TWI745323B - 脂化之肺炎鏈球菌抗原組合物、製備方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供用於預防或治療肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae ，SP )相關疾病的組合物及方法。更具體而言，提供包含肺炎球菌表面抗原A (PsaA)之重組型脂化融合蛋白質，該等重組型脂化融合蛋白質自N端至C端包含PsaA之N端原生脂質信號肽及PsaA之C端結構基因。亦描述誘發針對SP之廣譜黏膜免疫的方法，該方法包括投與包含重組型脂化融合蛋白質之疫苗。

Description

脂化之肺炎鏈球菌抗原組合物、製備方法及用途
本發明提供用於預防或治療肺炎鏈球菌感染之組合物及方法。更具體而言，本發明係關於脂化之肺炎鏈球菌抗原、其製備方法及其作為針對肺炎鏈球菌相關疾病的疫苗之用途。
肺炎鏈球菌(SP)為引起兒童肺炎、腦膜炎及敗血症之主要細菌性病原體。全世界每年約1百萬兒童由於SP感染死亡(O'Brien，K.L.等人，Lancet 374：893-902，2009)。
目前特許之肺炎球菌疫苗專有地靶向SP之莢膜多醣(CPS)，且此等疫苗嚴格地提供血清型特異性保護。儘管已藉由肺炎球菌CPS蛋白質共軛物疫苗(PCV)克服CPS抗原之不良免疫原性，但保護仍為血清型特異性的且PCV之高成本減少疫苗接種覆蓋範圍。此外，藉由SP研究鼻咽定殖已展示可潛在引起疾病之非疫苗肺炎球菌血清型迅速佔據空的生態棲位。因此，從長遠來看，廣泛引入CPS及PCV可僅僅改變侵入性肺炎球菌疾病之血清型分佈，而不降低整體SP疾病負擔(綜述參見Kadioglu,A.等人，Nature Reviews Microbiology 6：288-301，2008)。
目前為止最有前景的方法為基於導致毒性且對所有血清型共用的肺 炎球菌抗原來研發疫苗。諸如PsaA之原生蛋白質抗原或其免疫原性片段可在投與宿主時刺激免疫反應，但此類抗原具有不良免疫原性且為不良黏膜免疫原。因為SP必須首先經由黏膜表面進入宿主以產生感染，所以除抗原特異性IgG反應外亦期望誘發黏膜免疫(例如，黏膜分泌性IgA抗體)。實際上已證實在不誘發Th1反應的情況下，CD4+ T細胞不足之小鼠不能清除鼻咽定殖。
需要誘發黏膜免疫之廣譜肺炎球菌疫苗。
大體而言，經修飾之蛋白質(諸如脂化蛋白質)比未經修飾之蛋白質更具有免疫原性。已藉由使用重組技術在大腸桿菌(E.coli)中表現來製備某些疫苗產品中之蛋白質，然而，一般認為大腸桿菌不適用於產生經修飾之蛋白質(尤其脂化蛋白質)，此係因為大腸桿菌細胞對脂化蛋白質之自然脂化不良且不產生脂化形式的非自然脂化蛋白質。
美國專利第7,833,776號揭示在大腸桿菌中產生含有自Ag473衍生之脂化序列及目標多肽的脂化融合蛋白質。揭示促進大腸桿菌中融合蛋白質的脂化的含有至少Ag473之N端40個殘基(D1)的脂化序列。亦描述產生脂化形式之融合蛋白質的方法。
美國專利第7,960,535號描述重組型脂化PsaA蛋白質及可表現此類脂化PsaA蛋白質的重組型構築體。描述藉由使用自伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)之ospA基因衍生的異源前導序列實現脂質化的脂化PsaA蛋白質，該前導序列在轉譯讀取範圍中與psaA結構性基因結合。本發明亦提供製備脂化PsaA蛋白質之方法及此類蛋白質在免疫組合物中的用途。亦提供包含免疫原性脂化PsaA蛋白質之疫苗及在預防與治療肺炎鏈球菌感染中使用此類疫苗之方法。
美國專利第6,538,118號描述在表現系統(諸如大腸桿菌)中以重組方式形成的異源脂化蛋白質。異源脂化蛋白質具有因脂化蛋白質之蛋白質部分而不自然存在的前導序列。脂化蛋白質可具有螺旋體屬OspA前導序列。蛋白質部分可為OspC、PspA、UreA、UreB或其片段。亦揭示並主張用於形成及運用該等蛋白質的方法及組合物。
美國專利第8,771,990號描述在大腸桿菌中產生重組型脂化多肽的方法。該方法包括提供適用於表現重組型脂化多肽之大腸桿菌宿主細胞；及在基本培養基中在允許表現呈脂化形式之多肽的條件下培養大腸桿菌宿主細胞。
本發明之目標為改良先前技術中所存在之至少一些缺陷。已基於發明人對於需要用於預防及/或治療肺炎鏈球菌(SP)感染及SP相關疾病的經改良組合物及方法的理解研發本發明技術之實施例。
本發明至少部分地基於發明人之發現：可使用其原生脂質信號肽在大腸桿菌中產生重組型脂化SP抗原。具體而言，與依賴於異源脂質信號肽在大腸桿菌中產生脂化SP抗原之已知疫苗相對比，本發明人已使用原生PsaA脂質信號肽在大腸桿菌中產生重組型脂化PsaA融合蛋白質(在本文中被稱作『rlipo-PsaA』)。此外，rlipo-PsaA誘發黏膜免疫反應且預防小鼠模型中之SP相關疾病。出人意料地，rlipo-PsaA展示均勻的脂質結構，亦即，僅表現單一形式之脂質修飾。在小鼠模型中誘發之免疫反應不為血清型特異性的，例如，其預防超過一個血清型之SP。此外，rlipo-PsaA誘發抵抗共同投與之原本本身為非免疫原性的非脂化SP抗原的黏膜免疫，表明rlipo-PsaA之較強黏膜輔助效應。
因此，在第一態樣中，提供包含肺炎球菌表面抗原A(PsaA)之重組型脂化融合蛋白質，其中該重組型脂化融合蛋白質自N端至C端包含PsaA之N端原生信號肽及PsaA之C端結構基因。
重組型脂化融合蛋白質在N端或C端可進一步包含標籤或可偵測標記。在一個實施例中，重組型脂化融合蛋白質包含在C端包含6個組胺酸殘基的胺基酸標籤。
在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質包含具有闡述於SEQ ID NO：5中之胺基酸序列(MKKLGTLLVLFLSAIILVAC)的原生PsaA脂質信號肽。在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質包含與闡述於SEQ ID NO：5中之胺基酸序列至少約80%至99%一致的脂質信號肽，例如，與闡述於SEQ ID NO：5中之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%一致。在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質包含脂質信號肽，該脂質信號肽包含PsaA之N端部分。在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質包含脂質信號肽，該脂質信號肽包含約15至40個胺基酸之最大長度。
在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質包含闡述於SEQ ID NO：1或7(rlipo-PsaA)中之胺基酸序列或其同系物、片段、類似物或變體。在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質包含與闡述於SEQ ID NO：1或7中之胺基酸序列至少約80%至99%一致的胺基酸序列。重組型脂化融合蛋白質可包含與闡述於SEQ ID NO：1或7中之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%一致的胺基酸序列。應理解，重組型脂化融合蛋白質可包含全長PsaA蛋白質或其免疫原性部分。亦涵蓋其功能上等效或生物活性的同系物、片段、類似物及/或變體。
在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質呈經分離或純化形式，例如，自產生其之表現系統分離。
使用重組型技術產生且可使用任何合適之表現系統產生重組型脂化融合蛋白。在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質在大腸桿菌中(例如，在提供高度蛋白質表現之菌株中，諸如(但不限於)C43(DE3)、(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)或C2014(DE3)(NCIMB 40884))表現，且視情況自其分離或純化。在一個實施例中，藉由表現包含具有闡述於SEQ ID NO：6中之核苷酸序列的DNA的載體來製備重組型脂化融合蛋白質。
在一些實施例中，本文所提供之重組型脂化融合蛋白質包含均勻的脂質結構，例如，藉由質譜分析觀測到單一主要峰。在實施例中，重組型脂化融合蛋白質具有展示於圖6D中之質譜分析頻譜。
在一些實施例中，本文提供之重組型脂化融合蛋白質能夠誘發個體之針對SP感染及SP相關疾病之免疫反應，包括黏膜免疫反應。黏膜免疫反應可包含個體中之Th1反應及/或分泌性IgA之產生。在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質能夠在無佐劑存在的情況下投與時誘發黏膜免疫反應。
在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質進一步能夠針對同時投與之一或多種非脂化肺炎鏈球菌(SP)抗原(例如，肺炎球菌表面蛋白質A(PspA)、肺炎球菌表面蛋白質C(PspC)等)誘發黏膜免疫反應。
所誘發之免疫反應可預防大範圍之SP相關疾病(包括急性及慢性疾病兩者)，諸如(但不限於)肺炎、腦膜炎、敗血症、耳感染、竇感染及菌血症。在一些實施例中，所誘發之免疫反應不為血清型特異性的。
在另一態樣中，提供產生本文所描述之重組型脂化融合蛋白質的方法。該等方法包含以下步驟：(1)提供用表現載體轉化的宿主大腸桿菌細胞，該表現載體包含編碼PsaA之N端原生脂質信號肽的第一核苷酸序列及編碼PsaA之C端結構基因的第二核苷酸序列轉化；及(2)培養大腸桿菌轉化體以允許表現包含PsaA之N端原生脂質信號肽及PsaA之C端結構基因的融合蛋白質。宿主大腸桿菌細胞可來自提供高度蛋白質表現之菌株，諸如(但不限於)C43(DE3)、(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)及C2014(DE3)(NCIMB 40884)。在一些實施例中，在M9培養基中培養大腸桿菌轉化體。在一些實施例中，表現載體包含闡述於SEQ ID NO：6中之核苷酸序列。在一些實施例中，該方法進一步包含在重組型脂化融合蛋白之表現後將其自大腸桿菌分離或純化。
在一些實施例中，提供根據本文所提供之方法製作的重組型脂化融合蛋白質。
在另一態樣中，提供一種包含本文所描述之一或多種重組型脂化融合蛋白質及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的組合物。在一些實施例中，該組合物進一步包含一或多種非脂化SP抗原，諸如PspA及/或PspC。
在另一態樣中，提供一種用於預防或治療SP相關疾病之疫苗，該疫苗包含本文所描述之一或多種重組型脂化融合蛋白質及佐劑。在一些實施例中，該疫苗進一步包含一或多種非脂化SP抗原，諸如PspA及/或PspC。
在又一態樣中，提供一種對本文所描述之重組型脂化融合蛋白質具有特異性之經分離抗體或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段為多株 抗體。在替代實施例中，抗體或其片段為單株抗體。抗體或其片段可為人類化的、人類或嵌合的。在一些實施例中，抗體或其片段包含整個免疫球蛋白分子；單鏈抗體；單鏈可變片段(scFv)；單域抗體；Fab片段；F(ab')2片段；或二硫化物連接之Fv(di-scFv)。抗體或其片段可包含選自人類IgM、人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4及人類IgA1/2的重鏈免疫球蛋白恆定域。此外，抗體或其片段可包含選自人類Ig κ及人類Ig λ之輕鏈免疫球蛋白恆定域。在一些實施例中，抗體或片段以107M至1010M之高親和力常數結合至抗原。
亦提供包含經分離抗體或其片段及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的組合物。
在一些實施例中，本文所提供之組合物進一步包含用於預防或治療SP感染或SP相關疾病的第二藥劑。在一些實施例中，第二藥劑包含(但不限於)以下中之一或多者：結合至PspA之抗體及結合至PspC之抗體。在另一實施例中，第二藥劑包含諸如(但不限於)甲硝噠唑(metronidazole)或萬古黴素(vancomycin)的抗生素。
在另一態樣中，提供用於預防或治療SP感染及/或SP相關疾病之方法，該等方法包含向個體投與本文所描述之重組型脂化融合蛋白質、組合物、疫苗、或抗體或其片段，以使得在個體中預防或治療SP感染及/或SP相關疾病。亦提供誘發個體之針對SP感染之免疫以使得在個體中預防或治療SP感染的方法。在一些實施例中，提供誘發個體之針對SP感染之黏膜免疫以使得在個體中預防或治療SP感染的方法。在一些實施例中，黏膜免疫可包括Th1反應與分泌性IgA之產生中之一或多者。在一些實施例中，提供誘發個體之針對SP感染之非血清型特異性免疫以使得在個體中 預防或治療超過一個血清型之SP感染的的方法。
重組型脂化融合蛋白質、組合物、疫苗、抗體或其片段可經靜脈內、皮下、肌內、經黏膜或經口投與。在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質、組合物、疫苗、抗體或其片段與用於預防或治療SP感染之第二藥劑組合投與。第二藥劑可與重組型脂化融合蛋白質、組合物、疫苗、抗體或其片段同時投與，或其可依序投與(亦即，一者在另一者之後)。
亦提供重組型脂化PsaA融合蛋白質在製造用於預防或治療SP感染之疫苗中的用途。
在又一態樣中，提供用於預防或治療SP感染或SP相關疾病之套組，該等套組包含如本文所描述之一或多種重組型脂化融合蛋白質、抗體、組合物及/或疫苗。亦可在套組中提供供使用或供實施本文所描述之方法的說明書。套組可進一步包括實施本文所描述之方法所需要的額外試劑、溶劑、緩衝劑、佐劑等。
專利或申請案檔案含有至少一個彩制圖式。在申請且支付必要的費用後，專利局將提供具有彩色圖式之此專利或專利申請公開案之複本。
為更好理解本發明且更清晰地展示其可如何施行，現將以實例之方式對附圖進行參考，其根據本發明之較佳實施例說明態樣及特徵，且其中：圖1展示：(A)全長PsaA蛋白質之胺基酸序列；(B)無信號肽之PsaA的胺基酸序列；(c)膽鹼結合域(CBD)缺失之肺炎球菌表面蛋白質A(PspA△CBD)之胺基酸序列；及(D)CBD缺失之PspC(PspC△CBD)之胺基酸序列。
圖2展示所選擇之免疫原(包括rlipo-PsaA、rPsaA-Ct、rPspA△CBD及rPspC△CBD)之純化。A：在還原條件下藉由15% SDS-PAGE且藉由考馬斯藍(Coomassie Blue)染色監測rlipo-PsaA之純化過程。色帶1，在IPTG誘發之後的細胞裂解物；色帶2，IPTG誘發之前的細胞裂解物；色帶3，經誘發細胞之可溶餾份；色帶4，經純化rlipo-PsaA。色帶5至8為使用抗(His)6抗體對rlipo-PsaA純化過程之免疫印跡監測的結果。B：在還原條件下藉由15% SDS-PAGE且藉由考馬斯藍(Coomassie Blue)染色監測rPsaA-Ct之純化過程。色帶1，在IPTG誘發之後的細胞裂解物；色帶2，IPTG誘發之前的細胞裂解物；色帶3，經誘發細胞之可溶性餾份；色帶4，經純化rPsaA-Ct。色帶5至8為使用抗(His)6抗體對rPsaA-Ct純化過程之免疫印跡監測的結果。C：在還原條件下藉由15% SDS-PAGE且藉由考馬斯藍(Coomassie Blue)染色監測rPspA△CBD之純化過程。色帶1，在IPTG誘發之後的細胞裂解物；色帶2，IPTG誘發之前的細胞裂解物；色帶3，經誘發細胞之可溶性餾份；色帶4，經純化rPspA△CBD。色帶5至8為使用抗(His)6抗體對rPspA△CBD純化過程之免疫印跡監測的結果。D：在還原條件下藉由15% SDS-PAGE且藉由考馬斯藍(Coomassie Blue)染色監測rPspC△CBD之純化過程。色帶1，在IPTG誘發之後的細胞裂解物；色帶2，IPTG誘發之前的細胞裂解物；色帶3，經誘發細胞之可溶性餾份；色帶4，經純化rPspC△CBD。色帶5至8為使用抗(His)6抗體對rPspC△CBD純化過程之免疫印跡監測的結果。
圖3展示對rlipo-PsaA之N端片段的識別及藉由rlipo-PsaA活化骨髓源性樹突狀細胞(BMDC)。A：藉由Bruker AutoFlexTM III質譜儀分析經10分鐘消化之樣本。MALDI-TOF MS頻譜亦顯示出在m/z 1266處的主要峰 為來自rlipo-PsaA之N端的脂肽片段。B：CD40分子能夠在藉由rlipo-PsaA之刺激後上調，而藉由rPsaA-Ct之刺激作用不明顯。C：以劑量依賴方式藉由rlipo-PsaA而非藉由rPsaA-Ct群組誘發TNF-α之分泌。D：以劑量依賴方式藉由rlipo-PsaA而非藉由rPsaA-Ct群組誘發IL-12p40。
圖4展示抗PsaA IgG及IgA抗體效價之增強及在投與rlipo-PsaA之後誘發偏向Th1之免疫反應。A：以兩週時間間隔藉由皮下注射含30μg rlipo-PsaA之PBS或含30μg rPsaA-Ct之PBS對小鼠進行免疫兩次。在第2週、第4週及第5週，藉由rlipo-PsaA誘發之IgG效價比藉由rPsaA-Ct誘發之彼等IgG效價高1000倍。B：在第2週、第4週及第5週，在藉由rlipo-PsaA免疫之後所誘發的IgA效價比藉由rPsaA-Ct誘發之彼等IgA效價高10000倍。C：隨後，為分析在第5週藉由rlipo-PsaA及rPsaA-Ct免疫之後所誘發的抗體同型，量測IgG1及IgG2b之誘發水準。在經rlipo-PsaA免疫之小鼠及經rPsaA-Ct免疫之小鼠中比較IgG1水準。經rlipo-PsaA免疫之小鼠中的IgG2b水準比經rPsaA-Ct免疫接種之小鼠中的彼等IgG2b水準高。D：可藉由比較此等小鼠中之IgG2b/IgG1比率清晰地觀測到偏向Th1之現象。
圖5展示在動物模型中藉由rlipo-PsaA及其他疫苗候選物保護之小鼠抗SP之免疫。(A)展示第一研究，其中藉由rlipo-PsaA及rPsaA-Ct對小鼠進行疫苗接種，且隨後使用10×LD劑量之SP進行攻擊。經2×105 D39菌株(高毒性菌株)攻擊之小鼠在藉由rlipo-PsaA免疫接種之後為100%受保護且在藉由rPsaA免疫之後為約75%受保護。(B)展示第二研究，其中藉由rlipo-PsaA/rPspA△CBD/rPspC△CBD、rPsaA-Ct/rPspA△CBD/rPspC△CBD、rlipo-PsaA、rPsaA-Ct及PBS對小鼠進行疫 苗接種且隨後使用100×LD劑量之SP進行攻擊。經3.9×106 D39菌株攻擊之小鼠分別受免疫保護83.3%、50%、33.3%、16.7%及0%。(c)展示額外研究，其中如所指示，藉由rlipo-PsaA/rPspA△CBD/rPspC△CBD(T1+T2+T3)、rPsaA-Ct/rPspA△CBD/rPspC△CBD(T1+T2+T4)、rlipo-PsaA(T3)、具有或無佐劑(CT)之rPsaA-Ct(T4)及PBS對小鼠進行疫苗接種且隨後藉由不同血清型之肺炎鏈球菌病菌株進行攻擊。經疫苗接種之小鼠展示藉由肺炎鏈球菌血清型35B、14及19F之鼻咽定殖之顯著減少或存活於血清型3之致死性攻擊。
圖6展示使用質譜分析對重組型脂化融合蛋白質上發現之脂質結構進行分析。(A)展示來自腦膜炎球菌蛋白質Ag473之脂質信號肽產生至少三個峰，如藉由質譜分析所分析。(B)及(C)展示分別與Ag473之脂質信號肽融合的抗原D1E3及E7m亦含有至少三個峰。(D)展示相比之下，使用其自身原生脂質信號肽表現之rlipo-PsaA表現為一個主要峰(分子量)。
相關申請案
本申請案主張2015年12月10日申請之美國臨時申請案第62/265,525號之權益，該申請案之全部內容特此以引用之方式併入。
本發明提供包含PsaA蛋白質及其部分之重組型脂化融合蛋白質，該等融合蛋白質包含PsaA之原生脂質信號肽，其迄今為止係不可能的。
特定言之，吾等在本文中報告肺炎球菌表面抗原A(PsaA)、原生脂蛋白可使用其自身脂質信號肽自含有編碼PsaA之合成DNA片段的大腸桿菌構築體產生重組型脂化蛋白質。在小鼠模型中，藉由重組型脂化PsaA融合蛋白質之免疫增強PsaA特異性IgG及IgA抗體效價且誘發偏向Th1之免疫反應，以及保護小鼠免於不同肺炎球菌菌株之攻擊。此外，重組型脂 化PsaA融合蛋白質與其他經截斷抗原、膽鹼結合域(CBD)缺失之肺炎球菌表面蛋白質A(PspA△CBD)及CBD缺失之肺炎球菌表面蛋白質C(PspC△CBD)能夠誘發對抗共同投與之抗原的免疫反應且保護小鼠免受高劑量攻擊，而非脂化PsaA與PspA及PspC不提供保護。因此，本文所描述之重組型脂化融合蛋白質及其組合物適用作抗廣譜SP感染及SP相關疾病的疫苗。
在一些實施例中，除全身性免疫反應之外，本文所提供之重組型脂化融合蛋白質誘發針對肺炎鏈球菌(SP)之廣譜黏膜免疫反應。此外，重組型脂化融合蛋白質可對其他共同投與之SP抗原具有輔助效應，亦誘發針對該等抗原之免疫反應。在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質可具有如使用質譜分析所測定之均一脂質修飾。本文亦提供製備重組型脂化融合蛋白質之方法及其作為抗SP相關疾病之疫苗的用途。
在一些實施例中，重組型脂化融合蛋白質、組合物及其使用方法可提供以下優勢中之一或多者：誘發針對SP之保護性免疫反應(包括黏膜免疫反應)的能力；誘發針對非血清型特異性之SP的保護性免疫反應的能力；及/或誘發針對與重組型脂化PsaA融合蛋白質調配及/或共同投與之一或多種非脂化SP抗原的黏膜免疫反應的能力(換言之，具有黏膜輔助效應)。在一些實施例中，包含PsaA之原生脂質信號肽的重組型脂化PsaA融合蛋白質之供應提供具有均一脂質結構之脂化蛋白質，例如，僅具有單一形式之脂質修飾，如使用質譜分析所測定，其中觀測到單一峰。藉由使製造更容易及/或降低製造成本，藉由提供更簡單之融合蛋白質產品及經改良之批次間一致性，均一脂質結構在一些情形下可為有利的。在一些實施例中，本文所提供之重組型脂化融合蛋白質可有利地增加特異性及/或降 低經誘發免疫反應之交叉反應性，尤其與使用異源脂質修飾之已知抗原(諸如腦膜炎球菌脂體抗原(rAg473)、融合抗原(rlipo-D1E3及rlipo-E7m))相比。可使用本文所描述之重組型脂化融合蛋白質、組合物及使用方法獲得其他技術效應應理解，不需要在本發明技術之各實施例及每一實施例中採用本文所提及之所有技術效應及優勢。
重組型脂化融合蛋白質
本文提供包含肺炎球菌表面抗原A(PsaA)之重組型脂化融合蛋白質，其中重組型脂化融合蛋白質自N端至C端包含PsaA之N端原生脂質信號肽及PsaA之C端結構性基因，視情況在N端或C端具有標籤或可偵測標記。
應理解，本發明亦涵蓋重組型脂化融合蛋白質之任何免疫原性同系物、類似物、變體或片段或部分，且可在本文所提供之組合物及方法中使用。應注意，許多不同菌株及血清型之SP為已知的且由不同菌株及血清型表現之抗原可能在其胺基酸序列中略微地變化。然而，本文所提供之重組型脂化融合蛋白質不意謂受限於由任何特定菌株或血清型表現之PsaA蛋白質。明確期望本發明技術涵蓋同系物、變體、片段及類似物。
術語「重組型脂化融合蛋白質」及「重組型脂化PsaA融合蛋白質」在本文中可互換地使用，以意指包含本文所提供之原生PsaA脂質信號肽及/或根據本文所提供之重組方法產生的PsaA融合蛋白質。
術語「經脂化」在本文中用以意指藉由結合脂質基團而共價修飾之蛋白質。蛋白質可藉由各種脂質(包括脂肪酸、類異戊二烯化合物及膽固醇)共價修飾。脂化可影響蛋白質之活性及/或其次細胞定位，且增加肽抗原之免疫原性。脂化蛋白質對於許多細菌感染過程係至關重要的。
術語「重組型」在本文中用以意指活體外或使用重組表現系統產生(亦即，由編碼宿主細胞(諸如細菌性或動物細胞)中之蛋白質之重組型構築體(諸如表現載體)表現，且視情況自宿主細胞分離及/或純化，或呈來自表現系統之提取物使用)之蛋白質。重組型蛋白質可通常以高產量及純度產生且經操控以達最大之活性及最小之非所需活性。
大體而言，藉由以下製備重組型蛋白質：構築編碼所關注之PsaA融合蛋白質的合成或半合成DNA；以適用於表現脂化PsaA融合蛋白質之方式將DNA整合至表現載體中；轉化具有表現載體之合適原核或真核宿主細胞；培養經轉化或經轉染之宿主細胞以便表現脂化PsaA融合蛋白質；及視情況以重組方式分離或純化所產生之脂化PsaA融合蛋白質。
對於重組表現，對脂化PsaA融合蛋白質之DNA序列編碼可為完全合成、半合成或修飾原生psaA基因之結果。表現載體可含有用於偵測或純化融合蛋白質(諸如胺基酸標籤及類似者)，或用於操控DNA序列(諸如限制核酸內切酶裂解位點、連接子及類似者)的額外序列。熟習此項技術者應瞭解，融合蛋白質之不同部分大體上彼此相鄰置放且以轉譯開放閱讀框架關係耦接。
在一些實施例中，將編碼本文所描述之重組型脂化PsaA融合蛋白質的DNA片段插入至表現載體(諸如包括強啟動子(例如，T7、T5、T3或SP6啟動子)的載體)中以構築表現質體。強啟動子可例如由異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘發。接著可將表現質體引入至大腸桿菌宿主菌株中且在合適的蛋白質表現條件下培養陽性轉化體。在一些實施例中，大腸桿菌宿主菌株可對可由外源性蛋白質之過度表現所誘發的毒性效應具有抗性。可(例如)藉由美國專利第6,361,966號中所描述之方法識別且產生此類大腸 桿菌菌株。此類大腸桿菌菌株之實例包括(但不限於)C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)及C2014(DE3)(NCIMB 40884)。由此表現之重組型脂化融合蛋白質可自大腸桿菌寄主細胞分離或純化。可使用此項技術中已知之方法(諸如藉由抗脂蛋白抗體之免疫印跡法或質譜分析)確認蛋白質之脂化狀態。
在表1中給出例示性重組型脂化融合蛋白質之蛋白質/肽部分及其他SP抗原及其編碼DNA之序列。
Figure 105140949-A0305-02-0017-1
Figure 105140949-A0305-02-0018-2
Figure 105140949-A0305-02-0019-3
Figure 105140949-A0305-02-0020-4
自N端至C端展示1胺基酸序列，且自5'至3'方向展示核苷酸序列。
亦涵蓋重組型脂化PsaA融合蛋白質之變體、類似物及片段。如本文所使用，「變體」係指其中少數胺基酸已經取代、插入或缺失且保持起始蛋白質之相關生物活性或功能的天然存在蛋白質或肽之胺基酸序列。舉例而言，就供疫苗中使用之抗原而言，變體可保持起始蛋白質之免疫原性特徵，足夠其在誘發免疫中的預期使用。就抗體而言，變體可保持起始蛋白質之抗原結合特性，足夠其在特異性結合至抗原中的預期使用。
在一些實施例中，變體包括一或多種保守性胺基酸取代、一或多種非保守性胺基酸取代、一或多種缺失及/或一或多種插入。保守性取代為胺基酸殘基經另一具有類似特徵(例如，電荷或疏水性)之胺基酸殘基取代的取代。大體而言，保守性胺基酸取代將不會實質上改變蛋白質之功能特性。具有化學特性類似之側鏈的胺基酸之群組之實例包括：1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。例示性保守性胺基酸取代群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。其他保守性胺基酸取代在此項技術中為已知的且包括於本文中。非保 守性取代(諸如，用疏水性胺基酸置換鹼性胺基酸)亦為此項技術中熟知的。
如本文所使用，「類似物」係指其中一或多種胺基酸已經胺基酸類似物置換之天然存在之蛋白質的胺基酸序列。胺基酸類似物之非限制性實例包括非天然存在之胺基酸、合成胺基酸、僅自然存在於無關生物系統中的胺基酸、來自哺乳系統之經修飾胺基酸、具有經取代鍵以及此項技術中已知之其他修飾的多肽(天然存在及非天然存在)。在一些實施例中，類似物包括提高醣蛋白或糖肽穩定性之修飾。在一個實施例中，類似物包括β胺基酸、γ胺基酸或D胺基酸。
「片段」係指保持起始分子之相關生物活性或功能(例如，抗原性、抗原結合、免疫原性)的起始分子之部分。
「生物活性」或「功能上等效」片段、變體或類似物大體上保持起始分子之生物活性或功能，其足以在本發明組合物及方法中使用。因此，「生物活性」或「功能上等效」片段、變體或類似物可保持起始分子之結合特異性、抗原性或免疫原性。在一些實施例中，片段、變體或類似物具有與起始分子(例如，蛋白質)至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%序列一致。當提及抗體時，「功能上等效」大體上係指抗體之片段、衍生物、變體、類似物或融合蛋白質，其維持充足的抗原結合親和力、特異性及/或選擇性以在本發明組合物及方法中使用。功能上等效抗體或片段之抗原結合特性不必等同於參考抗體之彼等抗原結合特性，只要其足以在用於預防或治療肺炎鏈球菌相關疾病之本發明組合物及方法中使用。
變體、片段或類似物亦可在N端及/或C端末端處經修飾以允許多肽或 片段在構形上受限及/或允許耦接至免疫原性載劑。
進一步提供包含共軛至載劑分子之重組型脂化PsaA融合蛋白質的經共軛脂化PsaA抗原。載劑分子可為任何適合分子，諸如(但不限於)肽、蛋白質、膜蛋白質、碳水化合物部分、或載有先前所述類型之載劑分子中之任一者或載有脂化PsaA抗原本身的一或多種脂質體。許多此類載劑分子為在此項技術中已知的且可用於本文所提供之經共軛脂化PsaA抗原中。此外，可使用此項技術中已知之任何合適方法，(例如)藉由共價鍵或離子相互作用，直接地或使用連接子將載劑分子與脂化PsaA抗原連接。
在另一實施例中，脂化PsaA抗原經產生為含有不為原生SP PsaA序列之部分的其他不同胺基酸序列的融合蛋白質或共軛物，諸如胺基酸連接子或免疫原性載體，以及適用於蛋白質純化之配位體，諸如谷胱甘肽-S-轉移酶，組胺酸標籤及葡萄球菌蛋白質A。異源多肽可例如與重組型脂化PsaA融合蛋白質之N端或C端融合。
如本文所使用，術語「經分離」係指藉助其來源或衍生源(1)而不與在其天然狀態下與其相伴隨的天然締合組分締合，(2)不含來自同一物種之其他巨分子(例如，蛋白質、聚糖)，(3)由來自不同物種之細胞表現，或(4)在自然界中不存在的分子。因此，化學合成或在不同於其天然來源的細胞之細胞系統中合成之脂化蛋白質將與其天然締合組分「分離」。亦可藉由使用此項技術中熟知之純化或分離技術來分離而使脂化蛋白質實質上不含天然締合組分。本文所描述之組合物及方法中所使用之重組型脂化PsaA融合蛋白質大體上提供為純化或實質上純化的形式，亦即，實質上不含其他蛋白質及多肽，尤其不含其他SP或宿主細胞蛋白質或多肽。在一些實施例中，重組型脂化PsaA融合蛋白質為至少約50%純、至少約60% 純、至少約70%純、至少約80%、至少約90%純或至少約95%純(按重量計)。
可藉由各種手段(例如，重組表現、自細胞培養物純化、化學合成等)製備重組型脂化PsaA融合蛋白質。在一些實施例中，重組型脂化PsaA融合蛋白質在異源細胞中表現之後經純化。舉例而言，如上文概述，可使用此項技術中熟知之技術將編碼重組型脂化PsaA融合蛋白質之聚核苷酸引入至可在合適表現系統中表現之表現載體中，接著分離或純化經表現之融合蛋白質。通常，重組型脂化PsaA融合蛋白質在異源細菌性細胞(諸如大腸桿菌)中表現。可在此項技術中獲得各種細菌性表現系統且可使用任何此類合適之表現系統。
本文所描述之技術的許多變化為此項技術中已知的且可用以製備重組型脂化PsaA融合蛋白質。
醫藥組合物及方法
本文提供用於預防或治療個體之SP感染及/或SP相關疾病之組合物及方法，該等組合物及方法包含重組型脂化PsaA融合蛋白質。亦提供用於誘發對SP之免疫反應的組合物及方法。本文所提供之方法包含以有效誘發針對SP之免疫反應的量向個體投與重組型脂化PsaA融合蛋白質，從而減少、消除、預防或治療SP相關疾病。亦提供用於產生抗體以供在針對SP相關疾病之被動免疫中使用的組合物及方法。
肺炎鏈球菌(SP)為造成許多類型之肺炎球菌感染的致病性細菌。存在超過九十種已知莢膜血清型之SP，其中二十三種造成約85%至90%之肺炎球菌疾病。除了最常見之感染、肺炎及腦膜炎之外，SP亦造成肺炎球菌疾病，諸如(但不限於)敗血症、支氣管炎、鼻炎、急性鼻竇炎、中耳 炎、結膜炎、菌血症、敗血症、骨髓炎、感染性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窩組織炎及大腦膿腫。SP相關疾病可為急性感染或慢性感染之結果。在一些實施例中，SP相關疾病係選自肺炎、腦膜炎、耳感染、竇感染及菌血症。
術語「個體」及「患者」在本文中可互換地使用以意指需要預防或治療SP相關疾病或與SP相關聯之感染的個體。個體可為脊椎動物，諸如哺乳動物，例如人類、非人類靈長類、家兔、大鼠、小鼠、牛、馬、山羊或另一動物。動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如小鼠、綿羊、狗、母牛、禽鳥類、鴨、鵝、豬、雞、兩棲動物及爬行動物。在實施例中，個體為人類。
「治療(Treating/treatment)」係指(i)預防感染或再感染，例如預防法，或(ii)減少或消除所關注疾病之症狀，例如療法。「治療(Treating/treatment)」可係指投與包含本文所描述之重組型脂化PsaA融合蛋白質的組合物或係指投與針對此等融合蛋白質提出的抗體。藉由組合物治療個體可預防或降低感染風險及/或誘發對SP之免疫反應。
治療可為預防性的(例如，預防或延緩疾病發作、預防其臨床或亞臨床症狀之表現、或預防疾病之復發)或治療性的(例如，在疾病表現之後抑制或緩解症狀)。「預防(Preventing/prevention)」係指對尚未感染或無症狀及/或處於感染風險下之個體進行預防性投與或疫苗接種重組型脂化PsaA融合蛋白質或其組合物。
如本文所使用，術語「免疫反應」係指免疫系統細胞對外部或內部刺激(例如，抗原、細胞表面受體、細胞激素、趨化激素及其他細胞)之反應，其在該等免疫細胞中產生生物化學改變而引起免疫細胞移動、殺滅靶 細胞、噬菌作用、抗體產生、免疫反應之可溶性效應子之產生，及類似者。「免疫原性」分子為投與之後能夠在個體中產生免疫反應的分子。術語「黏膜免疫」及「黏膜免疫反應」可互換地使用以意指在黏膜表面處的免疫反應，通常涉及誘發常見的黏膜免疫系統。黏膜免疫反應通常包括分泌性IgA之產生及/或Th1反應之激活。
「自動免疫」係指向個體投與抗原(例如，免疫原性分子(例如，本文所描述之重組型脂化PsaA融合蛋白質))以誘發免疫反應的過程。相比之下，「被動免疫」係指通常以預製抗體之形式向個體投與活性體液免疫。被動免疫為可藉由投與抗體或其抗原結合片段達成的短期免疫的形式。可以若干可能形式，例如，以人類或動物血漿或血清之形式、以混合的動物或人類免疫球蛋白之形式、以來自經免疫個體或來自疾病恢復之供體的高效價動物或人類抗體之形式、以多株抗體或單株抗體之形式投與抗體。通常地，自被動免疫衍生之免疫提供即時保護或治療而可持續僅較短時間段。
在一些實施例中，提供用於抗SP感染及/或SP相關疾病之自動免疫的組合物及方法。提供用於誘發對個體中之SP細菌的免疫反應的組合物及方法，其包含：視情況在佐劑之存在下，以有效誘發個體中之免疫反應之量向個體投與重組型脂化PsaA融合蛋白質。在一個實施例中，提供包含有效免疫量之本文所提供之重組型脂化融合蛋白質及佐劑的組合物，其中組合物可有效地預防或治療有需要個體之SP相關疾病。在實施例中，不需要佐劑，亦即，提供用於誘發對個體中之SP細菌的免疫反應的組合物及方法，其包含：以有效誘發個體中之免疫反應之量向個體投與本文所提供之重組型脂化融合蛋白質，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋 劑。
在一些實施例中，提供用於誘發對個體中之SP的黏膜免疫反應的組合物及方法，該黏膜免疫反應例如為包含Th1反應及/或分泌性IgA之產生之免疫反應。在一些實施例中，誘發全身性免疫反應，例如，產生諸如IgG之抗體同型。在一些實施例中，誘發黏膜及全身性免疫反應兩者。
在一些實施例中，所誘發之免疫反應不為血清型特異性的。如本文所使用，「非血清型特異性」係指預防超過一個SP血清型之免疫反應。換言之，在用特定重組型脂化PsaA融合蛋白質進行免疫之個體中，所誘發之免疫反應不僅預防衍生融合蛋白質之血清型，而且預防一或多種額外SP血清型。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可由此提供針對SP之廣譜免疫，包括黏膜免疫。
在一些實施例中，組合物及方法進一步包含與一或多種額外SP抗原組合投與重組型脂化PsaA融合蛋白質。額外SP抗原可包括(例如)莢膜多醣抗原、膜結合型毒性因子或可預防SP感染之表面抗原。在一些實施例中，額外SP抗原為PspA或PspC。額外SP抗原之非限制性實例包括肺炎球菌β-半乳糖苷酶(BgaA)、肺炎球菌磷酸膽鹼(ChoP)、肺炎球菌烯醇酶(Eno)、肺炎球菌玻尿酸鹽解離酶(Hyl)、肺炎球菌自溶素A(LytA)、肺炎球菌神經胺酸酶(Nan)、肺炎球菌附著性及毒性A(PavA)、肺炎球菌鐵獲取(PiaA)，及肺炎球菌表面締合之Pht蛋白質(PhtA、PhtB、PhtD及PhtE)。
在一些實施例中，儘管一或多種額外抗原本身並非脂化及/或非免疫原性(亦即，在重組型脂化PsaA融合蛋白質不存在的情況下投與時)，但重組型脂化PsaA融合蛋白質與一或多種額外SP抗原組合投與誘發針對一或 多種額外抗原之黏膜免疫反應(除針對PsaA之黏膜免疫反應之外)。以此方式，重組型脂化PsaA融合蛋白質可具有黏膜輔助作用，誘發針對共調配及/或共同投與之非脂化抗原的特異性黏膜免疫。
此類非脂化抗原之非限制性實例包括PspA、PspC、肺炎球菌β-半乳糖苷酶(BgaA)、肺炎球菌磷酸膽鹼(ChoP)、肺炎球菌烯醇酶(Eno)、肺炎球菌玻尿酸鹽解離酶(Hyl)、肺炎球菌自溶素A(LytA)、肺炎球菌神經胺酸酶(Nan)、肺炎球菌附著性及毒性A(PavA)、肺炎球菌鐵獲取(PiaA)，及Pht蛋白質(PhtA、PhtB、PhtD及PhtE)之肺炎球菌表面締合。
佐劑大體上提高免疫反應之特異性及/或水準。佐劑可由此降低誘發免疫反應所必需之抗原之量，及/或產生有益於個體之足夠的免疫反應所必需之注射頻率。任何用以提高對抗原之免疫反應且適合用於個體(例如，醫藥學上可接受)的一或多種化合物可在本發明之組合物、疫苗及方法中用作佐劑。在一些實施例中，佐劑可為共軛或重組抗原中之載體分子(例如但不限於霍亂毒素B次單位、脂質體等)。在替代實施例中，佐劑可為已知提高免疫系統之反應的無關分子(例如但不限於經減弱的細菌性或病毒載體、AMVAD等)。在一個實施例中，佐劑可為產生強黏膜免疫反應之佐劑，諸如減毒病毒或細菌或鋁鹽。
佐劑之實例包括(但不限於)霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素、脂質體、刺激免疫錯合物(ISCOM)、免疫刺激序列寡脫氧核苷酸及氫氧化鋁。組合物亦可包括便於活體內遞送之聚合物(參見例如Audran R.等人，Vaccine 21：1250-5，2003；及Denis-Mize等人，Cell Immunol.，225：12-20，2003)。其他合適佐劑為熟習此項技術者熟知的。替代地，在一些實施例中，本文所描述之重組型脂化融合蛋白質可在無額外佐劑的情況下 用於針對SP相關疾病的疫苗中。
可藉由使用熟習此項技術者熟知之技術(包括(但不限於)混合、超聲處理及微氟化)均一地且緊密使抗原與佐劑締合來製備包括本文所描述之一或多種PsaA抗原的組合物、調配物及疫苗。佐劑將通常構成約5%至約10%(v/v)或約10%至約50%(v/v)之組合物。
在其他實施例中，提供用於被動免疫的組合物及方法，其包含對SP具有特異性之抗體或其抗原結合片段。如本文所使用，術語「抗體」係指結合至特異性抗原或抗原決定基之任何免疫球蛋白或完整分子以及其片段。此類抗體包括(但不限於)多株、單株、嵌合、人類化、單鏈、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)'片段及/或整個抗體之F(v)部分及其變體。此術語涵蓋所有同型，包括IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。
如本文所使用，術語「抗體片段」係指抗體之功能上等效片段或部分，亦即，係指保持親本抗體之抗原結合能力(例如，特異性，親和力及/或選擇性)的抗體之全部序列之不完全或經分離部分。抗原結合部分之非限制性實例包括：(i)Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，其為包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段，(v)dAb片段，其由VH域構成；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)；及(vii)單鏈Fv(scFv)，其由Fv片段之兩個域(VL及VH)構成。抗體片段之其他非限制性實例為Fab'片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
完整「抗體」包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈。各重鏈由重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個域 (CH1、CH2及CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個域(CL)組成。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，其中散置有更保守的區域，稱為構架區(FR)。各VH及VL由自胺基端至羧基端依以下次序佈置之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
如本文所使用術語「單株抗體」或「mAb」係指單分子組合物之抗體分子之製劑。單株抗體組合物顯示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和性。術語「人類單株抗體」係指具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區(若存在)之顯示單一結合特異性的抗體。在一個態樣中，人類單株抗體由融合瘤產生，該融合瘤包括從轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)獲得的B細胞，其具有包含與永生化細胞融合的人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組。「人類化抗體」係指其中非抗原結合區及/或抗原結合區中之胺基酸序列已改變而使得抗體更接近地類似人類抗體且仍保持其原始結合特性的至少一個抗體分子。人類化抗體通常為來自具有一或多個非人類物種之CDR及人類免疫球蛋白分子之構架區的非人類物種的抗體分子。術語「嵌合抗體」係指抗體中之不同部分來源於不同動物物種，例如具有來源於鼠類mAb之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的抗體。
如本文所使用，術語「抗原」係指促使抗體生成且可引起免疫反應之物質。儘管在嚴格的意義上，免疫原為誘發免疫系統之反應的物質，而 抗原被定義為結合至特異性抗體的物質，但術語「抗原」及「免疫原」在本文中可互換地使用。抗原或其片段可為與特定抗體接觸之分子(亦即抗原決定基)。當重組型脂化融合蛋白質或其片段用以對宿主動物進行免疫時，脂化融合蛋白質之大量區域可誘發抗體之產生(亦即，誘發免疫反應)，該等抗體特異性地結合至抗原(例如，脂化融合蛋白質上之給定區域或三維結構)。
術語「對…具有特異性」或「特異性結合」可互換地使用以意指抗體與其相應抗原之間的相互作用。相互作用依賴於結合分子(亦即，抗原或抗原決定基)所辨別之蛋白質的特定結構的存在。為使結合具有特異性，其應涉及所關注之抗原決定基及非背景抗原的抗體結合，亦即，不超過少量與其他抗原(諸如，其他蛋白質或脂質結構、宿主細胞蛋白質等)之交叉反應。本發明之抗體或抗原結合片段、其變體或衍生物亦可就其與抗原之結合親和力進行描述或詳細說明。可使用此項技術中已知之方法以實驗方式測定用於抗原之抗體的親和力。用於抗體之術語「高親和力」通常係指平衡締合常數(Kaff)為至少約1×107公升/莫耳、或至少約1×108公升/莫耳、或至少約1×109公升/莫耳、或至少約1×1010公升/莫耳、或至少約1×1011公升/莫耳、或至少約1×1012公升/莫耳、或至少約1×1013公升/莫耳、或至少約1×1014公升/莫耳或更大。KD(平衡解離常數)亦可用以描述抗體親和力且為Kaff之倒數。
本文所描述之重組型脂化融合蛋白質通常與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑組合以形成醫藥組合物。醫藥學上可接受之載劑可包括起作用以(例如)穩定或增加或減少醫藥組合物之吸收率或清除率的生理學上可接受之化合物。大體而言，醫藥學上可接受之載劑必須與組合物之活性成份相 容，視情況能夠穩定活性成份且對待治療之個體無害。生理學上可接受之化合物可包括(例如)磷酸鹽緩衝鹽水，碳酸氫鹽溶液，碳水化合物(諸如葡萄糖、蔗糖、聚葡萄糖)，抗氧化劑(諸如抗壞血酸或谷胱甘肽)，螯合劑，低分子量蛋白質，減少糖肽之清除或水解的組合物，或賦形劑或其他穩定劑及/或緩衝劑。其他生理學上可接受之化合物包括潤濕劑、乳化劑、分散劑或尤其適用於防止微生物生長或活動之防腐劑。各種防腐劑為熟知的且包括(例如)酚及抗壞血酸。清潔劑亦可用以穩定或增加或減少對醫藥組合物(包括脂質載劑)之吸收。醫藥學上可接受之載劑及調配物為熟習此項技術者已知且詳細地描述於科學及專利文獻中，參見(例如)最新版本之Remington's Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，Pa。(「雷明頓氏」)熟習此項技術者將理解，對包括生理學上可接受之化合物的醫藥學上可接受之載劑的選擇取決於(例如)本發明之脂化融合蛋白質、組合物、抗原或抗體的投與模式及途徑，且取決於其特定物理化學特徵。
本發明之組合物及疫苗可藉由任何合適手段投與，(例如)經口，諸如以丸劑、錠劑、膠囊、顆粒劑或散劑形式；舌下；經頰；非經腸，諸如經皮下、靜脈內、肌內、腹膜內或腦幹內注射或使用注射技術(例如，呈無菌可注射水溶液或非水溶液或懸浮液之形式)；經鼻，諸如藉由吸入噴劑、霧劑、薄霧或噴霧器；局部，諸如以乳膏、軟膏、油膏、散劑或凝膠形式；經皮，諸如以貼片形式；經黏膜；或經直腸，諸如以栓劑形式。本發明組合物亦可以適用於立即釋放或延長釋放之形式投與。立即釋放或延長釋放可藉由使用合適之醫藥組合物達成，或尤其就延長釋放而言，藉由使用諸如皮下植入或滲透泵之器件達成。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物可非經腸投與，(例如)藉由皮下注射或肌肉內注射或使用其他投與模式，諸如栓劑及經口調配物。對於栓劑，黏合劑及載劑可包括(例如)聚烷二醇或甘油三酯。經口調配物可包括通常採用之輔料，諸如醫藥等級之糖精、纖維素、碳酸鎂及其類似物。此等組合物可呈溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物，或散劑之形式。組合物可製備為用於注射液之最終產品，例如，呈液體溶液或乳液之形式(參見(例如)美國專利第4,601,903號；第4,599,231號；第4,599,230號；及第4,596,792號)。
為了易於投與及劑量均一性而，按單位劑型來調配經口或非經腸組合物調配通常係有利的。單位劑型係指適合作為待治療之個體的單一劑量的物理上離散之單位；各單位含有經計算以產生與所需醫藥載劑締合之所需治療性或免疫原性效應的預定量之活性化合物。使用此項技術中已知之方法可保護脂化融合蛋白質、抗原或抗體之組合物在經口投與時免於分解(參見(例如)Fix,Pharm Res.13：1760-1764，1996；Samanen,J.Pharm.Pharmacol.48：119-135，1996)。
在實施例中，將組合物或疫苗製備為可注射劑，呈液體溶液或懸浮液之形式，或製備為適用於在注射之前溶解或懸浮於液體媒劑中的固體形式。在另一實施例中，組合物或疫苗以固體形式製備，乳化或封裝於脂質體媒劑或用於持續遞送之其他顆粒載劑中。舉例而言，疫苗可為油狀乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位點特異性乳液、長滯留乳液、黏性乳液、微乳液、奈米乳液、脂質體、微粒、微球體、奈米球或奈米粒子之形式。疫苗可包括允許疫苗之持續釋放的可膨脹聚合物(諸如水凝膠)、可再吸收聚合物(諸如膠原蛋白)，或某些聚酸或聚酯(諸如用以製作可再吸 收縫合線的彼等者)。
在一些實施例中，本文所提供之組合物包括用於SP相關疾病之一或多種額外治療劑或預防劑。舉例而言，組合物可含有用於預防或治療SP感染之第二藥劑。此類第二藥劑之實例包括(但不限於)抗生素(諸如甲硝噠唑及萬古黴素)及抗體(諸如結合至額外SP抗原(諸如但不限於PspA及PspC)之抗體)。
在替代性實施例中，可單獨或與適用於預防或治療SP相關疾病之其他合適藥劑組合使用本發明之組合物。在一些實施例中，本發明之組合物與包含用於SP相關疾病之第二治療劑或預防劑的第二組合物同時投與。
如本文所使用，「治療有效量」或「有效量」係指足以預防或治療SP相關疾病以減輕(例如緩解、減少、降低)與SP相關疾病相關聯之症狀中之至少一者，及/或以誘發對SP之免疫反應，從而提供對個體之益處的重組型脂化融合蛋白質、組合物、疫苗、抗原或抗體的量。可藉由一般熟習此項技術者測定組合物、疫苗、抗原或抗體之有效量。用於成人之例示性抗原劑量包括(但不限於)每天約0.1mg/kg至500mg/kg之體重的抗原或抗體，其可以單次劑量或以單獨分次給藥之形式投與，諸如每天或每週或每兩週1至5次。
在一些實施例中，包含重組型脂化融合蛋白質之有效量之組合物含有約0.05μg至約1500μg蛋白質、約10μg至約1000μg蛋白質、約30μg至約500μg、或約40pg至約300pg蛋白質或彼等值之間的任何整數。舉例而言，可以約0.1μg至約200mg，例如，約0.1μg至約5μg、約5μg至約10μg、約10μg至約25μg、約25μg至約50μg、約50μg至約100μg、約100μg至約500μg、約500μg至約1mg、或約1mg至約2mg之劑量向個 體投與蛋白質，且在(例如)1週、2週、3週、4週、兩個月、三個月、6個月及/或一年後給予任選增效劑。
在一些實施例中，用於被動免疫之抗體組合物之有效量範圍介於約0.001mg/kg體重至約30mg/kg體重，例如，約0.01mg/kg體重至約25mg/kg體重、約0.1mg/kg體重至約20mg/kg體重、約1mg/kg至約10mg/kg、或約10mg/kg至約20mg/kg。
亦可每月一次、每月兩次、每月三次、每隔一週(qow)、每週一次(qw)、每週兩次(biw)、每週三次(tiw)、每週四次、每週五次、每週六次、每隔一天(qod)、每天(qd)、一天兩次(qid)或一天三次(tid)投與脂化融合蛋白質、組合物、疫苗、抗原或抗體。為預防目的，各劑量中之脂化融合蛋白質之量經選擇為誘發免疫保護性反應而對典型疫苗無明顯不良副作用之量。在初次疫苗接種之後，個體可接受經恰當隔開之一種或若干加強免疫。
應理解，任何特定個體之特定劑量及給藥頻率可變化且將視多種因素而定，該等因素包括：所採用之特異性化合物之活性；彼化合物之代謝穩定性及作用長度；個體之物種、年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；投與模式及時間；排泄及清除速率；藥物組合；及特定病況之嚴重程度。
套組
提供用於預防或治療SP感染及/或SP相關疾病之套組，其包含如本文所描述之一或多種重組型脂化PsaA融合蛋白質、抗原、抗體、組合物及/或疫苗。亦可在套組中提供供使用或供實施本文所描述之方法的說明書。套組可進一步包括實施本文所描述之方法所需要的額外試劑、溶劑、緩衝 劑、佐劑等。
除非上下文另有明確規定，否則如本文中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括多個參考物。
如本文所使用，術語「約」係指在實驗量測或測定之誤差限值內的值。舉例而言，除彼此之外約5%、約10%、約15%或約20%之兩個值在標準誤差之校正後可視為「約同」或「類似」。在一些實施例中，「約」係指如適於執行所揭示之方法或描述所揭示之組合物及方法的指定值之±20%、±10%或±5%的偏差，如熟習此項技術者應瞭解。
本文所描述之技術不意謂受限於特定方法、試劑、化合物、組合物或生物系統，其理所當然可變化。亦應瞭解，本文所使用之術語僅用於描述特定態樣之目的且不意欲為限制性的。
實例
參考以下實例將更易瞭解本發明，提供該等實例以說明本發明且不應理解為以任何方式限制其範疇。
除非另外定義或上下文明確規定，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術之人士通常瞭解之相同意義。應理解，可在實踐或測試本發明技術中使用類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料的任何方法及材料。
實例1. 脂化融合蛋白質(rlipo-PsaA)之表現。
表現且表徵具有圖1A中所描述之序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7；rlipo-PsaA)的包括原生PsaA脂質信號序列之重組型脂化融合蛋白質(rlipo-PsaA)。吾等在下文中報告此重組型脂化融合蛋白質能夠誘發黏膜免疫且使免疫反應朝向Th1歪斜，且能夠保護小鼠對抗肺炎鏈球菌(SP)相 關疾病。亦產生非脂化PsaA-Ct(在無脂質信號肽之情況下的PsaA；rPsaA-Ct)(圖1b)，以用於與rlipo-PsaA之功效進行比較。另外，產生經截斷肺炎球菌表面蛋白質A(PspA△CBD；圖1c)及肺炎球菌表面蛋白質C(PspC△CBD；圖1d)且發現其提高疫苗功效。
為表現且表徵rlipo-PsaA，自公開可獲得之資料庫獲得PsaA之胺基酸序列且PsaA之寄存編號為NP_359087。為提高產品產率，吾等使用大腸桿菌(E.coli)之密碼子使用以使DNA序列最佳化用於PsaA表現。PsaA基因由生物技術公司充分合成且使用Nde I及Xho I部位將PsaA基因選殖至表現載體pET-22b(+)(Novagen,Madison,WI,USA)中以產生pPsaA質體。因此，重組蛋白質之C端含有額外的六組胺酸(His6)標籤(圖1A)。為獲得無信號肽之PsaA，吾等藉由類似方法構造pPsaA-Ct質體。
將表現質體pPsaA-Ct轉化為大腸桿菌菌株BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)以用於蛋白質表現。在37℃下隔夜培養經轉化細胞且接著藉由1mM IPTG誘發3小時(h)。為獲得用於表現脂化免疫原之質體，將pPsaA轉化成大腸桿菌菌株C43(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)以用於脂體蛋白質表現。在37℃下隔夜培養經轉化細胞且接著在12℃下藉由1mM IPTG誘發3天。
在將pPsaA轉化成大腸桿菌菌株C43(DE3)中之後，在37℃下將經轉化細胞在5ml魯利亞貝爾塔尼(Luria-Bertani)(LB)培養液中擴增隔夜。隨後將隔夜培養物轉移至1000ml M9培養基(9mM NaCl、22mM KH2PO4、47.8mM Na2HPO4、19mM NH4Cl、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2及0.4%葡萄糖)中且在37℃下培養。在細菌達到最新對數期(OD 600nm約0.7)之後，在20℃下藉由添加1mM異丙硫基-β-D-半乳糖苷(IPTG) 誘發蛋白質表現20小時。
實例2. rlipo-PsaA之產生及表徵。
藉由固定金屬親和性層析法(IMAC)使自pPsaA-Ct表現之非脂化形式之抗原(rPsaA-Ct)，及自pPsaA表現之rlipo-PsaA分別自BL21(DE3)及C43(DE3)細胞分離如下。藉由離心(8000×g持續20分鐘)自4公升細胞培養基採集大腸桿菌細胞且使由此收集之集結粒再懸浮於含有50mM Tris(pH 8.0)之100ml均質化緩衝液中。隨後使用法式壓碎機(Constant Systems，DaventryUK)以27Kpsi在清潔劑之存在下破壞大腸桿菌細胞且將由此獲得之細胞裂解物以80,000×g離心60分鐘。使用提取緩衝液(1% Triton X-100/50mM Tris(PH8.9))收集且溶解集結粒。在以80000×g離心40分鐘之後，將上澄液與5mL Ni-NTA樹脂(Qiagen，San Diego,CA,USA)在冷室中一起培育隔夜。將經培育樣本及樹脂漿液裝至管柱(1.6cm i.d.×2.7cm)中。首先藉由50mL提取緩衝液洗滌管柱。重組型蛋白質經溶離緩衝液(1%Triton X-100；50mM Tris(pH 8.9))溶離且藉由SDS-PAGE及免疫印跡法兩者表徵。由此獲得之結果(圖2A中所示)指示分離具有高純度之重組型脂體-E7m。使用與銅離子耦合之IMAC達成脂多糖(LPS)之移除，且脂多糖(LPS)經1000mL溶離緩衝液及300mL洗滌緩衝液(100mM咪唑；1% Triton X-100；50mM Tris(pH 8.9))粗放地洗滌。製劑中之LPS殘餘物小於30EU/mg。
使用類似方法獲得rPsaA-Ct(圖2B)、rPspA△CBD(圖2B)及rPspC△CBD(圖2B)。
對Rlipo-PsaA進行質譜(MS)分析，如下文所描述。為識別rlipo-PsaA之N端片段，首先針對pH 8.5之5mM碳酸氫銨透析rlipo-PsaA，且接 著在室溫下在25mM碳酸氫銨(pH 8.5)中以rlipo-PsaA：胰蛋白酶之比率50：1(wt/wt)經胰蛋白酶(Promega Co.,Madison,WI,USA)處理5分鐘。藉由添加甲酸終止酶反應(最終濃度1.2%)。使用ZiptipTM(EMD Millipore,Darmstadt,Germany)進一步製備反應混合物。將1μl經胰蛋白酶消化之蛋白質與1μl α-氰基-4-羥基肉桂酸(Sigma,St.Louis,MI,USA)於乙腈/0.1%三氟乙酸中之1μl飽和溶液混合(1：3，vol/vol)。將一微升混合物置放於基質輔助雷射脫附離子化飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀(Bruker,Madison,WI,USA)之靶板上以供分析。自如上文所描述之MALDI-TOF分析中獲得之結果指示部分胰蛋白酶消化產品對應於rlipo-PsaA之N端片段且此等肽經脂化(圖3A)。
實例3. rlipo-PsaA之免疫原性研究。
BM-DC用作研究rlipo-PsaA之免疫刺激特性的模型。Rlipo-PsaA上調表面標記物CD80之表現，而rPsaA-Ct無作用(圖3B)。在細胞激素分泌研究中獲得類似結果。藉由rlipo-PsaA而非藉由rPsaA-Ct群組(圖3C及3D)誘發TNF-α(圖3C)及IL-12p40(圖3D)之分泌。此等結果指示rlipo-PsaA之免疫刺激活性與其脂質部分有關。
實例4. 經rlipo-PsaA之免疫增強抗原特異性IgG及IgA，且產生偏向Th1之反應。
為在活體內評估rlipo-PsaA之內部輔助特性，吾等分析在經rlipo-PsaA或rPsaA-Ct免疫之小鼠中之抗原特異性抗體反應之幅度(圖4A)。以兩週時間間隔藉由皮下注射含30μg rlipo-PsaA之PBS或含30μg rPsaA-Ct之PBS對小鼠進行免疫兩次。在第2週、第4週及第5週，藉由rlipo-PsaA誘發之IgG效價比藉由rPsaA-Ct誘發之彼等IgG效價高1000倍(圖4A)。在 第2週、第4週及第5週，在藉由rlipo-PsaA免疫之後所誘發的IgA效價比藉由rPsaA-Ct誘發之彼等IgA效價高10000倍(圖4B)。隨後，為分析在第5週藉由rlipo-PsaA及rPsaA-Ct免疫之後所誘發的抗體同型，量測IgG1及IgG2b之誘發水準。在經rlipo-PsaA免疫之小鼠及經rPsaA-Ct免疫之小鼠中比較IgG1水準。經rlipo-PsaA免疫之小鼠中的IgG2b水準比經rPsaA-Ct免疫之小鼠中的彼等IgG2b水準高(圖4C)。可藉由比較此等小鼠中之IgG2b/IgG1比率清晰地觀測到偏向Th1之現象(圖4D)。
實例5. 活體內保護實驗。
吾等在本文報告使用小鼠模型之研究，其中用免疫原對小鼠進行疫苗接種且該等小鼠接著經肺炎鏈球菌(SP)之不同菌株攻擊。
對於活體內保護實驗，藉由30μg之rlipo-PsaA或rPsaA-Ct對ICR小鼠(每組六隻小鼠)進行免疫。在第一研究中，藉由rlipo-PsaA及rPsaA-Ct對小鼠進行疫苗接種，且隨後使用10×LD劑量之SP進行攻擊。藉由2×105 D39菌株(高毒性菌株)攻擊之小鼠展示在經rlipo-PsaA免疫之後的100%保護且可見對於經rPsaA免疫之彼等小鼠的約75%保護(圖5A)。在第二研究中，藉由rlipo-PsaA/rPspA△CBD/rPspC△CBD、rPsaA-Ct/rPspA△CBD/rPspC△CBD、rlipo-PsaA、rPsaA-Ct及PBS對小鼠進行疫苗接種且隨後使用100×LD劑量之SP進行攻擊。經3.9×106 D39菌株攻擊之小鼠分別展示83.3%、50%、33.3%、16.7%及0%保護(圖5B)。
此等結果證實經30μg之rlipo-PsaA免疫的小鼠為100%受保護免於2×105cfu/mL D39菌株(高毒性菌株)的攻擊。對於單獨經rPsaA免疫之彼等小鼠而言，發現保護率為約75%(圖5a)。此等資料指示rlipo-PsaA可誘發比rPsaA顯著更強的保護性免疫，且更重要的係，保護經疫苗接種之動 物免於SP之不同菌株的攻擊。
吾等測試rlipo-PsaA是否可給予針對更高攻擊劑量(100×LD50、3.9×106cfu/mL D39菌株)、rlipo-PsaA及包括經截斷rPspA△CBD及rPspC△CBD之其他抗原的保護。其在動物攻擊研究中評定，其結果印象深刻，在經rlipo-PsaA/rPspA△CBD/rPspC△CBD疫苗接種之群組中發現保護>80%，而發現在經rPsaA-Ct/rPspA△CBD/rPspC△CBD或rlipo-PsaA、rPsaA-Ct或PBS免疫接種之群組中的保護率分別為50%、33%、16%及0%(圖5b)。此等結果指示本文所描述之重組型脂化融合蛋白質可用於研發基於蛋白質之肺炎球菌疫苗。
為測定重組型脂化融合蛋白質針對不同血清型之肺炎鏈球菌的潛在預防，亦藉由額外4種不同血清型(類型3、14、19F及35B)之菌株攻擊經疫苗接種之小鼠。如圖5中所示，除了對血清型2的保護(圖5a及5b)，疫苗顯著減少肺炎鏈球菌血清型14、19F及35B之鼻咽定殖或預防血清型3之致死性侵入性感染。此等資料指示本文所描述之重組型脂化融合蛋白質可提供對由肺炎鏈球菌之多個血清型引起的感染的保護。
實例6. rlipo-PsaA之脂質結構之表徵。
