TWI734242B - 轉移癌之治療及預後 - Google Patents

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Abstract

在此揭示一種治療患有轉移癌個體的方法。所述方法包含施用所述個體一有效量之製劑，其能夠抑制個體轉移癌中EF手結構域蛋白D2 (EF-hand domain-containing protein D2, EFHD2)核酸或由該核酸編碼之多肽表現。所述製劑可以是2-芳基丙酸(2-aryl propionic acid, 2-APA)化合物或是短髮夾核醣核酸(short hairpin ribonucleic acid , shRNA)，其能夠透過RNA干擾機制切割EFHD2基因RNA。在此提供一種透過一個體的生物樣本偵測和/或預後個體是否患有轉移癌的方法。所述方法包含以下步驟，測量生物樣本內EFHD2核酸或多肽的含量；以及將所述生物樣本內之EFHD2核酸或多肽含量與健康個體的該些數值進行比對；其中當生物樣本內的EFHD2核酸或EFHD2多肽含量相對於健康個體之EFHD2核酸或EFHD2多肽含量高時，顯示個體之癌症可能轉移。

Description

轉移癌之治療及預後
本揭示內容是關於一種癌症預後和/或治療的方法，特別是轉移癌。
轉移(metastasis)是一系列複雜的步驟，其中腫瘤細胞(neoplastic cell)離開原腫瘤部位，並透過血流或淋巴系統遷移至身體其他部位，形成與原發腫瘤類似的新腫瘤。
早期預測或診斷出原發性癌症是否具有轉移的風險，能夠拯救生命，使得高危險族群能夠被密切追蹤，或針對轉移性癌症給予不同的治療方法。有鑑於此，本領域亟需一種方法預測個體之癌症是否可能發生轉移，以及需要一種治療患有轉移癌個體之方法。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
原則上，本揭示內容意外發現EF手結構域蛋白D2 (F-hand domain-containing protein D2, EFHD2)的表現和腫瘤轉移正相關。
因此，本揭示內容提供新穎的短髮夾核醣核酸(small hairpin ribonucleic acid, shRNA)，其能夠預防和/或轉移腫瘤；以及一種可基於腫瘤內是否存有EFHD2來偵測、抑制、預測和/或治療腫瘤轉移的新穎方法。
本揭示內容第一態樣是提供一單離(isolated)的雙股短髮夾核醣核酸(shRNA)，其能夠過RNA干擾機制進行EFHD2基因RNA之切割，其中shRNA分子中的單股包含一核醣核酸，其與由序列編號：1之核酸或其部份編碼而成之EFHD2基因RNA互補。
依據本揭示內容之實施方式， shRNA具有與序列編號：4序列相似度至少90%的核醣核酸。
本揭示內容第二態樣是關於一種治療患有轉移癌個體之方法。所述方法包含施用該個體一有效量之製劑，其中該製劑能夠抑制個體轉移癌中EFHD2核酸；或所述核酸編碼之多肽的表現。
依據本揭示內容部份實施方式，所述製劑是經分離的雙股shRNA，其可引導核醣核酸EFHD2之切割。在較佳的實施方式中，所述shRNA具有的核醣核酸序列與序列編號：4有至少90%的序列相似度，其由序列編號1之核酸或其部份所編碼。
依據本揭示內容其他實施方式，所述製劑是對於EFHD2具專一性的抑制劑。在某些實施方式中，所述抑制劑是能夠選擇性結合至EFHD2多肽的抗體。在又一實施方式中，所述抑制劑是經由SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)所鑑別出的適體，且該適體專一性結合至EFHD2 多肽。在其他實施方式中，抑制劑是2-芳基丙酸 (2-APA)，其係選自於以下所組成之群組：伊布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、氟白布洛芬(flurbiprofen)和可多布洛芬(ketoprofen)。
依據本揭示內容某些實施方式，所述方法更包含施用另一製劑至所述個體，其中該製劑能夠誘發窖蛋白-1 (caveolin-1, CAV1)表現。
轉移癌的實例包含但不限於乳癌(breast cancer)、胃癌(gastric cancer)、胃腸道基質瘤(gastric cancer, gastrointestinal stromal tumor, GIST)、肺癌（如，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC))和胰腺癌(pancreatic cancer)。
本揭示內容也揭示一種利用一個體之生物樣本預後所述個體是否具有轉移癌的方法。所述方法包含以下步驟。 測量該生物樣本內EFHD2核酸或EFHD2多肽含量；以及 比較該生物樣本內之EFHD2核酸或EFHD2多肽含量與一健康個體之EFHD2核酸或EFHD2多肽含量； 其中當該生物樣本內的該EFHD2核酸或該EFHD2多肽含量相對於該健康個體之EFHD2核酸或該EFHD2多肽含量高時，顯示該個體之癌症可能轉移。
依據本揭示內容之實施方式，所述生物樣本可以是組織切片樣本、 全血樣本、血漿樣本、 血清樣本、尿液樣本或黏液樣本。
依據本揭示內容實施方式 ，所述癌症是乳癌、胃癌、胃腸道基質瘤(GIST)、肺癌(如，非小細胞肺癌(NSCLC))或胰腺癌。
依據本揭示內容之實施方式，所述個體接受過癌移除手術。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
「表現」(expression)一詞是指當符合條件時可產生mRNA且通常可編碼出蛋白的轉錄作用。表現可於細胞中自然地實現或執行(即，無人為介入)或經人為實現或執行(即，具有人為介入，例如利用化學試劑來調控啟動子)。可利用由位置特異重組酶(site-specific recombinase)所引發的重組事件(例如與Cre相關之重組)來啟動表現。可測定基因轉錄之mRNA或基因編碼之蛋白來決定表現。
