TWI752432B

TWI752432B - 蓮蓬萃取物用於治療或/及預防心臟疾病之用途

Info

Publication number: TWI752432B
Application number: TW109107895A
Authority: TW
Inventors: 陳璟賢
Original assignee: 中山醫學大學
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2022-01-11
Also published as: TW202133869A

Abstract

本發明係揭露一種將蓮蓬萃取物用於製造治療或預防心臟損傷之組合物之用途，意即透過投予一有效量之蓮蓬萃取物至一個體，能夠保護該個體之心肌細胞，達到預防或改善因心肌細胞損傷或心肌細胞凋亡所造成之疾病。

Description

蓮蓬萃取物用於治療或/及預防心臟疾病之用途

本發明係有關於植物萃取物之第二用途，特別係指一種蓮蓬萃取物用於治療或/及預防心臟疾病之用途。

按，心臟疾病一直以來都是全世界各國之主要死因之一，原因在於只要心肌細胞受損死亡，其對於個體所造成之健康損傷乃是難以回復者。癌症亦為全世界各國之主要死因之一，而隨著醫療技術之進步，目前已有許多癌症治療方法陸續地被提供，其中最為普及之治療方法為化療藥物。雖然投予化療藥物能夠達到治療腫瘤之效果，但是化療藥物亦有可能會作用於個體內之其他細胞，導致其他器官受損，如化療藥物對於心臟造成之心臟毒性會引起心臟衰竭、呼吸困難、心率不整、血栓等，嚴重者甚至會危害到病患之生命。

根據臨床統計資料，藥物所造成之心臟毒性之發生率約為5~20%，並且大多數患者都是於接受疾病治療一段時間後，才產生心臟相關併發症，意即患者被發現有心臟疾病之時間過晚，影響到介入時間，對於患者產生永久性或不可逆之心臟損傷；而若要降低藥物之心臟毒性，目前臨床上所採取之作法係為降低藥物使用劑量，惟，此種作法會使藥物療效降低，將會影響到患者治癒率及生存率。

本發明之主要目的係在於提供蓮蓬萃取物之第二用途，其係能夠有效地保護心肌細胞，使心肌細胞免於受到藥物作用或藥物毒性之影響而損傷，達到預防或治療心臟損傷之功效。

緣是，為能達成上述目的，本發明係揭露一種將蓮蓬萃取物用於製造治療或預防心臟損傷之組合物之用途，意即透過投予一有效量之蓮蓬萃取物至一個體，能夠保護該個體之心肌細胞，達到預防或改善因心肌細胞損傷或心肌細胞凋亡所造成之疾病。

其中，該心臟損傷係由藥物作用所引起者，如化療藥物。

其中，該蓮蓬萃取物係將一蓮蓬進行高溫萃取後所得者，具體來說，該蓮蓬萃取物中係含有大量槲皮素3-O-葡糖苷酸，並且幾乎不具有兒茶素。

於本發明之另一實施例中，本發明係揭露一種將蓮蓬萃取物用於製造治療或預防化療藥物引發心臟疾病之組合物之用途。

其中，該化療藥物係為藥物Cisplatin。

圖1係為本發明所揭蓮蓬萃取物未經SPE處理後直接進行HPLC/ESI-MS-MS之結果。

圖2係為本發明所揭蓮蓬萃取物經SPE處理後進行HPLC/ESI-MS-MS之結果。

圖3係為圖2之下方圖示比對文獻後之結果。

圖4A係為各組細胞經Annexin V/PI染色，並透過流式細胞儀分析細胞凋亡之結果。

圖4B係為量化圖4A之結果，其中，Y軸之數值為各組凋亡細胞數除以總細胞數之結果。

圖5A係為各組細胞經DAPI染色之結果。

圖5B係為量化圖5A之結果，其中，Y軸之數值為各組以DAPI螢光拍攝凋亡細胞數除以總細胞數之結果。

圖6A係為分析各組細胞心肌細胞凋亡蛋白酶活性之結果。

圖6B係為量化圖6A之結果，其中，Y軸之數值為總凋亡細胞之百分比。

圖7係為各組小鼠心臟組織切片經H&E染色觀察之結果。

圖8A係為各組小鼠心臟組織切片經TUNEL染色觀察之結果。

圖8B係為量化圖8A之結果。

本發明所揭蓮蓬萃取物，係指將一蓮蓬經萃取、分離、純化所得之混合物；並且，具體來說，本發明所揭蓮蓬萃取物經分析後可知，其成份中幾乎不含有沒食子兒茶素，而含有高量之槲皮素3-O-葡糖苷酸。

本發明所揭「有效量」，係指欲使一組合物產生所求特定效果所需化合物或活性成份之量，得以其在組合物中所佔重量百分比表示。而該有效量會因為投予途徑而有所不同。一般來說，該有效量係指活性成分或化合物於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%。

