CN107849540A - 肠道病毒71动物模型 - Google Patents
肠道病毒71动物模型 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107849540A CN107849540A CN201680019293.5A CN201680019293A CN107849540A CN 107849540 A CN107849540 A CN 107849540A CN 201680019293 A CN201680019293 A CN 201680019293A CN 107849540 A CN107849540 A CN 107849540A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mouse
- rodent
- virus
- infection
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001529459 Enterovirus A71 Species 0.000 title claims abstract description 559
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 221
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 190
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims abstract description 133
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 103
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 102
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 72
- 238000009795 derivation Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 112
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 39
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 36
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 36
- 102200135781 rs1042140 Human genes 0.000 claims description 29
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 claims description 16
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 16
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 claims description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 10
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 8
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 374
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 243
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 99
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 76
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 75
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 75
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 75
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 56
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 47
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 46
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 46
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 46
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 42
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 38
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 31
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 30
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 30
- 101100095199 Mus musculus Scarb2 gene Proteins 0.000 description 29
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 28
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 23
- 230000008859 change Effects 0.000 description 22
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 21
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 21
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 20
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 20
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 20
- 102000047612 human CCN2 Human genes 0.000 description 20
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 18
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 230000008473 connective tissue growth Effects 0.000 description 16
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 16
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 15
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 14
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 14
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 14
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 14
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 13
- 238000011160 research Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 11
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 11
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 11
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 11
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 10
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 description 10
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 9
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 9
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 9
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 8
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 208000020061 Hand, Foot and Mouth Disease Diseases 0.000 description 7
- 208000025713 Hand-foot-and-mouth disease Diseases 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000003818 area postrema Anatomy 0.000 description 7
- 206010006514 bruxism Diseases 0.000 description 7
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 6
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 6
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 5
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 5
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 5
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 5
- 210000003198 cerebellar cortex Anatomy 0.000 description 5
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 5
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 5
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 5
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 4
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 4
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 3
- 206010010947 Coordination abnormal Diseases 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 3
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 3
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 3
- 208000010513 Stupor Diseases 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 210000003591 cerebellar nuclei Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 208000016290 incoordination Diseases 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 210000000337 motor cortex Anatomy 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000002509 periaqueductal gray Anatomy 0.000 description 3
- 210000000449 purkinje cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 3
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 3
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 Amino Chemical group 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 2
- 241000988559 Enterovirus A Species 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 206010021888 Nervous system infections Diseases 0.000 description 2
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- VIROVYVQCGLCII-UHFFFAOYSA-N amobarbital Chemical compound CC(C)CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O VIROVYVQCGLCII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000001269 cardiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 210000002451 diencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 2
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 208000010726 hind limb paralysis Diseases 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 2
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001073 mediodorsal thalamic nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 208000006740 Aseptic Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010003840 Autonomic nervous system imbalance Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 241000867610 Chlorocebus pygerythrus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241001269238 Data Species 0.000 description 1
- 206010067671 Disease complication Diseases 0.000 description 1
- 101100011509 Drosophila melanogaster Baldspot gene Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010018873 Haemoconcentration Diseases 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 208000031361 Hiccup Diseases 0.000 description 1
- 101000595467 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000031927 Host cell factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010040 Host cell factor Proteins 0.000 description 1
- 241001207270 Human enterovirus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010015268 Integration Host Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027201 Meningitis aseptic Diseases 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 206010073333 Neuronophagia Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108010094052 Nik related kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010037394 Pulmonary haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000055391 Saffold virus Species 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001301 amobarbital Drugs 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000013096 assay test Methods 0.000 description 1
- 231100000877 autonomic nervous system dysfunction Toxicity 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009850 completed effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 208000019479 dysautonomia Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000003811 finger Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010231 histologic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006749 inflammatory damage Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010984 neurological examination Methods 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 210000002963 paraventricular hypothalamic nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 201000003144 pneumothorax Diseases 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 208000018290 primary dysautonomia Diseases 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000004088 pulmonary circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001202 rhombencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000036301 sexual development Effects 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000003863 superior colliculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000007484 viral process Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32311—Enterovirus
- C12N2770/32321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32311—Enterovirus
- C12N2770/32322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32311—Enterovirus
- C12N2770/32371—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
Abstract
本发明涉及肠道病毒71(EV71)，动物模型的开发以及候选抗EV71化合物的筛选。更具体地，本发明涉及这样的发现，已适应感染啮齿类动物细胞系的肠道病毒71(EV71)毒株或在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒可在免疫活性的啮齿类动物中引起疾病。
Description
相关申请的交叉引用
本申请涉及并要求2015年2月11日提交的美国临时专利申请系列号62/114,880和2015年1月28日提交的美国临时专利申请系列号62/108,828的优先权。每个申请整体援引加入本文。
序列表的提交
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表题为2577243PCTSequenceListing.txt，2015年12月29日创建，并且大小为32kb。电子格式的序列表的信息整体援引加入本文。
发明背景
本发明涉及肠道病毒71(EV71)，动物模型的开发以及候选抗EV71化合物的筛选。
本文中用来说明发明背景的出版物和其他材料，特别是提供关于实践的额外细节的案例，援引加入本文，并且为了方便在下文中按照作者和日期引用，在所附参考书目中按照作者字母顺序列出。
肠道病毒71(EV71)是直径大约30nm的小型无包膜病毒。病毒衣壳呈二十面体对称，并且包含60个相同单元(原体)，每个由4种病毒结构蛋白VP1–VP4组成。衣壳围绕7,450个核苷酸(nt)长的单链正义RNA基因组的核心。基因组包含单个开放阅读框，其编码2193个氨基酸(aa)的多聚蛋白，并且侧翼为745nt的长5′非翻译区(UTR)以及在其3′末端具有可变长度的poly-A带(poly-A tract)的85nt的较短3′UTR。所述多聚蛋白分为三个区，即P1、P2和P3。P1编码4种病毒结构蛋白1A-1D(VP4、VP2、VP3和VP1)；P2和P3编码7种非结构蛋白2A-2C和3A-3D[1–3]。主要衣壳蛋白(VP1)的系统发育分析将EV71分为6种基因型(以A-F为名称)[66]，并且基因型B和C进一步细分为基因亚型B1-B5和C1-C5[3]。
EV71引起一系列临床疾病，包括手足口病(HFMD)、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹，主要在婴幼儿中[4,5]。该病毒首先于1969年在美国加利福尼亚分离自患有急性脑炎的儿童，并且随后于1974年表征为肠道病毒属(Enterovirus)的一种新血清型[6]。在世界各地报道了有或无神经系统并发症和死亡的HFMD的爆发[7–20]。自1997年以来，EV71感染已成为亚太地区的主要公共卫生负担并受到持续的流行病学关注。由于于1997年出现在马来西亚的高度神经毒性EV71的HFMD爆发导致48例死亡[21,22]，然后于1998年在台湾发生的较大爆发具有超过129,000例的HFMD，405例严重感染和78例死亡，由于有神经源性心力衰竭和肺水肿的急性脑干脑脊髓炎[23–26]。在中华人民共和国，2008年记录了488,955个HFMD病例，有126例死亡[27]，并且在2009年增加至1,155,525例，有353例死亡[28]。在2010年，中国经历了有史以来最大的HFMD爆发，有超过1.7×106例，27,000个具有严重神经系统并发症的患者，和905例死亡[29]。
与其他人肠道病毒相似，EV71不能感染除人以外的动物，虽然恒河猴和食蟹猴可以被实验感染[30–32]。这主要是由于EV71低效结合至其用于脱壳和进入小鼠细胞的受体，其最近被鉴定为清道夫受体B类成员-2(SCARB2)蛋白[47]。人和鼠的SCARB2蛋白仅表现出84％氨基酸序列相同性，并因此显示显著的结构差异[49,67]，由此促成病毒-受体不相容性，构成非人细胞对EV71感染的天然抗性的基础。一旦病毒成功衔接细胞表面上的SCARB2受体并脱壳进入细胞质，病毒RNA被翻译，导致各种病毒非结构蛋白的表达。病毒RNA随后被复制，包装入衣壳并自由释放入环境中，以重新感染健康细胞。
理解其发病机理以及针对病毒的特异性疗法的开发受到缺少合适的小型动物模型的妨碍，因为EV71不能自然感染小型啮齿类动物。已尝试建立EV71感染和疾病的小鼠模型，大部分通过在幼龄乳鼠中连续传代的病毒适应(virus adaption)[33–39]。虽然一些模型能够概括临床疾病的症状，但是尚未报道在2周龄或更大的免疫活性小鼠中引起疾病。此外，EV71感染在人和实验猴中的疾病的临床特征和病理不可以在小鼠中复制，除了免疫受损的干扰素受体缺陷的AG129小鼠[35]。最近，表达人PSGL-1[68]和人SCARB2[69,70]蛋白的转基因小鼠已可获得，但是这些仅表现出对EV71感染的易感性的边缘改进。
由于它们的错误倾向复制和高突变率[40–42]，RNA病毒如已知为准种的一群相关变异序列进行复制[43,44]。其包含在某些环境中表现出最高适应性的主要物种，以及包含由具有一定概率分布的密切相关突变序列的集合组成的突变谱[44,45]。这些赋予RNA病毒基因组可塑性，这反映在它们快速适应变化中的环境的能力。
EV71感染引起致命神经系统疾病的机制未完全理解，因此几个研究小组已尝试在实验动物中复制人感染的病理，实验动物包括恒河猴和食蟹猴[114-120]、实验室小鼠[112,121-129]以及其他哺乳动物[130-133]。不幸的是，这些模型中没有一个表现出在人病例中观察到的神经系统特征的全谱，特别是那些可归因于具有暴发性神经源性肺水肿(NPE)的急性脑干脑炎[21,22,134-137]。实际上，即使在更准确复制人中EV71感染的表现(sign)和症状的实验系统中，深层机制基本上不同于在人患者中赋予疾病的那些。到目前为止，没有单一动物模型确凿地复制EV71诱导的NPE。关键区别是EV71在人患者中仅限于CNS组织[92-94,111]，而在动物模型中在包括骨骼肌[33-36,38,98]和肝[119]的非神经组织中也可以检测到病毒。虽然还已努力产生表达人EV71受体蛋白PSGL-1(P-选择素糖蛋白配体-1)和SCARB2(S 66cavenger受体B类，成员2)的转基因小鼠[68-70,47,138]，但这些模型中没有一个表现出NPE，因此它们对于鉴定对人患者的新干预的功用是有限的。
不存在合适的动物模型以在EV71感染的动物中研究感染和疾病发展，或者可以用来筛选抗病毒化合物或抗病毒疫苗。期望为了这些目的开发动物模型。
发明概述
本发明涉及肠道病毒71(EV71)，动物模型的开发以及候选抗EV71化合物的筛选。更具体地，本发明涉及这样的发现，已适应感染啮齿类动物细胞系的肠道病毒71(EV71)毒株或在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒可以在免疫活性的啮齿类动物和免疫受损的啮齿类动物中引起疾病。
此外，本发明涉及通过用适应感染NIH/3T3小鼠成纤维细胞的经修饰毒株(例如，EV71:TLLmv)感染BALB/c小鼠来开发EV71诱导的神经系统疾病的临床可信模型。利用这种方法，所述经修饰的EV71被用来在小鼠中诱导与神经源性肺水肿相关的急性脑脊髓炎，其特征在于肺肿胀以及与模拟感染的肺相比增加的器官重量。尽管不存在肺或心脏组织炎症，但是观察到肺泡中的灶性出血和蛋白液，高血清水平的儿茶酚胺以及脑干特别是延髓中的大量组织损伤。这些数据证实该模型准确复制人EV71诱导的神经源性肺水肿的迹象和症状。