「核酸」(nucleic acid)一詞是指諸如去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)及核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)等多核苷酸。核酸包含但不限於，單股及雙股多核苷酸。例示性之多核苷酸包含DNA、單股DNA、cDNA及mRNA。「核酸」(nucleic acid)一詞亦包含由核苷酸類似物所組成之DNA或RNA類似物，及可應用之單股(正股(sense)或負股(antisense))及雙股多核苷酸。「核酸」(nucleic acid)一詞包含經修飾的多核苷酸，其係包含經修飾的DNA及經修飾的RNA，例如包含一或多非自然核苷酸及核苷的DNA及RNA。「核酸」(nucleic acid)及「多核苷酸」(polynucleotide)在本說明書為可互換的詞彙，是指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及其單股或雙股形式之聚合物。「核酸」(nucleic acid)一詞包含具有已知核苷酸類似物或經修飾之骨架殘基或連結的核酸，其中該修飾可以是合成、自然產生或非自然產生的修飾，且/或 具有與參照核酸相似的結合特性，且/或具有與參照核酸相似的代謝方式。例示性的類似物包含，但不限於，硫代磷酸化(phosphorothioates)、磷醯胺(phosphoramidates)、甲基磷酸酯(methyl phosphonates)、掌性甲基磷酸酯(chiral-methyl phosphonates)、2-O-甲基核糖核苷酸(2-O-methyl ribonucleotides)、胜肽-核酸(peptide-nucleic acids,PNAs)。除非另有所指，否則一特定的核酸序列亦包含其保留性修飾變異物(例如簡併密碼子取代(degenerate codon substitutions))、互補序列及明確指示之序列。
「多肽」(polypeptide)及「蛋白」(protein)在本說明書為可互換的詞彙，是指胺基酸殘基的聚合物、該聚合物的變異物及合成類似物。因此，該些詞彙可指胺基酸聚合物，其中一或多胺基酸殘基為合成性之非自然產生的胺基酸，例如自然產生之胺基酸的化學類似物；以及自然產生的胺基酸聚合物。本說明書之多肽不侷限於特定長度的產物；因此，本說明書對多肽的定義包含多肽、寡肽(oligopeptide)及蛋白，且除非另有所指，該些詞彙為可互換的詞彙。本說明書所述多肽亦可以包含表現後修飾，例如醣化(glycosylation)、乙醯化(acetylation)及磷酸化(phosphorylation)等，以及本所屬領域所熟知之其他類型的修飾(包含自然產生及非 自然產生的修飾)。多肽可以是完整蛋白、完整蛋白之次序列、完整蛋白之片段、完整蛋白之變異或完整蛋白之衍生物。
在此所述「相似度(identical)或相似度百分比(percent identity)」是指兩條或兩條以上序列或子序列(subsequences)間當進行最大對應(maximum correspondence)之比對時，核苷酸或胺基酸殘基間相同或特定的百分比。為了測定相似度百分比，將序列以最佳比對目的進行排列（如，可將間隙引入至第一序列的序列中，使其與第二序列有最佳比對結果）。接著比較相應核酸或胺基酸位置的核苷酸或胺基酸殘基。當第一序列中的核苷酸或胺基酸位置上有與第二序列相對應位置相同的胺基酸或胺基酸殘基時，在該核苷酸或胺基酸位置上的分子為一致的。所述兩條序列間之序列相似百分比是序列間共有之核苷酸或胺基酸位置相同之數量的函數（即，相似度%＝(相同位置之數量/總位置數量)*100）。相關領域已有多種方法可供進行上述比對，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）等。本技術領域相關人士可以決定適合比對時所使用的參數，包含在比對全長序列時，欲實現最大比對結果所需的任一種演算法。在特定的實施方式中，兩條序列長度相同。因此，序列相似度100%，舉例來說是在兩個具有相同或不同數量殘基的方子中比對20個連續胺基酸殘基，該些分子中有20個殘基皆相同。
所述「治療(treatment)」一詞係指得到所欲的藥學和/或生理學效果；例如，延緩或抑制癌轉移。上述的效果是指能夠部分或完全地治癒或預防個體出現所述疾病的症狀。所述「治療(Treatment)」包含預防、治療或減緩一哺乳類的疾病，尤其是人類。所述治療包含：(1)預防(如，預防用藥)、治療或減緩一個體的疾病或症狀，其中所述個體可能患有疾病但尚未被診斷；(2)抑制一疾病(即，降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關之病理變化的風險)；或(3)治癒一疾病(即，減少與所述疾病相關的症狀)。
所述「施用(administered) (administering)(administration)」一詞係指傳遞方式包含，但不限於，靜脈內(intraveneously)、肌肉內(intramuscularly)、腹膜內(intraperitoneally)、動脈內(intraarterially)、顱內(intracranially)或皮下(subcutaneously)傳遞製劑(如，能夠干擾EFHD2基因表現之EFHD2抗體或短髮夾核醣核酸(shRNA))。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指一成分的用量、劑量和施用的期間，足以招致所欲的反應或效果，即，能有效治療轉移癌。以治療轉移癌為例，所述製劑(即，EFHD2抗體或能夠干擾EFHD2 RNA表現之小RNA)能用以降低、預防、延緩、抑制或遏止EFHD2之表現，可以有效預防癌症細胞散布至其他區域和/或生長。