TWI734009B - 含蛋白質液體之過濾方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係一種含蛋白質液體之過濾方法，其係以20 mg/mL以上且100 mg/mL以下之濃度含有蛋白質之含蛋白質液體之過濾方法，該方法包括：預過濾步驟，其係利用孔徑為0.08 μm至0.25 μm且包含疏水性樹脂之預濾器對含蛋白質液體進行過濾；及病毒去除步驟，其係於預過濾步驟後，利用包含合成高分子之病毒去除膜對含蛋白質液體進行過濾；且進行預過濾步驟之前之含蛋白質液體係病毒去除膜每1 m2 含有0.25 g以上之平均直徑未達100 nm之蛋白質之三聚體以上之多聚體。

Description

含蛋白質液體之過濾方法
本發明係關於一種含蛋白質液體之過濾方法。
近年來，除了來自入血液之血漿區分製劑以外，於生物醫藥品中，亦需要提高病毒安全性之對策。因此，於醫藥品製造商中，進行有於製造步驟中導入病毒去除/不活化步驟之研究。其中，利用使用病毒去除膜之過濾之病毒去除法係不使有用之蛋白質改性即可減少病毒之有效方法。
於病毒中，尤其關於小病毒，於血漿區分製劑領域報告有因人類小病毒B19所致之感染之事例，或於生物醫藥品領域報告有小鼠之小病毒對CHO(Chinese Hamster Ovary，中國倉鼠卵巢)細胞之污染之事例。又，亦報告有例如鉤端螺旋體物種(Leptospira species)等微小細菌殘留於生物醫藥中之事例。
作為微小病毒之小病毒由於不具有包膜，故而物理化學上穩定，對於在醫藥品之製造製程中作為通常進行之不活化步驟之加熱、低pH值、化學藥品處理具有耐受性。因此，作為與不活化法不同之作用機制之病毒去除方法，利用病毒去除膜之病毒去除及細菌去除之需求提高。
作為病毒去除用過濾膜，已知有包含如纖維素之天然素材之膜、或包含如聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚碸(PES)之合成高分子素材之病毒去除膜(例如參照專利文獻1、2及非專利文獻1至4)。於醫藥品製造現場，要求一種尺寸與有用之蛋白質接近、具備對微小病毒(作為示例，為小病毒)之較高之病毒去除性並且具有蛋白質之較高之過濾效率的病毒去除膜，且對病毒去除膜之要求逐年變得嚴格。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2004-277323號公報
[專利文獻2]美國專利申請案公開第2016/0176921號說明書
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Manabe.S、 Removal of virus through novel membrane filtration method.、 Dev. Biol. Stand.、 (1996)88: 81-90.
[非專利文獻2]Brandwein H等人、Membrane filtration for virus removal.、 Dev Biol (Basel).、 (2000)102: 157-63.
[非專利文獻3]Aranhα-Creado等人、Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter.、 Biologicals. (1998) Jun; 26(2):167-72.
[非專利文獻4]L. Moce-Llivina等人、Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions、 Journal of Virological Methods、 (2003) April、 Vol.109, Issue 1,Pages 99-101.