因此，在一方面，本发明涉及一种动物模型，其包含用能够感染啮齿类动物的肠道病毒71(在本文中有时称作经修饰的肠道病毒71)感染的啮齿类动物。在一实施方案中，这样的肠道病毒71是啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71。在另一实施方案中，这样的肠道病毒71是在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒(clone derived virus,CDV)。在一些实施方案中，所述在VP1中的突变使得CDV能够使用啮齿类动物SCARB2蛋白感染啮齿类动物细胞。在一实施方案中，所述啮齿类动物是免疫活性的啮齿类动物。在另一实施方案中，所述啮齿类动物是免疫受损的啮齿类动物。用作模型的合适动物优选为哺乳动物，最优选为方便的实验室动物如兔、大鼠、小鼠等。在一实施方案中，所述动物是小鼠。在一些实施方案中，所述小鼠是BALB/c小鼠。在另一实施方案中，所述啮齿类动物细胞系是小鼠细胞系。在进一步的实施方案中，所述小鼠细胞系是小鼠NIH/3T3细胞系。在另一实施方案中，所述小鼠细胞系是小鼠Neuro-2a细胞系。在一实施方案中，所述啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71是EV71:TLLm。在另一实施方案中，所述啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71是EV71:TLLmv。在一实施方案中，所述在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒是CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]。所述动物模型可用于研究病毒的全身传播以及动物模型中的人疾病谱。所述动物模型还可用于筛选抗病毒药物和疫苗。
在另一方面，本发明提供一种制备动物模型的方法，所述动物模型具有在人中观察到的EV71诱导的神经系统感染、疾病和病理的全谱。在一些实施方案中，所述方法包括用本文描述的经修饰的肠道病毒71感染本文描述的啮齿类动物并饲养被感染的啮齿类动物长达约4周。在一些实施方案中，待感染的啮齿类动物的年龄为约1周-约4周。在其他实施方案中，将所述被感染的啮齿类动物饲养约1周-约4周。在一些实施方案中，所述啮齿类动物是如本文描述的小鼠。在其他实施方案中，通过用所述经修饰的肠道病毒71接种所述啮齿类动物来感染所述啮齿类动物。在一实施方案中，所述接种是腹腔内的(I.P.)。在另一实施方案中，所述接种是肌肉内的(I.M.)。在一些实施方案中，接种入所述啮齿类动物的病毒剂量是约103-约107的半数细胞培养感染剂量(CCID50)。
在一额外方面，本发明提供一种筛选抗病毒药物的方法。按照这个方面，所述方法包括以下步骤：提供测试组的动物和对照组的动物，其中每组的动物是本文描述的动物模型的动物；向测试组施用抗病毒药物候选物；监测测试组和对照组中的疾病发展；比较测试组中的疾病发展与对照组中的疾病发展；以及选择相对于对照组在测试组中减少疾病发展的抗病毒药物候选物。在一实施方案中，在动物中筛选之前首先在用啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71感染的受试啮齿类动物细胞系中筛选抗病毒药物。在另一实施方案中，在动物中筛选之前首先在用VP1中包含突变的克隆衍生的病毒(CDV)感染的受试啮齿类动物细胞系中筛选抗病毒药物。
在另一方面，本发明提供一种筛选有效抗病毒疫苗的方法。根据这个方面，所述方法包括以下步骤：提供测试组的动物和对照组的动物，其中每组的动物是本文描述的动物模型的动物；向测试组施用抗病毒疫苗候选物；监测测试组和对照组中的疾病发展；比较测试组中的疾病发展与对照组中的疾病发展；以及选择相对于对照组在测试组中减少疾病发展的抗病毒疫苗候选物。在一实施方案中，在动物中筛选之前首先在用啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71感染的受试啮齿类动物细胞系中筛选抗病毒疫苗候选物。在另一实施方案中，在动物中筛选之前首先在用VP1中包含突变的克隆衍生的病毒(CDV)感染的受试啮齿类动物细胞系中筛选抗病毒疫苗候选物。
附图简要说明
图1A-1O示出各种灵长类细胞系的病毒感染之后观察到的细胞病变效应(CPE)。在48hpi观察用1MOI的EV71:BS(图1A、1D、1G、1J和1M)、EV71:TLLm(图1B、1E、1H、1K和1N)或EV71:TLLmv(图1C、1F、1I、1L和1O)病毒感染的灵长类细胞：RD细胞(图A1–1C)、HeLa细胞(图1D-1F)、HEp-2细胞(图1G–1I)、Vero细胞(图1J–1L)和COS-7细胞(图1M–1O)的细胞病变效应或细胞单层的死亡。图像是3个独立实验中的代表性结果。
图2A-2O示出用EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv感染的细胞系中的病毒抗原检测。用1MOI的各种病毒感染过夜接种的哺乳动物细胞系：HeLa(图2A–2C)、HEp-2(图2D–2F)、CHO-K1(图2G–2LI、NRK(图2J–2L)和TCMK(图2M–2O)。在48hpi收获细胞，包被在Teflon玻片上并在冷丙酮中固定。将细胞用pan-肠道病毒抗体探测并用FITC缀合的抗小鼠IgG染色。图像是两个独立实验的代表。
图3A-3D示出在NIH/3T3和Vero细胞中确定的EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv的生长动力学。在各种时间点收获来自用1MOI的各种病毒感染的各种哺乳动物细胞的上清液，并且利用Reed和Muench方法进行滴定和计数。图3A：在Vero细胞中确定的EV71:BS病毒滴度。图3B：在NIH/3T3细胞中确定的EV71:TLLmv病毒滴度。图3C和3D：在NIH/3T3细胞中确定的EV71:TLLm病毒滴度。来自未表现出生产性感染的细胞系的生长曲线未示出。
图4A-4O示出各种啮齿类动物细胞系的病毒感染之后观察到的细胞病变效应(CPE)。在48hpi观察用1MOI的EV71:BS(图4A、4D、4G、4J和4M)、EV71:TLLm(图4B、4E、4H、4K和4N)或EV71:TLLmv(图4C、4F、4I、4L和4O)病毒感染的啮齿类动物细胞：NIH/3T3细胞(图4A–4C)、Neuro-2A细胞(图4D–4F)、TCMK细胞(图4G–4I)、CHO-K1细胞图(4J–4L)和NRK细胞(图4M–4O)的细胞病变效应或细胞单层的死亡。图像是来自3个独立实验的代表性结果。
图5A-5D示出通过滴度比例确定的EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv在NIH/3T3中的病毒适应度评估(virus fitness assessment)。在NIH/3T3和Vero细胞中单独确定的病毒滴度用来计算病毒适应度为log[(NIH/3T3细胞中的滴度)/(Vero细胞中的滴度)]。(图5A)EV71:BS、(图5B)EV71:TLLmv和(图5C和5D)EV71:TLLm的病毒适应度计算自图3A-3D中示出的病毒滴度值。获得自未表现出生产性感染的细胞系的病毒适应度测定未示出。
图6A和6B示出用EV71:BS病毒RNA转染的NIH/3T3诱导生产性感染。将过夜接种的NIH/3T3和Vero细胞用收获自NIH/3T3细胞的病毒上清液接种，所述NIH/3T3细胞以前转染了提取自EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv的病毒RNA。图6A：在24hpi利用倒置光显微镜将细胞成像以观察诱导的CPE。图6B：在7dpi收获细胞，包被在Teflon玻片上，用pan-肠道病毒抗体探测，并且用抗小鼠FITC缀合的抗体染色。
图7A和7B示出在30℃下EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv在NIH/3T3和Vero细胞中的病毒适应度评估。将用EV71:BS(图a、d、g)、EV71:TLLm(图b、e、h)或EV71:TLLmv(图c、f、i)感染的过夜接种的(图7A)NIH/3T3和(图7B)Vero细胞在30℃下温育并在24hpi(图a–c)、48hpi(图d–f)和72hpi(图g–i)在有相差的光显微镜下观察。拍摄的图像是两个独立实验的代表。
图8A和8B示出在37℃下EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv在NIH/3T3和Vero细胞中的病毒适应度评估。将用EV71:BS(图a、d、g)、EV71:TLLm(图b、e、h)或EV71:TLLmv(图c、f、i)感染的过夜接种的(图8A)NIH/3T3和(图8B)Vero细胞在37℃下温育并在24hpi(图a–c)、48hpi(图d–f)和72hpi(图g–i)在有相差的光显微镜下观察。拍摄的图像是两个独立实验的代表。
图9A和9B示出在39℃下EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv在NIH/3T3和Vero细胞中的病毒适应度评估。将用EV71:BS(图a、d、g)、EV71:TLLm(图b、e、h)或EV71:TLLmv(图c、f、i)感染的过夜接种的(图9A)NIH/3T3和(图9B)Vero细胞在39℃下温育并在24hpi(图a–c)、48hpi(图d–f)和72hpi(图g–i)在有相差的光显微镜下观察。拍摄的图像是两个独立实验的代表。
图10A-10L示出用EV71:BS病毒RNA转染的小鼠细胞系NIH/3T3、Neuro-2A和TCMK用于病毒复制的证据。将过夜接种的NIH/3T3、Neuro-2A和TCMK细胞用1000CCID50的EV71:BS病毒(图10A、10C和10E)感染或用等量的病毒RNA (图10B、10D和10F)转染，并且在48hpi收获用于病毒抗原检测。在7dpi收获上清液中的病毒并且传代至新鲜的Vero(图10G、10I和10K)和NIH/3T3细胞(图10H、10J和10L)。在48hpi收获细胞并染色病毒抗原。
图11A-11D示出EV71:TLLm和EV71:TLLmv基因组中的适应性突变在VP1和VP2中的定位。利用DeepView/SwissPDBviewer v3.7和EV71衣壳P1区的3D结构(PDB ID 4AED)建模EV71:TLLm(图11A和11C)和EV71:TLLmv(图11B和11D)的VP1(图11A和11B)和VP2(图11C和11D)区中观察到的适应性突变。观察到的突变大部分位于如图所示的蛋白质的表面暴露的环。
图12示出收获自用EV71:BS病毒RNA转染或用活病毒感染的细胞的病毒上清液的相对于Vero细胞中的滴度的NIH/3T3细胞中的滴度比例。收获来自用病毒RNA转染或用活病毒感染的NIH/3T3、Neuro-2A、Vero和TCMK的上清液并通过Reed-和Muench方法进行病毒计数。示出在NIH/3T3细胞中确定的log(滴度)相对于在Vero细胞中确定的滴度的比例。3T3-TRANS：RNA转染的NIH/3T3细胞；3T3-INF：病毒感染的NIH/3T3细胞。星号表示p-值<0.05的学生t-检验(Student’s t-test)。
图13A和13B示出受感染的动物的存活分析。每天观察受感染的动物并称重。图13A：示出在感染后不同天的死亡数量的受感染的动物的Kaplan-Meier图。图13B：将体重变化作图以确定动物的一般健康。
图14A-14D示出受感染的动物的症状和病理。大部分受感染的动物表现出疾病症状。图14A：后肢瘫痪(箭头)。图14B：尸检之后膨胀肺的大体解剖学(箭头)。还将组织切片用苏木精和伊红染剂染色(图14C在10x和图14D在20x)。黑色箭头指向浸润肺泡腔的粘液物质。
图15A-15E示出将病毒基因组RNA转染入灵长类和啮齿类动物细胞均产生活病毒。图15A：将提取自EV71:BS、EV71:TLLm或EV71:TLLmv的基因组RNA分别转染入Vero、NIH/3T3和Neuro-2a细胞(P0)。收获转染上清液并接种在Vero或NIH/3T3细胞(P1)上以评价病毒子代的生存力。通过观察细胞病变效应(CPE)(图15B)和免疫荧光检测病毒抗原(图15C)评价P0细胞的感染。相似地，通过CPE诱导(图15D)和免疫荧光检测表达的病毒抗原(图15E)评价来自EV71:BS RNA转染的细胞的P1细胞的感染。
图16A-16F示出小鼠细胞适应的EV71:TLLm的衣壳编码区驱动小鼠细胞生产性感染EV71:BS。图16A：产生EV71:BS全基因组的感染性cDNA克隆，并且用来自EV71:TLLm衣壳的序列替代P1区以产生嵌合病毒EV71:BS[M-P1]。图16B：用来自EV71:BS或EV71:BS[M-P1]的克隆衍生的病毒(CDV)感染细胞，并且通过诱导溶解的细胞病变效应(CPE)(图16C)和病毒抗原表达(图16D)评价感染。将上清液重新接种在新鲜细胞中，从获得自感染的Vero的传代(P1和P2)(图16E)以及NIH/3T3(3T3)和Neuro-2A(N2a)细胞的传代P1(图16F)测量病毒滴度。误差棒(error bar)表示SD。*p<0.05。
图17A-17G示出衣壳中的VP1-L169F氨基酸取代足以使得EV71:BS能够进入小鼠细胞。图17A：通过将VP1：K98E、E145A和L169F；以及VP2：S144T和K149I中的氨基酸取代并入全长EV71:BS基因组产生各种突变cDNA克隆。对应于氨基酸取代的突变在括号中写出。通过评价溶解的细胞病变效应(CPE)的诱导(图17B和17C)和病毒抗原的表达(图17D和17E)来监测用克隆衍生的病毒(CDV)感染各种细胞系。确定来自受感染的Vero细胞(图17F)以及NIH/3T3和Neuro-2a细胞(图17G)的病毒滴度以评价活病毒子代的产生。误差棒表示SD。
图18A-18E示出在衣壳中具有组合的VP1氨基酸取代的EV71:BS病毒表现出改善的小鼠细胞感染。图18A：通过将VP1和VP2中的氨基酸取代的组合并入全长EV71:BS基因组产生各种突变cDNA克隆。对应于氨基酸取代的突变在括号中写出。通过评价细胞病变效应(图18B)，病毒抗原表达(图18C)，以及来自受感染的Vero(图18D)、以及NIH/3T3(3T3)和Neuro-2a(N2A)细胞(图18E)的病毒收率监测用克隆衍生的病毒(CDV)感染各种细胞系。没有病毒收率的其他克隆未示出。误差棒表示SD。
图19A-19C示出在衣壳中具有组合的VP1-K98E、E145A、L169F氨基酸取代的EV71:BS病毒可以在小鼠神经元细胞系Neuro-2a中稳定传代。克隆衍生的病毒在Neuro-2a和NIH/3T3细胞中传代两次。在每次传代，通过评价病毒抗原表达(图19A)和Vero细胞中测量的病毒滴度(图19B)监测感染。误差棒表示SD。*p<0.05；**p<0.005；***p<0.0005。图19C：确定代表性CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]的基因组序列以评价氨基酸取代K98E(A2734G)、E145A(A2876C)和L169F(C2947T)的证据。突变位点用星号标记。
图20A-20F示出EV71:TLLmv利用SCARB2感染灵长类和小鼠细胞。如通过减少的荧光信号确定的，用小鼠SCARB2(mSCARB2)抗血清预温育固定在Teflon玻片上的NIH/3T3细胞(图20A)和Vero细胞(图20B)抑制EV71:TLLmv结合。利用Imaris成像软件测量膜上的荧光强度(n＝100)。NSP(非特异性兔血清)。如通过免疫荧光测定评价的，在接种至NIH/3T3细胞上之前用mSCARB2(图20C)或人SCARB2(hSCARB2)(图20D)的重组可溶性蛋白预温育EV71:TLLmv减少病毒感染严重程度。在用EV71:TLLmv感染之前用hSCARB2(图20E)或mSCARB2(图20F)抗血清预温育活NIH/3T3细胞减少培养上清液中的病毒滴度。*p<0.05；**p<0.005；***p<0.0005。
图21A-21D示出用小鼠SCARB2兔抗血清温育Neuro-2A细胞减少用CDV突变体感染的严重程度。通过评价细胞病变效应(CPE)的诱导(图21A和21C)和感染后7天的病毒收率(图21B和21D)监测在用CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F](图21A和21B)或CDV:BS[M-P1](图21C和21D)感染之前用兔mSCARB2抗血清预温育的细胞中的感染严重程度。误差棒表示SD；*p<0.05；**p<0.005。CPE程度：1(0-25％细胞死亡)，2(25-50％)，3(50-75％)，4(75-100％)。
图22a-22c示出如通过在1周龄BALB/c小鼠中严重疾病的诱导证实的，EV71:TLLmv是3种经修饰的病毒毒株中最恶性的。图22a：如在观察期结束时评价的，采集自用EV71:BS(n＝6)、EV71:TLLm(n＝5)或EV71:TLLmv(n＝7)感染(腹腔内；I.P.)的小鼠血清中的中和抗体滴度。图22b和22c：通过I.P.途径(图22b)或肌肉内(I.M.)途径(图22c)用106CCID50(半数细胞培养感染剂量)的EV71:BS、EV71:TLLm或EV71:TLLmv接种的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。利用具有Welch's修正不等方差的的t-检验(图22a)或Mantel-Cox log-rank检验(图22b和22c)确定统计学显著性。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005。
图23a-23h示出小鼠中EV71:TLLmv感染的特征在于类似人疾病谱的急性严重疾病。图23a和23b：1周龄小鼠中EV71:TLLmv感染的剂量依赖性致死率。图23a：用各种剂量的EV71:TLLmv I.P.注射的6日龄幼崽的Kaplan-Meier存活曲线。图23b：中间人道终点(HD50)等于3.98x 103CCID50的病毒剂量。图23c：通过I.P.或I.M.途径用EV71:TLLmv接种的1周龄小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。图23d：用106CCID50的病毒剂量接种的小鼠中EV71:TLLmv感染诱导的年龄和途径依赖性致死率。图23e和23f：在绝症小鼠中观察到的临床表现，其中一些表现为后肢(灰色箭头)和/或前肢瘫痪。其他还表现出躯干上的小无毛病变(黑色箭头)。图23g和23h：通过I.P.途径(图23g)或I.M.途径(图23h)用EV71:TLLmv接种的1周龄小鼠的疾病分类。
图24a-24e示出BALB/c小鼠中EV71:TLLmv感染的严重程度取决于宿主年龄、病毒剂量和施用途径。图24a和24b：将8-10只小鼠的组通过I.P.途径(图24a)或I.M.途径(图24b)用106CCID50的病毒接种，并且对不同年龄组的动物确定Kaplan-Meier存活曲线。图24c和24d：在观察期结束时从通过I.P.途径(图24c)或I.M.途径(图24d)接种的各种年龄小鼠中采集的血清中的中和抗体滴度；1周(I.P.n＝7；I.M.n＝4)，2周(n＝5，n＝7)，3周(n＝4；n＝8)和4周(n＝4；n＝6)。图24e：采集自用各种剂量的EV71:TLLmv接种(I.P.)的小鼠的血清中的中和抗体滴度；CCID50 102(n＝5)，103(n＝4)，104(n＝4)，105(n＝5)或106(n＝7)。通过Mantel-Cox log-rank检验(图24a和24b)或具有Welch's修正的不等方差的t-检验(图24c、24d和24e)确定统计学显著性。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005。
图25a-25k示出IA类小鼠中EV71诱导的神经源性肺水肿(NPE)的表现。图25a-25d：获得自空白感染的(mock-infected)小鼠(图25a)或者表现出疾病IA类(图25b)、IB类(图25c)或II类(图25d)表现的EV71:TLLmv感染的小鼠的肺的代表性大体病理学(representitive gross pathology)。图像示出顶部和侧面视图。注意图25b中明显的肺不完全塌陷(白色箭头)。图25e：收获自空白感染的小鼠(n＝4)或者表现出疾病IA类(n＝8)、IB类(n＝9)或II类(n＝4)表现的EV71:TLLmv感染的小鼠的肺的湿重比较。图25f-25i：用苏木精&伊红(H&E)染色的肺组织切片(5μm)的代表性图像。示出获得自空白感染的小鼠(图25f)或者表现出疾病IA类(图25g)、IB类(图25h)或II类(图25i)表现的EV71:TLLmv感染的小鼠的肺的低倍和高倍放大图像。注意肺泡腔中粉色蛋白液的存在(图25g中的星号，高倍放大)，其中的一些充满红细胞(图25g中的灰色箭头，高倍放大)。图25j和25k：如在空白感染的小鼠(n＝9)或者表现出疾病IA类(n＝8)、IB类(n＝9)或II类(n＝3)表现的EV71:TLLmv感染的小鼠中确定的肾上腺素(图25j)和去甲肾上腺素(图25k)的血清水平。误差棒表示SEM。通过Mann-Whitney检验(图25e)或具有Welch's修正的不等方差的t-检验(图25j和25k)确定统计学显著性。*p<0.05，**p<0.005。
图26a和26b示出在IA类小鼠的肺和心脏组织中不存在病毒复制或炎症。图26a：肺组织切片(5μm)的代表性图像，所述肺组织切片源自用EV71:TLLmv感染的各种组的小鼠，并且用苏木精&伊红(H&E)染色用于组织病理学检查，或者利用兔血清抗EV71抗原(EV71IHC)标记用于病毒抗原定位。图26b：为H&E和EV71IHC处理的心脏组织切片(5μm)的代表性图像。
图27a-27d示出代表性地图，其示出EV71抗原的定位和分布以及IA类和IB类小鼠脑的不同区域中的病毒诱导的损伤。示出小脑皮层(CTX)(图27a、27b和27c)；下丘脑(HY)(图27a和27b)；海马(HP)(图27b和27c)；丘脑(TH)(图27b)；中脑(MB)和脑桥(P)(图27c)；以及小脑(CBX)和延髓(MY)(图27d)。相应标记检测到病毒抗原和病理损伤的区域。较大的点表示较强的信号/损伤大小。从brainstars.org1下载模板图像并在Creative Commons ofJapan下获得许可。脑组织冠状切面图获得自互动的Mouse Brain Atlas(http colonslash slash mouse dot brain-map dot org slash static slash atlas)[113]。
图28a-28n示出小鼠中的EV71:TLLmv感染与神经组织破坏和广泛的病毒复制相关。图28a-28l：用苏木精和伊红(H&E)染色或者用兔血清抗EV71抗原(EV71IHC)免疫染色的脑组织切片(5μm)的代表性图像。切片源自表现出疾病IA类(左图)或IB类(右图)表现的小鼠。脑中的病理损伤包括水肿(虚线框)、浸润细胞(图28k的左图的左上象限中的对角线区和右下象限的对角线区)、噬神经细胞现象(图28a-28c的左图)、神经变性(黑色星号)和浦肯野细胞的变性(灰色星号)。图28m和28n：来自疾病IA类(图28m)或IB类(图28n)小鼠的脊髓冠状切面的代表性图。高亮的是检测到病毒抗原和病理损伤的区域。较大的点大小表示更广泛的信号/损伤。V，腹侧；D，背侧。
图29a-29c示出IA类小鼠后脑其他区域中的EV71抗原和病毒诱导的损伤。图29a：用苏木精和伊红(H&E)染色用于组织病理学检查或者用兔血清抗EV71抗原(EV71IHC)染色用于病毒抗原定位的齿状核的代表性图像。方框区域在插图中放大示出。图29b：来自I类小鼠的脑干尾部的代表性图像。图像示出小脑皮层(CBX)和延髓(MY)。还标记极后区(areaprostrema)(AP；星号)和孤束核(NTS；虚线圆)用于参考。示出检测到病毒抗原和病理损伤的区域。较大的点代表较强的信号/损伤大小。从brainstars.org1下载模板图像并在Creative Commons of Japan下获得许可。脑组织冠状切面图获得自Mouse Brain Atlas(http colon slash slash mouse dot.brain-map dot org slash static slash atlas)[113]。图29c：来自IA类小鼠的髓质的代表性图像，其示出AP和NTS中的H&E和EV71IHC染色模式。
图30a-30f示出来自空白感染的小鼠(健康对照)的神经组织的组织切片。用苏木精&伊红(H&E)染色用于组织病理学检查或者用兔血清抗EV71抗原(EV71IHC)染色用于病毒抗原定位的正常小鼠组织切片(5μm)的代表性图像。脑切片示出海马中的CA3椎体神经元(图30a)；下丘脑中的网状神经元(图30b)和丘脑(图30c)；中脑导水管周围灰质中的神经元(图30d)；小脑皮层中的浦肯野细胞层(图30e)。注意正常浦肯野细胞形态学(图30e的左图中的黑色星号)；以及延髓中的网状神经元(图30f)。
图31a-31e示出其他神经组织中的EV71:TLLmv诱导的病理和病毒抗原分布。用苏木精&伊红(H&E)染色用于组织病理学检查或者用兔血清抗EV71抗原染色用于免疫组织化学分析(EV71IHC)的小鼠组织切片(5μm)的代表性图像。脑组织获得自EV71:TLLmv感染或空白感染的小鼠。脑冠状切片示出运动皮层椎体神经元(图31a)；脑桥灰质神经元(图31b)；以及来自颈椎(图31c)、胸椎(图31d)和腰椎(图31e)的脊髓冠状切片。注意运动皮层中明显的细胞浸润(图31a中左图的右下象限)和神经元坏死(图31a的第二个图中的黑色星号)。图31c-31e中的方框区域在各插图中放大示出。
发明详述
本发明涉及肠道病毒71(EV71)，动物模型的开发以及候选抗EV71化合物的筛选。更具体地，本发明涉及这样的发现，已适应感染啮齿类动物细胞系的肠道病毒71(EV71)毒株或在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒可以在免疫活性的啮齿类动物和免疫受损的啮齿类动物中引起疾病。这些EV71毒株在本文中有时称作经修饰的肠道病毒71。
此外，本发明涉及通过用适应感染NIH/3T3小鼠成纤维细胞的经修饰的毒株(例如，EV71:TLLmv)感染BALB/c小鼠来开发EV71诱导的神经系统疾病的临床可信模型。利用这种方法，经修饰的EV71被用来在小鼠中诱导与神经源性肺水肿相关的急性脑脊髓炎，其特征在于肺肿胀以及与空白感染的肺相比增加的器官重量。尽管不存在肺或心脏组织炎症，但是观察到肺泡中的灶性出血和蛋白液，高血清水平的儿茶酚胺以及脑干特别是延髓中的大量组织损伤。这些数据证实该模型准确复制人EV71诱导的神经源性肺水肿的表现和症状。
因此，在一方面，本发明涉及一种动物模型，其包含用能够感染啮齿类动物的肠道病毒71(在本文中有时称作经修饰的肠道病毒71)感染的啮齿类动物。在一实施方案中，这样的经修饰的肠道病毒71是啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71。在另一实施方案中，这样的经修饰的肠道病毒71是在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒(CDV)。在一些实施方案中，所述VP1中的突变使得CDV能够使用啮齿类动物SCARB2蛋白感染啮齿类动物细胞。在一实施方案中，所述啮齿类动物是免疫活性的啮齿类动物。在另一实施方案中，所述啮齿类动物是免疫受损的啮齿类动物。用作模型的合适动物优选哺乳动物，最优选方便的实验室动物如兔、大鼠、小鼠等。在一实施方案中，所述动物是小鼠。在另一实施方案中，所述啮齿类动物细胞系是小鼠细胞系。在进一步的实施方案中，所述小鼠细胞系是小鼠NIH/3T3细胞系。在另一实施方案中，所述小鼠细胞系是小鼠Neuro-2a细胞系。在一实施方案中，所述啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71是EV71:TLLm。在另一实施方案中，所述啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71是EV71:TLLmv。在一实施方案中，所述在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒是CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]。所述动物模型可用于研究病毒的全身性传播以及动物模型中的人疾病谱。所述动物模型还可用于筛选抗病毒药物和疫苗。
在按照需要的基础上制备所述动物模型。制备啮齿类动物细胞系适应的EV71毒株的大量标准化储备，滴定并保存在深度冷冻器中(-80℃)。用标准化滴度的病毒毒株感染“标准化”(基于统计学计算)数量的啮齿类动物(如BALB/c小鼠或NSG小鼠)以制备所述动物模型。本发明的动物模型在受感染时发展神经系统症状(与可以在人中发展的那些相似)。如本文所示，所述经修饰的肠道病毒71(如啮齿类动物细胞系适应的EV71病毒毒株)影响脑和在小鼠中表现的各种神经系统疾病。
在一些实施方案中，所述啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71是EV71:TLLm。在NIH/3T3小鼠细胞系中连续传代人EV71BS毒株最少60个循环之后衍生EV71:TLLm。在一实施方案中，EV71:TLLm于2015年1月12日在布达佩斯条约的条款下保藏在位于武汉大学，武汉430072中华人民共和国的中国典型培养物保藏中心，并且分配保藏号CCTCC V201437。在另一实施方案中，如果利用病毒RNA序列(GenBank登录号KF514879；SEQ ID NO:1)合成病毒RNA，可以利用高级反向遗传学(advanced reverse genetics)回收EV71:TLLm。高级反向遗传学技术是本领域公知的[84-87]。
在另一实施方案中，所述啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71是EV71:TLLmv。EV71:TLLmv衍生自在NIH/3T3小鼠细胞系中进一步传代EV71:TLLm另外40个循环。在一实施方案中，EV71:TLLmv于2015年1月12日在布达佩斯条约的条款下保藏在位于武汉大学，武汉430072中华人民共和国的中国典型培养物保藏中心，并且分配保藏号CCTCC V201438。在另一实施方案中，如果利用病毒RNA序列(GenBank登录号KF514880；SEQ ID NO:2)合成病毒RNA，可以利用高级反向遗传学回收EV71:TLLmv。高级反向遗传学技术是本领域公知的。
在进一步的实施方案中，所述经修饰的肠道病毒71是在衣壳蛋白VP1中具有突变的克隆衍生的病毒(CDV)，这使得所述经修饰的肠道病毒71能够使用啮齿类动物SCARB2蛋白感染啮齿类动物细胞。通过利用技术人员已知或如本文所述的技术制备全长基因组cDNA克隆产生在VP1中具有突变的经修饰的肠道病毒71。利用位点定向诱变或CRISPR技术产生VP1或肠道病毒71其他蛋白中的突变(参见，例如，PCT公开号WO2014/127287)。利用技术人员已知或如本文所述的技术从cDNA克隆复制活病毒(克隆衍生的病毒(CDV))。然后测试具有不同突变或突变集合的CDV感染啮齿类动物细胞的能力。或者，然后测试具有不同突变或突变集合的CDV结合至啮齿类动物SCARB2蛋白的能力作为初始筛选。任何合适的肠道病毒71毒株可以用来开发在VP1中具有突变的CDV。对于每种毒株，突变的数量和特定突变可变化以产生足以在靶啮齿类动物细胞中产生全面感染的CDV。因此，可以产生多种啮齿类动物毒性EV71毒株，其可以感染几种、许多种或所有类型的啮齿类动物，例如小鼠、细胞系。在实施方案中，用来产生在VP1中具有突变的CDV的所述EV71毒株是肠道病毒71BS毒株。在一实施方案中，所述经修饰的肠道病毒71是CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]。