一製劑的有效量不必然能夠治癒一疾病或症狀，但能延緩、阻礙或預防疾病或症狀的發生，或延緩疾病或症狀相關的病徵。具體的治療有效量或足夠用量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件（如，患者體重、年齡或性別）、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法（如果有的話）的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成酯類前驅藥的總重量（譬如以克、毫克或微克為單位）或表示成酯類前驅藥重量與體重比例（其單位為毫克/公斤（毫克/公斤））。所術治療有效量可分成一、二或更多劑量於單一施用劑量型式，且可於一指定期間內施用一次、二次或更多次。
所述「個體(subject)」或「患者(patient)」一詞可交互使用，且在此係指可接受本揭示內容化合物治療之動物(包含，人類)。所述「哺乳類(mammal)」一詞涵蓋哺乳綱的所有成員，包含：人類、靈長類動物、家畜和農畜。舉例而言，所述家畜或農畜可以是兔子、豬、羊和牛。所述哺乳類亦可涵蓋動物園或競賽用動物、寵物，以及齧齒類(如，小鼠和大鼠)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。  再者，所述「個體」或「患者」包含可從本揭示內容的治療方法得到良好治療效果的動物。舉例而言，所述「個體」或「患者」包含，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竹鼠、豬、猴子、豬、羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0。5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
2. 具體實施方式
2.1 預後癌轉移之方法和/或套組
本揭示內容是至少一部分是基於意外發現EF手結構域蛋白D2 (EF-hand domain-containing protein D2, EFHD2)表現與腫瘤轉移有正向關聯。因此，本揭示內容提供一種診斷或預後生物標記(即，EFHD2)，其能夠區別轉移性或非轉移性癌，以及於治療過程偵測和監控轉移癌細胞。再者，所述抑制EFHD2表現之製劑具有潛力作為進一步發展用於治療和/或預防癌症之醫藥品的候選物，特別是針對轉移癌。
本揭示內容提出一種藉由個體之生物樣本預後個體是否具有轉移癌的方法。所述方法包含以下步驟：測量生物樣本內EFHD2核酸或多肽量；以及將生物樣本內之EFHD2核酸或EFHD2多肽量與一健康個體之EFHD2核酸或EFHD2多肽量進行比對；其中當該生物樣本內的EFHD2核酸或EFHD2多肽量相對於健康個體之EFHD2核酸或EFHD2多肽量高時，顯示該個體之癌症可能轉移。
依據本揭示內容之實施方式 ，個體患有或曾經患有之癌症，是指乳癌、胃癌、胃腸道基質瘤(GIST)、肺癌(如，非小細胞肺癌(NSCLC))或胰腺癌。依據本揭示內容某些實施方式，所述個體先前已接受過癌症手術切除。
為了實施本發明之方法，首先，從個體取得生物樣本。舉例而言，適合本方法的樣本包含但不限於，組織切片樣本、全血樣本、血漿樣本、血清樣本、尿液樣本和黏液樣本。依據本揭示內容較佳的實施方式，係利用肺組織切片樣本進行預後。
依據本揭示內容之實施方式，測量EFHD2核酸量是指測量EF6HD2 mRNA量，其可利用本發明技術領域中具有通常知識者通常使用或已知的任一種分析法測定。為此，可利用具有高腐蝕性的化學溶液（例如，酚(phenol)、三氯乙酸/丙酮(trichloroacetic acid/acetone)和Trizol萃取生物樣本中的總RNA，再以氯仿中和。將混合物離心，以有機溶液(如，乙醇和異丙醇)沈澱液相中經萃取的RNA。經萃取的RNA接著以乙醇清洗，去除任何污染的蛋白質，接著進行乾燥（如，空氣乾燥和真空乾燥）產生RNA團塊(pellet)。將RNA團塊溶解於經焦碳酸二乙酯處理的水(diethylpyrocarbonate-treated H2 O, DEPC H2 O)，及透過逆轉錄(reverse transcription, RT)轉換成相對應的cDNA。原則上，逆轉錄是藉由混合RNA和Oligo(dT)20 引子、去氧核醣核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)(dNTP)，其包含dATP、dGTP、dTTP和 dCTP)、逆轉錄酶(reverse transcriptase)、反應緩衝液(reaction buffer)和非必要地添加逆轉錄酶輔因子(如，MgCl2 )所完成。在較佳的實施方式中，所述反應混合物更包含二硫蘇糖醇(dithiothreitol)(DTT)，用於穩定逆轉錄酶的氧化還原試劑，以及用於預防逆轉錄過程中RNA遭降解的RNase抑制劑。cDNA可作為模版再經定量聚合酶鏈反應分析(qPCR)進行定量，或進行微陣列分析(如，cDNA和寡核苷酸陣列分析)。依據一具體的實施例，利用qPCR測定EFHD2之mRNA量。
依據本揭示內容其他實施方式，可利用測定生物樣本中EFHD2多肽量取代測定EFHD2核酸量。舉例而言，將生物樣本與EFHD2之抗體培養在特定條件下，以形成一免疫複合物，其可利用西方墨點法、酵素連結免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫組織化學分析(immunohistochemistry, IHC)、免疫細胞化學(immunocytochemistry, ICC)分析、免疫螢光(immunofluorescence , IF)分析或luminex分析觀察和/或定量。依據一實施例，利用IHC測定EFHD2之蛋白量。
