出血及肺泡中之蛋白質性流體、兒茶酚胺之高血清含量及腦幹中之深度組織損害；(b)向該測試群投與抗病毒藥物候選物；(c)監測該測試群及該對照群中之疾病進展；(d)比較該測試群中之該疾病進展與該對照群中之該疾病進展；及(e)選擇相對於該對照群會減小該測試群中疾病進展之該抗病毒藥物候選物。
- 如請求項1之方法，其中在小鼠中篩選之前，首先在經感染該改質腸病毒71之測試小鼠細胞株中篩選該抗病毒藥物。
- 一種篩選有效抗病毒疫苗之方法，其包括：(a)提供小鼠測試群及小鼠對照群，其中每一群之該等小鼠包 括含有經感染改質EV71之小鼠之EV71神經感染小鼠模式，其中該改質EV71為EV71：TLLmv，其(i)已寄存於食品工業發展研究所且給予寄存號碼BCRC 970074；或(ii)已使用自SEQ ID NO：2合成該病毒RNA序列之高等反向基因學回收，其中測試群中之該等小鼠及對照群中之該等小鼠係藉由將介於105與106之間之中值細胞培養感染劑量(CCID50)之該改質EV71注射至該等小鼠之腹膜腔內或肌肉組織而感染，且其中該等經感染之小鼠展現與神經學肺水腫有關之急性腦脊髓炎，其特徵在於灶性出血及肺泡中之蛋白質性流體、兒茶酚胺之高血清含量及腦幹中之深度組織損害；(b)向該測試群投與抗病毒疫苗候選物；(c)監測該測試群及該對照群中之疾病進展；(d)比較該測試群中之該疾病進展與該對照群中之該疾病進展；及(e)選擇相對於該對照群減小該測試群中疾病進展之該抗病毒疫苗候選物。
- 如請求項3之方法，其中在小鼠中篩選之前，首先在經感染該改質腸病毒71之測試小鼠細胞株中篩選該抗病毒疫苗。
- 一種製備腸病毒71(EV71)神經感染之小鼠模式之方法，其包括(i)使用改質EV71感染年齡介於1週與2週之間之小鼠，其中該改質EV71為EV71：TLLmv，其(a)已寄存於食品工業發展研究所且給予寄存號碼BCRC 970074；或(b)已使用自SEQ ID NO：2合成該病毒RNA序列之高等反向基 因學回收，其中該小鼠係藉由將介於105與106之間之中值細胞培養感染劑量(CCID50)之該改質EV71注射至該小鼠之腹膜腔內或肌肉組織而感染，及(ii)飼養該受感染小鼠長達4週，藉此製得EV71神經感染之小鼠模式，其中該小鼠模式展現與神經學肺水腫有關之急性腦脊髓炎，其特徵在於灶性出血及肺泡中之蛋白質性流體、兒茶酚胺之高血清含量及腦幹中之深度組織損害。
- 如請求項5之方法，其中該CCID50為106。
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