在另一方面，本发明提供一种制备动物模型的方法，所述动物模型具有在人中观察到的EV71诱导的神经系统感染、疾病和病理的全谱。在一些实施方案中，所述方法包括用本文描述的经修饰的肠道病毒71感染本文描述的啮齿类动物并饲养经感染的啮齿类动物长达约4周。在一实施方案中，所述经修饰的肠道病毒71是EV71:TLLmv。在另一实施方案中，所述经修饰的肠道病毒71是EV71:TLLm。在进一步的实施方案中，所述经修饰的肠道病毒71是CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]。在一些实施方案中，待感染的啮齿类动物的年龄为约1周-约4周。在其他实施方案中，待感染的啮齿类动物的年龄为约1周-约3周。在其他实施方案中，待感染的啮齿类动物的年龄为约1周-约2周。在一实施方案中，待感染的啮齿类动物的年龄为约1周。在另一实施方案中，待感染的啮齿类动物的年龄为约2周。在进一步的实施方案中，待感染的啮齿类动物的年龄为约3周。在一些实施方案中，将受感染的啮齿类动物饲养约1周-约4周。在其他实施方案中，将受感染的啮齿类动物饲养约1周-约3周。在其他实施方案中，将受感染的啮齿类动物饲养约1周-约2周。在一实施方案中，将受感染的啮齿类动物饲养约1周。在另一实施方案中，将受感染的啮齿类动物饲养约2周。在一额外的实施方案中，将受感染的啮齿类动物饲养约3周。在进一步的实施方案中，将受感染的啮齿类动物饲养约4周。在一些实施方案中，所述啮齿类动物是免疫受损的啮齿类动物。在一些实施方案中，所述啮齿类动物是如本文描述的小鼠。在一实施方案中，所述免疫受损的小鼠是BALB/c小鼠。在其他实施方案中，通过用经修饰的肠道病毒71接种啮齿类动物来感染所述啮齿类动物。在一实施方案中，所述接种是腹腔内的(I.P.)。在另一实施方案中，所述接种是肌肉内的(I.M.)。在一些实施方案中，接种入啮齿类动物的病毒剂量是约103-约107的半数细胞培养感染剂量(CCID50)。在其他实施方案中，接种入啮齿类动物的病毒剂量是约103-约106的CCID50。在一实施方案中，接种入啮齿类动物的病毒剂量是约4x 103-约106的CCID50。在另一实施方案中，接种入啮齿类动物的病毒剂量是约104-约106的CCID50。在一额外的实施方案中，接种入啮齿类动物的病毒剂量是约105-约106的CCID50。在一实施方案中，接种入啮齿类动物的病毒剂量是约106的CCID50。
以这种方式制备的动物模型是表现出表面效度的EV71神经感染(neuro-infection)的可信小鼠模型，即这些动物表现出在人患者中EV71感染诱导的神经系统疾病(包括NPE)的全谱中可以观察到的整个范围的临床表现。这种动物模型还表现出关于疾病的大体和组织病理学特征的建构效度，这与致命的人类病例中报道的那些极为相似。这种新的体内模型代表一种强大的工具，其用于鉴定EV71神经病发病机理中的关键事件，用于剖析EV71诱导的NPE的机制，开发新的治疗形式和潜在的抗病毒疗法，以及用于进行新疫苗的临床前评价。
在一额外方面，本发明提供一种筛选抗病毒药物的方法。按照这个方面，所述方法包括以下步骤：提供测试组的动物和对照组的动物，其中每组的动物是本文描述的动物模型的动物；向测试组施用抗病毒药物候选物；监测测试组和对照组中的疾病发展；比较测试组中的疾病发展与对照组中的疾病发展；以及选择相对于对照组减少测试组中的疾病发展的抗病毒药物候选物。在一实施方案中，在动物中筛选之前首先在用啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71感染的受试啮齿类动物细胞系中筛选抗病毒药物。在另一实施方案中，在动物中筛选之前首先在用VP1中包含突变的克隆衍生的病毒(CDV)感染的受试啮齿类动物细胞系中筛选抗病毒药物。
在另一方面，本发明提供一种筛选有效抗病毒疫苗的方法。根据这个方面，所述方法包括以下步骤：提供测试组的动物和对照组的动物，其中每组的动物是本文描述的动物模型的动物；向测试组施用抗病毒疫苗候选物；监测测试组和对照组中的疾病发展；比较测试组中的疾病发展与对照组中的疾病发展；以及选择相对于对照组减少测试组中的疾病发展的抗病毒疫苗候选物。在一实施方案中，在动物中筛选之前首先在用啮齿类动物细胞系适应的肠道病毒71感染的受试啮齿类动物细胞系中筛选抗病毒疫苗候选物。在另一实施方案中，在动物中筛选之前首先在用VP1中包含突变的克隆衍生的病毒(CDV)感染的受试啮齿类动物细胞系中筛选抗病毒疫苗候选物。
按照本发明的方法，制备啮齿类动物细胞系适应的EV71毒株的大量标准化储备，滴定并保存在深度冷冻器中(-80℃)。或者，制备在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒(CDV)毒株的大量标准化储备，滴定并保存在深度冷冻器中(-80℃)。用标准化滴度的病毒毒株感染“标准化”(基于统计学计算)数量的动物如BALB/c小鼠或NSG小鼠。在疾病出现之前(预防效果的测定)或在疾病发生时(药物疗效的测定)向受感染的啮齿类动物施用各种标准化剂量的候选抗病毒药物或抗病毒疫苗。在一实施方案中，利用对啮齿类动物细胞系适应的EV71病毒毒株的溶细胞感染易感的组织培养细胞系(如本文描述的那些，包括实施例中描述的那些)进行抗EV71化合物的高通量体外筛选。在另一实施方案中，利用对在VP1中包含突变的克隆衍生的病毒(CDV)毒株的溶细胞感染易感的组织培养细胞系(如本文描述的那些，包括实施例)进行抗EV71化合物的高通量体外筛选。利用本领域公知的技术进行体外筛选。然后在本文描述的动物模型中体内筛选来自体外筛选选定的有希望的化合物。
如实施例2-8所示，人EV71分离株(EV71:BS)的连续传代产生获得体外感染培养的啮齿类动物细胞系能力的病毒毒株。源自NIH/Swiss小鼠胚胎[46]的小鼠贴壁成纤维细胞细胞系NIH/3T3用来使人EV71毒株适应感染啮齿类动物细胞。描述了两种这样的NIH/3T3适应的毒株-EV71:TLLm和EV71:TLLmv，其中EV71:TLLm代表早期(传代次数60)，而EV71:TLLmv代表适应过程的晚期(传代次数100)。基于病毒诱导的CPE的出现，高滴度值的测量，以及通过免疫染色的病毒抗原的阳性检测，我们将细胞中病毒诱导的感染分类为生产性或非生产性。生产性感染表现出阳性病毒抗原检测以及高病毒滴度，无论CPE的观察。在另一方面，非生产性感染的特征在于在截止测定极限下不可测量的病毒滴度，不管病毒抗原检测和/或CPE的观察。
尽管临床分离株EV71:BS仅感染灵长类细胞系，但EV71:TLLm生产性感染灵长类和啮齿类动物细胞系。值得注意的是，虽然EV71:TLLm病毒已成功获得感染啮齿类动物细胞的能力，但是适应NIH/3T3细胞的程度较不明显。如相对复制速度(RRR)测定中的负值所示(图5C和5D)，利用Vero细胞确定的病毒滴度比在NIH/3T3细胞中确定的高很多。此外，EV71:TLLm成功感染Vero细胞，在各种温育温度下导致完全CPE，而其仅可以在37℃下于受感染的NIH/3T3中实现完全CPE。小鼠细胞中的进一步适应，其产生EV71:TLLmv病毒，导致表现出较高程度的小鼠细胞适应的病毒毒株(图5B)，但是以缩小容许的宿主细胞谱为代价。EV71:TLLmv不像感染小鼠细胞一样高效地感染灵长类细胞系，虽然其表现出成功的感染，其导致在较广温度范围下温育的NIH/3T3细胞的完全CPE(表1)。但是，与前身EV71:TLLm相比，EV71:TLLmv看来已丧失进入并在猴肾COS-7细胞以及人HeLa和Hep-2细胞中复制的能力(图3B-3C；图2B-2C、2E-2F和2H-2I)。其还丧失在仓鼠CHO-K1和大鼠NRK细胞中高效复制的能力(图3B–3D；图2K–2L和2N–2O)。这些观察表明在NIH/3T3细胞中进一步传代病毒增加在小鼠细胞中适应的程度，以丧失在其他来源的细胞系中的感染能力为代价。
虽然不可精确定位哪个氨基酸取代适应小鼠NIH/3T3宿主细胞，但是病毒全基因组测序可揭示潜在的适应机制。鉴定的大多数氨基酸取代位于P1(衣壳)和RNA聚合酶(3D区)蛋白中(表2、3)，表明在宿主细胞进入和复制中可能改变的病毒蛋白活性。从EV71:TLLm和EV71:TLLmv毒株获得感染新宿主细胞的能力预期P1区中突变的积累。病毒使用衣壳蛋白形成结构环境开始通过病毒受体与容许的宿主细胞相互作用，所述病毒受体最近已鉴定为清道夫受体B类成员2(SCARB2)[47]，并且后来表征为EV71的主要病毒脱壳受体[48]，并且其被人肠道病毒A (HEV-A)物种的一些成员所使用。人SCARB2蛋白与其他灵长类的该蛋白享有约99％的序列相同性。在另一方面，小鼠SCARB2蛋白与灵长类蛋白相比表现出15％的序列相异性[49]，暗示显著的结构偏离灵长类SCARB2，并且可能有助于啮齿类动物细胞对天然EV71感染的反抗。这是可信的，病毒衣壳中的适应性突变可以使得病毒能够结合小鼠细胞受体并导致成功进入和感染新宿主。
衣壳蛋白突变的作图显示病毒P1区中大部分经鉴定的氨基酸取代位于蛋白质的暴露区中(图11A-11D)，特别是在VP1表面上的B–C、D–E、E–F和G-H环中。VP1残基150–180包含衔接SCARB2蛋白的病毒衣壳峡谷(canyon)。中心在Gln-172的这个区域包含在氨基酸163–177的主要VP1中和表位[32]。EV71:TLLm和EV71:TLLmv均表现出VP1峡谷的E-F环中的取代E167D和L169F(图11A–11B)，以前尚未报道的基因座。靠近SCARB2停靠位点的其他显著的氨基酸取代包括B–C环内的N104D和G-H环内的S241L，其位于Gln-172的半径内。与K244E联合的VP1S241L突变以前已报道产生自CHO细胞系适应的EV71的小鼠传代[50]。据发现与VP2K149I组合的这个突变与5-天小鼠幼崽中的非毒性表型相关。但是，据报道在VP1241从Leu至Ser的回复突变[51]产生自NOD/SCID小鼠脑组织中的适应，并且据发现与小鼠毒性表型相关。远离SCARB2停靠位点且位于D–E环中的VP1E145A突变是赋予感染小鼠细胞能力的另一候选。以前已报道VP1 145突变[34,37]，并且单一E145A突变导致NOD/SCID小鼠中的毒力[51]。C4基因型EV71的VP1中的另一突变Q145E与5-日龄小鼠中的毒力相关[52]。VP2中的小鼠细胞适应的突变，特别是残基136–150的中和表位内的那些[53]，也可有助于病毒感染啮齿类动物细胞的能力。在EV71:TLLm中观察到VP2E-F环中的两个取代(图11C)，但是3个取代存在于EV71:TLLmv中(图11D)。以前从未描述过这些突变，虽然在E-F环中的VP2 149的附近基因座在文献中曾提到[34,50,54]，并且描述为PSGL-1过量表达细胞中的传代适应性突变[55]。
为了研究P1区突变在结合用于宿主细胞进入的病毒受体中可能的作用，将EV71:BS病毒RNA转染入小鼠细胞。如病毒诱导的CPE的观察以及如Vero细胞中测定的培养上清液中可测量的病毒滴度所表明的(图12)，将EV71:BS RNA直接引入小鼠细胞的细胞质导致NIH/3T3细胞中的生产性感染。但是，将病毒上清液重新接种在新鲜NIH/3T3细胞上不能诱导生产性感染(图6A)，并且未检测到病毒抗原(图S4H)。相似地，将EV71:BS RNA转染入Neuro-2A细胞而不是直接病毒感染导致Neuro-2A细胞中的阳性抗原染色(图10C和10D)和可测量的病毒滴度(图12)。传代至新鲜Vero和NIH/3T3细胞的病毒上清液导致Vero中的阳性抗原染色(图10I)，但是在NIH/3T3细胞中没有(图10J)。这些数据表明规避用于宿主细胞进入的受体衔接的要求导致NIH3T3和Neuro-2A细胞中的成功感染和病毒子代的产生。这些数据还支持人EV71:BS不能通过小鼠细胞受体成功进入小鼠NIH/3T3和Neuro-2A细胞。此外，这些数据表明EV71:TLLm和EV71:TLLmv基因组的P1区内的突变赋予病毒有效的受体衔接的能力，并结果赋予宿主细胞进入的能力。
在P2和P3区中也观察到几个氨基酸突变，其编码对于病毒复制和操纵宿主细胞蛋白翻译机器至关重要的病毒蛋白[56]。这些适应性突变可在优化小鼠细胞内的EV71基因组复制和翻译中发挥功能。病毒3D蛋白单独在EV71:TLLmv中积累8个氨基酸取代，在EV71:TLLm中积累4个，并且两种毒株各自在3B中表现出1个突变，并且在3C中表现出2个突变。将病毒RNA直接接种入TCMK细胞洞察适应性突变在病毒的非结构蛋白中可能的作用。虽然已显示TCMK细胞容许EV71:TLLm和EV71:TLLmv感染(图3B和3D；图4Q和4R)，但是将EV71:BS病毒RNA转染入TCMK细胞并未导致成功感染。在感染和转染的细胞中未检测到病毒抗原信号(图10E–10F)，并且将病毒上清液传代至新鲜NIH/3T3和Vero细胞未产生阳性病毒抗原检测(图10K和10L)。此外，在受感染和经转染的细胞中均没有可测定的病毒滴度(图12)。这些数据表明除了衣壳区中的突变，需要EV71:TLLm和EV71:TLLmv中发现的P2和P3区内的突变以成功感染TCMK细胞。
据信这是首次报道在小鼠细胞系中连续传代之后成功获得生产性感染几种啮齿类动物细胞系能力的最初源自人临床样品的EV71毒株。RNA复制期间相对高的突变率导致用作未来适应性潜力的表型性状的遗传库的变异基因组，并且作为准种分布的结果复制[57,58]导致RNA病毒基因组的动态可塑性，其赋予改变中的环境的适应性[59,60]。虽然以前已报道EV71感染乳鼠[34,37,38,51]和其他啮齿类动物(例如，沙鼠)[39]，但是没有报道生产性感染体外培养的啮齿类动物细胞。这可能是由于与表型和宿主范围中的主要变化相关的高遗传屏障[58]。有趣的是，这是首次报道EV71的共有全基因组序列内的大量适应性突变。尽管以前记录的小鼠适应的EV71报道了基因组中的少于10个氨基酸取代[34,38,51]，但是我们报道了EV71:TLLm中的21个和EV71:TLLmv中的36个，仍然超过以前经鉴定的适应性突变的最大数量[37]。这些表明小鼠组织中病毒的几次传代[34,36,37]可能不足以打破遗传屏障并使病毒适应感染培养的小鼠细胞。相反，如这个研究中观察到的，几百次连续传代可能是必需的。
最近已解释EV71的宿主细胞限制，证实EV71利用清道夫受体B类成员-2(SCARB2)作为其用于宿主细胞进入[47]和在核内体中病毒脱壳[72]的功能性受体。人和小鼠SCARB2蛋白仅表现出84％氨基酸序列相同性[67]，其表明两种蛋白之间的结构差异。这种情况解释了EV71临床分离株一般不能感染小鼠衍生的细胞，以及小鼠和其他啮齿类动物对EV71实验性感染的一般抗性，这使得开发EV71感染的小动物模型的努力复杂化。尽管这种病毒-受体不相容性，但是，我们已显示当通过将病毒RNA转染入细胞来绕过感染的初始阶段(即受体介导的细胞进入)时，一些小鼠细胞支持EV71感染。EV71:BS不感染Neuro-2a和NIH/3T3细胞[71]，但是病毒基因组RNA的转染导致EV71蛋白的表达、溶解的细胞病变效应(CPE)的诱导以及活病毒子代的产生。相似地，以前在将脊髓灰质炎病毒RNA转染入哺乳动物细胞之后已产生活病毒[73-75]，虽然已知使用的细胞(HeLa)容许脊髓灰质炎病毒感染。在我们的实验中，证实非容许的小鼠神经元Neuro-2a和成纤维细胞NIH/3T3细胞支持病毒复制并在EV71:BS RNA转染入细胞质时产生活病毒子代，其表明小鼠细胞的内部环境包含EV71感染和支持病毒感染周期的完成需要的宿主因子，并且EV71蛋白在小鼠胞质溶胶中是有功能的。这些发现还表明在病毒接种时不存在NIH/3T3和Neuro-2a细胞感染可能是由于受体介导的宿主进入和脱壳中的缺陷，这主要是衣壳蛋白的功能。这些结果与我们以前的观察相似(上文或[71])，并且导致我们假设EV71:BS衣壳蛋白中的某些氨基酸取代可能使其能够结合其受体，因此导致病毒进入和脱壳，并随后感染小鼠细胞。两个独特的工具-小鼠细胞系(NIH/3T3)适应的EV71毒株(EV71:TLLm和EV71:TLLmv)和两种小鼠细胞系(Neuro-2a和NIH/3T3)提供了研究这种假设的机会。
表现出EV71:TLLm衣壳蛋白但表达EV71:BS非结构蛋白(CDV:BS[M-P1])的嵌合克隆衍生的病毒的感染表型证实“小鼠细胞进入表型”可以由源自小鼠细胞系适应的EV71毒株的衣壳蛋白赋予。这些嵌合CDV行为与小鼠细胞适应的EV71毒株相似，并且诱导Vero以及NIH/3T3和Neuro-2a细胞中的生产性感染，具有病毒感染周期完成的直接证据，即活病毒子代的产生。进一步地，诱变EV71:BS VP1以引入氨基酸取代K98E、E145A和L169F以及VP2中S144T和K149I导致小鼠细胞的有限感染。仅具有EV71:TLLm P1区置换的CDV(CDV:BS[M-P1])和具有组合的氨基酸取代VP1-K98E/E145A/L169F的CDV(CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F])可以在Neuro-2a和NIH/3T3细胞中成功传代以在所得的培养上清液中产生活病毒子代。如接种细胞中的CPE观察和病毒抗原检测支持的，剩余的包含其他氨基酸取代(单独或各种组合)的CDV表现出有限的进入小鼠细胞导致一个周期的复制。在受感染的细胞培养上清液中不存在活病毒子代，因为其重新接种在健康小鼠细胞上不能诱导感染。造成在感染这些CDV的细胞的培养上清液中不能产生活病毒子代的原因尚不清楚，但是一种可能性可能是由于突变之后所得的衣壳的结构不稳定性。我们怀疑引入的氨基酸可能与蛋白质包含的其他氨基酸不相容，因此影响整个衣壳蛋白折叠并改变衣壳结构。这种假设突出衣壳蛋白组装的复杂性，其中4种病毒蛋白(VP1-4)合作地相互作用以产生功能性衣壳。因此，可以使得病毒能够结合新受体的氨基酸取代还可以具有灾难性后果，特别是如果其因为与蛋白质中的其他氨基酸残基的不相容性而无意中使衣壳复合物不稳定。
实施例10-17中示出的结果显示3个VP1取代：K98E、E145A和L169F是必需的，并且足以结合其在小鼠细胞上的受体并使得EV71能够进入。虽然以前在文献中未曾提到VP1-169残基，但是以前已表明VP1-98和VP1-145作为结合白细胞上的人PSGL-1受体蛋白的标记[76]。Genbank中公开的EV71临床分离株的1,702VP1序列的分析证实突变组合VP198E/145A的生存力(尽管罕见)，其仅出现在5个分离株中(数据库的0.3％)。在另一方面，在调查的EV71VP1序列数据库中未观察到VP1-169F变体，证实其特别罕见。CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]可稳定传代至Neuro-2a细胞并持续产生活病毒子代，同时保留引入病毒基因组的突变3代，表明这种病毒至少在Neuro-2a细胞中是活的和稳定的。因此，将这3个残基：VP198E、145A和169F引入其他EV71临床分离株可能可以使其能够感染小鼠细胞，虽然这还有待证实。
与以前发现的EV71利用清道夫受体B类成员-2(SCARB2)蛋白作为其用于宿主细胞进入和脱壳入胞质的受体相似[47,72,77]，我们的数据也证实小鼠细胞适应的EV71:TLLmv利用小鼠SCARB2(mSCARB2)感染小鼠细胞。病毒在体外直接结合重组可溶性mSCARB2，并且在接种健康细胞之前用该蛋白质预温育活病毒减少细胞感染的严重程度。进一步的，通过与抗mSCARB2多克隆抗体结合阻断宿主细胞上的mSCARB2自由表面减少固定细胞上的病毒结合并抑制活细胞感染。结果还显示EV71:TLLmv结合至人SCARB2(hSCARB2)蛋白，该病毒用来感染灵长类细胞的蛋白。用EV71:TLLmv结合并感染灵长类细胞还被抗hSCARB2抗体阻断。虽然这里给出的数据仅显示EV71:TLLmv，但是结果还延伸至EV71:TLLm。EV71:TLLmv源自EV71:TLLm在NIH/3T3c细胞中的进一步传代，并且在两种小鼠细胞系适应的EV71毒株之间仅观察到一些氨基酸取代。因此，这些表明EV71:TLLm和EV71:TLLmv均利用细胞mSCARB2感染啮齿类动物细胞。
相似地，CDV:BS[M-P1]和CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]均利用mSCARB2感染小鼠细胞。如与对照相比减少的CPE诱导和较低的病毒滴度所支持的，用mSCARB2抗血清预温育的Neuro-2a细胞阻断细胞感染病毒。最近的数据显示结合至EV71峡谷的SCARB2触发“口袋因子”的释放，稳定成熟病毒粒子且推测是EV71中的鞘氨醇的衣壳峡谷内的脂质，[78]，促成病毒脱壳中的一系列事件：衣壳扩大(形成135-S或A-颗粒)，从来自五重轴衣壳连接挤压VP1N-端和VP4入核内体膜，以及将病毒基因组RNA释放入宿主细胞的细胞质[78-81]。最近的人SCARB2晶体结构数据还显示穿过整个蛋白质的脂质通道[67]，在递送β-葡糖脑苷脂酶至溶酶体的SCARB2功能的上下文中没有关联，但是Dang等人[72]提出其用作SCARB2结合期间从衣壳峡谷去除和运输鞘氨醇的导管。其序列在人和小鼠蛋白质之间高度分歧的SCARB2氨基酸残基140-151是EV71的主要结合位点[49]。这个相同区域充当控制SCARB2脂质通道打开和关闭的门，病毒脱壳期间酸性pH触发的事件。VP1-169残基在衣壳峡谷内，并且可能在SCARB2结合中具有直接功能。这个位置中从亮氨酸至苯丙氨酸的剧烈变化可能改变峡谷结构，其导致更适合小鼠SCARB2蛋白。在另一方面，VP1 98和145残基位于衣壳峡谷周围的边缘上，并且可能具有除SCARB2结合以外的另一功能。这些是简单的假设，并且必需解析小鼠SCARB2蛋白的结构并作图与病毒衣壳的相互作用，以阐明3个VP1氨基酸取代可以赋予“小鼠细胞进入表型”的确切机制。
据信这是首次科学研究诱导天然非容许的小鼠细胞的生产性感染的EV71衣壳位点特异性突变。以前的研究试图通过选择性病毒适应克服病毒宿主限制，如在活动物中传代以产生在小鼠中具有改善的感染谱的突变体的情况下[34,37,38,82]，或者通过异位表达人SCARB2蛋白的细胞改变克服病毒宿主限制[47,69,70,83]。EV71与小鼠SCARB2的不相容性一般导致小鼠对EV71感染的抗性，因此妨碍EV71感染的小鼠模型的开发。这可能还解释了为什么使用野生型或小鼠适应的病毒毒株的EV71感染的大部分小鼠模型不能概括在严重人感染中观察到的疾病谱[34,37,38]。在另一方面，表达人SCARB2的转基因小鼠表现出更广泛的EV71感染的特征而不需要小鼠适应病毒，但是人类疾病的全谱仍不可被清楚复制[69,70]。本文证实EV71中的某些氨基酸取代使其能够感染小鼠细胞，提供理解使得小鼠细胞系适应的EV71:TLLm和EV71:TLLmv能够有效感染培养的啮齿类动物细胞的分子机制的第一步。此外，可以提供另一种方法产生EV71感染的小鼠模型，以研究详细病理并复制人感染中看到的神经系统疾病的全谱。
在实施例22-25中，第一次证实用小鼠细胞适应的肠道病毒71(EV71)接种的年轻BALB/c小鼠表现出与神经源性肺水肿(NPE)相关的急性脑脊髓炎，酷似受感染的人患者中观察到的病理。用适应的病毒毒株EV71:TLLmv攻击的动物在脑的椎体和椎体外区域表现出不同水平的病毒诱导的组织损伤，表现为瘫痪、共济失调和震颤，并且与EV71感染的致死病例中鉴定的位于CNS的病理一致[91-95]。此外，一些小鼠表现出自主神经功能障碍相容的呼吸窘迫。基于在安乐死时的疾病表现，可以将动物容易地分为4组：IA类、IB类、II类和幸存者。虽然幸存者不存在疾病表现，但是II类中的小鼠表现出持续性弛缓性麻痹和严重的体重下降，而IA类和IB类小鼠额外的患有普遍在3-7DPI内致死的急性神经系统疾病。IA小鼠还表现出不是由于充血性心力衰竭或肺炎的显见的严重呼吸窘迫。相反，IA类中的动物在脑干尾部，特别是髓质中表现出广泛的组织损伤，连同高血清水平的儿茶酚胺，强烈建议在这些小鼠中观察到的呼吸道表现是神经源性肺水肿(NPE)的结果。来自IA类小鼠的肺与来自其他组的那些肺的大体病理比较显示在尸检时不完整的肺萎陷，以及显著增加的肺湿重，可能是由于出血和流体渗漏入肺泡腔。这些特征酷似在非病毒诱导的NPE的实验动物模型和具有暴发性NPE的致命人病例中观察到的那些[96,97]。实际上，IA类动物的组织病理学分析进一步显示充满蛋白质和充满红细胞的渗出液的肺泡腔的病灶区域，与致命的人病例中的观察一致[21,98-100]。
肺水肿(PE)通常被定义为肺的水含量的血管外增加，48，并且可以在心源性或神经源性的基础上细分。因为IA类小鼠心脏组织表现出正常组织学且缺少明显的疾病表现，我们能够排除心源性PE，并且肺实质中不存在病毒复制或炎症排除了直接病毒诱导的组织损伤。相反，我们在IA类小鼠中检测到高血清水平的儿茶酚胺，强烈表明这组表现出神经源性(NPE)，以前已证实这是严重的交感神经放电诱导的儿茶酚胺风暴的结果[96,101]。在这种情况下，自主神经系统功能障碍触发儿茶酚胺风暴，导致全身性和肺血管收缩。这导致血容量从全身循环转移至肺循环，其通过流体静力机制或由于直接肺内皮损伤以血浆渗漏和出血入肺泡腔告终[101-104]。虽然近年来已开发非病毒诱导的NPE的几种实验动物模型(综述参见Sedy[103]和Davison[104])，但是我们首次单独利用EV71感染成功诱导肺水肿的经典表现。因此，我们的新模型构成追求可以限制EV71感染和防止人患者中暴发性NPE的发生的抗病毒疗法和治疗方案中的重大进展。虽然可能肺水肿还可以通过对EV71感染应答的宿主细胞因子风暴诱导[105-107]，但是数据强烈表明EV71诱导的NPE的主要机制不包括大量炎症反应，相反与脑特定区域中的组织损伤有关。
与NPE诱导相关的脑区域已指定为触发区，其涵盖下丘脑室旁核和背内侧核[101,103]，以及腹侧和背侧髓质，包括NTS和AP区[96,104,108-110]。EV71诱导的NPE以前已归因于脑干组织的广泛损伤[21,22,93,111]，并且在我们的新小鼠模型中，我们在脑干和脊髓中检测到病毒抗原和广泛损伤。虽然IA类和IB类小鼠表现出脑干和脊髓中相似的损伤和病毒抗原分布，以及可比的血清儿茶酚胺上调，但是IB类动物中NPE的不存在可能通过NTS、髓质网状核(MdRN)、和髓质的AP区、小脑中的齿状核、和下丘脑前部的背内侧核中减少的数量和严重程度的脑损伤和/或较低的病毒抗原强度解释。因此我们提出脑干组织的急性、严重破坏，特别是与血管舒缩区相关的那些，导致EV71感染的宿主中的儿茶酚胺风暴，并且如果已知的触发区被充分破坏，这可以发展为NPE。
总的来说，本发明是表现出表面效度的EV71神经感染的可信小鼠模型[112]，即这些动物表现出在人患者中EV71感染诱导的神经系统疾病(包括NPE)的全谱中可以观察到的整个范围的临床表现。呈现IA类表现的疾病的EV71:TLLmv感染的小鼠中的标志观察通过包含两只不同IA类小鼠的两个视频剪辑的视频进行。两只动物均不能自行纠正(self-right)，并且处于昏迷状态。在第一只小鼠中明显表现为肋下衰退的呼吸急促的严重呼吸窘迫。在第二只小鼠中看到喘气、肋下衰退和从鼻孔喷出的起泡的液体。呈现IB类表现的疾病的EV71:TLLmv感染的小鼠中的标志观察通过一只1B类小鼠的视频进行。该动物不能自行纠正，并且处于神志不清(stupor)的状态。还观察到右肢的同侧瘫痪和左后肢的持续性震颤。这种模型还表现出关于疾病的大体和组织病理学特征的建构效度[112]，这与致命的人类病例中报道的那些极为相似。这种新的体内模型代表一种强大的工具，用于鉴定EV71神经病发病机理中的关键事件，用于剖析EV71诱导的NPE的机制，开发新的治疗方式和潜在的抗病毒疗法，以及用于进行新疫苗的临床前评价。
除非另有说明，本发明的实施采用本领域技术内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术。参见，例如，Maniatis et al.,1982,Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrookand Russell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York)；Green and Sambrook,2012,Molecular Cloning,4th Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Ausubel et al.,1992),Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley &Sons,including periodic updates)；Glover,1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford)；Russell,1984,Molecular biology of plants:a laboratory course manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；Anand,Techniques forthe Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie andFink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991)；Harlow and Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized CellsAnd Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MethodsIn Enzymology,Vols.154and 155(Wu et al.eds.),Immunochemical Methods In CellAnd Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；Riott,Essential Immunology,6th Edition,Blackwell ScientificPublications,Oxford,1988；Fire et al.,RNA Interference Technology:From BasicScience to Drug Development,Cambridge University Press,Cambridge,2005；Schepers,RNA Interference in Practice,Wiley–VCH,2005；Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNA Technology,DNA Press,2003；Gott,RNAInterference,Editing,and Modification:Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology),Human Press,Totowa,NJ,2004；Sohail,Gene Silencing by RNAInterference:Technology and Application,CRC,2004.
