CN113261642A - 冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品防腐保鲜领域，具体公开了一种冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用，抑菌实验发现冬凌草甲素除了能高效的抑制副溶血弧菌外还能抑制金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、霉菌和假单胞菌等多种微生物。本发明中的冬凌草甲素抑菌剂能够抑制多种致食品腐败的微生物，具有作为食品防腐剂的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及食品防腐保鲜领域，具体涉及冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用。
背景技术
食品防腐剂是能防止由微生物引起的腐败变质、延长食品保质期的添加剂。因兼有防止微生物繁殖引起食物中毒的作用，又称抗微生物剂。它的主要作用是抑制食品中微生物的繁殖。
现有的的防腐剂种类少，尤其是食品领域的防腐剂要求高，因此寻找到一种有效抑菌的具有食品防腐应用潜力的物质意义重大；
冬凌草甲素又称冬凌草素、延命草宁，是从唇形科香茶菜属植物冬凌草的叶子中提取出的一种贝壳杉烯二萜类化合物,具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血及较好的抗肿瘤活性作用，现已发现其对肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种细胞株均有抑制作用。其目前主要应用于癌症的治疗，杀虫清热解毒、消炎止痛、健胃活血的作用，主要作为药物用于人体疾病的治疗，因此，本发明提供一种新的用途。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用。
进一步地，所述冬凌草甲素用于制备抑制副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、霉菌和假单胞菌的食品防腐保鲜剂。
进一步地，所述冬凌草甲素对副溶血弧菌的最小抑菌浓度为25μg/ml。
进一步地，所述冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为150μg/ml。
进一步地，所述冬凌草甲素对霉菌的最小抑菌浓度为300μg/ml。
进一步地，所述冬凌草甲素对假单胞菌的最小抑菌浓度为50μg/ml。
本发明还提供了所述的食品防腐保鲜剂的制备方法，包括如下步骤：
S1，将月桂酸和琥珀酸酐按照质量比1:4-6混合，于85-200℃温度下处理1.5-3小时，获得除味剂；
S2，将冬凌草甲素、a-淀粉、玉米淀粉、乳糖和除味剂按照质量比1:5:24:36:7-9混合均匀后获得食品防腐保鲜剂。
本发明还提供了上述制备方法制备获得的食品防腐保鲜剂。
进一步地，所述食品防腐保鲜剂能够用于食品的防腐和保鲜。
进一步地，所述食品包括但不限于肉类、面食、奶制品和膨化食品。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明研究发现冬凌草甲素对副溶血弧菌具有较强的抑制力，且冬凌草甲素对副溶血性弧菌的MIC为25μg/mL，MBC为50μg/mL；
冬凌草甲素还对金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、霉菌和假单胞菌均具有较强的抑制能力，说明冬凌草甲素是制备食品防腐剂的潜在原料。
2、本发明制备得到了一种还含有冬凌草甲素的食品防腐保鲜剂，通过月桂酸和琥珀酸酐按一定比例混合处理制备获得了除味剂，除味剂有效的去除了冬凌草甲素的苦味，使其能够直接用于制备食品食品防腐保鲜剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中实施例1中的冬凌草甲素处理24h后对副溶血性弧菌的抑菌活性；
图2为本发明中实施例1中的不同浓度冬凌草甲素处理副溶血性弧菌后菌浑浊度对比图；
图3为本发明实施例1中96孔板中取冬凌草甲素浓度为25μg/mL和50μg/mL处理24h后的菌液进行梯度稀释滴板后的结果图；
图4为本发明实施例1中不同浓度冬凌草甲素(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)对副溶血弧菌生长的影响；
图5为本发明实施例1中在不同浓度冬凌草甲素处理后副溶血弧菌扫描电镜观察超微结构图；
其中，图5a为未经处理的副溶血弧菌的扫描电镜观察超微结构图；
图5b为DMSO处理副溶血性弧菌24h的副溶血弧菌的扫描电镜观察超微结构图；
图5c为25μg/mL oronidin处理副溶血性弧菌24h的副溶血弧菌的扫描电镜观察超微结构图；
图5d为50μg/mL oronidin处理副溶血性弧菌24h的副溶血弧菌的扫描电镜观察超微结构图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