基於生物樣本內所測得的EFHD2核酸或多肽量，醫生或臨床人員可將測得的量與健康個體（即，未罹患癌症個體）之EFHD2核酸或多肽量相比較，判定所述生物樣本是否為癌化樣本，以及個體患有的癌症是否可能發生轉移。依據本揭示內容之實施方式，當生物樣本內的EFHD2核酸或EFHD2多肽量相對於健康個體之EFHD2核酸或EFHD2多肽量高時，顯示個體之癌症可能轉移。
因此，本揭示內容提供一套組，其能夠測量生物樣本內EFHD2核酸或多肽的含量。
依據某些實施方式，套組中的組成包括一容器；一EFHD2之抗體；至少一製劑，其適合用以偵測生物樣本內EFHD2與抗EFHD2抗體的結合；以及與容器相關的說明書，並用以說明如何使用抗體測定生物樣本中的EFHD。所述說明書的形式可以是手冊、CD、VCD、DVD或軟體應用程式。所述套組可更包含陰性對照物，其用以表示健康個體內EFHD2核酸或多肽的正常量。
2.2  治療和/或預防轉移癌的方法
本揭示內容之目的在於提供治療和/或預防性治療患有轉移癌之個體。為達此目的，在此提供一種能夠抑制EFHD2之表現的製劑，並且其可作為預防和/或治療轉移癌的醫藥品。
本揭示內容進一步包含一種用以治療患有轉移癌個體的方法。所述方法包含：施用一有效量之製劑至所述個體，其中該製劑能夠抑制轉移癌個體中EFHD2核酸或一編碼所述核酸之多肽的表現。
依據一較佳的實施方式，可利用能夠透過RNA干擾引導EFHD2基因RNA切割之單離雙股shRNA作為製劑。所述shRNA的特徵在於核醣核酸的一股可與EFHD2基因之RNA互補。 依據本揭示內容實施方式，所述shRNA是以序列編號：1之核酸或其部份編碼而成，且所述核醣核酸和序列編號：4有90%之序列相似度。
依據本揭示內容其他實施方式，對於EFHD2具專一性之抑制劑可作為所述製劑。抑制劑可以是能夠選擇性結合至EFHD2多肽的抗體或經由SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)鑑別出的適體，並且能夠避免其發揮任何生物活性，例如，活化其他能夠導致癌轉移的細胞性蛋白。此外，所述抑制劑可以是能夠抑制EFHD2表現的化合物。依據本揭示內容之實施方式，2-芳基丙酸化合物(2-APAs)為較佳的EFHD2抑制劑。癌細胞含有較高量的內源性EFHD2，降低EFHD2的表現量可以減緩癌細胞生長。適合本揭示內容之2-APA化合物包含但不限於伊布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、氟白布洛芬(flurbiprofen)和可多布洛芬(ketoprofen)。在一較佳的實施方式中，所述EFHD2抑制劑是伊布洛芬，其可有效抑制人類非小細胞肺(NSCL)癌細胞中EFHD2表現；然而，非類固醇消炎藥物(non-steroid anti-inflammatory drugs, NSAID)，例如，阿斯匹靈(aspirin)、雙氯芬酸(diclofenac)、酮咯酸(ketorolac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、匹洛西卡(piroxicam)和舒林酸(sulindac)並無相同的效果。
依據其他實施方式，以EFHD2抑制劑(如，2-APA)前處理的癌細胞對於抗癌藥物的治療較具感受性。在一較佳的實施方式中，經伊布洛芬處理之人類NSCL癌症細胞對於後續施用抗癌藥物(如，順鉑)較具感受性。適合本發明所使用的抗癌藥物包含，但不限於，順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxalipatin)、長春鹼(vinblastine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、胺甲喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、溫諾平(vinorelbine,)、阿黴素(doxorubicin)、歐洲紫杉醇(docetaxel)、博萊黴素(bleomycin)、達卡巴仁(dacarbazine)、莫司汀(mustine)、長春新鹼(vincristine)、卡巴嗪(procarbazin)、培尼皮質醇(prednisolone)、泛艾黴素(epirubicin)，和卡培他濱（capecitabine）。在其他較佳的實施方式，相較於單獨施用順鉑(5毫克/公斤，注射，每週一次)，單獨施用伊布洛芬(25毫克/公斤，口服，每週三次)於降低腫瘤尺寸上較為有效；而相較於單獨施用順鉑或伊布洛芬，併用伊布洛芬和順鉑時於降低腫瘤尺寸上更為有效。
依據本揭示內容部份實施方式，發現EFHD2多肽過度表現與窖蛋白-1 (CAV1)之表現受抑制相關，表示EFHD2可透過抑制CAV1展現其生物功能。因此，在可任選或非必要地實施方式中，所述方法可包含施用所述個體其他能夠活化窖蛋白-1 (CAV1)表現之製劑。舉例而言，可建構出攜帶有CAV1基因之載體，並作為製劑對抗癌症患者中內源性EFHD2的作用，進而防止原發性腫瘤之癌細胞轉移至患者身體的其他部位。
依據本揭示內容之實施方式，所述個體是患有或曾經患有癌症，其可以是乳癌、胃癌、胃腸道基質瘤 (GIST)、肺癌(如，非小細胞肺癌(NSCLC))或 胰腺癌。依據本揭示內容某些實施方式，所述個體先前已接受過癌症手術切除，如，NSCLC。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
材料與方法