实施例
参考以下实施例描述本发明，所述实施例通过说明的方式提供而不是为了以任何方式限制本发明。使用了本领域公知的标准技术或下文特别描述的技术。
实施例1
实施例2-8的材料和方法
细胞系和病毒毒株：这个研究中使用的所有细胞系均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,USA)。利用各种哺乳动物细胞系进行研究；人腺癌细胞系HeLa(CCL-2)和HEp-2(CCL-23)，以及横纹肌肉瘤RD(CCL-136)；非洲绿猴肾Vero(CCL-81)，和Vervet猴肾成纤维细胞COS-7(CRL-1651)；小鼠神经母细胞瘤Neuro2A (CCL-131)，胚胎成纤维细胞NIH/3T3(CRL-1658)，和肾上皮TCMK(CCL-139)；仓鼠卵巢上皮样CHO-K1(CCL-61)，和正常大鼠肾上皮NRK(CRL-6509)。
人EV71BS毒株(EV71:BS)以前分离自感染EV71的死亡患者的脑干。储存在-80℃直至进一步使用之前将病毒在Vero细胞中传代4个循环。小鼠细胞(NIH/3T3)适应的EV71:TLLm毒株通过在小鼠NIH/3T3细胞中连续系列传代(>60个循环)衍生自EV71:BS毒株。将EV71:TLLm毒株在NIH/3T3细胞中进一步传代(40个循环)以产生小鼠细胞适应的毒性毒株(EV71:TLLmv)。
细胞系的维持和感染病毒：除非另有说明，使所有细胞系在补充了10％(v/v)胎牛血清(FBS, Singapore)和0.22％(w/v)碳酸氢钠(NaHCO3,Sigma USA)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM,USA)中生长，并且在37℃和5％CO2下温育。将所有受感染的细胞在维持培养基(补充了1％FBS和0.22％NaHCO3的DMEM)中温育。
将细胞(2.5–5.0×105个细胞/孔)接种在组织培养处理的六孔板(Nunc,FisherScientific)中过夜，用500μl的病毒悬浮液(MOI 1)感染，并且在30℃、37℃或39℃下温育2小时。将细胞在无菌的磷酸缓冲盐水(PBS,pH 7.4)溶液中洗涤两次，然后添加新鲜的维持培养基(DMEM,1％FBS)。每天观察受感染的细胞的不同溶解的细胞病变效应(CPE)的出现。
对于病毒生长动力学研究，将包含受感染的细胞的平板在各种时间点：感染后0、6、12、24、36、48和54小时(hpi)于-80℃下冷冻。使平板进行三个冻融循环，收获裂解物并通过剧烈涡旋然后以1,500×g离心10分钟来使其变澄清。将澄清的上清液在冷冻小瓶(Nunc,Fisher Scientific)中于-80℃下储存直至进一步使用。
对于温度适应测定，将被接种的Vero和NIH/3T3细胞在30℃、37℃和39℃下温育，并且每天观察CPE的出现。在48hpi收获各自的培养上清液并在冷冻小瓶中于-80℃下储存直至进一步使用。
用MOI(感染复数)1的亲代EV71:BS或衍生的NIH/3T3适应的EV71毒株感染各种哺乳动物细胞系，即RD、HeLa和HEp-2(人)、Vero和COS-7(猴)、NIH/3T3、Neuro-2A和TCMK(小鼠)、CHO-K1(仓鼠)、和NRK细胞(大鼠)，并且在37℃下温育10天。每天观察培养物的CPE的出现。
病毒滴度和相对复制速度(RRR)的确定：使病毒上清液进行终点滴定并在NIH/3T3和Vero细胞中测定。利用Reed和Muench方法[61]以及Reed和Muench计算器[62]计数病毒滴度。简单地说，将NIH/3T3(1×104个细胞/孔)和Vero细胞(4×103个细胞/孔)接种在96-孔板中过夜。将解冻至室温的冷冻病毒在无菌的1％去氧胆酸钠水溶液(Sigma Aldrich,USA)中稀释(10-1)，并且剧烈混合15分钟以分散病毒。将分散的病毒在维持培养基中进行10倍系列稀释，将从10-3稀释起的100μl稀释的病毒添加至每个孔的细胞上。将平板在37℃下温育，并且在倒置光显微镜下每天观察不同CPE的出现。病毒滴度报道为50％细胞培养感染剂量/体积(CCID50/ml)。
为了评价EV71:TLLm和EV71:TLLmv在NIH/3T3细胞中的适应程度，利用NIH/3T3和Vero细胞使收获自以前受感染的灵长类和啮齿类动物细胞系的病毒上清液进行病毒滴度测定。用来测量在NIH/3T3和Vero细胞中的相对复制速度(RRR)的滴度比例利用下式进行计算：
RRR＝log(A/B)
其中A是在NIH/3T3细胞中测定的病毒滴度，而B是在Vero细胞中测定的病毒滴度。
通过免疫荧光测定的病毒抗原检测：对于未表现出显著CPE的感染细胞，进行免疫荧光(IF)染色以验证感染。在72hpi将细胞胰蛋白酶消化，在无菌PBS中洗涤两次，并且包被在Teflon玻片(Erie,USA)上。将玻片在生物安全柜中风干并UV处理15分钟以灭活活病毒，然后在冷丙酮中于4℃下固定10分钟。将玻片用pan-肠道病毒抗体(Merck Millipore,USA)探测，并随后用与0.01％(w/v)伊文思蓝复染剂混合的FITC缀合的小鼠IgG(DAKOCytomation,Denmark)探测。
用EV71病毒RNA转染细胞：按照制造商的方案利用Lipofectamine 2000(Lifetechnologies,USA)用提取自4×106CCID50病毒的病毒RNA转染在24-孔板中接种过夜的Vero和NIH/3T3细胞(3×104个细胞/孔)。利用病毒RNA试剂盒(Qiagen,Germany)提取来自EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv的RNA并与Lipofectamine 2000在细胞上于37℃下温育6小时。每天观察转染细胞的CPE的出现。在7dpi，从受感染的细胞收获上清液并传代至新鲜接种的Vero和NIH/3T3细胞。每天观察细胞的CPE的出现，并且在7dpi，将细胞胰蛋白酶消化并加工用于免疫荧光病毒抗原检测。
EV71毒株的全基因组测序和遗传作图：利用病毒RNA试剂盒(Qiagen,Germany)提取EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv毒株的病毒RNA并利用Superscript II(SII-RT,LifeTechnologies,USA)逆转录。用GoTaq Green(Promega,USA)和简并EV71引物(引物序列可根据要求获得)扩增获得的cDNA。利用PCR清洁试剂盒(Geneaid Biotech,Taiwan)纯化扩增子并克隆入pZero2载体(Lifetech,USA)。从卡那霉素平板选择克隆，接种入LB肉汤(50μg/ml卡那霉素)并允许在37℃下生长过夜用于用QiaSpin Miniprep试剂盒(Qiagen,Germany)进行质粒提取。随后通过BigDye终止子方法(Applied Biosystems,USA)利用相同引物将质粒测序。利用BioEdit v7.0.9.0[63]对EV71新加坡分离株3799-SIN-98(GenBank登录号DQ341354.1)的全基因组序列比对获得的500-bp片段序列以重建EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv的全基因组序列。利用Deepview/Swiss pdbviewer ver.3.7(http colonslash slash expasy dot org slash spdbv slash)和SWISS-MODEL服务器[64,65]进行EV71:TLLm和EV71:TLLmv的启动子的分子建模。
实施例2
容许EV71:BS感染的灵长类细胞系而不是啮齿类动物细胞系
这个研究中使用的所有灵长类细胞系均容许EV71:BS病毒感染。人RD细胞以及猴Vero和COS-7细胞在感染后48小时(hpi)内表现出完全溶解的细胞病变效应(CPE)(图1A、1J和1M)，并且在固定的感染细胞中检测到病毒抗原(图2A-2L；对RD、COS-7和Vero细胞未示出数据)。收获自各种受感染的细胞系的上清液的病毒的生长动力学曲线证实RD、Vero和COS-7细胞中的生产性感染(图3A)。收获自RD和Vero细胞的病毒达到3×109 CCID50/ml的终点滴度，而来自COS-7的病毒滴度为106CCID50/ml(图3A)。EV71:BS在HeLa和Hep-2细胞中不诱导完全CPE(图1D和1G)，并且所得的病毒滴度在测定截止极限内不可测量。但是，在HeLa细胞(图2a)和Hep-2细胞(图2D)中通过间接免疫荧光染色均检测到病毒抗原，表明病毒成功进入细胞，但是低效或缺陷的复制可能导致不可测量的病毒滴度。
确定所有测试的啮齿类动物细胞系是不容许EV71:BS感染的。在感染之后不存在细胞溶解的CPE(图4A、4D、4G、4J和4M)，来自上清液的病毒滴度不可测量，并且在被接种的细胞中不可以检测到病毒抗原(图2G、2J和2M；图10A、10C和10E)。
实施例3
小鼠细胞(NIH/3T3)适应的EV71:TLLm病毒生产性感染灵长类和啮齿类动物细胞系
在NIH/3T3小鼠细胞系中系列传代EV71:BS最少60个循环之后衍生EV71:TLLm。除了NRK细胞，测试的所有灵长类和啮齿类动物细胞系均容许EV71:TLLm的生产性感染。在48hpi，在RD、Vero和COS-7(图1B、1K和1N)以及NIH/3T3和Neuro-2A细胞(图4B、E)中观察到完全CPE。高病毒滴度在收获自除NRK以外的所有受感染的细胞系的上清液中均可测量(图3C和3D)，并且受感染的细胞通过间接免疫荧光测定测试为病毒抗原阳性(图2B、2E、2H、2K和2N)。在NRK细胞中未观察到完全CPE和可测量的病毒滴度(图4N；图3D)，但是可以检测到病毒抗原(图2K)，表明通过EV71:TLLm病毒成功进入NRK细胞，但是低效的病毒复制可导致不可测量的病毒滴度。
实施例4
小鼠细胞(NIH/3T3)适应的EV71:TLLmv病毒生产性感染啮齿类动物细胞系但不是所有灵长类细胞系
EV71:TLLmv病毒毒株衍生自在NIH/3T3细胞中进一步传代EV71:TLLm另外40个循环。EV71:TLLmv在较少量的细胞系–RD、Vero、NIH/3T3、Neuro-2A和TCMK细胞中引起溶解的CPE(图3B)，并且仅在RD、NIH/3T3和Neuro-2A细胞中观察到完全CPE(图1C；4C、F)。如受感染的细胞中的阳性病毒抗原检测所示(图2L、2O和2R)，还注意到TCMK、CHO-K1和NRK细胞容许感染但不发展为完全CPE(图4I、L、O)。
在另一方面，如不存在CPE(图1F、1I和1O)、不可测量的病毒滴度(图3B)以及阴性病毒抗原检测(图2C、2F和未示出的数据)所示，观察到灵长类细胞系HeLa、Hep-2和COS-7不容许EV71:TLLmv感染。
实施例5
EV71:TLLmv病毒表现出对NIH/3T3细胞较高程度的适应，而EV71:TLLm更适应在Vero细胞中复制
通过计数Vero和NIH/3T3细胞中的病毒滴度确定在各种时间点收获自受感染的细胞的上清液中活病毒的量。通过NIH/3T3中测定的病毒滴度值比Vero中测定的滴度值计算的相对繁殖率(RRR)被用作病毒适应NIH/3T3细胞程度的替代度量。亲代EV71:BS病毒对RD、Vero和COS-7表现出较高的负RRR值(图5A)，表明在Vero细胞中测定的病毒滴度值远远超过在NIH/3T3细胞中测定的滴度。其他细胞系的相对繁殖率值不可以确定，因为不可以测量病毒滴度。在另一方面，EV71:TLLmv病毒表现出正RRR值，除了在Vero细胞中增殖的病毒(图5B)。正RRR值指示与Vero细胞相比在NIH/3T3细胞中更高效的复制，以及因此更高的滴度值。对收获自Vero细胞的EV71:TLLmv确定的负RRR值与观察到的缓慢生长动力学(图3B)和较低病毒滴度一致。EV71:TLLm表现出负RRR值(图5C和5D)，虽然比EV71:BS的RRR值的程度低。这表明虽然EV71:TLLm可以生产性感染一些啮齿类动物细胞系，但是与NIH/3T3细胞相比，其仍然更适应在Vero中复制。
实施例6
EV71:TLLm表现出比EV71:TLLmv更好的对变化的温度的适应性
将用亲代EV71:BS以及衍生的NIH/3T3适应的EV71:TLLm和EV71:TLLmv毒株感染的Vero和NIH/3T3细胞在各种温度：–30℃、37℃和39℃下温育，以确定病毒对温度变化或改变的适应性。EV71:BS表现出最有限的适应性，仅在37℃下温育的Vero细胞中观察到完全CPE(图8B；表1)。基于在37℃下于Vero细胞中(图S2B)以及在37℃和39℃下于NIH/3T3细胞中(图8A，图9A；表1)观察到的完全CPE，EV71:TLLmv表现出中等适应性。在另一方面，EV71:TLLm表现出最大适应性，其中对于所有温育温度其在Vero细胞中诱导完全CPE(图7B、图8B、图9B)，虽然在NIH/3T3细胞中仅在37℃下诱导完全CPE(图8A；表1)。
表1
在NIH/3T3和Vero细胞中生长的EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv对各种温育温度的病毒适应性的评价
1每天观察受感染的细胞的溶解细胞死亡的表现和完全CPE的出现时间。
2指示在受感染的细胞中不存在完全CPE。
3指示完全CPE的观察。
4指示不存在完全CPE，同时括号中的数字指示在细胞中观察到的CPE的最大程度。
实施例7
由于适应NIH/3T3细胞，EV71:TLLm和EV71:TLLmv的病毒基因组积累多个错义突变
使EV71:BS、EV71:TLLm、EV71:TLLmv的病毒RNA进行Sanger测序以确定共有基因组序列并鉴定可能的产生自NIH/3T3细胞中的适应过程的适应性突变。代表准种的优势群体的基因组共有序列已储存在GenBank,NCBI(国家生物技术信息中心)。EV71:TLLm(GenBank登录号KF514879；SEQ ID NO:1)对EV71:BS(GenBank登录号KF514878；SEQ ID NO:3)的全基因组序列比对显示60个核苷酸突变，其中21个导致氨基酸取代(表2)。在另一方面，在EV71:TLLmv(Genbank登录号KF514880；SEQ ID NO:2)和EV71:BS之间注意到83个突变，有36个氨基酸取代。大部分错义突变位于P1(衣壳蛋白基因)区中(表2)，特别是VP1蛋白基因内(表3)。
还在P2和P3区内观察到氨基酸变化，最值得注意的是在RNA依赖性RNA聚合酶(3D区)中。EV71:TLLm获得4个氨基酸变化，大部分在酶的手掌和拇指结构域中(表4)。在另一方面，EV71:TLLmv积累8个氨基酸变化，大部分也在聚合酶的手掌和拇指结构域中。在基因组的5′非翻译区(UTR)中也观察到核苷酸突变。除了碱基变化，在EV71:TLLm发现1-碱基插入，同时在EV71:TLLmv 5′UTR中观察到4-bp插入和20-bp缺失(表2和3)。在另一方面，在EV71:TLLm的VP3和3A区中以及在EV71:TLLm和EV71:TLLmv的3′UTR中均未观察到氨基酸取代。
表2
与EV71:BS相比EV71:TLLm和EV71:TLLmv的基因组中的核苷酸和氨基酸变化
表3
在EV71:TTLm和EV71:TLLmv病毒基因组的5’UTR和P1区中观察到的适应性突变
1成熟之前未切割的多聚蛋白中的氨基酸编号。
2成熟蛋白中的氨基酸编号。
3内部核糖体进入位点。
突变是基于与参考EV71:BS基因组的比对。
表4
在EV71:TTLm和EV71:TLLmv病毒基因组的P2和P3区中观察到的适应性突变
1成熟之前未切割的多聚蛋白中的氨基酸编号。
2成熟蛋白中的氨基酸编号。
3位于RNA依赖性RNA聚合酶的环指结构域中的突变。
4位于RNA依赖性RNA聚合酶的手掌结构域中的突变。
5位于RNA依赖性RNA聚合酶的拇指结构域中的突变。
突变是基于与参考EV71:BS基因组的比对。
实施例8
将EV71:BS病毒RNA转染入小鼠细胞导致生产性感染但病毒子代不可以重新感染相同小鼠细胞
用病毒RNA转染的Vero和NIH/3T3细胞在转染后7天(dpt)表现出完全CPE(数据未示出)。在用EV71:BS的病毒RNA转染的NIH/3T3细胞中检测到病毒抗原(图10B)，但是在用病毒感染的NIH/3T3细胞中未检测到(图10A)。重新接种至新鲜Vero和NIH/3T3细胞上的病毒上清液仅在Vero而不是NIH/3T3细胞中导致生产性感染(100％CPE)(图6A)，并且病毒抗原检测证实Vero细胞中的感染而非NIH/3T3(图6B)。
实施例9
实施例10-17的材料和方法
质粒、病毒、细菌和细胞系：编码小鼠SCARB2cDNA的质粒(pMD18-mSCARB2)(Genbank登录号NP_031670.1)购自Sino Biological,Inc.(Beijing,China)。用于在大肠杆菌(E.coli)细胞中重组表达可溶性mSCARB2蛋白的pQE30载体(Qiagen,Germany)是来自Dr.Kian Hong Ng(Temasek Lifesciences Laboratory,Singapore)的慷慨礼物。利用低拷贝数质粒pACYC177(New England Biolabs,Singapore)产生编码EV71的全长cDNA的质粒。表达T7聚合酶的质粒构建体(pCMV-T7pol)是来自新南威尔士的悉尼大学的Dr.PeterMcMinn,的慷慨礼物。用于克隆衍生的病毒的片段测序的质粒pZero-2购自Invitrogen(Life Technologies,USA)。
上文或以前描述了这个研究中使用的临床分离株EV71:BS(Genbank登录号KF514878)、EV71:TLLm(Genbank登录号KF514879.1)和EV71:TLLmv(Genbank登录号KF514880.1)[71]。
这个研究中使用的所有细胞系-非洲绿猴肾Vero(CCL-81)；小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a(CCL-131)和成纤维细胞NIH/3T3(CRL-1658)细胞均购自美国典型培养物保藏中心(USA)。如上文或以前所述生长和维持细胞[71]。
大肠杆菌细胞BL21菌株(New England Biolabs,Singapore)用于高水平的蛋白表达，TOP10菌株(Life Technologies,USA)用于单个克隆的片段测序，而XL-10Goldultracompetent菌株(Stratagene,USA)用于产生全长基因组cDNA克隆。
EV71:BS全长基因组cDNA克隆、衣壳嵌合克隆和VP1/VP2突变克隆的构建：通过两步克隆产生EV71:BS cDNA克隆。上文或以前已描述病毒RNA提取(Qiagen病毒RNA试剂盒，Germany)以及转化为cDNA(Life Technologies Superscript-II RT,USA)[71]。利用引物对：EV71_BamHI-PfF和EV71_Pf-AatIIR(表5)扩增编码5'UTR和P1区的基因组近端片段，其包含BamHI和AatII限制性位点用于克隆入质粒pACYC177。用引物对EV71_HindIII-DF和EV71_D-BamHIR扩增编码P2、P3和3'UTR的远端
片段，其还包含HindIII和BamHI限制性位点用于克隆。近端片段包含5'UTR上游的T7聚合酶启动子区以促进转录。用EagI和AatII消化之后将近端片段连接至远端片段并产生全长EV71:BS克隆。
表5
引物
为了用EV71:TLLm的P1代替EV71:BS的P1区，将MluI限制性位点工程化在5'UTR和P1之间的边界内(引物对SDM_MluIF和SDM_MluI-R)。扩增EV71:TLLm的P1cDNA序列(引物对MluI-TLLm-P1F和EagI-TLLm-P1R)，用MluI和EagI消化，并且克隆入包含近端片段的构建体。如所述随后将这种经修饰的近端片段连接至远端片段。
为了产生在VP2和VP1蛋白中具有氨基酸取代的克隆，在连接至远端片段之前，在近端片段中进行位点定向诱变。用特异性引物对VP2_G1385C-F和VP2_G1385C-R将VP2S144T(nt G1385C)氨基酸取代引入近端片段。还利用不同引物对以相似方式产生VP2S144T(ntG1385C)、VP1K98E(nt A2734G)、E145A(nt A2876C)和E167D(nt C2947T)(表5)。
“小鼠细胞进入表型”的评价：为了产生活病毒，利用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,USA)按照制造商推荐的方案将cDNA克隆与表达T7RNA聚合酶的另一构建体(pCMV-T7pol)共转染入Vero细胞。如上文或以前所述，在转染后7-10天收获转染上清液并以1MOI接种在过夜接种的细胞系上[71]。将细胞用病毒上清液在37℃下温育1小时，用PBS洗涤两次，然后用新鲜DMEM,1％FBS更换培养基。
为了评价感染表型，记录溶解的细胞病变效应(CPE)诱导的发展，并且在各种时间点拍摄照片。还如上文或以前所述收获受感染的细胞并加工用于病毒蛋白的免疫荧光检测[71]。简单地说，将粘附细胞胰蛋白酶消化并与来自培养上清液的颗粒细胞合并，在无菌的磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，并且固定在Teflon玻片上。将固定的细胞用pan-肠道病毒单克隆抗体(Merck Millipore,USA)温育并用标准的FITC缀合的抗小鼠IgG抗体检测。还收获受感染的细胞培养上清液，澄清并进行系列稀释，利用Reed和Muench方法确定病毒滴度[61]。一旦知道滴度，将上清液以1MOI传代在新鲜接种的NIH/3T3和Neuro-2a细胞上，并且利用本文描述的方法再次评价感染表型。
可溶性SCARB2蛋白的重组蛋白表达和SCARB2兔抗血清的产生：用引物对pQE-mSCARB2F和pQE-mSCARB2R扩增编码小鼠SCARB2的胞外结构域(aa Arg27-Thr 432)的质粒pMD18-mSCARB2以引入BamHI和HindIII限制性位点，以促进克隆入pQE30蛋白表达载体。将克隆转化入BL21大肠杆菌细胞，用1mM IPTG诱导蛋白表达过夜。将收获的细胞用溶菌酶(1mg/ml)消化，并且利用Ni-NTA柱(Germany)纯化粗提取物。将澄清的裂解物在1ml的50％Ni-NTA浆中于4℃和温和振荡下温育过夜。将蛋白质在洗涤缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)中洗涤5次，并且用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱。
在第0天用与弗氏完全佐剂混合的1.4μg纯化的小鼠SCARB2蛋白免疫两只健康雄性兔。在第21、42、63、84和105天注射包含与弗氏不完全佐剂混合的0.8μg抗原的加强剂量。在第117天进行通过心脏穿刺的终末出血，并且将收集的血液在4℃下温育过夜，然后以3,000rpm离心30分钟。收集澄清的血清并储存在-20℃下直至进一步使用。SCARB2兔抗血清的产生由淡马锡生命科学实验室机构动物护理和使用委员会(TLL-IACUC)批准[批准号047/12]。
与小鼠SCARB2蛋白的病毒竞争测定：进行体外结合测定以证实EV71:TLLmv与小鼠和人SCARB2蛋白的相互作用。将NIH/3T3细胞(6000/孔)接种在无菌的Teflon包被玻片(Erie,USA)上过夜。在病毒接种之前，将100MOI EV71:TLLmv与各种浓度的重组小鼠SCARB2(mSCARB2)或人SCARB2(hSCARB2)蛋白(4.0μg、2.0μg、1.0μg、0.5μg、0.25μg、0.125μg和0μg)在37℃下于振荡平台中温育2小时。每天观察受感染的细胞的CPE的表现，并且在感染后48小时于无水丙酮中固定(4℃,10mins)。将固定的细胞用pan-肠道病毒抗体(MerckUSA)免疫荧光测定。用垂直荧光显微镜(Nikon,Japan)将玻片成像。
病毒-SCARB2结合测定：在固定的细胞上进行抗体介导的SCARB2阻断测定以评价掩蔽细胞表面SCARB2蛋白是否影响病毒结合。将Teflon玻片上培养的NIH/3T3和Vero细胞固定(4％PFA，25分钟，室温)，并且用具有5％BSA的PBS在37℃下封闭1小时。将玻片在针对mSCARB2产生的多克隆兔血清(1:100)中于37℃下温育1小时。对于阴性对照，将细胞用针对Saffold病毒L蛋白产生的多克隆兔血清温育。将玻片在PBS中洗涤，然后用活EV71:TLLmv(1000MOI)在37℃下温育1小时，用pan-肠道病毒抗体探测并用FITC缀合的Ab检测。用ZeissLSM 510Meta倒置共聚焦激光显微镜(Zeiss,Germany)将玻片成像，并且利用Imaris(BitPlane Scientific Software,Germany)成像软件测量荧光强度。利用Prism GraphPadver.6.01(GraphPad Software,Inc.,USA)进行荧光强度差异的统计学分析。
利用兔抗SCARB2多克隆血清的保护细胞免于病毒感染的测定：还在活细胞上进行抗体介导的SCARB2阻断测定以评价其对细胞感染的影响。将过夜接种的NIH/3T3细胞(在96-孔板中1x104个细胞/孔)用针对小鼠或人SCARB2蛋白产生的兔多克隆血清的两倍系列稀释液(1:20至1:640)在37℃下温育1小时。随后将细胞用100MOI EV71:TLLmv或者克隆衍生的病毒突变体CDV:BS[M-P1]和CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]在37℃下温育1小时。在用新鲜DMEM(1％FBS)替换之前将细胞在PBS中洗涤两次。每天观察细胞的CPE的表现，并且在感染后3天(dpi)收获受感染的细胞培养上清液。如以前[6,71]，用之前的病毒分散方法通过在室温下于1％去氧胆酸钠中剧烈涡旋15分钟使上清液进行病毒滴定。用Reed和Muench方法[61]计数病毒滴度并用感染性计算器报道为CCID50/ml[62]。
实施例10
将EV71:BS基因组RNA转染入小鼠神经元Neuro-2a和成纤维细胞NIH/3T3产生活病毒子代
以前证实小鼠成纤维细胞NIH/3T3和神经母细胞瘤Neuro-2a细胞不容许EV71:BS感染，但是容许Vero细胞感染(上文或[71])。源自EV71:BS的两个毒株EV71:TLLm和EV71:TLLmv成功进入并在这些小鼠细胞内复制。为了确定EV71:BS基因组是否可以在这些不容许的细胞中复制，提取来自EV71:BS的基因组RNA并转染入Vero、NIH/3T3和Neuro-2a细胞。相似地，将来自EV71:TLLm和EV71:TLLmv的基因组RNA转染入这3个细胞系用于比较。为了评价产生的病毒子代的生存力，随后将转染上清液重新接种在新鲜细胞上(图15A)。
将全部3种病毒毒株的基因组RNA转染入Vero细胞导致转染的细胞单层中的溶解的细胞病变效应(CPE)(图15B)。在死细胞中也观察到病毒抗原表达(图15C)，表明成功的病毒复制。从EV71:TLLm或EV71:TLLmv病毒RNA转染入NIH/3T3和Neuro-2a细胞单层观察到相似的结果(图15B和15C)。在另一方面，EV71:BS RNA转染入NIH/3T3和Neuro-2a细胞导致表现出病毒抗原表达的一些细胞死亡，但是不导致细胞单层的完全CPE。将来自NIH/3T3和Neuro-2a细胞的EV71:BS转染上清液进一步传代至新鲜Vero细胞上导致诱导细胞单层的完全裂解(图15D)和死细胞中病毒抗原的检测(图15E)。但是，将转染上清液传代至新鲜NIH/3T3细胞不产生CPE(图15D)或病毒抗原表达(图15E)。
实施例11
小鼠细胞系适应的EV71:TLLm的衣壳编码的P1区负责病毒成功进入小鼠NIH/3T3和Neuro-2a细胞
以前的分析表明EV71:TLLm和EV71:TLLmv的衣壳蛋白可能负责成功进入NIH/3T3和Neuro-2a细胞(上文或[71])。为了证实这个，通过标准反向遗传学产生EV71:BS基因组的全长cDNA克隆。随后用EV71:TLLm P1的遗传序列代替EV71:BS的全长cDNA克隆的P1(衣壳)区以产生嵌合质粒克隆(图16A)。将EV71:BS cDNA克隆转染入Vero细胞以产生克隆衍生的病毒(CDV:BS)。相似地，转染嵌合克隆以产生表现出EV71:TLLm的衣壳蛋白且表达EV71:BS的非结构蛋白的CDV:BS[M-P1]。将这些CDV重新接种入各种细胞系以评价感染表型(图16B)。
EV71:BS克隆衍生的病毒(CDV:BS)在Vero细胞而非NIH/3T3和Neuro-2a细胞中诱导CPE，而CDV:BS[M-P1]在接种后48小时(hpi)在全部3种细胞系中均诱导CPE(图16C)。用CDV:BS[M-P1]而不是用CDV:BS感染的小鼠细胞导致死细胞中病毒抗原的检测(图16D)。为了评价第一传代(P1)中活病毒子代的产生和释放，将来自受感染的细胞的澄清的培养上清液重新接种在新鲜的相同细胞系的单层上，并且在72hpi测量病毒收率。CDV:BS和CDV:BS[M-P1]传代至Vero细胞上均表现出高病毒滴度，并且在进一步传代(P2)之后观察到显著的滴度增加(图16E)。同时，CDV:BS[M-P1]而非CDV:BS的传代(P1)在NIH/3T3和Neuro-2a细胞中均产生高病毒收率(图16F)。
实施例12