一、冬凌草甲素对副溶血性弧菌的抑菌作用
1、材料来源
(1)副溶血弧菌RIMD2210633由美国康涅狄格大学周晓辉老师友情赠送；
(2)冬凌草甲素(Oridonin，>98％,MW:149.2129,CAS：28957-04-2)，购自北京索莱宝科技有限公司。
2、抗菌活性评价
(1)最小抑菌浓度测定
将冬凌草甲素溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，经有机系膜膜过滤后稀释到合适浓度，取制备的菌悬液200μl/孔于96孔板中，加入冬凌草甲素使其终浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL，37℃、150r/min摇床培养24h后测定600nm处吸光值，每个浓度梯度组设3个平行，取平均值。以添加等量溶剂DMSO及无菌3％NaCl的LB培养基为对照组。
(2)生长的测定
冬凌草甲素对副溶血弧菌的杀菌曲线通过比浊法进行测定。
具体方法为，挑取单克隆过夜培养后按照1：50的比例进行转接培养至OD600值至0.6～0.8，取1mL菌悬液4000rpm，离心5min，添加对应OD600值毫升数的新鲜培养基后稀释100倍进行分装，然后分别添加冬凌草甲素至浓度为12.5μg/mL、25μg/mL、和50μg/mL，进行24h内OD600值的测定。
(3)冬凌草甲素的抑菌机理研究
使用扫描电镜进行细菌表面形态的观察。具体的处理方法是：将副溶血弧菌接种于无菌3％NaCl的LB培养基中，37℃、150r/min摇床培养过夜，然后按照过夜菌悬液：培养基＝1：50的比例进行转接，37℃、150r/min培养至OD600值为0.6～0.8，取适量菌液稀释100倍后分装到50mL离心管中，加入对应浓度的冬凌草甲素-DMSO溶液，使冬凌草甲素工作浓度为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL即1/2MIC、MIC和2MIC，并用添加相同体积的DMSO作为溶剂对照组37℃、150r/min培养24h后进行样品的收集和制样。4℃，4000rpm离心5min,PBS洗涤3次；用2.5％戊二醛溶液均匀重悬，然后在4℃静置2小时以上；接下来,离心并用PBS洗脱残存的戊二醛，最后将菌体用三个浓度梯度的酒精脱水：30％,50％和70％,浓度依次从低到高，最后，将悬浮在70％酒精中的细菌液体滴在用75％酒精浸泡一夜的小圆玻片上。干燥后，喷金，用扫描电镜观察细菌表面形态。
(4)验证冬凌草甲素对其他致腐微生物的抑制能力
选择常见的食品防腐剂Dowicil 200和苯甲酸钠作为对照组，选择常见的容易致食品腐败的微生物金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、霉菌和假单胞菌进行抑菌研究，检测冬凌草甲素对上述微生物的最小抑菌浓度(MIC)。
3、实验结果
(1)检测冬凌草甲素对副溶血弧菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
结果如图1所示，随着冬凌草甲素浓度的增加，菌液的OD600值表现出明显的下降趋势，OD600值最低时的冬凌草甲素浓度是50μg/mL，并与药物浓度增加到100μg/mL时的OD600值基本相同，不再降低；
如图2所示，随着冬凌草甲素浓度的增加，菌液呈现出明显逐渐清澈的趋势，当冬凌草甲素浓度为25μg/mL时，出现明显的清澈，冬凌草甲素浓度为50μg/mL和100μg/mL时，菌液呈现明显的无菌体生长的清澈度。
如图3所示，当冬凌草甲素浓度为25μg/mL时，与未处理组相比菌落生长量呈现1个稀释度的差异，基本认为该药物在该浓度下的杀菌率为90％；当浓度为50μg/mL时，与对照组相比，菌落生长呈3个稀释度的差异，基本认为该浓度下的杀菌率为99.9％。据此，冬凌草甲素对副溶血性弧菌的MIC为25μg/mL，MBC为50μg/mL，说明冬凌草甲素在低浓度下对副溶血性弧菌具有良好的抑制作用。
(2)生长曲线
不同浓度冬凌草甲素下副溶血弧菌的生长曲线如图4所示，在12.5μg/mL浓度下，冬凌草甲素对副溶血弧菌的生长没有抑制作用；在25μg/mL浓度下，冬凌草甲素对副溶血弧菌有抑制活性。
将菌液24h内的的OD600值进行汇总，结果如图4所示，当药物浓度为12.5μg/mL时，菌液浓度略低于未处理组，但生长趋势即OD600值增长趋势基本一致，说明药物浓度对细菌的生长没有影响；当药物浓度为25μg/mL时，与未处理组相比，前10h表现出较强的抑制作用，OD600值没有增长，10h后迅速恢复到与未处理组相同的生长趋势，15h时赶超低浓度处理组；在50μg/mL浓度下，与未处理组相比，抑制作用自始至终表现为明显，24小时内没有生长，说明副溶血弧菌被彻底杀灭。
(3)扫描电镜分析