近年來，於利用CHO作為宿主細胞之生物製劑之最終純化步驟中，對如下情況之擔憂增大：例如黎氏鉤端螺旋體(Leptospira licerasiae)等微小細菌或病毒之混入風險之產生機率較高。於抗體醫藥中，經過最終超過濾/透析過濾(UF/DF)步驟自20mg/mL濃縮至100mg/mL之濃度，其後使用孔徑0.22μm之除菌膜進行過濾之製劑大量地存在。該步驟未必為無菌條件，而成為未滅菌、手動設置環境，因此有產生來自作業者之污染、或最終緩衝劑準備中之來自微小細菌或病毒之污染之虞。然而，於醫藥品製造步驟中，最終UF/DF步驟一般係於利用病毒去除膜之病毒去除步驟後進行，因此於最終UF/DF步驟及其後之0.22μm除菌膜步驟中無法去除微小細菌或病毒。就此種觀點而言，本發明者等人發現，為了實現安全之製藥製造，用以去除最終UF/DF步驟後之微小細菌或病毒之步驟有用。
又，藉由最終UF/DF步驟所獲得之高濃度之蛋白質溶液有包含含有蛋白質之單體彼此聚集所形成的多聚體之情形。尤其，於如上所述之UF/DF等純化步驟中，藉由剪切應力促進蛋白質之凝聚，有多聚體變大至可見之粒子狀物之情形。製藥中所含之蛋白質之多聚體作為對人體產生副作用之原因已知，較佳為去除。進而，該等多聚體或粒子狀物成為使最終UF/DF步驟後所使用之病毒去除膜堵塞之原因。然而，已知該等多聚體或 粒子狀物一般難以利用0.22μm之除菌膜去除，迄今為止，對於在如上所述之利用超過濾等之純化步驟後去除多聚體之內容尚未進行充分研究。
因此，利用裝填有病毒去除膜之病毒去除裝置進行之蛋白質製劑半成品之過濾理想的是可以短時間過濾更多量之蛋白質，可去除多聚體，且以充分高之病毒去除性能去除病毒。但是，例如包含纖維素之病毒去除膜即便過濾含有0.25g/m2以上之多聚體之蛋白質溶液，亦不易產生堵塞，但若過濾20mg/mL以上之高濃度之蛋白質溶液，則過濾速度明顯降低，因此有與過濾低濃度蛋白質溶液之情形相比，每單位時間內可過濾之蛋白質量減少之傾向。
又，本發明者等人發現，關於包含合成高分子之病毒去除膜，耐壓性較高，即便將實際使用壓力提昇至300kPa左右亦無問題，但若將蛋白質濃度提昇至20mg/mL左右，則可能經常產生膜堵塞而無法過濾之問題。因此，於使用包含合成高分子之病毒去除膜之情形時，通常以10mg/mL以下之低濃度進行過濾(例如參照專利文獻1)。
就該等原因而言，使藉由各種層析法或最終超過濾等純化步驟得以提高之較高之蛋白質濃度之蛋白質製劑半成品於高壓下流經病毒去除裝置之過濾條件下的過濾方法之研究無法推進，又，適於該方法之病毒去除膜之開發亦無法推進。因此，本發明之課題之一在於提供一種可以較高之效率過濾以高濃度含有蛋白質之含蛋白質液體之方法。
根據本發明之態樣，提供一種含蛋白質液體之過濾方法，其係以20mg/mL以上且100mg/mL以下之濃度含有蛋白質之含蛋白質液體之過濾方法，該方法包括：預過濾步驟，其係利用孔徑為0.08μm至0.25μm且包含疏水性樹脂之預濾器對含蛋白質液體進行過濾；及病毒去除步驟，其係於預過濾步驟後，利用包含合成高分子之病毒去除膜對含蛋白質液體進行過濾；且進行預過濾步驟之前之含蛋白質液體係病毒去除膜每1m2含有0.25g以上之平均直徑未達100nm之蛋白質之三聚體以上之多聚體。
於上述方法中，預濾器亦可包含選自由聚醯胺、聚碸系、氟系樹脂所組成之群中之材料。
於上述方法中，預濾器亦可成為聚醚碸或聚偏二氟乙烯。
於上述方法中，預過濾步驟前之含蛋白質液體亦可進而含有粒子狀物，該粒子狀物係蛋白質之多聚體，且直徑為100nm以上。
上述方法亦可於預過濾步驟之前進而包含對含蛋白質液體進行透析過濾之透析過濾步驟。
上述方法亦可於預過濾步驟之前進而包含對含蛋白質液體進行超過濾之超過濾步驟。
上述方法亦可於透析過濾步驟之後進而不包含超過濾步驟及透析過濾步驟。
上述方法亦可於預過濾步驟之前進而包含使用切向流式過濾裝置進行過濾之切向流式過濾步驟。