EV71:BS衣壳中的VP1-L169F氨基酸取代使得病毒能够进入小鼠细胞并在小鼠细胞中诱导有限感染
小鼠细胞适应的EV71:TLLm的衣壳蛋白使得EV71:BS能够进入小鼠细胞，并且我们感兴趣的是赋予这种新表型的特定残基的身份。以前比较EV71:BS和小鼠细胞适应的EV71毒株的多聚蛋白序列比对的数据显示VP1和VP2蛋白上的多个氨基酸取代，它们可能参与宿主细胞上的病毒受体衔接(上文或[71])。这些残基包括VP1K98E、E145A和L169F，以及VP2S144T和K149I。为了确定这些氨基酸取代哪个是小鼠细胞进入必需的，通过标准位点定向诱变将导致这些氨基酸取代的单独突变引入EV71:BS全长cDNA克隆(图17A)。将这些经修饰的cDNA克隆独立地转染入Vero细胞以产生克隆衍生的病毒(CDV)，并且将收获的上清液接种在新鲜接种的Vero、NIH/3T3和Neuro-2a细胞上以评价感染表型。
用所有突变克隆衍生的病毒(CDV)感染的Vero细胞均表现出100％CPE，但是仅那些包含VP1氨基酸取代的CDV-CDV:BSVP1[K98E]、CDV:BSVP1[E145A]和CDV:BSVP1[L169F]-在Neuro-2a细胞中导致100％CPE(图17B和17C)。用在VP1(CDV:BSVP1)和VP2(CDV:BSVP2)中包含氨基酸取代的CDV感染的Vero和Neuro-2a细胞中检测到病毒抗原表达，但是仅有用CDV:BSVP2感染的NIH/3T3细胞表现出病毒抗原表达(图17D和17E)。此外，如在Vero细胞中测定，用所有突变CDV感染的Vero细胞均产生可测量的病毒滴度(图17F)，表明病毒生存力，但是仅CDV:BSVP1[L169F]在受感染的NIH/3T3和Neuro-2a细胞的培养上清液中产生可测量的病毒滴度(图17G)。但是，将来自用CDV:BSVP1[L169F]感染的NIH/3T3和Neuro-2a细胞的培养上清液进一步传代至健康小鼠细胞上不能诱导感染。
实施例13
小鼠细胞中的高效生产性感染需要VP1中的组合氨基酸取代
为了评价VP1和VP2中组合的氨基酸取代是否也可以使得EV71:BS能够进入小鼠细胞，产生具有氨基酸取代的各种组合(BSVP2[S144T/K149I]、BSVP1[K98E/E145A]、BSVP1[K98E/E145A/L169F]和BS[VP1/VP2])的EV71:BS的全长基因组cDNA克隆(图18A)。将质粒克隆独立地转染在Vero细胞上，并且将所得的上清液用来接种Vero、NIH/3T3和Neuro-2a细胞以评价感染表型。
除了CDV:BSVP2[S144T/K149I]，所有测定的CDV均在Vero和Neuro-2a细胞中诱导CPE(图18B)。在用各种CDV感染的所有细胞中还检测到病毒抗原，虽然在比较小鼠细胞系时免疫染色在Neuro-2a中比在NIH/3T3细胞中更明显。如在Vero细胞中测定的，高病毒滴度在用所有CDV感染的Vero细胞的培养上清液中均可测量(图18D)，但是仅CDV:BSVP1[K98E/E145A]和CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]在感染的NIH/3T3和Neuro-2a细胞的培养上清液中产生可测量的病毒滴度(图18E)。
实施例14
具有在VP1K98E、E145A和L169F的组合氨基酸取代的EV71:BS病毒可以在小鼠Neuro-2a细胞中成功传代
到目前为止4种克隆衍生的病毒分离株使得EV71:BS能够进入并感染培养的小鼠细胞系：CDV:BS[M-P1]、CDV:BSVP1[L169F]、CDV:BSVP1[K98E/E145A]和CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]。为了鉴定这些CDV中哪种可以稳定感染小鼠细胞多个循环，将病毒上清液在相同细胞系中传代两次，即从Neuro-2a至新鲜Neuro-2a细胞。通过CPE诱导和病毒抗原表达的评价以及活病毒后代的产生监测感染。
如通过病毒抗原的检测(图19A)和可测量的病毒滴度(图19B)证实的，仅CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]和CDV:BS[M-P1]可以在Neuro-2a细胞中成功地连续传代。在第2和3代中均观察到阳性染色，并且与第一代相比，在第2代中记录到病毒滴度增加。在另一方面，仅CDV:BS[M-P1]能够在NIH/3T3细胞中诱导病毒抗原表达(图19A)，但是未检测到活病毒子代。源自Neuro-2a细胞中的第三代的CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]的基因组测序显示引入的氨基酸突变没有变化(图19C)。
实施例15
小鼠细胞系适应的毒株EV71:TLLmv在体内和体外均结合SCARB2蛋白
最近证实EV71利用清道夫受体B类成员-2(SCARB2)蛋白作为其宿主细胞进入的受体[47]。为了确认小鼠细胞系适应的EV71毒株在感染小鼠细胞期间是否也利用SCARB2，进行竞争性病毒结合测定。首先，在与活EV71:TLLmv体外结合之前，将在Teflon包被的玻片上生长过夜并用4％多聚甲醛温和固定的NIH/3T3和Vero细胞用兔血清抗小鼠SCARB2蛋白(mSCARB2)温育。利用pan-肠道病毒单克隆抗体荧光检测结合的细胞，并且将荧光强度定量。用抗mSCARB2血清预温育NIH/3T3细胞导致EV71:TLLmv结合的显著减少(图20A)，这在用非特异性血清(NSP)预温育时未观察到。利用Vero细胞观察到相似的结果(图20B)。
在第二个实验中，在接种至接种的NIH/3T3细胞上之前，将活EV71:TLLmv与重组可溶性SCARB2蛋白一起温育，并且通过结合的pan-肠道病毒单克隆抗体的荧光标记评价感染。与可溶性mSCARB2预温育的病毒以剂量依赖性方式减少细胞感染的严重程度(图20C)。当在预温育中使用人SCARB2(hSCARB2)蛋白时获得相似的结果(图20D)。
实施例16
通过小鼠细胞与针对SCARB2蛋白产生的血清预温育阻断EV71:TLLmv细胞感染。
为了评价通过阻断EV71:TLLmv与SCARB2的相互作用是否减少细胞感染，在用活EV71:TLLmv接种之前用SCARB2蛋白抗血清的各种稀释液温育接种的NIH/3T3细胞，并且通过测量活病毒子代的滴度来评价感染。用hSCARB2抗血清的低稀释液(1:20至1:80)预温育细胞导致与对照相比病毒滴度显著的剂量依赖性减少(图20E)。当用mSCARB2抗血清预温育细胞时获得相似的结果(图20F)。
实施例17
CDV:BS[M-P1]和CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]利用小鼠SCARB2蛋白作为它们进入小鼠细胞的功能受体
CDV:BS[M-P1]和CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]均稳定地感染小鼠Neuro-2a细胞。为了确定这些CDV是否像小鼠细胞适应的EV71:TLLmv毒株也利用mSCARB2用于病毒进入和脱壳，在用CDV突变体感染之前将Neuro-2a细胞用mSCARB2抗血清温育。在用CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F](图21A)或CDV:BS[M-P1](图21B)感染的细胞中观察到溶解CPE的剂量依赖性减少。在感染后7天(dpi)滴定培养上清液显示与对照相比，在用SCARB2抗血清预温育的细胞中CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]病毒滴度没有显著差异(图21C)。在另一方面，相对于对照，在用血清预温育的CDV:BS[M-P1]感染的细胞中检测到显著的病毒滴度减少(图21D)。
实施例18
实施例19的材料和方法
动物模型：为了确定小鼠细胞适应的毒株(EV71:TLLm和EV71:TLLmv)的动物感染表型，将5-6日龄的Balb/c小鼠用106CCID50的病毒感染并观察疾病和神经系统并发症的症状。动物随访最多28天，之后将动物处死并收集血清用于EV71特异性抗体的检测。
实施例19
小鼠细胞系适应的EV71(EV71:TLLm和EV71:TLLmv)在Balb/c小鼠中的神经毒性研究
在用EV71:TLLm感染的免疫活性的动物(n＝7)中，2只(29％)在感染后8天死于严重和持续性(>24小时)瘫痪(图13A)。在其他存活的小鼠中，5只(5/7,71.4％)表现出震颤和共济失调，5只表现出一个或两个后肢局部麻痹，以及4只(4/7,57.1％)表现出一个或两个后肢暂时瘫痪。在另一方面，用EV71:TLLmv感染的动物表现出更严重的疾病临床表现。10只中的9只(90％)受感染的动物在感染的8天内死于疾病(图13A)，9只中的6只(66.7％)在感染后第4天内发生死亡。出现的其他症状包括震颤(5/10,50％)、一个或两个后肢局部麻痹(6/10,60％)以及一个或两个后肢瘫痪(5/10,50)。虽然与空白感染的动物相比，用EV71:TLLm感染的小鼠体重看来没有差异，但是用EV71:TLLmv感染的小鼠在感染的前10天内表现出体重的急剧减少(图13B)。更有趣的是，我们在EV71感染的小鼠中观察到一个新症状，由此瘫痪的动物(图14A，箭头)出现具有突出的肋下衰退的呼吸急促。此外，9只中的6只(66.7％)死亡在安乐死之前出现这个症状。在尸检时，我们还观察到在打开胸腔时肺衰竭萎陷(图14B，箭头)，在收集肺和心脏组织时尸检中的正常过程，表明存在肺水肿。组织的组织学检查显示肺的肺泡腔中的肺水肿和出血的特征(图14C)，并且较高放大图像显示均质蛋白物质的现状(图14D，箭头)。
还利用免疫受损的小鼠(如NSG小鼠)进行这个实施例。除了疾病的严重程度更大并且死亡率更高之外获得相似的结果。
实施例20
筛选候选抗EV71化合物
利用已显示对EV71:TLLm或EV71:TLLmv病毒毒株的溶细胞感染易感的小鼠NIH/3T3细胞系进行候选抗EV71化合物的高通量体外筛选。然后在动物模型中体内测试来自体外筛选的选定的有希望的化合物。为了完成体内筛选，用标准化滴度的病毒毒株感染标准化(基于统计学计算)数量的BALB/c小鼠，所述病毒毒株采自制备、滴定并保存在深度冷冻器(-80℃)中的小鼠细胞系适应的EV71毒株(EV71:TLLm和EV71:TLLmv)的标准化储备。向受感染的小鼠施用各种标准化剂量的候选抗EV71化合物，或在疾病出现之前施用用于测定候选化合物的潜在预防效果，或在疾病发生之后施用用于测定候选化合物的潜在治疗效果。
实施例21
实施例22-25的材料和方法
小鼠和病毒毒株：成年BALB/c小鼠购自InVivos(Singapore)，并且交配以获得幼崽。用于接种的EV71毒株包括EV71:BS、EV71:TLLm和EV71:TLLmv，其细节和特征在本文中已描述。
伦理声明：动物程序由淡马锡生命科学实验室的动物机构护理和使用委员会(IACUC)批准(批准号TLL-14-023)。将垂死的收感染的动物通过I.P.途径注射90mg/kg戊巴比妥安乐死。按照加州大学旧金山分校的动物机构护理和使用委员会(IACUC)设置的准则和标准程序进行神经系统检查。安乐死的标准包括以前设置的准则[34]：(1)丧失>20％最大记录的体重，(2)瘫痪持续>48h，(3)没有进食或不能进食，(4)不能自行纠正，以及(5)改变的意识状态，其表现为神志不清或昏迷。幼崽观察总计28天，并且将这个时期存活的动物通过I.P.注射戊巴比妥安乐死。
动物操作和感染：将不同年龄(6、14、21或28日龄)的8只小鼠的组通过I.P.或I.M.注射用EV71:TLLmv(剂量106CCID50)接种。为了确定EV71:TLLmv的最佳剂量，将6-日龄幼崽的组(n＝8每组)通过I.P.途径用不同剂量的病毒(106、105、104、103或102CCID50)攻击。在感染后第一周期间每天两次观察受感染的动物的疾病表现。如上文所述将垂死的动物和在观察期存活的那些动物安乐死。通过心脏穿刺利用26G针进行末梢血采集。
尸检、大体病理学观察和组织采集：利用标准方案将安乐死的动物尸检以收获器官。还进行大体病理学检查并在IACUC批准下拍摄照片。将肺用无菌PBS表面冲洗两次，然后在测量湿重之前在滤纸上吸干液体。将用于组织学研究的收获的器官在10％中性缓冲福尔马林(NBF)中于4℃下储存1周。
确定：组织病毒负荷。利用Teflon杵将冷冻组织浸软并重建(reconstitute)于1mlDMEM(1％FBS)中。然后将样品混合1h并离心两次(20g,30min,4℃)以去除组织碎片并获得澄清的病毒。将病毒样品在1％去氧胆酸钠中分散[88]，然后10-倍系列稀释并转移至NIH/3T3细胞上。每天观察受感染的细胞的细胞病变效应(CPE)，并且将细胞用pan-肠道病毒单克隆抗体(Merck Millipore,USA)染色[88]。计数病毒滴度并报道为CCID50/g组织。
组织学分析的组织加工：将固定的组织在一系列增加浓度的70％、95％和100％乙醇中脱水。将组织在2次变化(change)的醇和3次变化的Histoclear II(ElectronMicroscopy Sciences,USA)中温育，并且最终用4次变化的液体石蜡浸润。所有温育均在室温下进行1h，同时以100rpm温和摇动。石蜡浸润在设置为65℃的烤箱中进行。利用切片机将石蜡包埋的组织块切片(5μm)，装载在聚-赖氨酸包被的玻片上，在42℃下干燥过夜，然后在室温下储存直至进一步使用。
组织切片的染色：通过在2次变化的Histoclear II中温育将组织切片脱蜡，然后在100％、95％、70％和50％的减少醇浓度中缓慢复水。在染色之前将玻片在PBS中温育10min。通过首先用Harris'苏木精(Sigma Aldrich,USA)淹没玻片并在室温(RT)下温育15min来进行苏木精和伊红(H&E)染色。然后将玻片在水中漂洗，在1％酸性醇(95％乙醇，1％HCl)中脱色，浸在0.2％NH4OH中，并且在水中漂洗10min，然后在伊红溶液中复染。随后将玻片在95％乙醇中脱色，通过3次变化的无水醇和2次变化的Histoclear II脱水。最终将组织置于DPX封固液(Sigma Aldrich,USA)中。
免疫组织化学：在脱蜡和复水之后，通过在组织学级微波炉和柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中于96℃下温育30min使玻片进行热诱导的抗原检索。允许玻片在3h中冷却至RT，随后用5％正常猪血清在RT下封闭1h。没有进一步洗涤，然后将玻片在4℃下于包含多克隆抗体抗EV71(来自Dr.Hiroyuki Shimizu of NIID,Japan的慷慨礼物)的兔血清中温育过夜。然后将玻片在Tris-缓冲盐水(pH 7.4)、0.05％Tween-20(TBS-T)中洗涤5次，并且在TBS中漂洗两次，随后通过添加3％H2O2在RT下1h来猝灭内源性过氧化物酶。随后将玻片在TBS中洗涤两次，然后用猪抗兔Ig-HRP(Dako Cytomation,Denmark)在RT下温育1h。洗涤之后，将玻片在二氨基联苯胺(DAB)中温育，并且用苏木精复染。
作图组织切片中的病毒抗原和病毒诱导的损伤：小鼠脑的代表性冠状切片的模板图像下载自www dot brainstars dot org[89]。这些图像自由使用，并且在CreativeCommons of Japan的许可下修改。将观察到的损伤和病毒抗原标记在模板图像上。利用冠状切片的小鼠脑图集(atlas)鉴定受影响的脑区域(www dot mouse dot brain-map dotorg slash static slash atlas)[90]。相似地，将胸部脊髓的代表性冠状切片用作脊髓图片的模板。然后将示出病毒抗原和病毒诱导的损伤的区域标记在模板图像上。
血清儿茶酚胺水平的测量：在尸检期间通过垂死动物的心脏穿刺采集血液样品。通过在3000g，4℃下离心凝结的血液样品30min获得血清，然后储存在-20℃下直至利用2-CAT(A-N)ELISA试剂盒(Labor Diagnostika Nord,Germany)根据制造商的方案确定儿茶酚胺水平。
统计分析：利用Windows的GraphPad Prism(版本6.01)(GraphPad Software,USA,www dot graphpad dot com)产生所有图表并进行统计学分析。
病毒毒株EV71:TLLm和EV71:TLLmv诱导的感染表型的比较：将6-日龄BALB/c幼崽的组用106CCID50剂量的EV71:BS、EV71:TLLm或EV71:TLLmv通过腹腔内(I.P.)或肌肉内(I.M.)途径接种(n＝10只小鼠/组)。在接种后第一周期间每天两次观察动物的疾病表现，并且如已描述的，在检测到严重表现时将动物安乐死。
来自受感染的小鼠的血清中的中和抗体水平的测量：在尸检时在室温下凝结之前通过心脏穿刺采集血液样品，并且通过在3000g，4℃下离心20min获得血清。将样品储存在-20℃下直至进一步分析。测定冷冻储备的随机样品的中和抗体滴度。在96-孔板中制备血清的2-倍系列稀释液(1:20至1:1280)并与100CCID50病毒混合。将混合物在37℃下温育1h，然后添加NIH/3T3细胞(6,000个细胞/孔)。将平板在37℃下温育几天，并且在第4-10天观察CPE。利用Reed和Muench方法确定中和抗体滴度(报道为单位/ml血清)。
实施例22
经修饰的EV71毒株在小鼠宿主中的感染动力学
目前的肠道病毒71(EV71)诱导的神经系统疾病和病理的动物模型仅部分复制人类疾病。因此我们的目的是利用可以生产性感染啮齿类动物和灵长类细胞系[88]的小鼠细胞(NIH/3T3)适应的病毒毒株EV71:TLLm和EV71:TLLmv开发疾病病理的临床可信模型。首先，通过评价用病毒通过腹腔内(I.P.)途径感染的1-周龄BALB/c小鼠中的疾病病理来评价EV71:TLLm和EV71:TLLmv与亲代毒株EV71:BS相比的相对毒力。虽然在所有接种的动物中均观察到血清转化，但是仅有用EV71:TLLm或EV71:TLLmv感染的小鼠发展为致死疾病(图22a和22b)。相似地，当通过可选的肌肉内(I.M.)途径施用适应的毒株时，这些再次与相对于亲代毒株EV71:BS减少的宿主存活相关(57％存活；图22c)。当将I.P.和I.M.感染途径考虑在一起时，接种后的平均存活时间对于EV71:TLLmv感染是感染后4天(DPI)，对于EV71:TLLm感染是7DPI(x2＝6.840；p＝0.0089)。总的来说，这些数据表明小鼠细胞适应的病毒毒株与EV71:TLLmv与最大水平的致死率相关，并且因此被用于所有随后的实验。
然后评价最佳病毒剂量、接种途径和用于进一步模型开发的小鼠年龄。首先，证实EV71:TLLmv感染的小鼠中的疾病严重程度取决于病毒剂量；在用106的半数细胞培养感染剂量(CCID50)接种的动物中观察到最低存活率(图23a)，并且中间人道终点(HD50)等于3.98x 103CCID50(图23b)。然后评价动物年龄和感染途径对宿主存活的影响；用EV71:TLLmv注射的1周龄小鼠的存活曲线不受接种途径的显著影响(图23c)，但是年轻动物一致表现出比年长动物差的存活，与病毒注射部位无关(图23d)。仅在年长动物中才可能识别注射途径对疾病严重程度的任何影响；虽然3周龄小鼠完全耐受I.P.感染，但是一些动物在通过I.M.途径的病毒注射中未存活(图24a和24b)。在感染存活的所有小鼠中均检测到血清转化，包括那些未表现出疾病的任何表现的小鼠(图24c、24d和24e)。这些数据证实EV71:TLLmv诱导急性和严重的感染，其在1-3周龄的小鼠中是致死的。这里测试的条件中，在用106CCID50的病毒剂量注射入腹膜腔或肌肉组织的1周龄小鼠中疾病严重程度最大。
实施例23
EV71:TLLmv感染小鼠中的疾病发展
用EV71:TLLmv接种的大部分1-周龄小鼠死于疾病，并且表现出神经系统疾病的各种临床表现。受感染的动物表现出共济失调、局部或全身震颤、步态不稳以及暂时或持续直至安乐死时间的肢体局部麻痹和瘫痪。基于临床表现，可以将生病的动物容易地分为4组(表6)。幸存者包括在28天的观察期中的任何点均没有看来垂死的小鼠。I类动物在3-7DPI之后呈现严重表现，包括不能自行纠正以及神志不清或昏迷。这组中的所有动物均表现出痉挛性肢体局部麻痹和/或瘫痪(前肢、后肢或两者)，但是虽然一些动物缺少呼吸系统症状(IB类)，然而其他额外的特征在于呼吸窘迫的表现，包括呼吸急促、打嗝、喘气和肋下衰退(IA类)。呈现IA类表现的疾病的EV71:TLLmv感染的小鼠中的标志观察通过包含两只不同IA类小鼠的两个视频剪辑的视频进行。两只动物均不能自行纠正，并且处于昏迷状态。表现为肋下衰退的呼吸急促的严重呼吸窘迫在第一只小鼠中很明显。在第二只小鼠中看到喘气、肋下衰退和从鼻孔喷出的泡沫状液体。呈现IB类表现的疾病的EV71:TLLmv感染的小鼠中的标志观察通过一只1B类小鼠的视频进行。该动物不能自行纠正，并且处于神志不清的状态。还观察到右肢的同侧瘫痪和左后肢的持续性震颤。最后，II类小鼠在7DPI之后呈现感染表现，包括肢体的持续性弛缓性麻痹(>48h持续时间)(图23e)连同严重的体重下降(>20％最大体重)。在所有疾病类别中，一些受感染的动物表现出无毛病变或它们背上的秃斑，持续几天(图23f)。用EV71:TLLmv I.P.接种的大部分幼崽分类为I类(图23g)；IA类动物包含19.3％(n＝11；明显的呼吸系统表现)，而IB类动物包含43.9％(n＝25；没有明显的呼吸系统表现)。II4类动物代表受感染幼崽的仅12.3％(n＝7)，而幸存者构成所有受感染的小鼠的24.5％(n＝14)。在通过I.M.途径接种的幼崽中观察到疾病分类之间相似的分布模式(图23h)。总的来说，这些数据表明用EV71:TLLmv感染的小鼠表现出可变发病率和严重程度的神经系统和呼吸系统症状，这反映在人类患者中观察到的疾病的全谱。
表6
在安乐死时EV71:TLLmv感染的BALB/c小鼠的临床特征
a在观察期结束时(28DPI)评价动物
b动物不能自行纠正，但是对脚趾的物理刺激有反应。
b动物不能自行纠正，并且对脚趾的物理刺激没反应。
d在35％的IB类小鼠中观察到心动过速
实施例24
呈现IA类表现的小鼠中的神经源性肺水肿
进一步研究在IA类小鼠中观察到的呼吸窘迫是否是病毒诱导的肺水肿(PE)的表现。IA类、IB类和II类小鼠之间大体肺病理的比较显示IA类肺在尸检时肿胀、不完全坍塌(图25a-25d)，并且表现出相对于来自其他组的肺增加的湿重(图22E)。来自假接种的肺组织切片(图25f)和IA类肺的比较显示仅在受感染的动物的肺泡腔中的出血的病灶区域以及充满蛋白质和红细胞的液体的积累(图25g)。这些病理特征在IB类和II类小鼠的肺中不存在(图25h和25i)。此外，我们发现在采集自任何组的小鼠的肺中没有炎性浸润或病毒抗原的证据(图26a)。相似地，每类受感染的小鼠中的心肌的组织化学分析也不能发现炎性浸润、心肌坏死或病毒抗原的任何证据(图26b)。总的来说，这些数据证实IA类小鼠中明显的呼吸窘迫不可以归因于肺炎或充血性心力衰竭。因此我们试图确定这组中观察到的PE是否是神经源性的，所以然后我们测量儿茶酚胺的血清水平以确定神经递质浓度在具有呼吸系统表现的EV71:TLLmv感染的小鼠(IA类)中是否被调节。利用这种方法，我们观察到肾上腺素和去甲肾上腺素的血液浓度在IA类小鼠中显著高于在II类小鼠或空白感染的动物中检测到的那些(图25j和25k)。这些数据强烈表明IA类小鼠在死亡之前表现出EV71诱导的神经源性肺水肿(NPE)。
实施例25
IA类、IB类和II类小鼠中的EV71:TLLmv病毒向神经性
然后评价来自每个疾病组的动物的脑和脊髓中的EV71:TLLmv和病毒诱导的损伤的分布，以鉴定可能有助于仅在IA类小鼠中选择性发展的NPE的因素。IA类和IB类中的大部分动物表现出病毒抗原的广泛染色(检测到>10个阳性神经元)以及在评价的所有CNS区中的轻度病理损伤(观察到>5个损伤)(表7)。相比之下，具有II类疾病的5只小鼠中仅1只在感觉皮层、海马、间脑、中脑、延髓或腰部脊髓中表现出病毒抗原和/或损伤。我们不能在CNS以外测试的任何组织中检测到病毒抗原(除了通过I.M.途径接种之后的骨骼肌，数据未示出)。
表7
致命感染的BALB/c小鼠中的EV71抗原和病毒诱导的损伤的CNS分布
a每个玻片检测的病毒抗原的密度：+，<10个阳性神经元；++，10-20个阳性神经元；+++，>20个阳性神经元
b在指定的脑区域中表现出病毒抗原的动物的百分比(n＝5)
c神经组织中病理损伤的分布：+，<5个损伤；++，5-10个损伤；+++，>10个损伤
d在指定的脑区域中表现出损伤的动物的百分比(n＝5)
当比较IA类和IB类小鼠之间的CNS病理时，观察到组织损伤和病毒抗原均位于海马、间脑、中脑、小脑和延髓内的相同区域，但是在具有IA类疾病的动物中病理更严重(表7和图27a-27d)。实际上，当与IB类小鼠比较时，IA类中的动物表现出更广泛的神经元变性、吞噬作用和海马CA3神经元中的坏死(图28a和28b)。IA类小鼠还表现出下丘脑中的强病毒抗原染色，伴随有明显的组织炎症和神经元坏死，而这些病理特征在IB类动物中是有限的(图28c和28d以及图27b)。相似地，IA类小鼠还呈现更严重的病毒诱导的病理的特征以及丘脑的腹后复合物(图28e和28f以及图27b)，包括中脑导水管周围灰质(PAG)、中脑网状区和运动相关上丘的中脑相关组织(图28g和28h以及图7c)，以及小脑的浦肯野细胞和齿状核(图28i和28j，图27d和图29a)中的病毒抗原强度。
在两个疾病组中(IA类和IB类)，在延髓中(图28k和28l)，特别是在中间网状核(IRN)、小细胞网状核(PARN)和三叉神经脊束核(sptV)的运动相关区域中(图27d和图29b)检测到最广泛的病毒抗原分布以及包括神经元损伤和组织炎症的病理损伤。但是，仅1A类小鼠在髓质网状核的腹侧和背侧区域、孤束核(NTS)以及极后区(AP)中表现出病毒抗原和组织损伤(图29b和29c)。为了比较，还示出来自空白感染的小鼠的海马、下丘脑、丘脑、中脑、小脑和延髓的代表性图像(图30a-30f)。相比之下，IA类和IB类小鼠在运动皮质、躯体感觉皮质、脑桥或脊髓灰质前角内的组织损伤或病毒抗原染色的分布、定位或程度方面没有不同(图28m和28n，图27a-27c以及图31a-31e)，与NPE是由病毒触发的特定脑区域损伤而不是所有组织中EV71诱导的病理的均匀增加引起的观念一致。
在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个(a)”和“一个(an)”和“这个”以及相似指称的使用应当理解为覆盖单数和复数，除非在本文中另有指明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放性术语(即，表示“包括但不限于”)。除非本文中另有指明，本文中值的范围的列举仅是为了用作单独指落入此范围的每个不同值的简略方法，并且每个不同值如其在本文中单独列举一样并入本说明书。除非本文另有说明或显然违背上下文，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本发明，并不对本发明的范围构成限制。本说明书中没有语言应当被理解为任何未要求保护的元素对本发明的实施是必要的。
本文描述了本发明的实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。在阅读前面的描述时，那些实施方案的变化对于本领域技术人员可以变得显而易见。发明人希望技术人员适当采用这类变化，并且发明人计划不像本文具体描述地实施本发明。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中列举的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或显然违背上下文，本发明涵盖上述元素的任意组合的所有可能的变化。
参考文献
1.Alexander JP,Baden L,Pallansch MA,Anderson LJ(1994)Enterovirus71infections and neurologic disease–United States,1977–1991.J Infect Dis 169:905–908.
2.Melnick JL(1996)Enteroviruses:Polioviruses,Coxsackieviruses,Echoviruses,and Newer Enteroviruses.In:Fields B N KDM,Howley P M,et al..,editor.Fields Virology.Philadelphia.:Lippincott-Raven.655–712.
3.Bible JM,Iturriza-Gomara M,Megson B,Brown D,Pantelidis P,et al.(2008)Molecular epidemiology of human enterovirus 71in the United Kingdomfrom 1998to 2006.J Clin Microbiol 46:3192–3200.
4.Ooi MH,Wong SC,Lewthwaite P,Cardosa MJ,Solomon T(2010)Clinicalfeatures,diagnosis,and management of enterovirus 71.Lancet Neurol 9:1097–1105.