结晶紫染色结果如图5所示，OD590值随着药物浓度的增加而降低。当药物浓度小于50μg/mL时，OD590值最小，96孔板颜色有变浅的趋势。当药物浓度小于50μg/mL时，颜色与LB培养基颜色基本一致。结果表明，冬凌草甲素对细菌生物膜的形成有较大的影响。结合副溶血弧菌生长过程中生物膜及其生长繁殖的影响，认为冬凌草甲素可能通过影响生物膜的形成来影响副溶血性弧菌的生长繁殖。
(4)冬凌草甲素对其他微生物的MIC值
表1冬凌草甲素与不同防腐剂的MIC值
由表1可以看到，冬凌草甲素不仅仅能够抑制副溶血弧菌，还能对其之外的其他导致食品腐败的多种微生物(包括金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、霉菌和假单胞菌等)均有较好的抑制作用，说明本发明中的冬凌草甲素具有用于制备食品防腐剂的潜力。
实施例2
实施例2提供一种含有冬凌草甲素的食品防腐保鲜剂的制备方法，包括如下步骤：
S1，除味剂制备：将月桂酸和琥珀酸酐按照质量比1:5混合，于150℃温度下处理2小时，获得除味剂。
S2，称取冬凌草甲素1g，a-淀粉5g，玉米淀粉24g，乳糖36g，除味剂8g，混合均匀后获得含有冬凌草甲素的食品防腐保鲜剂。
实施例3
实施例3提供一种含有冬凌草甲素的食品防腐保鲜剂的制备方法，与实施例2基本相同，区别在于：
S1中，月桂酸和琥珀酸酐按照质量比为1:4，处理温度为85℃，处理时间为3小时；
S2中，称取冬凌草甲素1g，a-淀粉5g，玉米淀粉24g，乳糖36g，除味剂7g。
实施例4
实施例4提供一种含有冬凌草甲素的食品防腐保鲜剂的制备方法，与实施例2基本相同，区别在于：
S1中，月桂酸和琥珀酸酐按照质量比为1:6，处理温度为200℃，处理时间为1.5小时；
S2中，称取冬凌草甲素1g，a-淀粉5g，玉米淀粉24g，乳糖36g，除味剂9g。
上述实施例2-4制备获得的食品防腐保鲜剂通过苦味检测发现其中冬凌草甲素的苦味大大降低，能够用于食品的防腐和保鲜领域。
本发明首先研究了冬凌草甲素的抑菌活性，发现冬凌草甲素对多种导致食品腐败的微生物均为抑制作用，且抑制效果较好，然后利用S1中制备得到的除味剂消除冬凌草甲素的苦味，使其能够用于食品防腐中，然后再通过S2制备获得冬凌草甲素防腐剂，用于食品的防腐。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用。
2.如权利要求1所述冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用，其特征在于，所述冬凌草甲素用于制备抑制副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、霉菌和假单胞菌的食品防腐保鲜剂。
3.如权利要求2所述冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用，其特征在于，所述冬凌草甲素对副溶血弧菌的最小抑菌浓度为25μg/ml。
4.如权利要求2所述冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用，其特征在于，所述冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为150μg/ml。
5.如权利要求2所述冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用，其特征在于，所述冬凌草甲素对霉菌的最小抑菌浓度为300μg/ml。
6.如权利要求2所述冬凌草甲素在制备食品防腐保鲜剂中的应用，其特征在于，所述冬凌草甲素对假单胞菌的最小抑菌浓度为50μg/ml。
7.权利要求2所述的食品防腐保鲜剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将月桂酸和琥珀酸酐按照质量比1:4-6混合，于85-200℃温度下处理1.5-3小时，获得除味剂；
S2，将冬凌草甲素、a-淀粉、玉米淀粉、乳糖和除味剂按照质量比1:5:24:36:7-9混合均匀后获得食品防腐保鲜剂。
8.由权利要求7所述的制备方法制备获得的食品防腐保鲜剂。
9.如权利要求8所述的食品防腐保鲜剂，其特征在于，所述食品防腐保鲜剂能够用于食品的防腐和保鲜。
10.如权利要求9所述的食品防腐保鲜剂，其特征在于，所述食品包括但不限于肉类、面食、奶制品和膨化食品。
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| CN115669844A (zh) * | 2022-11-09 | 2023-02-03 | 河北同福健康产业有限公司 | 一种抗老化面食保鲜剂、其制备方法及应用 |
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| CN1140091A (zh) * | 1995-03-15 | 1997-01-15 | 花王株式会社 | 苦味消除剂 |
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