TWI754872B - 用於製備蛋白的嵌合型訊息肽 - Google Patents

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Abstract

一種用於蛋白表現的嵌合型訊息肽，包括一N-區域、一疏水性區域，以及一C-區域，其中該N-區域及該C-區域是來自一第一蛋白的相同訊息肽，且該疏水性區域是來自一第二蛋白的訊息肽，其中該第一蛋白與該第二蛋白為不同的蛋白。所述第一蛋白及第二蛋白是個別選自由BM40、IL2、HA、胰島素、CD33、IFNA2、IgK前導序列、AZU，以及SEAP所組成的群組。

Description

用於製備蛋白的嵌合型訊息肽
本發明整體上是關於治療性蛋白的製備。具體來說，本發明是關於人工訊息肽於優化蛋白表現的相關應用。
現今產業界致力於發展CHO這類的穩定細胞株來製備高品質的蛋白或抗體。在過去，對於哺乳類表現系統進行優化的方向，主要著重在下游製程的改良，以及培養基的發展上。然而，為符合高產量、快速開發，以及降低製造成本等需要，人們也需要同時考慮優化表現載體以及其他的組成分得部分。當製備分泌型蛋白的時候，會影響蛋白分泌的速率決定步驟在於蛋白轉位進入內質網內腔時的步驟。該步驟會與分泌訊息的序列有關，即所謂的訊息肽(signal peptide，SP)。已有大量的研究顯示，蛋白或抗體原本內源性訊息肽通常並不是最佳化的，因此仍有需要再進一步改善。
訊息肽是一種短片段(長度通常為5-30個胺基酸)的胜肽，存在於大部分之新合成蛋白的N端，所述蛋白包括該些會從細胞分泌出去、滯留在特定胞器(高基氏體或內質網)的內部，或是嵌入細胞膜中的蛋白。
訊息肽是由一段N-區域、一段疏水性區域(H-區域)，以及一段C-區域所組成。訊息肽的H-區域含有一段疏水性的胺基酸(長度約為5-16個殘基)，並傾向於形成一種單一的阿伐螺旋結構。許多訊息肽的N-區域含有一段短片段的帶正電胺基酸，它可藉由已知的正電內在法則(positive-inside rule)，來促進多肽在轉位期間內仍保有正確的拓撲學。在訊息肽的C-區域，通常會有一段用於讓訊息肽酶辨認並且切割的胺基酸。然而，蛋白酶切割位點不會存在於作為訊息肽的跨膜域中，所謂跨膜域有時被稱為訊息定錨序列(signal anchor sequences)。
許多研究發現，大部分蛋白的天然訊息肽並不是最佳化的，此外，將訊息肽做優化，或以替代性訊息肽置換天然訊息肽，可增加標的蛋白的產量。舉例來說，L. Kober等人證明，以人類白蛋白及人類天青黴素(azurocidin，AZU)所衍生的天然訊息肽來製備抗體，可獲得較佳的抗體表現量(Biotechnol. Bioeng., 2013 Apr;110(4):1164-73. doi: 10.1002/bit.24776)。
本發明具體是關於一種嵌合型訊息肽。一種用於蛋白表現的嵌合型訊息肽，包括一N-區域、一疏水性區域，以及一C-區域，其中該N-區域及該C-區域是來自一第一蛋白的訊息肽，且該疏水性區域是來自一第二蛋白的訊息肽，其中該第一蛋白與該第二蛋白為不同的蛋白。
依據本發明的某些實施方式，該第一蛋白及第二蛋白可以是個別選自由基底膜蛋白40(basement membrane protein 40，BM40)、介白素2(interleukin 2，IL2)、血细胞凝集素(hemagglutinin，HA)、胰島素(Insulin)、CD33、干擾素阿伐2(interferon alpha 2，IFNA2)、免疫球蛋白卡帕鏈(immunoglobulin kappa chain，IgK)、天青黴素(Azurocidin，AZU)，以及分泌型鹼性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)所組成的群組。
本發明的另一態樣是關於一種利用本發明嵌合型訊息肽以製備一標的蛋白或抗體的方法。依據本發明的一個實施方式，所述方法包含：將一種包括本發明嵌合型訊息肽的表現卡匣轉染至一哺乳類宿主細胞中；培養該哺乳類宿主細胞使其表現該標的蛋白；以及，收集該標的蛋白。
在參閱以下的說明及申請專利範圍後，本發明的其他態樣及優點當可輕易瞭解。
本發明具體是關於一種嵌合型訊息肽，以及其於真核系統中增強標的蛋白產量的用途。依據本發明的實施方式，是將嵌合型訊息肽設計成可增強真核宿主細胞中標的蛋白的表現及/或分泌。訊息肽的長度通常為5-30個胺基酸，並可分為一N-區域、一H-區域(疏水性區域)，以及一C-區域。可利用不同方法來建構本發明嵌合型訊息肽，舉例來說，可藉由將一第一訊息肽的疏水性區域置換成一第二訊息肽的疏水性區域來建構。