5.Solomon T,Lewthwaite P,Perera D,Cardosa MJ,McMinn P,et al.(2010)Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71.LancetInfect Dis 10:778–790.
6.Schmidt NJ,Lennette EH,Ho HH(1974)An apparently new enterovirusisolated from patients with disease of the central nervous system.J InfectDis 129:304–309.
7.Blomberg J,Lycke E,Ahlfors K,Johnsson T,Wolontis S,et al.(1974)Letter:New enterovirus type associated with epidemic of aseptic meningitisand-or hand,foot,and mouth disease.Lancet 2:112.
8.Kennett ML,Birch CJ,Lewis FA,Yung AP,Locarnini SA,et al.(1974)Enterovirus type 71infection in Melbourne.Bull World Health Organ 51:609–615.
9.Deibel R,Gross LL,Collins DN(1975)Isolation of a new enterovirus(38506).Proc Soc Exp Biol Med 148:203–207.
10.Hagiwara A,Tagaya I,Yoneyama T(1978)Epidemic of hand,foot andmouth disease associated with enterovirus 71infection.Intervirology 9:60–63.
11.Chumakov M,Voroshilova M,Shindarov L,Lavrova I,Gracheva L,et al.(1979)Enterovirus 71isolated from cases of epidemic poliomyelitis-likedisease in Bulgaria.Arch Virol 60:329–340.
12.Shindarov LM,Chumakov MP,Voroshilova MK,Bojinov S,Vasilenko SM,etal.(1979)Epidemiological,clinical,and pathomorphological characteristics ofepidemic poliomyelitis-like disease caused by enterovirus 71.J Hyg EpidemiolMicrobiol Immunol 23:284–295.
13.Nagy G,Takátsy S,Kukán E,Mihály I, I(1982)Virologicaldiagnosis of enterovirus type 71 infections:experiences gained during anepidemic of acute CNS diseases in Hungary in 1978.Arch Virol 71:217–227.
14.Chonmaitree T,Menegus MA,Schervish-Swierkosz EM,Schwalenstocker E(1981)Enterovirus 71 infection:report of an outbreak with two cases ofparalysis and a review of the literature.Pediatrics 67:489–493.
15.Samuda GM,Chang WK,Yeung CY,Tang PS(1987)Monoplegia caused byEnterovirus 71:an outbreak in Hong Kong.Pediatr Infect Dis J 6:206–208.
16.Gilbert GL,Dickson KE,Waters MJ,Kennett ML,Land SA,et al.(1988)Outbreak of enterovirus 71 infection in Victoria,Australia,with a highincidence of neurologic involvement.Pediatr Infect Dis J 7:484–488.
17.Hayward JC,Gillespie SM,Kaplan KM,Packer R,Pallansch M,et al.(1989)Outbreak of poliomyelitis-like paralysis associated with enterovirus71.Pediatr Infect Dis J 8:611–616.
18.Tagaya I,Takayama R,Hagiwara A(1981)A large-scale epidemic ofhand,foot and mouth disease associated with enterovirus 71 infection in Japanin 1978.Jpn J Med Sci Biol34:191–196.
19.Ishimaru Y,Nakano S,Yamaoka K,Takami S(1980)Outbreaks of hand,foot,and mouth disease by enterovirus 71.High incidence of complicationdisorders of central nervous system.Arch Dis Child 55:583–588.
20.Hagiwara A,Yoneyama T,Hashimoto I(1983)Isolation of a temperature-sensitive strain of enterovirus 71 with reduced neurovirulence for monkeys.JGen Virol 64(Pt 2):499–502.
21.Lum LC,Wong KT,Lam SK,Chua KB,Goh AY,et al.(1998)Fatal enterovirus71encephalomyelitis.J Pediatr 133:795–798.
22.Lum LC,Wong KT,Lam SK,Chua KB,Goh AY(1998)Neurogenic pulmonaryoedema and enterovirus 71 encephalomyelitis.Lancet 352:1391.
23.Chang LY,Huang YC,Lin TY(1998)Fulminant neurogenic pulmonaryoedema with hand,foot,and mouth disease.Lancet 352:367–368.
24.Yan JJ,Wang JR,Liu CC,Yang HB,Su IJ(2000)An outbreak ofenterovirus 71infection in Taiwan 1998:a comprehensive pathological,virological,and molecular study on a case of fulminant encephalitis.J ClinVirol 17:13–22.
25.Liu CC,Tseng HW,Wang SM,Wang JR,Su IJ(2000)An outbreak ofenterovirus 71 infection in Taiwan,1998:epidemiologic and clinicalmanifestations.J Clin Virol 17:23–30.
26.Wang JR,Tsai HP,Chen PF,Lai YJ,Yan JJ,et al.(2000)An outbreak ofenterovirus 71 infection in Taiwan,1998.II.Laboratory diagnosis and geneticanalysis.J Clin Virol 17:91–99.
27.China C(2008)Report on the hand,foot and mouth disease outbreak inFuyang City,Anhui Province and the prevention and control in China.Beijing,China:Office of the World Health Organization,China.
28.Yang F,Zhang T,Hu Y,Wang X,Du J,et al.(2011)Survey of enterovirusinfections from hand,foot and mouth disease outbreak in China,2009.Virol J 8:508.
29.Zeng M,El Khatib NF,Tu S,Ren P,Xu S,et al.(2012)Seroepidemiologyof Enterovirus 71 infection prior to the 2011 season in children inShanghai.J Clin Virol 53:285–289.
30.Zhang Y,Cui W,Liu L,Wang J,Zhao H,et al.(2011)Pathogenesis studyof enterovirus 71 infection in rhesus monkeys.Lab Invest 91:1337–1350.
31.Arita M,Shimizu H,Nagata N,Ami Y,Suzaki Y,et al.(2005)Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys.JGen Virol 86:1391–1401.
32.Chen P,Song Z,Qi Y,Feng X,Xu N,et al.(2012)Molecular determinantsof enterovirus 71 viral entry:cleft around GLN-172 on VP1 protein interactswith variable region on scavenge receptor B 2.J Biol Chem 287:6406–6420.
33.Chen YC,Yu CK,Wang YF,Liu CC,Su IJ,et al.(2004)A murine oralenterovirus 71 infection model with central nervous system involvement.J GenVirol 85:69–77.
34.Chua BH,Phuektes P,Sanders SA,Nicholls PK,McMinn PC(2008)Themolecular basis of mouse adaptation by human enterovirus 71.J Gen Virol 89:1622–1632.
35.Khong WX,Yan B,Yeo H,Tan EL,Lee JJ,et al.(2012)A non-mouse-adaptedenterovirus 71(EV71)strain exhibits neurotropism,causing neurologicalmanifestations in a novel mouse model of EV71 infection.J Virol 86:2121–2131.
36.Ong KC,Badmanathan M,Devi S,Leong KL,Cardosa MJ,et al.(2008)Pathologic characterization of a murine model of human enterovirus 71encephalomyelitis.J Neuropathol Exp Neurol 67:532–542.
37.Wang W,Duo J,Liu J,Ma C,Zhang L,et al.(2011)A mouse muscle-adaptedenterovirus 71 strain with increased virulence in mice.Microbes Infect 13:862–870.
38.Wang YF,Chou CT,Lei HY,Liu CC,Wang SM,et al.(2004)A mouse-adaptedenterovirus 71 strain causes neurological disease in mice after oralinfection.J Virol 78:7916–7924.
39.Yao PP,Qian L,Xia Y,Xu F,Yang ZN,et al.(2012)Enterovirus 71-induced neurological disorders in young gerbils,Meriones unguiculatus:development and application of a neurological disease model.PLoS One 7:e51996.
40.Borrego B,Novella IS,Giralt E,Andreu D,Domingo E(1993)Distinctrepertoire of antigenic variants of foot-and-mouth disease virus in thepresence or absence of immune selection.J Virol 67:6071–6079.
41.Burch CL,Chao L(1999)Evolution by small steps and ruggedlandscapes in the RNA virus phi6.Genetics 151:921–927.
42.Steinhauer DA,Domingo E,Holland JJ(1992)Lack of evidence forproofreading mechanisms associated with an RNA virus polymerase.Gene 122:281–288.
43.Biebricher C,Eigen M(2006)What is a Quasispecies.In:Domingo E,editor.Quasispecies:Concept and Implications for Virology.Heidelberg:Springer-Verlag.1–31.
44.Eigen M,Schuster P(1977)The hypercycle.A principle of naturalself-organization.Part A:Emergence of the hypercycle.Naturwissenschaften 64:541–565.
45.Eigen M,Biebricher C(1988)Sequence Space and QuasispeciesDistribution.In:Domingo E,Holland J,Ahlquist P,editors.RNA Genetics.BocaRaton:CRC Press.211–245.
46.ATCC NIH/3T3 ATCC CRL-11658.
47.Yamayoshi S,Yamashita Y,Li J,Hanagata N,Minowa T,et al.(2009)Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.Nat Med 15:798–801.
48.Yamayoshi S,Ohka S,Fujii K,Koike S(2013)Functional comparison ofSCARB2and PSGL1 as receptors for enterovirus 71.J Virol 87:3335–3347.
49.Yamayoshi S,Koike S(2011)Identification of a human SCARB2 regionthat is important for enterovirus 71 binding and infection.J Virol 85:4937–4946.
50.Zaini Z,Phuektes P,McMinn P(2012)Mouse adaptation of a sub-genogroup B5strain of human enterovirus 71 is associated with a novel lysineto glutamic acid substitution at position 244 in protein VP1.Virus Res 167:86–96.
51.Arita M,Ami Y,Wakita T,Shimizu H(2008)Cooperative effect of theattenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essentialfor attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model.JVirol 82:1787–1797.
52.Zaini Z,McMinn P(2012)A single mutation in capsid protein VP1(Q145E)of a genogroup C4 strain of human enterovirus 71 generates a mouse-virulent phenotype.J Gen Virol 93:1935–1940.
53.Liu CC,Chou AH,Lien SP,Lin HY,Liu SJ,et al.(2011)Identificationand characterization of a cross-neutralization epitope of Enterovirus71.Vaccine 29:4362–4372.
54.Zaini Z,Phuektes P,McMinn P(2012)A reverse genetic study of theadaptation of human enterovirus 71 to growth in Chinese hamster ovary cellcultures.Virus Res 165:151–156.
55.Miyamura K,Nishimura Y,Abo M,Wakita T,Shimizu H(2011)Adaptivemutations in the genomes of enterovirus 71 strains following infection ofmouse cells expressing human P-selectin glycoprotein ligand-1.J Gen Virol 92:287–291.
56.Lin JY,Chen TC,Weng KF,Chang SC,Chen LL,et al.(2009)Viral and hostproteins involved in picornavirus life cycle.J Biomed Sci 16:103.
57.Eigen M(1993)The origin of genetic information:viruses asmodels.Gene 135:37–47.
58.Domingo E,Sheldon J,Perales C(2012)Viral quasispeciesevolution.Microbiol Mol Biol Rev 76:159–216.
59.Domingo E,Menéndez-Arias L,Holland JJ(1997)RNA virus fitness.RevMed Virol 7:87–96.
60.Domingo E(2002)Quasispecies theory in virology.Journal of Virology76:463–465.
61.Reed L,Muench H(1938)A simple method of estimating fifty per centendpoints.The American Journal of Hygiene 27:493–497.
62.Lindenbach BD,Evans MJ,Syder AJ, B,Tellinghuisen TL,et al.(2005)Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.Science 309:623–626.
63.Hall T(1999)BioEdit:a user-friendly biological sequence alignmenteditor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucleic Acids SymposiumSeries 41:95–98.
64.Arnold K,Bordoli L,Kopp J,Schwede T(2006)The SWISS-MODELworkspace:a web-based environment for protein structure homologymodelling.Bioinformatics 22:195–201.
65.Guex N,Peitsch MC(1997)SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer:anenvironment for comparative protein modeling.Electrophoresis 18:2714–2723.
66.Bessaud M,Razafindratsimandresy R,Nougairede A,Joffret ML,Deshpande JM,Dubot-Peres A,Heraud JM,de Lamballerie X,Delpeyroux F,Bailly JL.(2014).Molecular comparison and evolutionary analyses of VP1 nucleotidesequences of new African human enterovirus 71 isolates reveal a wide geneticdiversity.PloS one 9:e90624.
67.Neculai D,Schwake M,Ravichandran M,Zunke F,Collins RF,Peters J,Neculai M,Plumb J,Loppnau P,Pizarro JC,Seitova A,Trimble WS,Saftig P,Grinstein S,Dhe-Paganon S.(2013).Structure of LIMP-2 provides functionalinsights with implications for SR-BI and CD36.Nature 504:172-176.
68.Liu J,Dong W,Quan X,Ma C,Qin C,Zhang L.(2012).Transgenicexpression of human P-selectin glycoprotein ligand-1 is not sufficient forenterovirus 71 infection in mice.Archives of virology 157:539-543.
69.Fujii K,Nagata N,Sato Y,Ong KC,Wong KT,Yamayoshi S,Shimanuki M,Shitara H,Taya C,Koike S.(2013).Transgenic mouse model for the study ofenterovirus 71 neuropathogenesis.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 110:14753-14758.
70.Lin YW,Yu SL,Shao HY,Lin HY,Liu CC,Hsiao KN,Chitra E,Tsou YL,ChangHW,Sia C,Chong P,Chow YH.(2013).Human SCARB2 transgenic mice as an infectiousanimal model for enterovirus 71.PloS one 8:e57591.
71.Victorio CB,Xu Y,Ng Q,Chow VT,Chua KB.(2014).Phenotypic andgenotypic characteristics of novel mouse cell line(NIH/3T3)-adapted humanenterovirus 71 strains(EV71:TLLm and EV71:TLLmv).PLoS One 9:e92719.
72.Yamayoshi S,Iizuka S,Yamashita T,Minagawa H,Mizuta K,Okamoto M,Nishimura H,Sanjoh K,Katsushima N,Itagaki T,Nagai Y,Fujii K,Koike S.(2012).Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7,A14,and A16 andenterovirus 71.J Virol 86:5686-5696.
73.Wilson T,Papahadjopoulos D,Taber T.(1979).The introduction ofPoliovirus RNA into cells via lipid vesicles(Liposomes).Cell 17:77-84.
74.Collis PS,O'Donnell BJ,Barton DJ,Rogers JA,Flanegan JB.(1992).Replication of Poliovirus RNA and subgenomic RNA transcripts in transfectedcells.Journal of Virology 66:6480-6488.
75.van Der Werf S,Bradley J,Wimmer E,Studier FW,Dunn JJ.(1986).Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNApolymerase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 83:2330-2334.
76.Nishimura Y,Lee H,Hafenstein S,Kataoka C,Wakita T,Bergelson JM,Shimizu H.(2013).Enterovirus 71 binding to PSGL-1 on leukocytes:VP1-145 actsas a molecular switch to control receptor interaction.PLoS pathogens 9:e1003511.
77.Dang M,Wang X,Wang Q,Wang Y,Lin J,Sun Y,Li X,Zhang L,Lou Z,Wang J,Rao Z.(2014).Molecular mechanism of SCARB2-mediated attachment and uncoatingof EV71.Protein&cell 5:692-703.
78.Wang X,Peng W,Ren J,Hu Z,Xu J,Lou Z,Li X,Yin W,Shen X,Porta C,Walter TS,Evans G,Axford D,Owen R,Rowlands DJ,Wang J,Stuart DI,Fry EE,Rao Z.(2012).A sensor-adaptor mechanism for enterovirus uncoating from structuresof EV71.Nature structural&molecular biology 19:424-429.
79.Lyu K,Ding J,Han JF,Zhang Y,Wu XY,He YL,Qin CF,Chen R.(2014).Humanenterovirus 71 uncoating captured at atomic resolution.J Virol 88:3114-3126.
80.Ren J,Wang X,Hu Z,Gao Q,Sun Y,Li X,Porta C,Walter TS,Gilbert RJ,Zhao Y,Axford D,Williams M,McAuley K,Rowlands DJ,Yin W,Wang J,Stuart DI,RaoZ,Fry EE.(2013).Picornavirus uncoating intermediate captured in atomicdetail.Nature communications 4:1929.
81.Shingler KL,Yoder JL,Carnegie MS,Ashley RE,Makhov AM,Conway JF,Hafenstein S.(2013).The enterovirus 71 A-particle forms a gateway to allowgenome release:a cryoEM study of picornavirus uncoating.PLoS pathogens 9:e1003240.
82.Ong KC,Badmanathan M,Devi S,Leong KL,Cardosa MJ,Wong KT.(2008).Pathologic characterization of a murine model of human enterovirus 71encephalomyelitis.Journal of neuropathology and experimental neurology 67:532-542.
83.Lin YW,Lin HY,Tsou YL,Chitra E,Hsiao KN,Shao HY,Liu CC,Sia C,ChongP,Chow YH.(2012).Human SCARB2-mediated entry and endocytosis of EV71.PloS one7:e30507.
84.Bridgen,A(Ed.)(2012)Reverse Genetics of RNA Viruses:Applicationsand Perspectives,John Wiley&Sons,Ltd,Oxford.
85.Jackson,D,Cadman,A,Zurcher,T,Barclay,WS(2002)A reverse geneticsapproach for recovery of recombinant influenza B viruses entirely from cDNA.JVirol 76:11744-11747.
86.Neumann,G,Watanabe,T,Ito,H,Watanabe,S et al.(1999)Generation ofinfluenza A viruses entirely from cloned cDNA.Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350.
87.Stobart,CC and Moore,ML(2014)RNA virus reverse genetics andvaccine design.Viruses 6:2531-2550.
88.Victorio,C.B.,Xu,Y.,Ng,Q.,Chow,V.T.&Chua,K.B.Phenotypic andgenotypic characteristics of novel mouse cell line(NIH/3T3)-adapted humanenterovirus 71 strains(EV71:TLLm and EV71:TLLmv).PloS one 9,e92719(2014).
89.Kasukawa,T.,et al.Quantitative expression profile of distinctfunctional regions in the adult mouse brain.PloS one 6,e23228(2011).
90.Lein,E.S.,et al.Genome-wide atlas of gene expression in the adultmouse brain.Nature 445,168-176(2007).
91.Wong,K.T.,et al.The distribution of inflammation and virus inhuman enterovirus 71 encephalomyelitis suggests possible viral spread byneural pathways.Journal of neuropathology and experimental neurology 67,162-169(2008).
92.Chan,L.G.,et al.Deaths of children during an outbreak of hand,foot,and mouth disease in sarawak,malaysia:clinical and pathologicalcharacteristics of the disease.For the Outbreak Study Group.Clinicalinfectious diseases:an official publication of the Infectious DiseasesSociety of America 31,678-683(2000).
93.Hsueh,C.,et al.Acute encephalomyelitis during an outbreak ofenterovirus type 71 infection in Taiwan:report of an autopsy case withpathologic,immunofluorescence,and molecular studies.Modern pathology:anofficial journal of the United States and Canadian Academy of Pathology,Inc13,1200-1205(2000).
94.Shieh,W.J.,et al.Pathologic studies of fatal cases in outbreak ofhand,foot,and mouth disease,Taiwan.Emerging infectious diseases 7,146-148(2001).
95.Wong,K.T.,Chua,K.B.&Lam,S.K.Immunohistochemical detection ofinfected neurons as a rapid diagnosis of enterovirus 71encephalomyelitis.Annals of neurology 45,271-272(1999).
96.Lu,W.H.,et al.Hexamethonium reverses the lethal cardiopulmonarydamages in a rat model of brainstem lesions mimicking fatal enterovirus 71encephalitis.Critical care medicine 41,1276-1285(2013).
97.Rogers,F.B.,et al.Neurogenic pulmonary edema in fatal and nonfatalhead injuries.The Journal of trauma 39,860-866；discussion 866-868(1995).
98.Yu,P.,et al.Histopathological features and distribution of EV71antigens and SCARB2 in human fatal cases and a mouse model of enterovirus 71infection.Virus research 189,121-132(2014).
99.Gao,L.,et al.Pathological examinations of an enterovirus 71infection:an autopsy case.International journal of clinical and experimentalpathology 7,5236-5241(2014).
100.Jiang,M.,et al.Autopsy findings in children with hand,foot,andmouth disease.The New England journal of medicine 367,91-92(2012).
101.Theodore,J.&Robin,E.D.Speculations on neurogenic pulmonary edema(NPE).The American review of respiratory disease 113,405-411(1976).
102.Busl,K.M.&Bleck,T.P.Neurogenic Pulmonary Edema.Critical caremedicine 43,1710-1715(2015).
103.Sedy,J.,Zicha,J.,Kunes,J.,Jendelova,P.&Sykova,E.Mechanisms ofneurogenic pulmonary edema development.Physiological research/AcademiaScientiarum Bohemoslovaca 57,499-506(2008).
104.Davison,D.L.,Terek,M.&Chawla,L.S.Neurogenic pulmonaryedema.Critical care 16,212(2012).
105.Wang,S.M.,Lei,H.Y.&Liu,C.C.Cytokine immunopathogenesis ofenterovirus 71 brain stem encephalitis.Clinical&developmental immunology2012,876241(2012).
106.Wang,S.M.,et al.Pathogenesis of enterovirus 71 brainstemencephalitis in pediatric patients:roles of cytokines and cellular immuneactivation in patients with pulmonary edema.The Journal of infectiousdiseases 188,564-570(2003).
107.Huang,S.W.,et al.Exogenous interleukin-6,interleukin-13,andinterferon-gamma provoke pulmonary abnormality with mild edema inenterovirus71-infected mice.Respiratory research 12,147(2011).
108.Inobe,J.J.,Mori,T.,Ueyama,H.,Kumamoto,T.&Tsuda,T.Neurogenicpulmonary edema induced by primary medullary hemorrhage:a case report.Journalof the neurological sciences 172,73-76(2000).
109.Blessing,W.W.,West,M.J.&Chalmers,J.Hypertension,bradycardia,andpulmonary edema in the conscious rabbit after brainstem lesions coincidingwith the A1 group of catecholamine neurons.Circulation research 49,949-958(1981).
110.Nathan,M.A.&Reis,D.J.Fulminating arterial hypertension withpulmonary edema from release of adrenomedullary catecholamines after lesionsof the anterior hypothalamus in the rat.Circulation research 37,226-235(1975).
111.Wong,K.T.,et al.The distribution of inflammation and virus inhuman enterovirus 71 encephalomyelitis suggests possible viral spread byneural pathways.Journal of neuropathology and experimental neurology 67,162-169(2008).
112.Wang,Y.F.&Yu,C.K.Animal models of enterovirus 71 infection:applications and limitations.Journal of biomedical science 21,31(2014).
113.Lein,E.S.,et al.Genome-wide atlas of gene expression in the adultmouse brain.Nature 445,168-176(2007).
114.Hashimoto,I.&Hagiwara,A.Pathogenicity of a poliomyelitis-likedisease in monkeys infected orally with enterovirus 71:a model for humaninfection.Neuropathology and applied neurobiology 8,149-156(1982).
115.Nagata,N.,et al.Pyramidal and extrapyramidal involvement inexperimental infection of cynomolgus monkeys with enterovirus 71.Journal ofmedical virology 67,207-216(2002).
116.Nagata,N.,et al.Differential localization of neurons susceptibleto enterovirus 71 and poliovirus type 1 in the central nervous system ofcynomolgus monkeys after intravenous inoculation.The Journal of generalvirology 85,2981-2989(2004).
117.Arita,M.,et al.Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71show attenuation in cynomolgus monkeys.The Journal of general virology 86,1391-1401(2005).
118.Arita,M.,et al.An attenuated strain of enterovirus 71 belongingto genotype a showed a broad spectrum of antigenicity with attenuatedneurovirulence in cynomolgus monkeys.J Virol 81,9386-9395(2007).
119.Zhang,Y.,et al.Pathogenesis study of enterovirus 71 infection inrhesus monkeys.Laboratory investigation；a journal of technical methods andpathology 91,1337-1350(2011).
120.Chen,H.,et al.The effect of enterovirus 71 immunization onneuropathogenesis and protein expression profiles in the thalamus of infectedrhesus neonates.Virology 432,417-426(2012).
121.Chen,Y.C.A murine oral enterovirus 71 infection model withcentral nervous system involvement.Journal of General Virology 85,69-77(2004).
122.Wang,Y.F.,et al.A mouse-adapted enterovirus 71 strain causesneurological disease in mice after oral infection.J Virol 78,7916-7924(2004).
123.Chua,B.H.,Phuektes,P.,Sanders,S.A.,Nicholls,P.K.&McMinn,P.C.Themolecular basis of mouse adaptation by human enterovirus 71.The Journal ofgeneral virology 89,1622-1632(2008).
124.Chen,C.S.,et al.Retrograde axonal transport:a major transmissionroute of enterovirus 71 in mice.J Virol 81,8996-9003(2007).
125.Ong,K.C.,et al.Pathologic characterization of a murine model ofhuman enterovirus 71 encephalomyelitis.Journal of neuropathology andexperimental neurology 67,532-542(2008).
126.Wang,W.,et al.A mouse muscle-adapted enterovirus 71 strain withincreased virulence in mice.Microbes and infection/Institut Pasteur 13,862-870(2011).
127.Khong,W.X.,et al.A non-mouse-adapted enterovirus 71(EV71)strainexhibits neurotropism,causing neurological manifestations in a novel mousemodel of EV71 infection.J Virol 86,2121-2131(2012).
128.Caine,E.A.,Partidos,C.D.,Santangelo,J.D.&Osorio,J.E.Adaptation ofenterovirus 71 to adult interferon deficient mice.PloS one 8,e59501(2013).
129.Arita,M.,Ami,Y.,Wakita,T.&Shimizu,H.Cooperative effect of theattenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essentialfor attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model.JVirol 82,1787-1797(2008).
130.Xu,F.,et al.Enterovirus 71 infection causes severe pulmonarylesions in gerbils,meriones unguiculatus,which can be prevented by passiveimmunization with specific antisera.PloS one 10,e0119173(2015).
131.Koroleva,G.A.,Karmysheva,V.Y.&Lukashev,A.N.390 Enterovirus 71pathogenicity in monkeys and cotton rats.Archives of virology 159,1133-1138(2014).
132.Yao,P.P.,et al.Enterovirus 71-induced neurological disorders inyoung gerbils,Meriones unguiculatus:development and application of aneurological disease model.PloS one 7,e51996(2012).
133.Yang,X.,et al.Aneonatal gnotobiotic pig model of humanenterovirus 71 infection and associated immune responses.Emerg MicrobesInfect 3,e35(2014).
134.Wang,S.M.,et al.Clinical spectrum of enterovirus 71 infection inchildren in southern Taiwan,with an emphasis on neurologicalcomplications.Clinical infectious diseases:an official publication oftheInfectious Diseases Society of America 29,184-190(1999).