細胞株和細胞培養。人類肺腺癌細胞 A549和H1299來自於美國菌種中心(American Type Culture Collection, ATCC; Maryland, USA)。人類肺腺癌細胞株CL1-0來自於台大醫院（臺北，臺灣）。CL1-5-F4 (F4) 細胞株之建立是依據Chu YW等人所揭示的步驟(Am J Respir Cell Mol Biol (1997) 17:353-360)從CL1-0選擇出更具侵襲性的細胞群。H1299和F4細胞培養於DMEM/F-12培養基(Invitrogen)。A549和CL1-0細胞維持於RPMI 1640培養基(Invitrogen)。所有培養基額外添加10%胎牛血清和1%抗生素(GIBCO)。所有細胞置於潮濕大氣環境(5% CO2 和95%空氣)於37°C生長。
動物。所有動物研究所涵蓋的步驟(2017-305)皆經中國醫藥大學附設醫院(CMUH)（臺中，臺灣）實驗動物照護及使用委員會（IACUC）核准。5週齡公BALB/c 裸鼠 (18至25克)取自於國家實驗動物中心(臺北，臺灣)。小鼠飼養於光照週期為12小時光照與12小時黑暗的環境，並採自由進食和自由飲水。
西方墨點法。蛋白質分別利用10%或12.5% SDS-PAGE分離，並透過電墨點法轉移至PVDF膜上，(400V，於4°C處理3小時)（25 mmol/L Tris-HCl、197 mmol/L 甘胺酸和13.3% (v/v)甲醇）。接著，利用TBST (5% (w/v)脫脂牛奶)進行遮斷反應，接著以初級抗體於室溫下進行培養至隔夜。於清洗TBST後，再利用結合有辣根過氧化物(horseradish peroxidase)的二級抗體於室溫下培養一小時。依據製造商的說明書(NEN Life Science)利用增強ECL受質顯示免疫反應訊號。在此所使用的初級抗體包含EFHD2 (ab106667；abcam)、E-鈣黏蛋白 (#5296；細胞訊號)、波形蛋白 (#3932；細胞訊號)、CAV1 (#3238；細胞訊號)和β-肌動蛋白 (ab8226；abcam)。
免疫組織化學分析。利用BenchMark XT自動染色機(Ventana Medical Systems) iVIEW 3,3-二氨基聯苯胺(3,3-diaminobenzidine)(DAB)偵測套組(Ventana Medical Systems)完成免疫組織化學分析(Immunohistochemical assays, IHCs)。將含人類肺腺癌組織之石蠟切片(4 µm)去除石蠟、復水(hydrated)，及加熱至95-100°C  4分鐘，誘導抗原修復。使內源性過氧化酶活性失活後，利用兔抗人類EFHD2多株抗體(#ab119119；abcam；1:1,200)完成IHC染色。組織切片最終以iVIEW銅培養4分鐘，增強訊號強度。接著，以蘇木精(hematoxylin)複染、脫水、固定，及利用Eclipse E600光學顯微鏡 (Nikon)觀察。所有染色結果均由經驗豐富的組織學家進行評估。
傷口癒合實驗(Wound healing assay)。 利用細胞培養容器Culture-Insert well (ibidi GmbH，Germany)進行體外遷移分析。癌細胞 (4.5 x104 細胞)以合適的培養基及容器培養24小時。於移除Culture-Insert後，癌細胞再額外培養8小時。記錄癌細胞遷移距離，並且利用ImageJ 軟體測量遷移區域。
基質膠侵襲分析(Matrigel invasion assay)。於體外侵襲分析中，將癌細胞 (1.5×105 細胞於200 µL中)懸浮至PET膜轉移室(PET membrane transwell insert chamber) BD Biosciences)的上半部，所述PET膜轉移室塗覆有基質膠(1毫克/毫升；BD Biosciences)，並位於24孔盤上。PET膜轉移室的下方添加含10% FBS之培養基作為趨化劑。置於37°C培養24小時後，通過轉移室之癌細胞以3.7％福馬林(formalin) (Sigma-Aldrich)固定，再以0.1%結晶紫(crystal violet) (Sigma-Aldrich)染色。
MTT分析
是一種比色分析法用以測定酵素活性(即，還原酶)，在活細胞中，所述酵素可以還原3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)，使黃色的四唑(tetrazole)轉變成紫色的三苯基甲脂(formazan)。此一還原反應僅發生於存活的細胞；因此，MTT分析通常是用來評估細胞存活率及增殖。簡而言之，添加不同劑量之試驗化合物(即，特錠劑量之伊布洛芬和/或順鉑)至細胞中處理24時。接著，添加MTT染劑(500微克/毫升)，進行反應4小時，再以500微升之異丙醇終止試驗。以分光光度計測定溶液在波長570nm下的吸光值。
短髮夾干擾RNA (shRNAs)之建構
分別建構和合成表2可轉錄成切割編碼EFHD2、GFP和CAV1基因的短髮夾干擾RNA之核酸。陰性控制組shRNA和目標shRNA是由RNA技術平台與基因操控核心設施（RNAi Core Facility)(中央研究院，臺北，臺灣)所提供。轉錄的shRNA列示於表3。
表2 轉錄本發明shRNA之核酸
名稱 序列(5’- 3’) 正股 序列編號：
shEFHD2 CCGGG AGAAG ATGTT CAAGC AGTAT CTCGA GATAC TGCTT GAACA TCTTC TCTTT TTTG 1
shGFP CCGGC AACAG CCACA ACGTC TATAT CTCGA GATAT AGACG TTGTG GCTGT TGTTT TTG 2
shCAV1 CCGGG ACGTG GTCAA GATTG ACTTT CTCGA GAAAG TCAAT CTTGA CCACG TCTTT TT 3
表3  本發明 shRNA之核醣核酸序列
名稱 序列(5’- 3’) 序列編號：
shEFHD2 GGCCC UCUUC UACAA GUUCG UCAUA GAGCU CUAUG ACGAA CUUGU AGAAG AGAAA AAAC 4