可利用已知的訊息肽來建構本發明嵌合型訊息肽。常用的訊息肽包括該些來自BM40(基底膜蛋白40)、IL-2(介白素2)、HA(血球凝集素)、胰島素、CD33，IFNA2(干擾素阿伐2)、IgK(免疫球蛋白卡帕鏈)、SEAP(分泌型鹼性磷酸酶)，以及AZU(天青黴素)蛋白的訊息肽。在以下的說明中，該些蛋白名稱可用於指稱各自的訊息肽(SP)。可自該些天然的訊息肽中，選取較佳的訊息肽再進一步做最佳化。為評估該些訊息肽於增強蛋白產量的效率，本領域技術人員可建構一種含有該訊息肽的表現載體，並檢測蛋白的表現量，例如，利用酵素免疫測定法(ELISA)或其他測定法。以下的實施例將以抗體作為標的蛋白的實例。然而，本領域技術人員當可理解本發明的實施方式可用於表現任一種蛋白，並不僅限於抗體。
為利用抗體作為標的蛋白，首先將一抗體的重鏈及輕鏈分別選殖至兩個載體中。或者是，可使用一個涵蓋重鏈及輕鏈的表現載體。為便於檢測，該些載體尚可含有標籤(例如，分別含有一紅色螢光標籤及一綠色螢光標籤)。將待測的訊息肽整合在該抗體重鏈或輕鏈的轉譯起始密碼子ATG之前。接著，藉由將該些載體共轉染(co-transfection)至適當的宿主細胞中，來評估抗體的生產效率。可利用一些已知可有效幫助蛋白生產的訊息肽(例如，白蛋白(ALB)、天青黴素(AZU)、H5L1，以及H7N1等)，來作為正控制組。
為製備蛋白，可將含有本發明訊息肽的構建體建構至任一種適當的蛋白表現系統(例如，E. coli、酵母菌細胞、CHO等)的表現載體中。舉例來說，在本發明的先前研究中，是將適當的表現載體J1.0delta及J1.0.2(基於pTCAE8.3的架構)用於建構賀癌平及癌思停的製備上。各別載體的訊息肽是AZU(天青黴素)或Ori(原本的訊息肽)。為找出較佳的訊息肽，可將各別載體(分別含有重鏈或輕鏈之核酸序列)中的AZU及Ori，置換成其他的訊息肽。在一實施例中，共計建構32個載體，且各載體均含有一種抗體(例如，賀癌平或癌思停)的輕鏈或重鏈，以及不同的訊息肽。
將該些表現載體以瞬時轉染至CHO細胞(例如，DXB11細胞，或CHOK1(CCL61-S1)細胞)中，並依不同的重鏈(HC)對輕鏈(LC)的比例(1：1或1：4)，來評估轉染/表現的效率。接著利用酵素免疫測定法來評估抗體的表現量。
如第1圖所示，是以賀癌平作為標的蛋白，該構建體是以BM40及CD33作為訊息肽，所生產的產量是與作為正控制組的AZU訊息肽相當或更佳。此外，第1圖顯示出，當HC/LC的比例為1：1時，抗體效價可達到8至9微升/毫升；且當HC/LC的比例為1：4時，抗體效價可達到4至5.5微升/毫升。因此，在本實施例中，HC/LC為1：1的比例可生產較高的抗體產量。
接下來，本實驗是應用不同的訊息肽來製備癌思停。如第2圖所示，該構建體具有BM40、CD33及IgK訊息肽，所生產的產量高於具有原本訊息肽(ORI)的構建體。含BM40、CD33及IgK訊息肽的蛋白表現量是與正控制組(AZU)相當或更佳。轉染比例不同(HC/LC = 1：1或1：4)所生產的產量不同。當HC/LC = 1：1時，抗體效價為200-250奈克/毫升，而當HC/LC = 1：4時，抗體效價可達300-550奈克/毫升。因此，在本實施例中，1：4的比例可生產更多的蛋白。
基於上述測試及其他類似的測試，可發現到相較於正控制組AZU，一些訊息肽會具有類似或較佳的能力來增強蛋白表現。以下選取該些訊息肽再進一步做最佳化。該些選定的訊息肽包括CD33、IgK、BM40、AZU，以及SEAP訊息肽。
如上所述，訊息肽可分為三個區域：N-區域、H-區域(疏水性區域)，以及C-區域。訊息肽的疏水性區域(H-區域)會形成一螺旋結構，其重要性在於會與一訊息辨識顆粒(signal recognition particle，SRP)進行交互作用。這類交互作用會促使訊息辨識顆粒去結合初生蛋白，並促進該蛋白的轉位即跨越ER膜。因為H-區域具有此種重要的功能，以下實驗將研究改變H-區域是否可改善訊息肽的效率。
本發明提出一個方法是創建嵌合型訊息肽，其中將第一訊息肽的H-區域置換成第二訊息肽中對應的H-區域。為進行上述H-區域的置換，首先需分析該訊息肽來決定各區域的邊界，以及訊息蛋白酶的切割位點。本領域有許多方法/程式可進行這類分析，例如，SignalP 4.0、SignalP-HMM、PrediSi，以及Signal Blast等。