以下，為能更進一步說明本發明及其功效，將茲舉若干實例並搭配圖式做詳細說明如後。

以下實例中所使用之順鉑(cisplatin,CDDP)為ACROS公司所製造，貨號：A0364307，純度

99.9%，分子量300.046g/mol。而所使用之順鉑溶液係將計算所得之順鉑(mg)溶於適當體積之去離子水中所得者，舉例來說，配置1mM順鉑溶液，則取0.3mg順鉑粉末溶於1ml之去離子水中。

實例一：製備蓮蓬萃取物

秤取150g的乾燥蓮蓬並加入6L的去離子水，100℃煮沸後悶煮3小時，再開鍋蓋煮1小時，冷卻後再進行過濾，將過濾好的蓮蓬汁以減壓濃縮機將90%水分抽出，得到膏狀的產物後再放入真空高溫熱風乾燥機將其乾燥後製成粉狀，此即為本發明所揭蓮蓬萃取物。

更進一步以Waters Symmetry分析管柱(2.1×150mm,3.5μm,Waters Corp.,Milford,MA,USA)以及C18管柱(Security-Guard Ultra C18 guard column,2.1mm×2.0mm,sub-2μm,Phenomenex,Inc.,Torrance,CA,USA)，並搭配具有光電二極管陣列探測器之HPLC系統，對本發明所揭蓮蓬萃取物進行HPLC/ESI-MS-MS分析，分析結果如圖1所示。

取本發明所揭蓮蓬萃取物5mg，溶於1ml、20%甲醇，過濾後，進行HPLC/ESI-MS-MS分析，分析條件如下：溶劑A：含有0.1%甲酸的水；溶劑B：含有0.1%甲酸的乙腈；流速：0.3mL/min；管柱溫度：35℃；5分鐘：5%B溶劑、15-40分鐘：5-35%B溶劑、15-40分鐘：35-60%B溶劑、40-45分鐘：60-95%B溶劑、最後10分鐘：95%B溶劑；以光電二極管陣列探測器於210~600nm內掃描，並監測於254、280、325、375nm之吸收光譜。

另以SPE(HLB)處理本發明所揭蓮蓬萃取物後，再以30%甲醇洗脫後進行HPLC/ESI-MS-MS分析，分析條件及環境如上所述，結果如圖2所示。

由圖1至圖3之結果可知，本發明所揭蓮蓬萃取物於滯留時間18~19分鐘時，偵測到含有大量槲皮素3-O-葡糖苷酸，並且幾乎不具有兒茶素。

實例二：細胞實驗(一)

取H9c2細胞，分為五組，將細胞種於6公分培養盤中，每盤1.5×10⁵顆細胞，進行培養，其中：

第一組係為空白組，未給予本發明所揭蓮蓬萃取物及藥物cisplatin。

第二組係為藥物組，於細胞生長至六分滿時投予藥物cisplatin。

第三組係為低劑量實驗組，預先投予本發明所揭蓮蓬萃取物(2.5μg/ml))進行培養，至於細胞生長至六分滿時再投予藥物cisplatin。

第四組係為高劑量實驗組，預先投予本發明所揭蓮蓬萃取物(5μg/ml))進行培養，至於細胞生長至六分滿時再投予藥物cisplatin。

第五組係為蓮蓬萃取物組，加入本發明所揭蓮蓬萃取物(5μg/ml))進行培養。

細胞於添加藥物cisplatin滿48小時後，收集細胞，再以DMEM回溶，避光加入100μl Annexin V染劑染色，並置室溫反映20分鐘，透過流式細胞儀進行分析得到凋亡百分比，結果如圖4A及圖4B所示。

由圖4A及圖4B之結果可知，藥物cisplatin確實會增加心肌細胞凋亡，造成心臟損傷，而預先投予本發明所揭蓮蓬萃取物，係能夠有效地減少心肌細胞凋亡之數量，意即能夠保護心臟免受於藥物所造成之損傷，有效地達到預防及/或治療心臟疾病之功效。

實例三：細胞實驗(二)

本實例中之細胞處理方式如實例二所述，不同者在於，細胞於添加藥物cisplatin滿48小時後，用4%福馬林固定細胞，放置培養箱30分鐘。固定好後將細胞洗潤並加入DAPI染劑(stock：1mg/ml，用磷酸鹽緩衝液稀釋成1μg/ml)，避光染色15分鐘，以磷酸鹽緩衝液將染劑洗淨，再以螢光觀察並拍攝染色結果，最後以Image J進行DAPI-positive計數與量化，結果如圖5A及圖5B所示。

由圖5A及圖5B之結果可知，於第二組細胞中之藍色螢光亮點比例最高，顯示其細胞凋亡之程度較其他組明顯；而相較於第二組細胞來說，投予本發明所揭蓮蓬萃取物之細胞，其細胞凋亡數量較少。由此結果可知，藥物cisplatin確實會造成心肌細胞損傷，而預先投予本發明所揭蓮蓬萃取物，係能夠保護心肌細胞而不會受到藥物cisplatin之影響，意即本發明所揭蓮蓬萃取物確實能夠達到預防或治療藥物所造成之心臟疾病。