shGFP GGCCG UUGUC GGUGU UGCAG AUAUA GAGCU CUAUA UCUGC AACAC CGACA ACAAA AAC 5
shCAV1 GGCCC UGCAC CAGUU CUAAC UGAAA GAGCU CUUUC AGUUA GAACU GGUGC AGAAA AA 6
RNA分離和定量聚合酶鏈反應(qPCR)
利用TRIzol試劑(Invitrogen)萃取總RNA。RT-PCR是利用1 μg之樣本和MMLV First-Strand合成套組(GeneDireX)所完成，接著10倍稀釋RT-PCR產物以進行qPCR分析。利用KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix套組(Kapa Biosystems)以LightCycler 480設備(Roche)完成qPCR。GAPDH作為內源性對照(endogenous control)。利用2− ΔΔCt 以Ct比較法評估特定DNA表現。
轉染合成shRNA建構物至A549 細胞
A549細胞株維持並培養在96孔盤中，接著於隔日添加lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carisbad, CA USA)將帶有特定shRNA之質體轉染至細胞中。具體而言，以無抗生素之DMEM 培養基，於室溫、試驗期間25分鐘的條件，讓5µg之peIF4G質體（含本發明shRNA (shEFHD2, shGFP或shCAV1)）以及9µl之lipofectamine 2000形成複合物。將複合物添加至A549細胞維持並培養於96孔盤中，進一步培養24小時。在篩選具shRNA高表現率之細胞上，利用含嘌黴素(puromycin)之培養基挑選出穩定地人類或鼠表現shRNA細胞株和陰性對照siRNA，並且經選擇的細胞株維持於含有嘌黴素之培養基中。利用RT-PCR分析RNA量或西方墨點法分析蛋白量偵測目標基因表現，以確認A549細胞中shRNA之轉染。
製備異種移植小鼠模型
於BALB/c裸鼠背部以立體定位注射方式原位異種移植H1299細胞 (1x106 細胞)。每週利用IVIS測量小鼠腫瘤進程（包含生長和轉移），連續測量七週。
統計學分析
所述數據以平均數±標準差(means ± SD)表示，以及類別資料以頻率(frequencies)和比例(proportions)呈現。利用連續變數學生t -試驗（連續變數）以及卡方檢定(Chi-square test)或費雪爾正確概性檢定(Fisher’s exact test)（類別變數）檢驗差異之顯著性。利用Kaplan-Meier法測定整體存活率和無疾病存活率(disease-free survival)，並與利用對數秩檢定(log-rank test)之測定相較之。利用Cox比例風險模型(Cox proportional hazard model)完成與無疾病存活期相關的獨立因素之多變量分析。利用IBM SPSS Statistics 22 (IBM Co.)進行數據之統計分析。P > 0.05視為具有統計顯著性。
實施例1 EFHD2 促進肺腺癌細胞之上皮細胞間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)和轉移能力
為了測定EFHD2是否有助於肺腺癌細胞之轉移能力，利用pcDNA載體使A549細胞中的EFHD2過度表現，以及shRNA (即，shEFHD2)以減弱H1299 細胞中的EFHD2。在MTT試驗中，過度表現和減弱EFHD2對於細胞生長並無顯著影響。然而，A549細胞中EFHD2過度表現能夠顯著增加遷移和侵襲能力，而在H1299中EFHD2減弱有相反的效果，定量結果分別示於第1圖(A)和 (B)。
先前研究指出EFHD2 調節肌動蛋白束和F-肌動蛋白結構，並有助於板狀偽足(lamellipodia)之形成(Huh Y. H.等人，Cell Mol. Life Sci. 70,4841-4854 (2013))，代表其為轉移過程的重要驅動因素。因此，利用共軛焦顯微鏡觀察EFHD2對板狀偽足形成的影響。這些圖像顯示EFHD2增加侵襲性偽足樣突起結構並形成侵襲性偽足，該些結果可透過皮層肌動蛋白和F-肌動蛋白共定位以肉眼觀察(第1圖(C))。此外，相較於對組細胞，EFHD2過度表現之A549具有侵襲性偽足結構的細胞明顯較多。(第1圖(D))。
當腫瘤細胞從原發病灶處擴散至遠處器官時，上皮間質轉化（EMT）是轉移開始時的重要步驟。為了測定EFHD2是否調節EMT程式，測量EFHD2過度或減量表現後EMT相關蛋白之表現。西方墨點法之結果顯示EFHD2減量表現會降低H1299和H2981細胞中間質細胞標記波形蛋白的表現(第2圖(A))。相對地，在A549和CL1-0 細胞中，EFHD2過度表現會增加間質細胞標記波形蛋白的表現，以及降低上皮細胞標記E-鈣黏蛋白之表現(在CL1-0無法測得E-鈣黏蛋白)(第2圖(B))。此外，EFHD2會增加A549細胞中EMT相關轉錄因子Snail、Twist1、ZEB1的表現，而EFHD2減量表現會一併降低該些因子的表現(數據未揭露於此)。
綜上，所述結果顯示EFHD2有助於促進肺腺癌細胞進行EMT程式和轉移。
實施例2  EFHD2透過抑制CAV1促進EMT
為調查調控EMT中EFHD2潛在機制，利用比較蛋白質體學分析測定EFHD2過度表現對於蛋白質特徵(protein signatures)的影響。在EFHD2-過度表現和對照組之A549中總共鑑定出 3,904個蛋白，並利用無標籤蛋白質體學方法(label-free proteomic method)定量蛋白質。相較於對照細胞（數據未顯示），EFHD2過度表現之A549細胞中有338個蛋白之表現量超過5倍，並且有383個蛋白之表現量小於0.2倍。鑑於EFHD2與轉移相關，於PubMed網站上以「經鑑定蛋白(identified protein)」和「轉移」進行檢索，以鑑別出EFHD2的潛在標的，其以西方墨點法驗證。結果顯示當EFHD2過度表現時，窖蛋白-1(CAV1)之表現顯著降低。在此，不僅以西方墨點法及共軛焦顯微鏡分析確認蛋白質量表現(第3圖(A)和(B))，也以qPCR測定mRNA量表現(第3圖(C))，證實EFHD2能夠顯著抑制CAV1表現。