舉例來說，SignalP伺服器(由丹麥科技大學生物序列分析中心所託管)，可預測胺基酸序列中是否存在訊息肽切割位點，以及其位置。所述方法是基於一些人工類神經網路的組合運用，來預測切割位點，以及預測訊息肽/非訊息肽。此外，所述伺服器並提供用以預測N-區域、H-區域及C-區域的方法。
本實驗利用CD33_IgK嵌合型訊息肽作為實例，MPLLLWVLLLWAGALA-EVQLVESGGG(序列編號：11)，SignalP 4.0會預測C、S、Y分數。C分數預測出訊息肽酶會切在序列MPLLLWVLLLWAGALA-EVQLVESGGG(序列編號：11)中的丙胺酸(A)之後，以及麩胺酸(E)之前。S分數表示該序列是訊息肽的可能性：該分數越高代表該序列越有可能是訊息肽。Y分數是基於C分數及S分數的綜合分數。Y分數進一步確認肽酶會切在麩胺酸殘基之前(參見第3A圖)。
另一種與上述類似的程式是SignalP-HMM(基於隱藏式馬可夫模型(hidden Markov Model)，Henrik Nielsen and Anders Krogh,In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6 ), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122--130 (1998))，該程式並預測N-區域、H-區域及C-區域，以及訊息肽酶切割位點(第3B圖)。該程式並預測肽酶會切在麩胺酸之前，此結果與SignalP 4.0的預測結果一致。
另一種程式是PrediSi(可預測訊息肽，Karsten Hiller et al.“Prediction of Signal Peptides and Their Cleavage Positions,” Nucleic Acids Res., 2004, July 1, 32: W375-W379, doi: 10.1093/nar/gkh378)，該程式並預測肽酶會切割在丙胺酸(A)與麩胺酸(E)之間(第3C圖)。最後，BLAST程式，其藉由同源性比較其他已知的訊息肽切割位點，也可用於預測切割位點(第3D圖)。
可使用上述任一種方法來預測訊息肽，以及其對應的N-區域、H-區域及C-區域。上述方法通常會產生一致的結果。即使在演繹上會產生些微誤差，但精確地劃分N-區域、H-區域與C-區域之間的邊界對於本發明的實施並非至關重要。如上所述，H-區域是一段傾向於形成α-螺旋的疏水性拉伸段。已知訊息辨識顆粒(SRP)的M結構域會結合至訊息肽，而訊息肽的H-區域可具有相當大的序列變化，H-區域甚至可包括一段合成的多白胺酸(poly-Leu)胜肽(Kendall et al., “Idealization of the hydrophobic segment of the alkaline phosphatase signal peptide,” Nature, 1986; 321:706–708)。因此，將一段α-螺旋置換成另一段α-螺旋並不會影響原先α-螺旋的確切邊界。
依據本發明的實施方式，基於上述的預測方法，或其他類似的方法，本領域技術人員可設計出H-區域的置換以創建嵌合型訊息肽。舉例來說，本領域技術人員可將一第一訊息肽的H-區域置換成一第二訊息肽的H-區域。基於上述該些有前景的訊息肽，例如，CD33、IgK、BM40、AZU及SEAP訊息肽，本領域技術人員可創建出不同的嵌合型訊息肽。
在本說明書中，以下的註解適用於嵌合型訊息肽：所述第一訊息肽(提供N-區域及C-區域)列示在前，接著是第二訊息肽(提供H-區域)的名稱。舉例來說，BM40_CD33(或稱BM-CD或BMCD)嵌合型訊息肽，含有來自BM40的N-區域及C-區域，以及來自CD33的H-區域。與上述類似地，CD33_BM40(或稱CD-BM或CDBM)嵌合型訊息肽，含有來自CD33的N-區域及C-區域，以及來自BM40的H-區域。其他的實例尚包括：CD33_IgK(CD33含IgK前導序列的疏水性區域)、IgK_CD33(IgK前導序列含CD33的疏水性區域)、SEAP_AZU(SEAP含AZU的疏水性區域)，以及AZU_SEAP(AZU含SEAP的疏水性區域)。該些嵌合型訊息肽的核苷酸及胜肽序列列示於以下的表1中： 表1
訊息肽名稱 訊息肽序列 序列編號
CD33_IgK MPLLLWVLLLW AGALA 1
IgK_CD33 METDTLLLLLPLLW VPGSTG 2
SEAP_AZU MILGPLTVLALLAGLL RLQLSLG 3
AZU_SEAP MTRCMLLLLLLLGL ASSRA 4
BM40_CD33 MRALLLLLPLLW AGRALA 5
CD33_BM40 MPWIFFLLCL AGALA 6
SEAP MILGPCMLLLLLLLGLRLQLSLG 7
AZU MTRLTVLALLAGLLASSRAGSSPLLD 8
AZUd MTRLTVLALLAGLLASSRA 9
3D5R SP MRVPAQLLGLLLLWLPGARC 10
CD33-IgK-P MPLLLWVLLLW AGALA-EVQLVESGGG 11
BM40_CD33-截斷型 MRALLLLLPLLW AGRA 12
底線表示嵌合型訊息肽中的疏水性區域。
以下的章節將以特定的嵌合型訊息肽作為實例，以說明本發明的實施方式。然而，本領域技術人員當可理解該些有限的實施例僅作為說明之用，並非旨在限制本發明的範疇。
首先，可將該些嵌合型訊息肽進行電腦模擬(in silico)分析，利用SignalP伺服器(或其他類似的服務)來確認該些嵌合型訊息肽仍可作為訊息肽，以及仍具有訊息肽酶的切割位點。以下的實例是利用BMCD及CDBM嵌合體作為訊息肽，以說明本發明的實施方式。然而，該些說明內容可均等應用在本發明的其他嵌合型訊息肽中。
如第4圖所示，嵌合型訊息肽BMCD及CDBM，二者皆具有定義良好的訊息肽酶切割位點，說明這類嵌合型訊息肽有可能會保留其原有功能。所有的其他嵌合體，包括CDIgK、IgKCD、SEAPAZU及AZUSEAP，均發現到它們與上述類似，皆有保留訊息肽酶的切割位點。
接著，測試該些嵌合型訊息肽作為訊息肽的能力，以及評估其幫助及增強蛋白表現/分泌的能力。所述測試是利用列示在第5圖中的例示性構建體來進行。
如第5圖所示，是將該嵌合型訊息肽選殖至一個表現抗體重鏈(HC)的表現載體中，以及選殖至另一個表現抗體輕鏈(LC)的表現載體中，並選殖在屬於訊息肽(SP)的位置。在本實施例中，該表現載體是控制在一個適當的啟動子(例如，CMV啟動子)下，並包含一段內部核醣體進入區(internal ribosome entry site，IRES)序列，以利核糖體進入。可將該HC載體及該LC載體分別以增強型綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)，以及圓盤海葵紅色螢光蛋白(Discosoma red fluorescence protein，DsRed)做標記，以便於分析。接著將上述兩個表現載體共轉染至宿主細胞(例如，CHO細胞)中，以製備蛋白。可利用任一種適當的方法(例如，酵素免疫測定法)，來分析蛋白生產量。
本實驗利用賀癌平作為標的蛋白，而第6圖提供不同的嵌合型訊息肽(例如，CD-IgK、IgK-CD、SEAP-AZU、AZU-SEAP、BM-CD，以及CD-BM)的實驗結果。如所預期的，一些嵌合型訊息肽可賦予與AZU(正控制組)相當或更佳的蛋白表現量。在該些較佳的嵌合型訊息肽中，BMCD展現出最佳的功效。
上述結果是來自於共轉染兩個載體，以製備賀癌平的HC及LC鏈。另一種替代性方法是建構一個同時表現HC及LC的表現載體。為測試單一載體表現系統是否會更有效率，於是將含有BMCD的HC載體，以及含有BMCD的LC載體進行次轉殖(subcloned)至一適當的表現載體(例如，載體J2.0-PDSZ，其是基於pTCAE8.3的架構)中。在CHO細胞中測試所述載體來表現賀癌平。如第7圖所示，BMCD嵌合型訊息肽明顯優於AZU(正控制組)。來自BMCD所得的表現量約為AZU的1.5倍。
第7圖同時顯示，正確的嵌合型訊息肽序列至關重要。舉例來說，BMCD的截斷型變異體(序列編號：12)，其中最後的兩個殘基(LA)缺失，因而喪失某些訊息肽功能，很可能因為該等缺失而干擾該訊息肽的切割作用。已知訊息肽的C-區域含有一個更為極性的羧基端，其中在-3及-1位置(自訊息肽酶的切割位點起算)上，通常含有小型脂肪族殘基(例如，Ala)，以及少見的芳香或帶電的殘基。因此，BMCD的C-端缺失Leu-Ala可能會折損訊息肽酶的切割作用，進而干擾蛋白的分泌作用。