135.Huang,C.C.,et al.Neurologic complications in children withenterovirus 71 infection.The New England journal of medicine 341,936-942(1999).
136.Ho,M.,et al.An epidemic of enterovirus 71 infection inTaiwan.Taiwan Enterovirus Epidemic Working Group.The New England journal ofmedicine 341,929-935(1999).
137.Chang,L.-Y.,et al.Clinical features and risk factors of pulmonaryoedema after enterovirus-71-related hand,foot,and mouth disease.The Lancet354,1682-1686(1999).
138.Nishimura,Y.,et al.Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is afunctional receptor for enterovirus 71.Nature medicine 15,794-797(2009).
序列表
<110> 淡马锡生命科学研究院有限公司
<120> 肠道病毒71动物模型
<130> 2577-243PCT
<150> US 62/114,880
<151> 2015-02-11
<150> US 62/108,828
<151> 2015-01-28
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7438
<212> DNA
<213> Enterovirus 71:TLLm
<400> 1
ttcaaacagc ctgtgggttg cacccactca cagggcccac gtggcgctag cactctggtt 60
ctacggaacc tttgtgcgcc tgttttacgc cccttcccca atttgcaact tagaagcaat 120
acacaacact gatcaacagc gggcatggcg caccagctat gtcttgatca agcacttctg 180
tttccccgga ccgactatca atagactgct cacgcggttg aaggagaaag cgtccgttat 240
ccggctaact acttcgaaaa acctagtaac accattgaag ctgcagagtg tttcgctcgg 300
cacttccccc gtgtagatca ggtcgatgag tcactgcaat ccccacgggt gaccgtggca 360
gtggctgcgt tggcggcctg cctatggggc aacccatagg acgctctaat gcggacatgg 420
tgcgaagagt ctattgagct agttagtagt cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcctaa 480
ctgcggagca catgccttca acccagaggg tagtgtgtcg taatgggcaa ctctgcagcg 540
gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattctt atattggctg cttatggtga 600
caattacaga attgttacca tatagctatt ggattggcca tccggtgtgc aatagagcta 660
ttatatacct ttttttttgg ctttgtacca ctaaccttaa aatctataat caccctcgac 720
tttatattaa ccctcaacac agtcaagcat gggctcacag gtgtccactc agcgatccgg 780
ctcccacgag aactccaatt cagctacagg aggctccacc attaattaca ctaccatcaa 840
ctattacaaa gactcctatg ctgcgacagc gggcaaacag agcctcaaac aagaccctga 900
taagtttgct aaccctgtca aggacatttt cactgaaatg gctgcgccac tgaagtctcc 960
atccgctgaa gcttgtggtt acagtgatcg cgtggcacaa ctcaccattg gaaactccac 1020
cattactaca caggaggcgg caaacatcat agttggttac ggtgagtggc cctcatactg 1080
ctctgatgac gacgctacag cggtggacaa accaacgcgc ccagatgttt cagtgaatag 1140
gttttataca ctggacacta aactgtggga aaagtcatcc aaggggtggt attggaagtt 1200
tcctgatgtg ttgactgaga ccggagtctt tggccagaac gcacagtttc actatttgta 1260
taggtcaggg ttttgcattc atgtgcaatg taacgctagc aagttccatc aaggagcgct 1320
gttagtcgcc atacttccag agtatgttat agggacaata gcaggcggta caggaacaga 1380
ggacacccac cctccttaca tacaaacaca acctggcgcc gacggtttcg agctgcagca 1440
cccgtacgtg ctcgatgctg ggattcctat atcacaattg acagtgtgtc cccatcaatg 1500
gattaacctg cggaccaata actgtgccac aataatagtg ccatatatga acacactgcc 1560
tttcgactct gccctgaacc attgcaattt tgggctgttg gtagtaccca ttagcccatt 1620
agattttgac caaggggcaa ctccggttat ccctattaca atcactctag ctccaatgtg 1680
ctctgagttt gcaggtctca gacaggcagt cactcaaggc tttcccactg agccaaaacc 1740
aggaacgaat caattcttga ccaccgatga cggcgtctca gcacccattc taccaaattt 1800
ccatcccact ccatgtattc acatacccgg tgaagtcaga aacctgcttg agttgtgtca 1860
agtggagact attcttgagg ttaacaacgt acccaccaat gctaccagtc tgatggaaag 1920
gctacgattc ccggtgtccg cgcaagcggg gaaaggtgaa ttgtgtgccg tgtttagggc 1980
cgaccctgga agagacggtc catggcaatc aacaatgctg ggccagttgt gtggatatta 2040
cacccagtgg tcagggtcac tggaggtcac ttttatgttt accgggtctt tcatggccac 2100
aggtaaaatg ctcatagctt atacacctcc tggcggcccc ttacccaaag atcgggccac 2160
agcaatgctg ggcacacatg ttatctggga ttttgggcta caatcatctg tcacccttgt 2220
aataccatgg attagtaata cccactacag ggcgcatgcc cgggatggag tgtttgacta 2280
ctataccaca ggactggtca gtatctggta tcaaacaaac tacgtagttc caattggggc 2340
acccaacaca gcttatataa tagcactagc ggcagcccag aagaatttca ccatgaaact 2400
gtgcaaagac accagtcaca tattacagac agcctccatt cagggagata gggtggcaga 2460
tgcgatcgag agctctatag gagatagtgt gagtagggca cttacccagg ccctgccagc 2520
acccacaggt caaaacacac aggtgagcag tcatcgacta gacactggcg aagttccagc 2580
gctccaagct gctgaaattg gggcatcgtc aaatactagt gatgagagta tgattgagac 2640
acgatgcgtt cttaactcac atagtacagc agagaccacc ttggacagtt tcttcagtag 2700
ggcaggtttg gtaggagaga tagatttccc tcttgagggt accaccaatc cagatggtta 2760
tgccaactgg gacatagaca taactggtta cgcacaaatg cgcaggaaag tggagctgtt 2820
cacctacatg cgctttgatg cggaattcac ttttgttgcg tgcactccta ctggtgcggt 2880
tgttccacaa ttactccagt atatgtttgt tccccctggt gctcccaaac cagagtctag 2940
agattcattt gcttggcaga cagccacaaa cccctcagtc tttgtcaagt tgactgatcc 3000
cccggcacag gtctcagttc cgttcatgtc acccgcgagc gcttaccagt ggttttacga 3060
cgggtacccc acgtttggag aacacaaaca ggagaaagac ctcgagtatg gagcgtgtcc 3120
taataatatg atgggcactt tctcggtgcg aaccgtgggg tcattaaagt ccaagtaccc 3180
cttggttgtc agaatatata tgagaatgaa gcatgtcagg gcgtggatac ctcgcccgat 3240
gcgcaaccaa aactatttgt tcaaagccaa cccaaactat gccggtaact ccattaagcc 3300
gaccggcact agtcgtactg ccattactac ccttggaaag ttcggccagc agtctggggc 3360
catctacgtg ggcaacttca gagtggttaa tcgtcacctc gctactcata atgactgggc 3420
gaacctcgtc tgggaagaca gctcccgcga cctattagtg tcgtctacca ccgctcaggg 3480
ctgtgataca attgcacgtt gtgactgtca aacaggagtg tactattgta attccaagag 3540
aaagcactat ccagtcagct tttctaaacc cagcctcata tatgtggaag ctagcgagta 3600
ttaccctgct agataccaat cgcacctgat gcttgcagtg ggccactctg agcccggcga 3660
ctgcggaggc atcttgaggt gtcaacatgg tgtagttggt atagtgtcca cgggtggcaa 3720
cgagctcgtt ggatttgctg atgtgaggga tctcttgtgg ttagatgaag aggccatgga 3780
gcaaggtgtg tccgactaca ttaaggggct cggtgatgcg tttggaacag gcttcactga 3840
cgctgtatcc agggaagttg aagcccttag gaaccacctt ataggatctg atggagcagt 3900
tgagaaaatc ctaaagaacc ttattaagct gatttcagcg ttagtaattg tgatcaggag 3960
cgattatgat atggtcaccc tcacagcaac tttagccctg attggttgtc atggaagtcc 4020
ttgggcttgg attaaagcca agacagcatc cattttaggt atccccatcg cccagaagca 4080
gagtgcttct tggctaaaga aatttaatga tatggcgagt gctgccaagg gtttagaatg 4140
gatatctaat aaaattagca agttcattga ctggctcagg gagaaaattg ttccagcagc 4200
taaggagaaa gcagaatttt taaccaattt gaagcaattg ccactattag agaaccagat 4260
cacaaattta gagcagtccg ctgcctcaca agaggacctt gaagctatgt ttgggaatgt 4320
gtcatacctc gcccatttct gtcgcaagtt ccaaccatta tacgccgcgg aagctaagcg 4380
agtctatgtt ctagagaaga gaatgaataa ctacatgcag ttcaagagca aacaccgtat 4440
tgaacctgta tgtctcatca ttagaggctc accaggcact ggaaagtccc ttgcgaccgg 4500
tatcattgct cgggccatag cagacaagta tcactctagt gtgtactcac ttccaccaga 4560
ccctgaccat tttgacgggt acaaacagca agtggttaca gttatggatg atctgtgtca 4620
raatcctgac ggcaaagaca tgtcattatt ttgccagatg gtgtctaccg tggattttat 4680
cccaccaatg gcttctctcg aagaaaaggg agtttctttc acatctaaat ttgttatcgc 4740
atccaccaac gctagcaaca ttatagtgcc tacagtgtca gactctgacg ccattcgtcg 4800
caggttttac atggattgcg acattgaggt gacagactca tacaaaacag atttgggtag 4860
actagacgct ggacgggctg ctaagctatg ctctgagaac aacaccgcaa acttcaaacg 4920
atgcagccca ctagtgtgtg ggaaagctat tcaacttaga gacaggaagt ctaaggtcag 4980
gtacagcgtg gacacagtgg tctctgaact tattagagaa tataatagca gatccgctat 5040
tggtaataca attgaagcac tattccaagg tccacccaag ttcaggccaa ttagaatcag 5100
tcttgaggag aagccagccc cagacgctat tggcgatctc ctcgctagtg tagatagcga 5160
ggaagtgcgc caatactgta gggagcaagg ctggatcatc cctgaaactc ccaccaatgt 5220
tgaacgacac cttaatagag cagtgctagt catgcaatcc atcgctactg tggtggcagt 5280
cgtctcactg gtgtacgtta tttacaagct ctttgcgggg tttcaaggtg cgtactctgg 5340
agctcccaag caaatgccca agaaacctgt cctccgtacg gcaacagtgc agggtccgag 5400
tcttgacttt gctctatcct tactgagaag gaacatcagg caagtccaaa cagatcaagg 5460
gcattttacc atgttaggtg tcagagatcg cttagccgtt cttccacggc actcacagcc 5520
cgggaagact atttgggtgg agcacaaact tgtgaacgtc cttgacgcag ttgagctggt 5580
ggatgagcag ggcgttaatt tggaactcac attggtgaca ctagatacta atgaaaaatt 5640
tagagatatc accaagttca ttccagagac cattagcggc gctagtgatg caactttagt 5700
gatcaacaca gaacatatgc catcaatgtt tgtcccagtg ggggacgtcg tgcagtacgg 5760
gttcttgaac cttagtggaa agccaactca taggaccatg atgtacaatt tccctacaaa 5820
agcaggacag tgtggaggtg tggtcacatc agtcggtaag attgttggca ttcacattgg 5880
cggcaacggg cgccaagggt tctgtgctgg tttgaagagg agttacttcg caagtgtgca 5940
gggtgagatc caatgggtga agcctaacaa ggaaactggt agactgaaca tcaatggtcc 6000
aactcgcact aagctggagc ctagtgtgtt tcatgatgtg tttgaaggta ataaggaacc 6060
agcagtttta acaagtaaag accctagatt ggaggtcgac tttgaacaag ccctgttttc 6120
caagtatgtg ggcaatgttt tacacgagcc cgatgaatac gtgattcaag ctgccctcca 6180
ctacgcgaat caacttaaac aattggacat agacactagc aagatgagca tggaggaagc 6240
gtgctatggc actgaaaacc tggaagcaat agacctctgc actagtgccg ggtacccata 6300
cagcgccctt ggtatcaaga aaagagacat tcttgacccc acaaccaggg atgtgtccaa 6360
gatgaaattc tatatggata aatacgggct agacctgcca tactctacct atgtgaagga 6420
tgagcttagg tccctggata aaatcaagaa aggaaaatca cgcttgatag aggctagtag 6480
cttgaatgac tctgtctacc ttagaatgac ttttgggcac ctttacgagg tgtttcatgc 6540
caaccctggc actgtgactg gctcagcagt gggttgcaac ccggacgtgt tttggagcaa 6600
actaccgatt ctgctgcctg ggtcactctt tgcctttgac tactcaggat acgatgctag 6660
tctcagcccg gtatggttca gggctctaga agttgtgtta cgggagattg ggtattcaga 6720
ggaggccgtg tccctaatag aagggatcaa ccacacccac catgtgtacc ggaacaaaac 6780
atactgtgta cttggtggaa tgccctcggg atgttctggt acttccatct ttaatacaat 6840
gatcaacaac atcatcatta gaaccctttt gatcaaaacc tttaagggaa tagacctgga 6900
tgagttgaac atggtggcct atggggacga tgtgctggct agttacccct ttcccattga 6960
ttgccttgag ttggctaaga ctggcaaaga gtatggtttg accatgacac ctgcagacaa 7020
atcaccctgt ttcaatgaag taacatggga aaatgctacc ttcctgaaga gaggattctt 7080
gccagaccac caatttccat tcttaattca ccctacgatg cccatgagtg agatccgtga 7140
gtccattcga tggactaaag acgcgcgcaa cacccaagat cacgtgcgct ccctgtgtct 7200
gttggcatgg cacaatggta aggatgaata tgagaagttt gtgagtgcaa ttagatcagt 7260
tccagttgga aaagcgttgg ccattcctaa tttcgagaac ctgagaagaa attggctcga 7320
attgttttaa tattacagct taaagctgaa ccccactaga aatctggtcg cgttaatgac 7380
tagtgggggt aaatttgtta taaccagaat agcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 7438
<210> 2
<211> 7421
<212> DNA
<213> Enterovirus 71:TLLmv
<400> 2
ttcaaacagc ctgtgggttg cacccactca cagggcccac gtggcgctag cactctggtt 60
ctacggaacc tttgtgcgcc tgttttacgc cccttcccca atttgcaact tagaagcaat 120
acacaacact gatcaacagg cggcatggcg caccagctat gtcttgatca agcacttctg 180
tttccccgga ccgagtatca atagactgct cacgcggttg aaggagaaag cgtccgttat 240
ccggctaact acttcgaaaa acctagtaac accattgaag ctgcagagtg tttcgctcgg 300
cacttccccc gtgtagatca ggtcgatgag tcactgcaat ccccacgggt gaccgtggca 360
gtggctgcgt tggcggcctg cctatggggc aacccatagg acgctctaat gcggacatgg 420
tgcgaagagt ctattgagct agttagtagt cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcctaa 480
ctgcggagca catgccttca acccagaggg tagtgtgtcg taatgggcaa ctctgcagcg 540
gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattctt atattggctg cttatggtga 600
caattacaga attgttacca tatagctatt ggattggcca tccggtgtgc aatagagcta 660
ttatatacct atttttcttt tggctttgta tcactaacct taaaatctat aatcaccctc 720
gactttatag catgggctca caggtgtcca ctcagcgatc cggctcccac gagaactcca 780
attcagctac aggaggctcc accattaatt acactaccat caactattac aaagactcct 840
atgctgcgac agcgggcaaa cagagtctca aacaagaccc tgataagttt gctaaccctg 900
tcaaggacat tttcactgaa atggctgcgc cactgaagtc tccatccgct gaagcttgtg 960
gttacagtga tcgcgtggca caactcacca ttggaaactc caccattact acacaggagg 1020
cggcaaacat catagttggt tacggtgagt ggccctcata ctgctctgat gacgacgcta 1080
cagcggtgga caaaccaacg cgcccagatg tttcagtgaa taggttttat acactggaca 1140
ctaaactgtg ggaaaagtca tccaaggggt ggtattggaa gtttcctgat gtgttgactg 1200
agaccggagt ctttggccag aatgcacagt ttcactattt gtataggtca gggttttgca 1260
ttcatgtgca atgtaacgct agcaagttcc atcaaggagc gctgttagtc gccatacttc 1320
cagagtatgt tatagggaca atagcaggcg gtacaggaac agaggacacc caccctcctt 1380
acatacaaac acaacctggc gccgacggtt tcccgctgca gcacccgtac gtgctcgatg 1440
ctgggattcc tatatcacaa ttgacagtgt gtccccatca atggattaac ctgcggacca 1500
ataactgtgc cacaataata gtgccatata tgaacacact gcctttcgac tctgccctga 1560
accattgcaa ttttgggctg ttggtagtac ccattagccc attagatttt gaccaagggg 1620
caactccggt tatccctatt acaatcactc tagctccaat gtgctctgag tttgcaggtc 1680
tcagacaggc agtcactcaa ggctttccca ctgagccaaa accaggaacg aatcaattct 1740
tgaccaccga tgacggcgtc tcagcaccca ttctaccaaa tttccatccc actccatgta 1800
ttcacatacc cggtgaagtc agaaacctgc ttgagttgtg tcaagtggag actattcttg 1860
aggttaacaa tgtacccacc aatcctacca gtctgatgga aaggctacga ttcccggtgt 1920
ccgcgcaagc ggggaaaggt gaattgtgtg ccgtgtttag ggccgaccct ggaagagacg 1980
gtccatggca atcaacaatg ctgggccagt tgtgtggata ttacacccag tggtcagggt 2040
cactggaggt cacttttatg tttaccgggt ctttcatggc cacaggtaaa atgctcatag 2100
cttatacacc tcctggcggc cccttaccca aagatcgggc cacagcaatg ctgggcacac 2160
atgttatctg ggattttggg ctacaatcat ctgtcaccct tgtaatacca tggattagta 2220
atacccacta cagggcgcat gcccgggatg gagtgtttga ctactatacc gcaggactgg 2280
tcagtatctg gtatcaaaca aactacgtag ttccaattgg ggcacccaac acagcttata 2340
taatagcact agcggcagcc cagaagaatt tcaccatgaa actgtgcaaa gacaccagtc 2400
acatgttaca gacagcctcc attcagggag atagggtggc agatgcgatc gagagctcta 2460
taggagatag tgtgagtagg gcacttaccc aggccctgcc agcacccaca ggtaaaaaca 2520
cacaggtgag cagtcatcga ctagacactg gcgaagttcc agcgctccaa gctgctgaaa 2580
ttggggcatc gtcaaatact agtgatgaga gtatgattga gacacgatgc gttcttaact 2640
cacatagtac agcagagacc accttggaca gtttcttcag tagggcaggt ttggtaggag 2700
aggtagaatt ccctcttgag ggtaccacca atccaggtgg ttatgccaac tgggacatag 2760
acataactgg ttacgcacaa atgcgcagga aagtggagct gttcacctac atgcgctttg 2820
atgcggaatt cacttttgtt gcgtgcactc ctactggtgc ggttgttcca caattactcc 2880
agtatatgtt tgttcccccc ggtgctccca aaccagagtc tagagattca tttgcttggc 2940
agacagccac aaacccctca gtctttgtca agttgactga tcccccggca caggtctcag 3000
ttccgttcat gtcacccgcg agcgcttacc agtggtttta cgacgggtac cccacgtttg 3060
gagaacacaa acaggagaaa gacctcgagt atggagcgtg tcctaataat atgatgggca 3120
ctttctcggt gcgaaccgtg gggtcattaa agtccaagca ccccttgatt gtcagaatat 3180
atatgagaat gaagcatgtc agggcgtgga tacctcgccc gatgcgcaac caaaactatt 3240
tgttcaaagc caacccaaac tatgccggta actccattaa gccgaccggc actagtcgta 3300
cttccattac cacccttgga aagttcggcc agcagtctgg ggccatctac gtgggcaact 3360
tcagagtggt taatcgtcac ctcgctactc ataacgactg ggcgaacctc gtctgggaag 3420
acagctcccg cgacctatta gtgtcgtcta ccaccgctca gggctgtgat acaattgcac 3480
gttgtgactg tcaaacagga gtgtactatt gtaattccaa gagaaagcac tatccagtca 3540
gcttttctaa acccagcctc atatatgtgg aagctagcga gtattaccct gctagatacc 3600
aatcgcacct gatgcttgca gtgggccact ctgagcccgg cgactgcgga ggcatcttga 3660
ggtgtcaaca tggtgtagtt ggtatagtgt ccacgggtgg caacgagctc gttggatttg 3720
ctgatgtgag ggatctcttg tggttagatg aagaggccat ggagcaaggt gtgtccgact 3780
acattaaggg gctcggtgat gcgtttggaa caggcttcac tgacgctgta tccagggaag 3840
ttgaagccct taggaaccac cttataggat ctgatggagc agttgagaaa atcctaaaga 3900
accttattaa gctgatttca gcgttagtaa ttgtgatcag gagcgattat gatatggtca 3960
ccctcacagc aactttagcc ctgattggtt gtcatggaag tccttgggct tggattaaag 4020
ccaagacagc atccatttta ggtatcccca tcgcccagaa gcagagtgct tcttggctaa 4080
agaaatttaa tgatatggcg agtgctgcca agggtttaga atggatatct aataaaatta 4140
gcaagttcat tgactggctc agggagaaaa ttgttccagc agctaaggag aaagcagaat 4200
ttttaaccaa tttgaagcaa ttgccactat tagagaacca gatcacaaat ttagagcagt 4260
ccgctgcctc acaagaggac cttgaagcta tgtttgggaa tgtgtcatac ctcgcccatt 4320
tctgtcgcaa gttccaacca ttatacgccg cggaagctaa gcgagtctat gttctagaga 4380
agagaatgaa taactacatg cagttcaaga gcaaacaccg tattgaacct gtatgtctca 4440
tcattagagg ctcaccaggc actggaaagt cccttgcgac cggtatcatt gctcgggcca 4500
tagcagacaa gtatcactct agtgtgtact cacttccacc agaccctgac cattttgacg 4560
ggtacaaaca gcaagtggtt acagttatgg atgatctgtg tcagaatcct gacggcaaag 4620
acatgtcatt attttgccag atggtgtcta ccgtggattt tatcccacca atggcttctc 4680
tcgaagaaaa gggagtttct ttcacatcta aatttgttat cgcatccacc aacgctagca 4740
acattatagt gcctacagtg tcagactctg acgccattcg tcgcaggttt tacatggatt 4800
gcgacattga ggtgacagac tcatacaaaa cagatttggg tagactagac gctggacggg 4860
ctgctaagct atgctctgag aacaacaccg caaacttcaa acgatgcagc ccactagtgt 4920
gtgggaaagc tattcaactt agagacagga agtctaaggt caggtacagc gtggacacag 4980
tggtctctga acttattaga gaatataata gcagatccgc tattggtaat acaattgaag 5040
cactattcca aggtccaccc aagttcaggc caattagaat cagtcttgag gagaagccag 5100
tcccagacgc tattggcgat ctcctcgcta gtgtagatag cgaggaagtg cgccaatact 5160
gtagggagca aggctggatc atccctgaaa ctcccaccaa tgttgaacga caccttaata 5220
gagcagtgct agtcatgcaa tccatcgcta ctgtggtggc agtcgtctca ctggtgtacg 5280
ttatttacaa gctctttgcg gggtttcaag gtgcgtactc tggagctccc aagcaaatgc 5340
ccaagaaacc tgtcctccgt acggcaacag tgcagggtcc gagtcttgac tttgctctat 5400
ccttactgag aaggaacatc aggcaagtcc aaacagatca agggcatttt accatgttag 5460
gtgtcagaga tcgcttagcc gttcttccac ggcactcaca gcccgggaag actatttggg 5520
tggagcacaa acttgtgaac gtccttgacg cagttgagct ggtggatgag cagggcgtta 5580
atttggaact cacattggtg acactagata ctaatgaaaa atttagagat atcaccaagt 5640
tcattccaga gaccattagc ggcgctagtg atgcaacttt agtgatcaac acagaacata 5700
tgccatcaat gtttgtccca gtgggggacg tcgtgcagta cgggttcttg aaccttagtg 5760
gaaagccaac tcataggacc atgatgtaca atttccctac aaaagcagga cagtgtggag 5820
gtgtggtcac atcagtcggt aagattgttg gcattcacat tggcggcaac gggcgccaag 5880
ggttctgtgc tggtttgaag aggagttact tcgcaagtgt gcagggtgag atccaatggg 5940
tgaagcctaa caaggaaact ggtagactga acatcaatgg tccaactcgc actaagctgg 6000
agcctagtgt gtttcatgat gtgtttgaag gtaataagga accagcagtt ttatcaagca 6060
aagaccctag attggaggtc gactttgaac aagccctgtt ttccaagtat gtgggcaatg 6120
ctttacacga gcccgatgaa tacgtgattc aagctgccct ccactacgcg aatcaactta 6180
aacaattgga catagacact agcaagatga gcatggagga agcgtgctat ggcactgaaa 6240
acctggaagc aatagacctc tgcactagtg ccgggtaccc atacagcgcc cttggtatca 6300
agaaaagaga cattcttgac cccacaacca gggatgtgtc caagatgaaa ttctatatgg 6360
ataaatacgg gctagacctg ccatactgta cctatgtgaa ggatgagctt aggtccctgg 6420
ataaaatcaa gaaaggaaaa tcacgcttga tagaggctag tagcttgaat gactctgtct 6480
accttagaat gacttttggg cacctttacg aggtgtttca tgccaaccct ggcactgtga 6540
ctggctcagc agtgggttgc aacccggacg tgtttgggag caaactaccg attctgctgc 6600
ctgggtcact ctttgccttt gactactcag gatacgatgc tagtctcagc ccggtatggt 6660
tcagggctct agaagttgtg ttacgggaga ttgggtattc agaggaggcc gtgtccctaa 6720
tagaagggat caaccacacc caccatgtgt accggaacaa aacatactgt gtacttggtg 6780
gaatgccctc gggatgttct ggtacttcca tctttaatac aatgatcaac aacatcatca 6840
ttagaaccct tttgatcaaa acctttaagg gaatagacct ggatgagttg aacatggtgg 6900
cctatgggga cgatgtgctg gctagttacc cctttcccat tgattgcctt gagttggcta 6960
agactggcaa agagtatggt ttgaccatga cacctgcaga caaatcaccc tgtttcaatg 7020
aagtaacatg ggaaaatgct accttcctga agagaggatt cttgccagac caccaatttc 7080
cattcttaat tcaccctacg atgcccatga gtgagatccg tgagtccatt cgatggacta 7140
aagacgcgcg caacacccaa gatcacgtgc gctccctgtg tctgttggca tggcacaatg 7200
gtaaggatga atatgagaag tttgtgagtg caattagatc agttccagtt ggaaaagcgt 7260
tggccattcc taatttcgag aacctgagaa gaaattggct cgaattgttt taatattaca 7320
gcttaaagct gaaccccact agaaatctgg tcgcgttaat gactagtggg ggtaaatttg 7380
ttataaccag aatagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 7421
<210> 3
<211> 7437
<212> DNA
<213> Enterovirus 71:BS
<400> 3
ttcaaacagc ctgtgggttg cacccactca cagggcccac gtggcgctag cactctggtt 60
ctacggaacc tttgtgcgcc tgttttacgc cccttcccca atttgcaact tagaagcaat 120
acacaacact gatcaacagc aggcatggcg caccagctat gtcttgatca agcacttctg 180