為了確認EFHD2是否透過抑制CAV1調控EMT，在此進行母A549細胞CAV1減量表現和EFHD2過度表現之A549細胞之CAV1回復(rescue)試驗。CAV1直接減量表現使得間質細胞標記波形蛋白的表現量增加，並減少上皮細胞標記E-鈣黏蛋白之表現(第3圖(D))。在回復試驗中，A549 細胞CAV1之再表現部分破壞EFHD2誘導的EMT(第3圖(D))。此外，CAV1減量表現增強EMT相關轉錄因子Twist1、ZEB1和ZEB2表現，與A549 細胞中EFHD2過度表現的效果相似(數據未顯示)。
綜上，所述結果顯示EFHD2能夠透過抑制CAV1促進EMT。
實施例3  2-APA抑制癌細胞EFHD2表現
在此實施例中，研究2-APA化合物和非類固醇消炎藥物(NSAID)分別對於H1299和F4 細胞之影響。結果示於第4圖。
結果顯示2-APA化合物（包含伊布洛芬、萘普生、氟白布洛芬和可多布洛芬）能夠有效抑制EFHD2表現(第4圖(A))，而NASIDs（包含阿斯匹靈、雙氯芬酸、酮咯酸、甲芬那酸、匹洛西卡和舒林酸）不具有相同的功效(第4圖(B))。
實施例4  伊布洛芬對於癌細胞之EFHD2表現的影響
基於實施例3的實驗結果，選擇伊布洛芬作為2-APA的例示化合物更進一步研究其對於癌細胞中EFHD2表現的影響。
4.1  伊布洛芬 抑制EFHD2表現和癌細胞遷移
請參見第5圖，其中伊布洛芬能夠降低H1299和F4細胞中的EFHD2表現量，且具有劑量依賴性(第5圖(A))；再者，所述H1299和F4細胞遷移和侵襲能力也減弱(第5圖，(B))。
4.2  伊布洛芬活化蛋白酶體和溶酶體EFHD2降解
為了得知伊布洛芬如何抑制EFHD2表現，利用qPCR 先測定經/未經伊布洛芬處理之EFHD2 mRNA量。然而，結果顯示伊布洛芬並不影響EFHD2 mRNA量的改變(數據未顯示)。
由於泛素-蛋白酶體路徑(ubiquitin-proteasome pathway)和自噬-溶酶體路徑(autophagy-lysosome pathway)是引起細胞性蛋白質降解的兩個主要系統，在此進一步研究這二系統中任一系統是否參與伊布洛芬媒介EFHD2降解。為達成前述目的，利用MG132和巴佛洛黴素A1 (bafilomycin A1, Baf-A1)分別抑制蛋白酶體和自噬蛋白降解。結果顯示單以MG132或Baf-A1無法降低伊布洛芬誘導的EFHD2降解，但併用MG132和Baf-A1可以穩定EFHD2(第6圖)。由此可以證實，伊布洛芬誘導的EFHD2降解是透過依賴蛋白酶體和溶酶體機制。
實施例5  伊布洛芬能夠增強癌細胞對於化療藥物的感受性
5.1 伊布洛芬透過抑制EFHD2能夠增強癌症細胞對於化療藥物的感受性
在此實施例中，研究比較伊布洛芬及其與化療藥物(即，順鉑)1\併用對於表現EFHD2與否之H1299細胞存活力之作用。為達此目的，依據實施例1所示之步驟，H1299細胞利用本發明 shRNA (即，H1299shEFHD2 ) 進行前處理，以降低H1299 細胞中EFHD2的表現；以及對照組細胞是以shGFP進行前處理。結果示於第7圖。
參見第7圖，正常H1299細胞（即，H1299shGFP ）和EFHD2減量表現之H1299細胞（H1299shEFHD2 ）的存活率均隨順鉑濃度的增加而降低。接著，合併伊布洛芬 (600 μM)和順鉑(1、2、5、10或20 μM)(即，H1299shGFP +伊布洛芬)處理之正常H1299 細胞的存活率低於單以順鉑處理之正常細胞（即，H1299shGFP )，由此可見伊布洛芬能夠增強H1299 細胞 對於之後施用順鉑的感受性，導致正常H1299 細胞存活率較低。然而，在缺少EFHD2表現之細胞上，合併使用伊布洛芬和順鉑(即，H1299shEFHD2 + 伊布洛芬)處理的存活率，相較於以相同方式處理的對照細胞(即，H1299shGFP + 伊布洛芬)，其顯示伊布洛芬透過抑制EFHD2發揮作用。
5.2伊布洛芬不會增強缺乏內源性EFHD2之癌細胞對於化療藥物之感受性
在此實施例中，不以干擾RNA使內源性EFHD2表現量降低，而是利用低量內源性EFHD2之人類肺腺癌細胞A549進一步說明伊布洛芬的作用(即，增強癌症細胞對於化療藥物的感受性)。結果示於第8圖。
實驗結果顯示，缺少內源性EFHD2會導致伊布洛芬無法增強細胞對於順鉑處理 (A549pcDNA vs A549pcDNA + 伊布洛芬)的感受性，以及額外添加轉染有攜帶外源性EFHD2基因載體之A549細胞，該細胞對於順鉑處理較具抗性(A549pcDNA vs A549pEFHD2 )。然而，以伊布洛芬處理具外源性EFHD2之A549 細胞，無法增加其對於順鉑的感受性(A549pEFHD2 vs A549pEFHD2 + 伊布洛芬)，此可能是A549細胞中EFHD2的量過度表現所導致的，使得無法利用伊布洛芬處理抑制EFHD2。
實施例6  2-APA使癌細胞對於化療藥物致敏化
在此實施例中，研究2-APA(如，伊布洛芬、氟白布洛芬、萘普生和可多布洛芬)和順鉑對於F4細胞的影響。
與實施例5的結果相似，當肺癌F4細胞先以2-APA (20 μM)（包含伊布洛芬、氟白布洛芬、萘普生和可多布洛芬）進行前處理，該些細胞對於後續以順鉑處理時變得較敏感，造成更多的細胞死亡（相較於控制組；數據未示於此)。
實施例7  合併伊布洛芬和順鉑進行治療能夠協同降低腫瘤尺寸