儘管上述結果是利用賀癌平作為標的蛋白/抗體，本實驗也同時測試其他蛋白(例如，癌思停、地諾單抗等)，並發現到它們具有類似的實驗結果。舉例來說，第8圖顯示出，SEAP_AZU嵌合型訊息肽約增加40％的地諾單抗產量。
除了該些嵌合型訊息肽本身的作用以外，該些嵌合型訊息肽所處在的脈絡/環境也可影響蛋白生產的效率。換言之，不同的載體可進一步增強該些嵌合型訊息肽的效率。舉例來說，本實驗發現到，相較於載體J2.0，表現載體J2.0.2約生產2倍的地諾單抗的量。與上述類似地，癌思停利用載體J2.0.2也有較佳的產量。另一方面，在賀癌平及Tim3抗體的部分，則是載體J2.0會生產較高的產量。載體J2.0.2在表現HC鏈及LC鏈上分別利用不同的啟動子，如第9圖所示。因此，嵌合型訊息肽於增強蛋白生產的能力，可藉由選擇較佳的載體來進一步強化。
第10A–10C圖提供另一個實施例，是利用載體J2.0.2及嵌合型訊息肽SEAP-AZU來表現地諾單抗。第10A圖是說明細胞培養及蛋白表現的流程圖。簡言之，將CHO細胞(3×105 個細胞/毫升)種在一批培養瓶中。在批次培養5至6天後，可收集上清液，並利用酵素免疫測定法(ELISA)或高效液相層析法(HPLC)來分析蛋白產量。第10B圖呈現J2.0.2-PDSB-DenoAZUd，以及J2.0.2-PDSB-DenoSEAPAZU的構建載體。該些載體含有二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因以促進細胞株轉染，所述細胞株是來自缺乏該DHFR基因的CHO細胞。第10C圖顯示兩種載體在第5天及第6天所得的地諾單抗產量。利用該些載體所得的產量是彼此相當，這說明SEAPAZU嵌合型訊息肽與正控制組AZU同樣有效。
儘管上述實施例提供不同抗體的產量，本發明的實施方式也可用於製備其他蛋白(例如，感興趣的融合蛋白)。第11A圖顯示用以製備一融合蛋白3D5R的表現構建載體。三個構建體分別含有原本的訊息肽(SP，MRVPAQLLGLLLLWLPGARC，序列編號：10)、AZUd(序列編號：9)，以及BMCD(序列編號：5)。第11B圖呈現出蛋白表現的結果。很清楚的是，AZUd訊息肽(為C-區域缺失7個胺基酸殘基的AZU訊息肽，並發現到其功效與AZU訊息肽同樣良好)，於製備及分泌3D5R融合蛋白是有效的；其產量是原本訊息肽的2.7倍。與上述類似的是，嵌合型訊息肽BMCD也是非常有效，可生產原本訊息肽的1.9倍量。
第12A及12B圖則提供另一個實施例，是利用J2.0載體及BMCD訊息肽來製備T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域3(TIM3)的抗體。第12A圖呈現該構建載體，含有原本的訊息肽(ori)或BMCD訊息肽。第12B圖顯示瞬時轉染3天後的TIM3產量，或批次培養中的轉染細胞經第I期選汰6天後的TIM3產量。在二種轉染-表現系統中，相較於利用原本訊息肽的載體，BMCD可生產3倍及2.6倍的蛋白表現量。
上述實施例證實本發明的嵌合型訊息肽可有效增強重組蛋白(包含抗體)的生產及分泌。所述增強功效在瞬時轉染，以及批次培養中的穩定轉染細胞中均可見到。
本發明的實施方式可利用本領域所熟知的任一種適當方法來實踐之。以下說明僅提供某部分的實施例。本領域技術人員當可理解該些實施例僅供說明之用，並可在不悖離本發明範疇的前提下，對本發明進行修改及變化。
細胞培養及培養基
中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞株DXB11得自哥倫比亞大學的Lawrence Chasin博士。CHO的DXB11細胞株不含DHFR(或稱為DUX-B11，或DUKX)基因，該細胞株是歷史上第一株用於大量製備異源性蛋白，並且迄今仍用於製備許多蛋白複合體的CHO細胞株(C.S. Kaas et al.,“Sequencing the CHO DXB11 genome reveals regional variations in genomic stability and haploidy,” BMC Genomics, 16, Article No. 160 (2015))。將細胞培養在一培養箱中，培養條件為5％之CO2 、溫度37°C，以及95％之濕度。細胞培養的培養基包括Hyclone及混合培養基(50％之CDFortiCHO，以及50％之ActiCHO)。在將細胞以台酚藍染色後，利用自動細胞計數器TC10(Bio-Rad，USA)進行細胞計數及存活率分析。
轉染用的構建體包括嘌黴素抗性基因。基於嘌黴素抗性來選汰穩定細胞群。一旦細胞群變為單一選殖株，則不需要再行選汰。
載體建構
在本實施例中，可利用PCR來擴增含有訊息肽序列的各HC或LC胜肽片段，接著利用任一種本領域所熟知的技術(例如，利用高效融合酵素(In-Fusion® HD)(Clontech，Takara Bio USA, Inc.，Mountain View，CA))，將所述胜肽片段整合至表現載體中。為建構本發明的表現載體，將選定的訊息肽序列選殖至一適當載體(例如，基於pcDNA3.1或pTCAE的架構)中，所述載體已含有待表現的蛋白(例如，標的抗體的HC或LC鏈)。所述載體並含有一段IRES序列以便控制報導基因(例如，EGFP及DsRed)。以CD33訊息肽為例，而製備CMV-HCCD33 -IRES-EGFP，以及CMV-LCCD33 -IRES-DsRed構建體。其他含訊息肽的載體均可依上述步驟建構。舉例來說，以下的訊息肽序列(表2)已依類似的方式建構至表現載體中。 表2
訊息肽名稱 序列 序列編號
BM40 gccaccatgagagcctggatcttttttctgctctgcctcgctggcagagccctggct 13
IL_2 gccaccatgcagctgctgtcatgcatcgcattgatcttggcgctggtg 14
HA gccaccatgaagaccatcatcgccctgtcctacatcttctgcttggtcctcgga 15
胰島素 gccaccatggcgctgtggatgcgcctgctgccgctgctggcgctgctggcgctgtggggcccagatccggcggcggcg 16
CD33 gccaccatgccgctgctgctgctgctgccgctgctgtgggcgggcgcgctggcg 17
IFNA2 gccaccatggcgctgacctttgcgctgctggtggcgctgctggtgctgagctgcaaaagc 18
IgG卡帕鏈 gccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt 19
SEAP atgattctggggccctgcatgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggc 20
CD33-IgK gccaccatgccgctcctgctatgggtactgctgctctgggcgggcgcgctggcg 21
IgK-CD33 gccaccatggagacagacacactgctgctgctgctgccgctgctgtgggttccaggttccactggt 22
SEAP-AZU gccaccatgattctggggcccctgacagtcctggccctgctggctggtctgctgaggctacagctctccctgggc 23
AZU-SEAP gccaccatgacccggtgcatgctgctgctgctgctgctgctgggcctggcgtcctcgagggcc 24
BM40-CD33 gccaccatgagagccctgctgctgctgctgccgctgctgtgggctggcagagccctggct 25
CD33-BM40 gccaccatgccgtggatcttttttctgctcgcctcgcgggcgcgctggcg 26
可利用任一種常規的選殖技術來建構該些載體。在某些特定的實施例中，是利用重疊延伸PCR(overlapping PCR)技術，例如，PCR擴增，並連接已擴增的重疊性片段。該些技術是慣用且常規的技術。
轉染 CHO 細胞
可利用任一種本領域所熟知的適當方法及設置，將構建體轉染至宿主細胞中。舉例來說，將CHOK1細胞培養在一6-孔盤中。各孔種植1×106 個細胞(於3毫升之Hyclone™及HyCell™的CHO培養基(GE Healthcare)，並含有8毫體積莫耳濃度之GlutaMAX™(Thermo Fischer)中)。可利用任一種本領域所熟知的適當試劑(例如，利用FreeStyle MAX™親脂性試劑(Thermo Fischer))，來轉染含有賀癌平LC及HC之構建體的載體(例如，pcDNA3.1)。舉例來說，將賀癌平HCBM40CD33 、賀癌平LCBM40CD33 ，以及Freestyle MAX™轉染試劑(Thermo Fischer)分別加至OptiPRO™ SFM溶液(Thermo Fischer)中，以製備載體溶液(如表3所示)。使該些溶液靜置5分鐘，接著將它們加至轉染試劑中，並充分混和。使所得溶液靜置20分鐘，之後轉染至細胞中。接著，在轉染3天後評估細胞的產量。 表3
CHOK1 樣本 ID pcDNA3.1-HerHCBM40CD33 (A) + pcDNA3.1-HerLCBM40CD33 (B) TCAE-HerBMCD
賀癌平 濃度(微克/微升) A： 0.83 / B： 0.61 A： 0.83 / B： 0.61 A： 0.83 / B： 0.61 2
製備DNA-液體複合物   1：4 1：2 1：1  
將5微克之DNA稀釋在OptiPRO SFM中(共計0.15毫升) 質體(微升) HC： 1.2 / LC： 6.6 HC： 2 / LC： 5.5 HC： 3/ LC： 4.1 2.5
培養基(微升) 142.2 142.5 142.9 147.5
將5微升之FreeStyle MAX稀釋在OptiPRO SFM中(共計0.15毫升) 微脂體(微升) 5 5 5 5
培養基(微升) 145 145 145 145
將已稀釋的DNA加至已稀釋的試劑中 反應20分鐘        
加入3毫升的複合物至各懸浮瓶(3毫升)；細胞密度/毫升 1.00E+6        
蛋白表現
為在待測的CHO細胞中製備蛋白/抗體，可自廠商，或利用本領域所熟知的步驟來製備該抗體/蛋白表現構建體，以及將該構建體轉染至該待測的CHO細胞中，以瞬時表現該抗體或蛋白。將已經轉染的CHO細胞培養一段適當期間(例如，3天)以製備該標的蛋白。或者是，可利用轉染來製備穩定細胞株，以便利用常規培養或批次培養來製備蛋白。可利用任一種本領域所熟知的方法來促進選汰穩定轉染的細胞株。舉例來說，本領域技術人員可利用含有DHFR基因的載體，以及缺乏該DHFR基因的CHO細胞，來促進選汰。據此，僅有該些含有轉染載體的CHO細胞可存活在限制性培養基中。
可利用任一種適當方法來評估蛋白的表現量，例如，酵素免疫測定法、高效液相層析法，或其他方法。惟若該表現的蛋白具有酵素活性(例如，SEAP)，則本領域技術人員尚可利用該活性來評估蛋白表現量。舉例來說，以SEAP為例，可利用Clontech的化學發光套組GreatEscAPe™進行檢測。將5×稀釋緩衝液與ddH2 O以1：5的比例進行稀釋，以製備1×稀釋緩衝液。為評估蛋白表現量，自已經轉染的細胞或對照轉染的細胞中各取25微升的細胞培養基至一96-孔微量滴定盤中。可視需要，將該微量盤密封並冷凍在–20°C中，以便未來分析之用。將75微升的1×稀釋緩衝液加至該96-孔微量滴定盤的各樣本中。將該微量盤以黏性鋁箔或一般的96-孔上蓋密封，並在65°C下(利用加熱板或水浴槽)使該稀釋的樣本反應30分鐘。
使樣本在冰上冷卻2–3分鐘，接著使其平衡至室溫。將100微升的SEAP基質溶液加至各樣本中。在室溫下，使樣本反應30分鐘，接著讀值。利用96-孔盤式分析儀光度計(例如，CLARIOstar® )來偵測並記錄化學發光訊號。以酵素免疫測定法測定培養上清液中的抗體效價。將效價除以每天存活的細胞密度之曲線下面積的整數來計算細胞特定生產力(cell specific productivity，Qp)。
儘管本發明的實施方式已經描述一定的實施方式，本發明所屬技術領域具有通常知識者當可從本發明中獲益，並可在不悖離本揭示內容範圍的情形下，理解其他經設計的實施方式。據此，本發明的範圍應以隨附的申請專利範圍為準。
無
第1圖闡述在不同HC/LC的比例下，不同的常見訊息肽於增強賀癌平(Herceptin；曲妥珠單抗(Trastuzumab))產量的效率。
第2圖闡述在不同HC/LC的比例下，不同的常見訊息肽於增強癌思停(Avastin；貝伐單抗(Bevacizumab))產量的效率。
第3A圖闡述SignalP 4.0軟體於預測嵌合型CD33_IgK訊息肽的結果。SignalP 4.0軟體預測C、S、Y的分數，並基於該些分數進行分析。C分數是預測訊息肽酶會切在序列MPLLLWVLLLWAGALA-EVQLVESGGG(序列編號：11)中的丙胺酸(A)之後，以及麩胺酸(E)之前。