實例四：分析H9c2心肌細胞凋亡蛋白酶活性

本實例中之細胞處理方式如實例二所述，收集加藥滿48小時後之細胞，取50μl之細胞液，透過商業套組(MuseTM MultiCaspase Kit)分析各組細胞之心肌細胞凋亡蛋白酶活性，結果如圖6A及圖6B所示。

由圖6A及圖6B之結果可知，相較於第一組來說，第二組細胞中之細胞凋亡蛋白酶的活性明顯上升；而相較於第二組來說，第三組及第四組細胞之細胞凋亡蛋白酶則明顯下降。

由上述結果顯示，藥物cisplatin確實會造成心肌細胞損傷，並造成心肌細胞走向凋亡，而提高罹患心臟疾病之風險；預先投予本發明所揭蓮蓬萃取物能夠降低細胞凋亡蛋白酶之活性，使心肌細胞不會走向凋亡，意即可有效降低藥物cisplatin所導致之細胞凋亡。藉此可知，本發明所揭蓮蓬萃取物確實能夠達到預防或改善藥物所造成之心臟損傷，降低罹患心臟疾病之風險。

實例五：動物試驗

由樂斯科生物科技動物中心購入28隻週齡6週大之雄性BALBc裸鼠，分別依據下列條件進行飼養：

第一組係為空白組，未投予本發明所揭蓮蓬萃取物及藥物cisplatin。

第二組係為藥物組，以腹腔注射藥物cisplatin，劑量為5mg/kg BW，每週一次，共4週。

第三組係為實驗組，先給予1%本發明蓮蓬萃取物3週，再以腹腔注射cisplatin，劑量為5mg/kg BW，每週一次，共4週，並且於注射期間持續給予1%本發明蓮蓬萃取物。

第四組為蓮蓬萃取物組，於飼料中添加1%本發明蓮蓬萃取物，未投予藥物cisplatin。

於實驗結果後犧牲各組小鼠，並進行後續實例之分析。

實例六：H & E染色分析

取實例五中各組小鼠之心臟組織，進行石蠟包埋切片後，以蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin stain；H&E)，分別以倍率200X及400X觀察染色結果，結果如圖7所示。

由圖7之結果可知，第二組小鼠之心肌細胞排列較為鬆散，心臟結構較多空洞存在，顯示藥物cisplatin會使心臟受損；而第三組小鼠之心肌細胞排列較為緊密並且維持細胞外型之完整，整體來說，心臟結構未存在空洞情形。

由此結果可知，藉由預先投予本發明所揭蓮蓬萃取物，係能夠保護個體心肌細胞，使之不受藥物之影響而破壞結構，並且，若於投予藥物之同時也投予本發明所揭蓮蓬萃取物，亦可以發揮治療或改善藥物對於心臟所造成之不良影響；換言之，本發明所揭蓮蓬萃取物係能夠有效地改善或治療心臟損傷。

實例七：TUNEL染色分析

取實例五中各組小鼠之心臟組織，進行石蠟包埋切片後，以市售商業套組(Apo-BrdU-IHCTM In Situ DNA Fragmentation Assay Kit)進行TUNEL(Terminal deoxynucleotide transferase Dutp Nick End Labeling)染色，分別以倍率200X及400X觀察染色結果，並進行量化，結果如圖8A及圖8B所示。

由圖8A及圖8B之結果可知，第二組小鼠心臟組織中具有較為明顯及較高比例之褐色區域，顯示藥物cisplatin造成細胞凋亡之百分比較第一組明顯提升；而相較於第二組小鼠，第三組小鼠心臟組織中之褐色區域明顯下降，顯示第三組小鼠心臟組織中細胞凋亡之比率較第二組小鼠低。

由此可知，透過預先投予本發明所揭蓮蓬萃取物，係能夠保護個體之心臟，改善或避免心肌細胞受到藥物影響而損傷，進而達到預防或治療心臟疾病之功效，並且能夠降低罹患心臟疾病之風險。

Claims

一種將富含槲皮素3-O-葡糖苷酸之蓮蓬萃取物用於製造治療或預防心臟疾病之組合物之用途，其中：該心臟疾病係由一化療藥物引起者；該富含槲皮素3-O-葡糖苷酸之蓮蓬萃取物係由一乾燥蓮蓬以100℃熱水進行萃取並進行過濾，再將濾液進行減壓濃縮後所得者。
如請求項1所述用途，其中，該富含槲皮素3-O-葡糖苷酸之蓮蓬萃取物係幾乎不含有兒茶素。
如請求項1所述用途，其中，該化療藥物係為藥物Cisplatin。