tttccccgga ccgagtatca atagactgtt cacgcggttg aaggagaaag cgtccgttat 240
ccggctaact acttcgagaa acctagtaac accattgaag ctgcagagtg tttcgctcgg 300
cacttccccc gtgtagatca ggtcgatgag tcactgcaat ccccacgggt gaccgtggca 360
gtggctgcgc tggcggcctg cctatggggc aacccatagg acgctctaat gcggacatgg 420
tgcgaagagt ctattgagct agttagtggt cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcctaa 480
ctgcggagca catgccttca atccagaggg tagtgtgtcg taatgggcaa ctctgcagcg 540
gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattctt atattggctg cttatggtga 600
caattacaga attgttacca tatagctatt ggattggcca tccggtgtgc aatagagcta 660
ttatatacct atttgttggc tttgtaccac taaccttaaa atctataacc accctcgact 720
ttatattaac cctcaacaca gtcaagcatg ggctcacagg tgtccactca gcgatccggc 780
tcccacgaga actccaattc agctacagaa ggctccacca ttaattacac taccatcaac 840
tattacaaag actcctatgc tgcgacagcg ggcaaacaga gcctcaaaca agaccctgat 900
aagtttgcta accctgtcaa ggacattttc actgaaatgg ctgcgccact gaagtctcca 960
tccgctgaag cttgtggtta cagtgatcgc gtggcacaac tcaccattgg aaactccacc 1020
attactacac aggaggcggc aaacatcata gttggttacg gtgagtggcc ctcatactgc 1080
tctgatgacg acgctacagc ggtggacaaa ccaacgcgcc cagatgtttc agtgaatagg 1140
ttttatacac tggacactaa actgtgggaa aagtcatcca aggggtggta ttggaagttt 1200
cctgatgtgt tgactgagac cggagtcttt ggccagaacg cacagtttca ctatttgtat 1260
agatcagggt tttgcattca tgtgcaatgt aacgctagca agttccatca aggagcgctg 1320
ttagtcgcca tacttccaga gtatgttata gggacagtgg caggcggtac aggaacagag 1380
gacagccacc ctccttacaa acaaacacaa cctggcgccg acggttttga gctgcagcac 1440
ccgtacgtgc tcgatgctgg gattcctata tcacaattga cagtgtgccc ccatcaatgg 1500
attaacctgc ggaccaataa ctgtgccaca ataatagtgc catatatgaa cacactgcct 1560
ttcgactctg ccctgaacca ttgcaatttt gggctgttgg tagtgcccat tagcccatta 1620
gattttgacc aaggggcaac tccggttatc cctattacaa tcactctagc tccaatgtgc 1680
tctgagtttg caggtctcag acaggcagtc actcaaggct ttcccactga gccaaaacca 1740
ggaacgaatc aattcttgac caccgatgac ggcgtctcag cacccattct accaaatttc 1800
caccccactc catgtattca catacccggt gaagtcagaa acctgcttga gttgtgtcaa 1860
gtggagacta ttcttgaggt taacaacgta cccaccaatg ctaccagtct gatggaaagg 1920
ctacgattcc cggtgtccgc gcaagcgggg aaaggtgaat tgtgtgccgt gtttagggcc 1980
gaccctggaa gagacggtcc atggcaatca acaatgctgg gccagttgtg tggatattac 2040
acccagtggt cagggtcact ggaggtcact tttatgttta ccgggtcttt catggccaca 2100
ggtaaaatgc tcatagctta tacacctcct ggcggcccct tacccaaaga tcgggccaca 2160
gcaatgctgg gcacacatgt tatctgggat tttgggctac aatcatctgt cacccttgta 2220
ataccatgga ttagtaatac ccactacagg gcgcatgccc gggatggagt gttcgactac 2280
tataccacag gactggtcag tatctggtat caaacaaact acgtagttcc aattggggca 2340
cccaacacag cttacataat agcactagcg gcagcccaga agaattttac catgaaactg 2400
tgcaaagaca ccagtcacat attacagaca gcctccattc agggagatag ggtggcagat 2460
gtgatcgaga gctctatagg agatagtgtg agtagggcac ttacccaggc cctgccagca 2520
cccacaggtc aaaacacaca ggtgagcagt catcgactag acactggcga agttccagcg 2580
ctccaagctg ctgaaattgg ggcatcgtca aatactagtg atgagagtat gattgagaca 2640
cgatgcgttc ttaactcaca tagtacagca gagaccacct tggacagttt cttcagtagg 2700
gcaggtttgg taggagagat agatctccct cttaagggta ccaccaatcc aaatggttat 2760
gccaactggg acatagacat aactggttac gcacaaatgc gcaggaaagt ggagctgttc 2820
acctacatgc gctttgatgc ggaattcact tttgttgcgt gcactcctac tggtgaggtt 2880
gttccacaat tactccagta tatgtttgtt ccccctggtg ctcccaaacc agagtctaga 2940
gaatcacttg cttggcagac agccacaaac ccctcagtct ttgtcaagtt gactgatccc 3000
ccggcacagg tctcagttcc gttcatgtca cccgcgagcg cttaccagtg gttttacgac 3060
gggtacccca cgtttggaga acacaaacag gagaaagacc tcgagtatgg agcgtgtcct 3120
aataatatga tgggcacttt ctcggtgcga accgtggggt catcaaagtc caagtacccc 3180
ttggttgtca gaatatatat gagaatgaag catgtcaggg cgtggatacc tcgcccgatg 3240
cgcaaccaaa actatttgtt caaagccaac ccaaactatg ccggtaactc cattaaaccg 3300
accggcacta gtcgtactgc cattactacc cttggaaagt tcggccagca gtctggggcc 3360
atctacgtgg gcaacttcag agtggttaat cgtcacctcg ctactcataa tgactgggcg 3420
aacctcgtct gggaagacag ctcccgcgac ctattagtgt cgtctaccac cgctcagggc 3480
tgtgatacaa ttgcacgttg tgactgtcaa acaggagtgt actattgtaa ttccaagaga 3540
aagcactatc cagtcagctt ttctaaaccc agcctcatat atgtggaagc tagcgagtat 3600
taccctgcta gataccaatc gcacctaatg cttgcagtgg gccactctga gcccggcgac 3660
tgcggaggca tcttaaggtg tcaacatggt gtagttggta tagtgtccac gggtggcaac 3720
gggctcgttg gatttgctga tgtgagggat ctcttgtggt tagatgaaga ggccatggag 3780
caaggtgtgt ccgactacat taaggggctc ggtgatgcgt ttggaacagg cttcactgac 3840
gctgtatcca gggaagttga agcccttagg aaccacctca taggatctga tggagcagtt 3900
gagaaaatcc taaagaacct tattaagctg atttcagcgt tagtaattgt gatcaggagc 3960
gattatgata tggtcaccct cacagcaact ttagccctga ttggttgtca tggaagtcct 4020
tgggcttgga ttaaagccaa gacagcatcc attttaggta tccccatcgc ccagaagcag 4080
agtgcttctt ggctaaagaa atttaatgat atggcgagtg ctgccaaggg tttagaatgg 4140
atatccaata aaattagcaa gttcattgac tggctcaggg agaagattgt tccagcagct 4200
aaggagaaag cagaattttt aaccaatttg aagcaattgc cactattaga gaaccagatc 4260
acaaatttag agcagtccgc tgcctcacaa gaggaccttg aagctatgtt tgggaatgtg 4320
tcatacctcg cccatttctg tcgcaagttc caaccattat acgccacgga agctaagcga 4380
gtctatgttc tagagaagag aatgaacaac tacatgcagt tcaagagcaa acaccgtatt 4440
gaacctgtat gtctcatcat tagaggctca ccaggcactg gaaagtccct tgcgaccggt 4500
atcattgctc gggccatagc agacaagtat cactctagtg tgtactcact tccaccagac 4560
cctgaccatt ttgacgggta caaacagcaa gtggttacag ttatggatga tctgtgtcag 4620
aatcctgacg gcaaagacat gtcattattt tgccagatgg tgtccaccgt ggattttatc 4680
ccaccaatgg cttctctcga agaaaaggga gtttctttca catctaaatt tgttatcgca 4740
tccaccaacg ctagcaacat tatagtgcct acagtgtcag actctgacgc cattcgtcgc 4800
aggttttaca tggattgcga cattgaggtg acagactcat acaaaacaga tttgggtaga 4860
ctagacgctg gacgggctgc taagctatgc tctgagaaca acaccgcaaa cttcaaacga 4920
tgcagcccac tagtgtgtgg gaaagctatt caacttagag acaggaagtc taaggtcagg 4980
tacagcgtgg acacagtggt ctctgaactt attagagaat ataatagcag atccgctatt 5040
ggtaacacaa ttgaagcact attccaaggc ccacccaagt tcaggccaat tagaatcagt 5100
cttgaggaga agccagcccc agacgctatt ggcgatctcc tcgctagtgt agatagcgag 5160
gaagtgcgcc aatactgtag ggagcaaggc tggatcatcc ctgaaactcc caccaatgtt 5220
gaacgacacc ttaatagagc agtgctagtc atgcaatcca tcgctactgt ggtggcagtc 5280
gtctcactgg tgtacgttat ttacaagctc tttgcggggt ttcaaggtgc gtactctgga 5340
gctcccaagc aaatgctcaa gaaacctgtc ctccgtacgg caacagtgca gggtccgagt 5400
cttgactttg ctctatcctt actgagaagg aacatcaggc aagtccaaac agatcaaggg 5460
cattttacca tgttaggtgt cagagatcgc ttagccgttc tcccacggca ctcacagccc 5520
gggaagacta tttgggtgga gcacaaactt gtgaacatcc ttgacgcaat tgagctggtg 5580
gatgagcagg gcgttaattt ggaactcaca ttggtgacac tagatactaa tgaaaaattt 5640
agagatatca ccaagttcat tccagagacc attagcggcg ctagtgatgc aactttagtg 5700
atcaacacag aacatatgcc atcaatgttt gtcccagtgg gggacgtcgt gcagtacggg 5760
ttcttgaacc ttagtggaaa gccaactcat aggaccatga tgtacaattt ccctacaaaa 5820
gcaggacagt gtggaggtgt ggtcacatca gtcggtaaga ttgttggcat tcacattggc 5880
ggcaacgggc gccaagggtt ctgtgctggt ttgaagagga gttacttcgc aagtgtgcag 5940
ggtgagatcc aatgggtgaa gcctaacaag gaaactggta gactgaacat caatggtcca 6000
actcgcacta agctggagcc tagtgtattt catgatgtgt ttgaaggtaa taaggaacca 6060
gcagttttaa caagtaaaga ccctagattg gaggtcgact ttgaacaagc cctgttttcc 6120
aagtatgtgg gcaatgtttt acacgagccc gatgaatacg tgattcaagc tgccctccac 6180
tacgcgaatc aacttaaaca attggacata aacactagca agatgagcat ggaggaagcg 6240
tgctatggca ctgaaaacct ggaagcaata gacctctgca ctagtgccgg gtacccatac 6300
agcgcccttg gcatcaagaa aagagacatt cttgacccca caaccaggga tgtgtctaag 6360
atgaaattct atatggataa atacgggcta gacctgccat actctaccta tgtgaaggat 6420
gagcttaggt ccctggataa aatcaagaaa ggaaaatcac gcttgataga ggctagtagc 6480
ttgaatgact ctgtctacct cagaatgact tttgggcacc tttacgaggt gtttcatgcc 6540
aaccctggca ctgtgactgg ctcagcagtg ggttgcaacc cggacgtgtt ttggagcaaa 6600
ctaccgattc tgctgcctgg gtcactcttt gcctttgact actcaggata tgatgctagt 6660
ctcagcccgg tatggttcag ggctctagaa gttgtgttac gggagattgg gtattcagag 6720
gaggccgtgt ccctaataga agggatcaac cacacccacc atgtgtaccg gaacaaaaca 6780
tactgtgtac ttggtggaat gccctcggga tgttctggta cttccatctt taattcaatg 6840
atcaacaaca tcatcattag aacccttttg atcaaaacct ttaagggaat agacctggat 6900
gagttgaaca tggtggccta tggggacgat gtgctggcta gttacccctt tcccattgat 6960
tgccttgagt tggctaaaac tggcaaagag tatggtttga ccatgacacc tgcagacaaa 7020
tcaccctgtt tcaatgaagt aacatgggaa aatgctacct tcctgaagag aggattcttg 7080
ccagaccacc aatttccatt cttaattcac cctacgatgc ccatgagaga gatccgtgag 7140
tccattcgat ggactaaaga cgcgcgcaac acccaagatc acgtgcgctc cctgtgtctg 7200
ttggcatggc acaatggtaa ggatgaatat gagaagtttg tgagtgtaat tagatcagtt 7260
ccagttggaa aagcgttggc cattcctaat ttcgagaatc tgagaagaaa ttggctcgaa 7320
ttgttttaat attacagctt aaagctgaac cccactagaa atctggtcgc gttaatgact 7380
agtgggggta aatttgttat aaccagaata gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 7437
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 4
ctagggatcc taatacgact cactataggt tcaaacagcc tgtgggttgc acccactcac 60
agg 63
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 5
ctaggacgtc cggccgaact ttccaagggt agtaatggca gtacgactag tgcc 54
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 6
taataagctt cggccggcag tctggggcca tctacgtg 38
<210> 7
<211> 61
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 7
gcgcggatcc tttttttttt tttttttttt gctattctgg ttataacaaa tttaccccca 60
c 61
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 8
ggtgtccact caacgcgtcg gctcccacga gaactccaat tcagctacag aaggctcc 58
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 9
caagcatggg ctcacaggtg tccactcaac gcgtcggctc ccacg 45
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 10
actcaacgcg tcggctccca cgagaactcc aattcagcta cagaaggc 48
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 11
actgccggcc gaactttcca agggtagtaa tggcagtacg actagtgcc 49
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 12
cagaggacac ccaccctcct tacaaacaaa cacaacctgg cgcc 44
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 13
ggagggtggg tgtcctctgt tcctgtaccg cctg 34
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 14
ctccttacat acaaacacaa cctggcgccg acg 33
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 15
tgtgtttgta tgtaaggagg gtggctgtcc tctgttcc 38
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 16
ctccctcttg agggtaccac caatccaaat ggttatgcca actggg 46
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 17
tggtaccctc aagagggaga tctatctctc ctaccaaacc tgccc 45
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 18
ctactggtgc ggttgttcca caattactcc agtatatgtt tgttccccct gg 52
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 19
ggaacaaccg caccagtagg agtgcacgca acaaaagtga att 43
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 20
agagaatcat ttgcttggca gacagccaca aacccc 36
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 21
gccaagcaaa tgattctcta gactctggtt tgggagcacc 40
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 22
attaggatcc gtctttcaga aggcggtaga ccag 34
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 23
tataaagctt cgacacgcca gccacgtgaa aaccaagcca aag 43
Claims (33)
1.一种肠道病毒71(EV71)神经感染的动物模型，其包含用经修饰用于感染啮齿类动物的EV71感染的啮齿类动物。
2.权利要求1的动物模型，其中所述经修饰的EV71是啮齿类动物细胞系适应的EV71。
3.权利要求1或2的动物模型，其中所述经修饰的EV71是啮齿类动物细胞系适应的EV71，其是EV71:TLLmv。
4.权利要求3的动物模型，其中EV71:TLLmv已保藏在中国典型培养物保藏中心并分配保藏号CCTCC V201438。
5.权利要求1或2的动物模型，其中所述经修饰的EV71是啮齿类动物细胞系适应的EV71，其是EV71:TLLm。
6.权利要求5的动物模型，其中EV71:TLLm已保藏在中国典型培养物保藏中心并分配保藏号CCTCC V201437。
7.权利要求1的动物模型，其中所述经修饰的EV71是在VP1中包含突变的EV71克隆衍生的病毒(CDV)。
8.权利要求1或7的动物模型，其中所述经修饰的EV71是EV71CDV CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]。
9.权利要求1-6中任一项的动物模型，其中所述啮齿类动物是免疫活性的。
10.权利要求9的动物模型，其中所述啮齿类动物是小鼠。
11.权利要求10的动物模型，其中所述啮齿类动物细胞系是小鼠细胞系NIH/3T3。
12.权利要求7或8的动物模型，其中所述啮齿类动物是免疫活性的。
13.权利要求12的动物模型，其中所述啮齿类动物是小鼠。
14.权利要求13的动物模型，其中所述啮齿类动物细胞系是小鼠细胞系NIH/3T3或小鼠细胞系Neuro-2a。
15.权利要求1或2的动物模型，其中所述啮齿类动物是免疫受损的。
16.权利要求15的动物模型，其中所述啮齿类动物是小鼠。
17.权利要求16的动物模型，其中所述小鼠是BALB/c小鼠。
18.一种筛选抗病毒药物的方法，包括：提供测试组的动物和对照组的动物，其中每组的动物包含权利要求1-17中任一项的动物模型；向测试组施用抗病毒药物候选物；监测测试组和对照组中的疾病发展；比较测试组中的疾病发展与对照组中的疾病发展；以及选择相对于对照组减少测试组中的疾病发展的抗病毒药物候选物。
19.权利要求18的方法，其中所述抗病毒药物在动物中筛选之前，首先在用经修饰的肠道病毒71感染的测试啮齿类动物细胞系中筛选。
20.一种筛选有效抗病毒疫苗的方法，包括：提供测试组的动物和对照组的动物，其中每组的动物包含权利要求1-17中任一项的的动物模型；向测试组施用抗病毒疫苗候选物；监测测试组和对照组中的疾病发展；比较测试组中的疾病发展与对照组中的疾病发展；以及选择相对于对照组减少测试组中的疾病发展的抗病毒疫苗候选物。
21.权利要求20的方法，其中所述抗病毒疫苗在动物中筛选之前，首先在用经修饰的肠道病毒71感染的测试啮齿类动物细胞系中筛选。
22.一种制备权利要求1的动物模型的方法，包括
用经修饰用于感染啮齿类动物的EV71感染啮齿类动物，以及
饲养受感染的啮齿类动物，
由此制备EV71神经感染的动物模型。
23.权利要求22的方法，其中所述啮齿类动物在感染时的年龄为约1周-约4周。
24.权利要求22或23的方法，其中将所述受感染的啮齿类动物饲养长达约4周。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其中用约103-约107的半数细胞培养感染剂量感染所述啮齿类动物。
26.权利要求22-25中任一项的方法，其中所述经修饰的EV71是啮齿类动物细胞系适应的EV71，其是EV71:TLLmv。
27.权利要求26的方法，其中EV71:TLLmv已保藏在中国典型培养物保藏中心并分配保藏号CCTCC V201438。
28.权利要求22-25中任一项的方法，其中所述经修饰的EV71是啮齿类动物细胞系适应的EV71，其是EV71:TLLm。
29.权利要求28的方法，其中EV71:TLLm已保藏在中国典型培养物保藏中心并分配保藏号CCTCC V201437。
30.权利要求22-25中任一项的方法，其中所述经修饰的EV71是在VP1中包含突变的EV71克隆衍生的病毒(CDV)。
31.权利要求30的方法，其中所述经修饰的EV71是EV71CDV CDV:BSVP1[K98E/E145A/L169F]。
32.权利要求22-31中任一项的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠。
33.权利要求32的方法，其中所述小鼠是BALB/c小鼠。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562108828P | 2015-01-28 | 2015-01-28 | |
| US62/108,828 | 2015-01-28 | ||
| US201562114880P | 2015-02-11 | 2015-02-11 | |
| US62/114,880 | 2015-02-11 | ||
| PCT/SG2016/050031 WO2016122403A1 (en) | 2015-01-28 | 2016-01-25 | Enterovirus 71 animal model |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107849540A true CN107849540A (zh) | 2018-03-27 |
| CN107849540B CN107849540B (zh) | 2021-12-21 |
Family
ID=56543857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201680019293.5A Active CN107849540B (zh) | 2015-01-28 | 2016-01-25 | 肠道病毒71动物模型 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6772155B2 (zh) |
| KR (1) | KR20170106473A (zh) |
| CN (1) | CN107849540B (zh) |
| AU (1) | AU2016212766B2 (zh) |
| MY (1) | MY202113A (zh) |
| SG (1) | SG11201706054QA (zh) |
| TW (1) | TWI764859B (zh) |
| WO (1) | WO2016122403A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112094822A (zh) * | 2019-06-02 | 2020-12-18 | 复旦大学 | 基于EV71毒株的感染性cDNA克隆及其应用 |
| CN114304064A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-04-12 | 首都医科大学 | 一种头部畸形伴神经-运动障碍动物模型的建立方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102243526B1 (ko) * | 2020-01-21 | 2021-04-22 | (주)노터스생명과학 | 수족구백신의 비임상 평가용 형질전환 동물 및 이의 제조방법 |
| US20240043944A1 (en) * | 2020-12-21 | 2024-02-08 | Chiaho Shih | Novel enterovirus 71 mutations associated with disease severity |
| CN115211402A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-10-21 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种cv-b3感染的啮齿动物模型的构建方法和用途 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102220288A (zh) * | 2011-05-04 | 2011-10-19 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 一种肠道病毒ev71型鼠适应株573及其应用 |
-
2016
- 2016-01-25 AU AU2016212766A patent/AU2016212766B2/en active Active
- 2016-01-25 SG SG11201706054QA patent/SG11201706054QA/en unknown
- 2016-01-25 CN CN201680019293.5A patent/CN107849540B/zh active Active
- 2016-01-25 WO PCT/SG2016/050031 patent/WO2016122403A1/en active Application Filing
- 2016-01-25 MY MYPI2017001107A patent/MY202113A/en unknown
- 2016-01-25 JP JP2017540259A patent/JP6772155B2/ja active Active
- 2016-01-25 KR KR1020177023889A patent/KR20170106473A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-01-27 TW TW105102566A patent/TWI764859B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102220288A (zh) * | 2011-05-04 | 2011-10-19 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 一种肠道病毒ev71型鼠适应株573及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VICTORIO， C. B. L.等: "Phenotypic and Genotypic Characteristics of Novel Mouse Cell Line (NIH/3T3)-Adapted Human Enterovirus 71 Strains (EV71:TLLm and EV71:TLLmv)", 《PLOS ONE》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112094822A (zh) * | 2019-06-02 | 2020-12-18 | 复旦大学 | 基于EV71毒株的感染性cDNA克隆及其应用 |
| CN114304064A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-04-12 | 首都医科大学 | 一种头部畸形伴神经-运动障碍动物模型的建立方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016122403A1 (en) | 2016-08-04 |
| TWI764859B (zh) | 2022-05-21 |
| AU2016212766A1 (en) | 2017-09-07 |
| MY202113A (en) | 2024-04-04 |
| JP6772155B2 (ja) | 2020-10-21 |
| AU2016212766B2 (en) | 2022-03-24 |
| SG11201706054QA (en) | 2017-08-30 |
| KR20170106473A (ko) | 2017-09-20 |
| JP2018513671A (ja) | 2018-05-31 |
| TW201702376A (zh) | 2017-01-16 |
| CN107849540B (zh) | 2021-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Novel genotype of infectious bronchitis virus isolated in China | |
| Cortez et al. | Astrovirus biology and pathogenesis | |
| Chua et al. | The molecular basis of mouse adaptation by human enterovirus 71 | |
| Graham et al. | A decade after SARS: strategies for controlling emerging coronaviruses | |
| Fujii et al. | Transgenic mouse model for the study of enterovirus 71 neuropathogenesis | |
| Muir et al. | Molecular typing of enteroviruses: current status and future requirements | |
| He et al. | Characterization of a novel G3P [3] rotavirus isolated from a lesser horseshoe bat: a distant relative of feline/canine rotaviruses | |
| CN107849540A (zh) | 肠道病毒71动物模型 | |
| Chang et al. | Selection and characterization of vaccine strain for Enterovirus 71 vaccine development | |
| CN108064165A (zh) | 猪流行性腹泻病毒株和由其产生的免疫原性组合物 | |
| Ye et al. | Structural basis for recognition of human enterovirus 71 by a bivalent broadly neutralizing monoclonal antibody | |
| CN105451763A (zh) | 用于疫苗中的登革热病毒嵌合式构建物的组合物及方法 | |
| Zeiss et al. | Animal models of COVID-19. I. Comparative virology and disease pathogenesis | |
| Corneillie et al. | Animal models for hepatitis E virus | |
| Victorio et al. | Cooperative effect of the VP1 amino acids 98E, 145A and 169F in the productive infection of mouse cell lines by enterovirus 71 (BS strain) | |
| Dan et al. | A genetically engineered attenuated coxsackievirus B3 strain protects mice against lethal infection | |
| Swain et al. | Does enterovirus 71 urge for effective vaccine control strategies? Challenges and current opinion | |
| CN103081868B (zh) | hSCARB2基因转殖鼠的制造及其做为肠病毒感染动物模式的应用 | |
| Brown Jordan et al. | Characterization of novel, pathogenic field strains of infectious bronchitis virus (IBV) in poultry in Trinidad and Tobago | |
| Zhang et al. | Current status and future direction of duck hepatitis A virus vaccines | |
| Shulman | Polio and its epidemiology | |
| Guo et al. | Co‐circulation and evolution of genogroups I and II of respiratory and enteric feline calicivirus isolates in cats | |
| Billam et al. | Analysis of the complete genomic sequence of an apparently avirulent strain of avian hepatitis E virus (avian HEV) identified major genetic differences compared with the prototype pathogenic strain of avian HEV | |
| Victorio et al. | Phenotypic and genotypic characteristics of novel mouse cell line (NIH/3T3)-adapted human enterovirus 71 strains (EV71: TLLm and EV71: TLLmv) | |
| Devaux et al. | Is it time to switch to a formulation other than the live attenuated poliovirus vaccine to prevent poliomyelitis? |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |