TWI748646B - 殺菌劑及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種殺菌劑及殺菌方法，其中殺菌劑係包含化學式I所示之化合物：

其中，Ar₁及Ar₂係各自獨立為經取代基取代或未經取代的苯基、萘基、噻吩基、呋喃基或吡啶基，且Ar₁及Ar₂係為相同或不同；該取代基係選自由鹵素、羥基、烷基及烷氧基所組成的群組；當Ar₁及Ar₂係各自獨立為經二該取代基取代的苯基時，Ar₁及Ar₂係為不同。

Description

殺菌劑及其用途

本發明是有關於殺菌劑及殺菌方法。

薑黃素(curcumin)是一種從薑黃(turmeric)中提取得到的黃色色素，為薑黃中最主要的薑黃色素，約占薑黃色素的70%。除了薑黃素之外，類薑黃素(curcuminoids)為薑黃植物中的成分之一，主要包括去甲氧基薑黃素(約10~20%)、去二甲氧基薑黃素(約10%)和六氫薑黃素等。

薑黃素因對人體具有良好的作用而被應用在醫療及保健食品上。有許多的研究指出薑黃素具有抗發炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗肥胖以及預防慢性疾病等各種臨床醫療功效，因此近年來已有許多薑黃素的保健食品於市面上販售。另外薑黃素也可做為良好的光敏劑，其吸收波長範圍為210~510nm，涵蓋了紫外光與可見光的藍光的部分，經由特定波長照射後會產生自由基，可造成抗藥性細菌失去活性與抗腫瘤細胞的作用。除此之外，薑黃素在傷口上可增強上 皮再生以及增加成纖維細胞生長與血管密度，增加傷口癒合的速度以及透過活化Akt/GSK3β、ERK或p38MAPK訊號傳導途徑抑制人體黑色素細胞中的黑色素生成。根據JECFA(聯合國和世界衛生組織聯合食品添加劑專家委員會)和EFSA(歐洲食品安全局)的報告，薑黃素的每日允許攝入量(ADI)為0~3mg/體重kg。

本發明的目的在於進一步提供一種相較於薑黃素能更有效提升殺菌效果的化合物，並將其有效應用於殺菌劑上。

本發明提供一種殺菌劑，其係包含化學式I所示之化合物：

其中，Ar₁及Ar₂係各自獨立為經取代基取代或未經取代的苯基、萘基、噻吩基、呋喃基或吡啶基，且Ar₁及Ar₂係為相同或不同；該取代基係選自由鹵素、羥基、烷基及烷氧基所組成的群組；當Ar₁及Ar₂係各自獨立為經二該取代基取代的苯基時，Ar₁及Ar₂係為不同。

較佳地，化學式I所示之化合物係選自下列化合物1至化合物11中的至少之一：

較佳地，殺菌劑可殺害及/或抑制的菌種包含需氧菌。

較佳地，殺菌劑可殺害及/或抑制的菌種包含革蘭氏陽性菌。

較佳地，革蘭氏陽性菌包含表皮葡萄球菌或金黃色葡萄球菌。

較佳地，化學式I所示之化合物的濃度為係為0.5ppm~1ppm。

本發明還提供一種殺菌之方法，其包含：將上述化學式I所示之化合物與菌種接觸；以及對該化合物施予波長為410~510nm(λ_max=462nm)之光源照射。

本發明之殺菌劑及殺菌方法至少具有下述優點之其一：

1、本發明所使用於殺菌的化合全部係人工合成，純度高，相較於天然的薑黃素內有三種混合物，具有更佳的殺菌效果。

2、雖然已知薑黃素及其衍生物具有殺菌效果，但並非對任何菌種均必然有效。本發明所使用的類薑黃素對於需氧性的菌種有相當高的殺菌能力。

此處所說明的圖式用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，但並不構成對本申請的不當限定。圖式中：第1圖為薑黃素或類薑黃素對表皮葡萄球菌的殺菌效果。

第2圖為化合物8經藍光照射前和照射後，對表皮葡萄球菌結構影響之SEM圖，其中(a)為照射前、(b)為照射1分鐘後及(c)為照射5分鐘後。

第3圖為類薑黃素之穩定度測試結果圖，其中(a)為化合物1、(b)化合物8、及(c)為化合物9。

為使本申請的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將參照相關圖式並結合實施例對本發明之技術方案進行清楚、完整地描述，其中所描述的實施例僅是本申請一部分，而不是全部的實施例。

除非特別定義，否則所有於此所用的技術及科學名詞均與本領域技術人員所通常理解的意義相同。若于本文中所用定義與其他公開文獻中所載定義有所矛盾或不一致，則應以此處所用的定義為准。

如本文中所用者，術語「含」、「包含」、「含有」、「具有」或其任何其他變型，是意欲涵蓋非排他性的涵括。

數值或參數給出了範圍、較佳範圍或上限選值與下限選值之列舉時，應將其理解為特定公開由任何範圍上限或較佳值與任何範圍下限或較佳值之任何配對所形成之所有範圍，無論該些範圍是否分別公開。例如，當敘述一個範圍為「1至5」時，所敘述之範圍應被理解為包含範圍「1至4」、「1至3」、「1至2」、「1至2與4至5」、「1至3與5」等等。若本說明書中敘述一個數值範圍，則除非另有說明，該範圍意欲包含其端點以及該範圍內的所有整數和小數。

此外，除非另有明確說明，「或」意指包含性的「或」而非指排除性的「或」。例如，條件A「或」B滿足於下述情況之任何一種：A成立(或存在)且B不成立(或不存在)、A不成立(或不存在)且B成立(或存在)、以及A和B兩者皆成立(或存在)。

同樣地，除非上下文明確說明，否則位於本文的元素或成份之前的不定冠詞「一」、「一個」及「一種」旨在非限制性地說明所述元素或成份的 實例數目(即出現數)。因此，「一」、「一個」及「一種」應理解為包含一個或至少一個，且所述元素或成分的單數詞形也包含複數形式。

本文中所使用的「殺菌」一詞，意指具有殺害、消滅或破壞菌種、降低菌種數量以及/或抑制菌種增生的能力。

在一實施例中，本發明提供一種殺菌劑，其係包含化學式I所示之化合物：

其中，Ar₁及Ar₂係各自獨立為經取代基取代或未經取代的苯基、萘基、噻吩基、呋喃基或吡啶基，且Ar₁及Ar₂係為相同或不同；該取代基係選自由鹵素、羥基、烷基及烷氧基所組成的群組；當Ar₁及Ar₂係各自獨立為經二該取代基取代的苯基時，Ar₁及Ar₂係為不同。

實例

實例中，使用了17種合成之類薑黃素與作為比較例之薑黃素(Curcumin I)進行實驗比較，其結構係分別如下所示：

實驗方法

菌株培養

菌種1：由-80℃冰箱中取出表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis TCU-1 BCRC 81267)，以接種環沾取菌液，於LB培養基上畫三區，於37℃培養箱中12小時，次日以接種環取出盤上的一個菌落於10ml的LB培養基中培養於37℃培養箱中12小時，測吸光度OD600nm=1後，菌數量濃度約為10⁹CFU/ml，以2000 xg進行離心10分鐘，去除上清液。

菌種2：由-80℃冰箱中取出金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus TCU-2 BCRC81268)，以接種環沾取菌液，於LB培養基上畫三區，於37℃培養箱中12小時，次日以接種環取出盤上的一個菌落於10ml的LB培養基中培養於37℃培養箱中12小時，測吸光度OD600nm=1後，菌數量濃度約為10⁹CFU/ml，以2000 xg進行離心10分鐘，去除上清液。

菌種3：由-80℃冰箱中取出大腸桿菌(Escherichia coli)，以接種環沾取菌液，於LB培養基上畫三區，於37℃培養箱中12小時，次日以接種環取出盤上的一個菌落於10ml的LB培養基中培養於37℃培養箱中12小時，測吸光度 OD 600nm=1後，菌數量濃度約為10⁹CFU/ml。此時再連續稀釋1000倍，吸取菌液200μl至新的離心管中，再加入800μl的LB培養基，此時菌數量約為5 x 10⁵CFU/ml，進行離心(2000 xg，10分鐘)。

藍光裝置與照射方式

LED T8燈管：光波長為410~510nm(λ_max=462nm)，瓦數最大值為5W。

將LED燈管架設於保麗龍製藍光裝置上，並與待照射之試管保持距離約5mm。

實驗流程

步驟1、實驗組與控制組之樣品配置

將上述17種合成之類薑黃素秤重1mg，溶解於0.5ml的DMSO溶劑中，作為100% DMSO 2000ppm的stock標準品。取出10μl的stock加入990μl的LB培養基中(稀釋100倍)，再從稀釋100倍的類薑黃素取出100μl加入於900μl的LB培養基中(稀釋1000倍)，最終再取稀釋1000倍的類薑黃素1ml加入1ml的LB培養基中，作為待反應試劑(2ml，最終共稀釋2000倍，即1ppm)，此係作為實驗組。此外，以添加薑黃素但同樣以LB培養基稀釋2000倍的DMSO作為比較組，且以未添加薑黃素或類薑黃素但同樣以LB培養基稀釋2000倍的DMSO作為控制組(control)。

步驟2、藍光誘導光敏劑殺菌

將最終稀釋好的類薑黃素2ml，分別取1ml加入兩管已去除上清液之離心下的菌體中，均勻混合後置於25毫升容量的試管中，一管放入藍光裝置中照光1分鐘(1min)，再進行點滴塗盤法。另一管，以未照光(dark)作為對照 組。比較組(即，添加薑黃素)及控制組(即，未添加薑黃素或類薑黃素)亦被配置有經照光1分鐘或未照光之二試管。

步驟3、點滴塗盤法

將上述反應完的樣品以LB培養基作為溶劑，序列稀釋至10E-7，於10E-4、10E-5、10E-6、10E-7分別取10μl滴於LB培養基中，培養於37℃12小時後，以10E-5作為菌的計數並拍照記錄結果。

步驟4、藍光及光敏劑之殺菌率計算

殺菌率={1-T_(CFU/ml)/C_(CFU/ml)}×100%

其中，T為經實驗組或比較組未照光(dark)或經照光1分鐘(1min)，或控制組經照光1分鐘(1min)的菌落數，C為控制組(即，無添加薑黃素或類薑黃素)未照光(dark)的菌落數。

實驗結果

第一部分：表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌

請參見第1圖，其係顯示上述17種合成之類薑黃素於無/有光動力作用(亦即，無藍光照射(dark)或有藍光照射1分鐘(1min))對表皮葡萄球菌的殺菌率，其中，殺菌率係以未添加薑黃素或類薑黃素(control)且未經藍光照射(dark)時的菌落數作為計算基礎，因此數值係為零。從第1圖中可發現，化合物1、化合物2、化合物5、化合物8和化合物9經照光1分鐘(樣品名稱分別為1(1min)、2(1min)、5(1min)、8(1min)和9(1min))，相較於其他化合物具有明顯較好的殺菌效果。

發明人進一步對殺菌效果最佳的此五種類薑黃素(分別為化合物1、化合物2、化合物5、化合物8和化合物9)，就其對表皮葡萄球菌和金黃色葡 萄球菌的影響再進行實驗三重複，其結果分別如表1和表2所示，可發現化合物1、化合物8及化合物9對於表皮葡萄球菌及金黃色葡萄球菌的殺菌效果均為最佳。其中，化合物8和化合物9不管對於表皮葡萄球菌或金黃色葡萄球菌均具有極佳的殺菌效果，殺菌率均可達99%以上。第2圖分別為化合物8經藍光(a)照射前、(b)照射後1分鐘和(c)照射後5分鐘後，對表皮葡萄球菌結構影響之SEM圖。可明顯看出，化合物8經照光後，對表皮葡萄球菌具有造成穿孔的殺傷力。

進一步地，承如上述的實驗方法進行殺菌測試，差異僅在於將化合物1、化合物8及化合物9的濃度下降至0.5ppm，所得的實驗結果如表3。可發現化合物8和化合物9即使降低濃度，仍有很好的殺菌效果。