第3B圖闡述SignalP-HMM軟體於預測嵌合型CD33_IgK訊息肽的結果。SignalP-HMM軟體預測訊息肽的N-區域、H-區域及C-區域。Signal-HMM軟體並預測訊息肽酶會切在MPLLLWVLLLWAGALA-EVQLVESGGG(序列編號：11)中的丙胺酸(A)之後，以及麩胺酸(E)之前。
第3C圖闡述PrediSi軟體於預測嵌合型CD33_IgK訊息肽的結果。PrediSi軟體並預測訊息肽酶會切在MPLLLWVLLLWAGALA-EVQLVESGGG(序列編號：11)中的丙胺酸(A)之後，以及麩胺酸(E)之前。
第3D圖闡述BLAST軟體於預測嵌合型CD33_IgK訊息肽的結果。藉由序列同源性的比較，BLAST軟體並預測訊息肽酶會切在MPLLLWVLLLWAGALA-EVQLVESGGG(序列編號：11)中的丙胺酸(A)之後，以及麩胺酸(E)之前。
第4圖闡述嵌合型訊息肽BMCD及CDBM二者皆具有定義良好的訊息肽酶切割位點，說明這類的嵌合型訊息肽可能會保留其原有功能。
第5圖為一示意圖，用以說明建構分別含有本發明不同訊息肽序列的重鏈及輕鏈表現載體。
第6圖闡述本發明不同嵌合型訊息肽的實驗結果。一些嵌合型訊息肽可賦予與AZU相當或更佳的蛋白表現量。在該些較佳的嵌合型訊息肽中，BMCD展現出最佳功效。
第7圖闡述BMCD嵌合型訊息肽的功效顯著優於AZU。攜帶BMCD訊息肽的蛋白表現量約為攜帶AZU的1.5倍。第7圖並闡述，正確的嵌合型訊息肽序列至關重要。舉例來說，BMCD變異體(具有最後兩個殘基(LA)缺失)的功效大為減弱。
第8圖闡述SEAP_AZU嵌合型訊息肽約可增加40％的地諾單抗(Denosumab)產量。
第9圖闡述不同的載體可影響嵌合型訊息肽的效率。
第10A圖為一流程圖，用以說明細胞培養及蛋白製備的實驗步驟。第10B圖闡述兩個分別利用Azud及SEAPAZU訊息肽以製備地諾單抗的表現載體。第10C圖闡述利用第10B圖的表現載體所得之地諾單抗產量的結果。
第11A圖闡述分別利用原本的訊息肽、AZUd訊息肽，以及BMCD訊息肽來製備融合蛋白3D5R的構建載體。第11B圖闡述利用第11A圖的表現載體所得之蛋白表現量的結果。利用AZUd訊息肽所得之融合蛋白3D5R的產量是原本訊息肽的2.7倍，而利用BMCD訊息肽所得之融合蛋白3D5R的產量是原本訊息肽的1.9倍。
第12A圖闡述利用原本的訊息肽或BMCD嵌合型訊息肽來製備對抗T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM3)的抗體的表現構建載體。第12B圖闡述利用第12A圖的表現載體來製備蛋白的結果。如圖所示，BMCD訊息肽所生產的蛋白遠高於原本的訊息肽。在瞬時(transient)轉染實驗中，BMCD訊息肽的蛋白產量高於原本訊息肽的3倍，而在穩定轉染的細胞中，BMCD訊息肽的蛋白產量是原本訊息肽的2.6倍。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009

Claims (7)

  1. 一種用於蛋白表現的嵌合型訊息肽，包含一N-區域、一疏水性區域(H-區域)，以及一C-區域，其中該N-區域及該C-區域是來自一第一蛋白的訊息肽，且該疏水性區域(H-區域)是來自一第二蛋白的訊息肽，其中該第一蛋白與該第二蛋白為不同的蛋白；以及該嵌合型訊息肽包含選自序列編號：1至6的序列。
  2. 如請求項1所述之嵌合型訊息肽，其中該嵌合型訊息肽包含序列編號：5或6的序列。
  3. 一種用以編碼如請求項1所述之嵌合型訊息肽的單離DNA序列，其中該單離DNA序列是選自序列編號：21至26。
  4. 一種表現載體，其係於哺乳類宿主細胞中用以製備一標的蛋白，其中該表現載體包含一啟動子，其係與如請求項3所述之單離DNA序列功能性連接，且該如請求項3所述之單離DNA序列係與一用以編碼該標的蛋白的DNA序列框內(in frame)連接。
  5. 一種用以製備一標的蛋白的方法，包含：(a)將如請求項4所述之表現載體轉染至一哺乳類宿主細胞中；(b)培養該哺乳類宿主細胞使其表現該標的蛋白；以及(c)收集該標的蛋白。
  6. 如請求項5所述之方法，其中該哺乳類宿主細胞是CHO細胞。
  7. 如請求項5所述之方法，其中該標的蛋白是一抗體。
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