質譜分析用以表徵rlipo-PsaA之脂質結構且使用異源脂質信號肽與在大腸桿菌中產生的其他脂化SP抗原之脂質構造進行比較。來自表現於大腸桿菌系統中之腦膜炎球菌蛋白質Ag473(具有脂質信號肽序列：MKKLLIAAMMAAALAAC)之脂質信號肽產生至少三個峰，如藉由質譜分析測定(圖6A)。與Ag473之脂質信號肽融合的抗原D1E3及E7m亦含有至少三個峰(圖6B、圖6C)。相比之下，使用其自身原生脂質信號肽(SEQ ID NO：6)表現之rlipo-PsaA在大腸桿菌系統中表現為一個主要峰(分子量) (圖6D)。關於脂質部分之分子結構的更多資訊，參見：蛋白質組研究(Proteomics)，2011 11(13)：2620-7。此等結果指示，出人意料地，僅單一形式之脂質修飾表現在rlipo-PsaA上。
儘管參考其較佳實施例詳細描述本發明，但提供此等實施例以說明而非限制本發明。可能製作採用本發明之原理且屬於如此處所附之申請專利範圍所定義的其精神及範疇內的其他實施例。
本說明書中揭示之所有特徵可以任何組合形式組合。本說明書中揭示之各特徵可經用於相同、等效或類似目的之替代性特徵置換。因此，除非另有明確說明，否則所揭示之各特徵僅為一系列等效或類似通用特徵之實例。
本文中所引用之所有文檔及參考文獻之內容據此以全文引用的方式併入。
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<151> 2015-12-10
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 309
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌
<400> 1
Figure 105140949-A0305-02-0042-5
Figure 105140949-A0305-02-0043-6
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌
<400> 2
Figure 105140949-A0305-02-0043-8
Figure 105140949-A0305-02-0044-9
<210> 3
<211> 379
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌
<400> 3
Figure 105140949-A0305-02-0045-10
Figure 105140949-A0305-02-0046-11
<210> 4
<211> 490
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌
<400> 4
Figure 105140949-A0305-02-0046-12
Figure 105140949-A0305-02-0047-13
Figure 105140949-A0305-02-0048-14
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌
<400> 5
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<210> 6
<211> 954
<212> DNA
<213> 肺炎鏈球菌
<400> 6
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<210> 7
<211> 315
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌
<400> 7
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Figure 105140949-A0305-02-0050-18
<210> 8
<211> 296
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌
<400> 8
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Figure 105140949-A0305-02-0052-20

Claims (19)

  1. 一種包含肺炎球菌表面抗原A(PsaA)之重組型脂化融合蛋白質，其中該重組型脂化融合蛋白質係於大腸桿菌(E.coli)中產生，其係來自包含SEQ ID NO：1所載的胺基酸序列之融合蛋白質或包含與SEQ ID NO：1所載之胺基酸序列至少約80%至95%一致的胺基酸序列之融合蛋白質，且其中該重組型脂化融合蛋白質包含脂質結構，該脂質結構包含如藉由質譜分析法所觀察到之單一主要峰。
  2. 如請求項1之重組型脂化融合蛋白質，其中該重組型脂化融合蛋白質在C端進一步包含標籤或可偵測標記。
  3. 如請求項2之重組型脂化融合蛋白質，其中該標籤為包含6個組胺酸殘基之胺基酸標籤。
  4. 如請求項1至3中任一項之重組型脂化融合蛋白質，其中該融合蛋白質係經分離或經純化。
  5. 如請求項1至3中任一項之重組型脂化融合蛋白質，其中該單一主要峰具有約1266之m/z。
  6. 如請求項1至3中任一項之重組型脂化融合蛋白質，其中該重組型脂化融合蛋白質誘發個體之針對肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)感 染的黏膜免疫反應。
  7. 如請求項6之重組型脂化融合蛋白質，其中該黏膜免疫反應包含個體中之Th1反應及/或分泌性IgA之產生。
  8. 如請求項6之重組型脂化融合蛋白質，其中該重組型脂化融合蛋白質在無佐劑之情況下投與時誘發該黏膜免疫反應。
  9. 如請求項6之重組型脂化融合蛋白質，其中該重組型脂化融合蛋白質誘發針對同時投與的一或多種非脂化肺炎鏈球菌(SP)抗原之黏膜免疫反應。
  10. 如請求項9之重組型脂化融合蛋白質，其中該一或多種非脂化SP抗原係選自肺炎球菌表面蛋白質A(PspA)、肺炎球菌表面蛋白質C(PspC)、肺炎球菌β-半乳糖苷酶(BgaA)、肺炎球菌磷酸膽鹼(ChoP)、肺炎球菌烯醇酶(Eno)、肺炎球菌玻尿酸解離酶(Hyl)、肺炎球菌自溶素A(LytA)、肺炎球菌神經胺酸酶(Nan)、肺炎球菌附著性及毒性A(PavA)、肺炎球菌鐵獲取(PiaA)及Pht蛋白質(PhtA、PhtB、PhtD及PhtE)之肺炎球菌表面締合。
  11. 如請求項6之重組型脂化融合蛋白質，其中該黏膜免疫反應不為血清型特異性。
  12. 如請求項6之重組型脂化融合蛋白質，其中該個體具有肺炎、腦膜 炎、耳感染、竇感染或菌血症。
  13. 一種產生如請求項1至12中任一項之重組型脂化融合蛋白質的方法，該方法包含以下步驟：(1)提供經過表現載體轉化的宿主大腸桿菌細胞，該表現載體包含SEQ ID NO：6所載之核苷酸序列；及(2)培養該大腸桿菌轉化體，以允許表現包含PsaA之該N端原生脂質信號肽及PsaA之該C端結構基因的該融合蛋白質。
  14. 如請求項13之方法，其中該宿主大腸桿菌細胞來自提供高度蛋白質表現的菌株，該菌株視情況選自C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)及C0214(DE3)(NCIMB 40884)。
  15. 一種組合物，其包含如請求項1至12中任一項之重組型脂化融合蛋白質或根據如請求項13或14之方法產生的重組型脂化融合蛋白質，及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。
  16. 如請求項15之組合物，其中該組合物進一步包含一或多種非脂化SP抗原，其中該一或多種非脂化SP抗原係視情況選自肺炎球菌表面蛋白質A(PspA)、肺炎球菌表面蛋白質C(PspC)、肺炎球菌β-半乳糖苷酶(BgaA)、肺炎球菌磷酸膽鹼(ChoP)、肺炎球菌烯醇酶(Eno)、肺炎球菌玻尿酸解離酶(Hyl)、肺炎球菌自溶素A(LytA)、肺炎球菌神經胺酸酶(Nan)、肺炎球 菌附著性及毒性A(PavA)、肺炎球菌鐵獲取(PiaA)及Pht蛋白質(PhtA、PhtB、PhtD及PhtE)之肺炎球菌表面締合。
  17. 一種用於預防或治療SP感染之疫苗，其包含如請求項1至12中任一項之重組型脂化融合蛋白質，或根據如請求項13或14之方法產生的重組型脂化融合蛋白質，及佐劑。
  18. 如請求項17之疫苗，其中該疫苗進一步包含一或多種非脂化SP抗原，該一或多種非脂化SP抗原係選自肺炎球菌表面蛋白質A(PspA)、肺炎球菌表面蛋白質C(PspC)、肺炎球菌β-半乳糖苷酶(BgaA)、肺炎球菌磷酸膽鹼(ChoP)、肺炎球菌烯醇酶(Eno)、肺炎球菌玻尿酸解離酶(Hyl)、肺炎球菌自溶素A(LytA)、肺炎球菌神經胺酸酶(Nan)、肺炎球菌附著性及毒性A(PavA)、肺炎球菌鐵獲取(PiaA)及Pht蛋白質(PhtA、PhtB、PhtD及PhtE)之肺炎球菌表面締合。
  19. 一種如請求項1至12中任一項之重組型脂化融合蛋白質或根據如請求項13或14之方法產生的重組型脂化融合蛋白質之用途，其係用於製造在個體中誘發針對SP感染之免疫用的藥物。
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