表3、濃度0.5ppm之化合物1和化合物8和化合物9對於表皮葡萄球菌葡的影響

類薑黃素穩定度測試

將化合物1、化合物8及化合物9分別以DMSO配置為2000ppm的stock標準品，並將其存放於未經照光的室溫(25℃)環境中。待穩定度實驗測試時，將該些stock標準品再以DMSO稀釋100倍(即，濃度為20ppm)，並置放48小時後，肉眼可以觀察到化合物1的顏色略有改變，而化合物8與化合物9則無。分別取2μl於超微量分光光度計上測量各該化合物於220~750nm的吸光度。如第3圖之結果顯示，化合物8(最大吸收波長440nm)與化合物9(最大吸收波長426nm)在最大波長的吸光度下降約0.8%與1.3%(分別如圖(b)和(c)所示)，而化合物1(最大吸收波長426nm)在最大波長的吸光度則下降了約6.4%。因此，根據此結果，可發現化合物8和化合物9相較於化合物1具有更好的穩定性。

第二部分：大腸桿菌

對於表皮葡萄球菌或金黃色葡萄球菌均具有極佳殺菌效果的類薑黃素化合物8，進一步探討其對於大腸桿菌的影響。

方法一：將stock標準品稀釋2000倍且菌數量濃度約為10 ⁹ CFU/ml

如上述步驟1所載，將化合物8秤重1mg，溶解於0.5ml的DMSO溶劑中，作為100% DMSO 2000ppm的stock標準品，再藉由LB培養基稀釋2000倍作為待反應試劑(1ppm)。此外，大腸桿菌的培養則如上述菌種培養之菌種3所載，經測得吸光度OD 600nm=1後，以2000 xg進行離心10分鐘，去除上清液，取得菌數量濃度約為10⁹CFU/ml。控制組除未添加化合物8外，其他條件均與實驗組相 同，且後續實驗流程同上述步驟2至4。其實驗結果如表4所示，於此條件下，化合物8對於大腸桿菌的殺菌效果係為有限。

方法二：將stock標準品稀釋1000倍且菌數量濃度約為10 ⁹ CFU/ml

如上述步驟1所載，將化合物8秤重1mg，溶解於0.5ml的DMSO溶劑中，作為100% DMSO 200ppm的stock標準品，再藉由LB培養基稀釋1000倍作為待反應試劑。此外，大腸桿菌的培養則如上述菌種培養之菌種3所載，經測得吸光度OD 600nm=1後，以2000 xg進行離心10分鐘，去除上清液，取得菌數量濃度約為10⁹CFU/ml。控制組除未添加化合物8外，其他條件均與實驗組相同，且後續實驗流程同上述步驟2至4。相較於方法一，方法二係進一步提高類薑黃素化合物8的濃度至2ppm，其實驗結果如表5所示。於此條件下，化合物8對於大腸桿菌的殺菌效果稍加提升。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本創作之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims (6)

1. 一種殺菌劑，其係使用於革蘭氏陽性菌，且包含化學式I所示之化合物：

   

   其中該化學式I所示之化合物係選自下列化合物1至化合物11中的至少之一：

   

   
2. 如請求項1項所述之殺菌劑，其中該革蘭氏陽性菌包含表皮葡萄球菌或金黃色葡萄球菌。
3. 如請求項1所述之殺菌劑，其中該化學式I所示之化合物的濃度為0.5ppm~1ppm。
4. 一種殺菌劑用於製造殺菌的藥物之用途，其包含：將化學式I所示之化合物與革蘭氏陽性菌接觸；以及對該化合物施予藍光範圍波長之光源照射；

   

   其中該化學式I所示之化合物係選自下列化合物1至化合物11中的至少之一：

   
5. 如請求項4所述之用途，其中該革蘭氏陽性菌包含表皮葡萄球菌或金黃色葡萄球菌。
6. 如請求項4所述之用途，其中該化學式I所示之化合物的濃度為係為0.5ppm~1ppm。

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