在此實施例中，研究伊布洛芬和順鉑合併治療對於異種移植小鼠體內治療的效果，其中所述異種移植小鼠是依據「材料和方法」一節所示之步驟製備而成。為進行治療，所述小鼠利用順鉑(5毫克/公斤，經注射，每週一次，連續施用三週)和伊布洛芬(25毫克/公斤，經口服，於順鉑注射當天，以及注射前和後一日)進行治療，該些藥物可單獨或合併施用。 接著犧牲小鼠，摘取腫瘤並進行分析。結果示於第9圖。
結果顯示，以順鉑進行治療能夠顯著降低腫瘤尺寸，單獨施用伊布洛芬同樣具有類似的功效，且甚至比順鉑更有效。此外，令人意外的是合併使用順鉑和伊布洛芬對於減少腫瘤尺寸上具有協同效果。。
綜上所述，本揭示內容鑑別並確認EFHD2與腫瘤轉移和生長極為相關。因此，能夠抑制EFHD2表現的製劑(無論是干擾RNA或化合物)能夠作為發展預防腫瘤細胞生長和/或轉移醫藥品之先導化合物。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖，EFHD2增加肺腺癌細胞之轉移能力。測定A549細胞EFHD2過度表現和H1299細胞EFHD2減量表現(knockdown)對於轉移能力的影響。(A)以傷口癒合實驗(wound-healing assay)分析遷移能力。(B)以轉移盤侵襲遷徙試驗(transwell invasion assay)分析侵襲能力。(C)以皮層肌動蛋白(cortactin) (綠色)和F-肌動蛋白(F-actin)(紅色)螢光共定位(colocalized)觀察到侵襲性偽足(invadopodia)。(D) 侵襲性偽足之癌症細胞的定量結果N=100細胞/樣本。**，P > 0.01； 第2圖，EFHD2促進EMT；利用西方墨點法(Western blot assay)測定EMT相關標記E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)之蛋白表現結果，其中(A)EFHD2減量表現之H1299和H2981細胞，以及(B)EFHD2過度表現之A549和CL1-0細胞。β-肌動蛋白為上樣對照(loading control)； 第3圖，EFHD2部份透過CAV1之抑制促進EMT，其中(A)利用西方墨點法測定EFHD2對於A549和CL1-0 細胞中CAV1表現之影響，β-肌動蛋白為上樣對照；(B)利用共軛焦顯微鏡分析EFHD2過度表現之A549 細胞及其對照組的CAV1蛋白；(C)利用qPCR分析EFHD2過度表現之A549 細胞及其對照組中的CAV1 mRNA量；(D)利用西方墨點法測定A549細胞中CAV1減弱表現和EFHD2過度表現之A549 細胞中CAV1再表現對於E-鈣黏蛋白和波形蛋白量的影響； 第4圖，抑制癌症細胞中EFHD2表現的是2-APAs化合物而非NSAID化合物；利用西方墨點法測定(A) 2-APA化合物包含伊布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、氟白布洛芬(flurbiprofen)和可多布洛芬(ketoprofen)；以及(B) NSAID 化合物包含阿斯匹靈(aspirin)、雙氯芬酸(diclofenac)、酮咯酸(ketorolac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、匹洛西卡(piroxicam)和舒林酸(sulindac)對於H1299和F4細胞中EFHD2的影響。β-肌動蛋白為上樣對照； 第5圖，伊布洛芬降低癌症細胞中EFHD2表現，其中(A)利用西方墨點法分別測定不同劑量之伊布洛芬對於H1299和F4細胞中EFHD2的影響；(B)利用轉移盤遷徙系統分析伊布洛芬對於H1299和F4細胞對於侵襲和遷徙能力的影響； 第6圖，伊布洛芬活化EFHD2之蛋白酶體和溶酶體降解；H1299細胞以MG132和/或Baf-A1預處理0.5小時，接著以600 µM伊布洛芬處理既定時長；利用西方墨點法測定EFHD2表現； 第7圖，伊布洛芬增強癌細胞對於化療藥物的感受性；利用MTT分析測定經/未經伊布洛芬和/或順鉑處理之對照細胞(H1299shGFP )或以RNA干擾技術敲除EFHD2表現細胞(H1299shEFHD2 )的細胞存活率； 第8圖，伊布洛芬無法增強缺乏內源性EFHD2之癌細胞對於化療藥物之感受性，用MTT分析測定經/未經伊布洛芬和/或順鉑處理之對照細胞(A549pcDNA )或轉染有攜帶內源性EFHD2基因之載體的細胞(A549pEFHD2 )；以及 第9圖，合併使用伊布洛芬和順鉑能夠協同降低腫瘤尺寸，其中(A)為接受順鉑、伊布洛芬，以及順鉑和伊布洛芬之組合治療之異種移植小鼠的腫瘤照片，(B)是(A)圖異種移植小鼠的腫瘤體積隨時間變化結果所繪示之折線圖。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (4)

  1. 一種利用一製劑製備治療轉移癌之醫藥品的用途，其中該製劑能夠抑制EF手結構域蛋白D2(EF-hand domain-containing protein D2，EFHD2)之表現，其中，該製劑是一2-芳基丙酸(2-aryl propionic acid,2-APA)，其係選自以下之群組：伊布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、氟白布洛芬(flurbiprofen)和可多布洛芬(ketoprofen)。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該製劑是伊布洛芬。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該癌症是乳癌、胃癌、胃腸道基質瘤(GIST)、肺癌或胰腺癌。
  4. 如請求項3所述之用途，其中該肺癌是非小細胞肺癌(NSCLC)。
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