上述方法亦可於預過濾步驟之前進而包含將含蛋白質液體攪拌2小時以上之攪拌步驟。
上述方法亦可於預過濾步驟與病毒去除步驟之間不包含其他步驟。
於上述方法中，亦可連續地進行預過濾步驟及病毒去除步驟。
於上述方法中，預濾器亦可為片狀之過濾器。
於上述方法中，預濾器亦可包含多層膜。
於上述方法中，預濾器亦可包含過濾器之孔徑於各層不同之多層膜。
於上述方法中，經預濾器過濾後之含蛋白質液體之黏度亦可低於經預濾器過濾前之含蛋白質液體之黏度。
於上述方法中，蛋白質亦可含有抗體。抗體亦可為單株抗體。
於上述方法中，病毒去除膜亦可包含聚偏二氟乙烯。利用病毒去除膜之小病毒之對數去除率(LRV)亦可為4.0以上。
於上述方法中，亦可為，病毒去除膜具有：一次側之表面，其被供給經預濾器過濾後之含蛋白質液體；及二次側之表面，其供透過該病毒去除膜之透過液排出；自一次側對該病毒去除膜供給含有直徑20nm之金膠體之溶液而利用該病毒去除膜捕捉金膠體，並於該病毒去除膜之剖面中測定亮度時，將亮度之位移之光譜之面積值之標準偏差除以亮度之位移之光譜之面積值之平均值所獲得之值為0.01以上且1.50以下；於該病毒去除膜之剖面中，供捕捉直徑20nm以上且直徑30nm以下之金膠體之部位之厚度於濕潤狀態下為10μm以上且30μm以下。
於上述方法中，進行預過濾步驟之前之含蛋白質液體之氫離子指數亦可為4.0以上且8.0以下。進行預過濾步驟之前之含蛋白質液體之離子強度亦可為0mmol/L以上且300mmol/L以下。進行預過濾步驟之前之含蛋白質液體亦可含有包含選自由糖類及鹼性胺基酸所組成之群中之至少一種之添加劑。
於上述方法中，亦可為，預濾器能夠進行原位滅菌(sterilization in place)。
根據本發明，能夠提供一種可以較高之效率過濾以高濃度含有蛋白質之含蛋白質液體之方法。
1:一次側之表面
2:二次側之表面
10:病毒去除膜
圖1係本發明之實施形態之具有中空纖維膜之形狀之病毒去除膜之模式圖。
圖2係本發明之參考例之具有中空纖維膜之形狀之病毒去除膜中之病毒捕捉部位之模式圖。
圖3係本發明之實施形態之具有中空纖維膜之形狀之病毒去除膜中之病毒捕捉部位之模式圖。
圖4係本發明之實施形態之具有平膜之形狀之病毒去除膜之模式圖。
圖5係表示本發明之實施例之病毒去除膜之製造條件及評價結果之表。
圖6係表示本發明之實施例之蛋白質粒子之粒徑分佈之曲線圖。
圖7係將本發明之實施例之含多聚體液體施加至尺寸排除層析法時之吸光度之曲線圖。
圖8係表示本發明之實施例1及比較例1之病毒去除膜之總過濾量之經時變化之曲線圖。
圖9係表示本發明之實施例及比較例之病毒去除膜之過濾所需之時間之表。
圖10係表示本發明之實施例2及比較例2之病毒去除膜之總過濾量之經時變化之曲線圖。
圖11係表示本發明之實施例3及比較例3之病毒去除膜之總過濾量之經時變化之曲線圖。
圖12係表示本發明之實施例4及比較例4之病毒去除膜之總過濾量之經時變化之曲線圖。
圖13係表示本發明之實施例5、6及比較例5之病毒去除膜之總過濾量之經時變化之曲線圖。
圖14係表示本發明之實施例及比較例之病毒去除膜之過濾所需之時間之表。
以下對本發明之實施形態進行說明。於以下圖式之記載中，對相同或類似之部分以相同或類似之符號表示。但是，圖式係模式性者，並非準確地表示具體尺寸等。因此，具體之尺寸等應對照以下之說明進行判斷，當然，於圖式相互間亦包含相互之尺寸之關係或比率不同之部分。
本發明之實施形態之含蛋白質液體之過濾方法係以20mg/mL以上且100mg/mL以下之濃度含有蛋白質的含蛋白質液體之過濾方法，且包括：預過濾步驟，其係利用孔徑為0.08μm至0.25μm且包含疏水性樹脂之預濾器對含蛋白質液體進行過濾；及病毒去除步驟，其係於預過濾步驟後，利用包含合成高分子之病毒去除膜對含蛋白質液體進行過濾；且進行預過濾步驟之前之含蛋白質液體係病毒去除膜每1m2含有0.25g以上之平均直徑未達100nm之蛋白質之三聚體以上之多聚體。於病毒去除步驟中，可將細菌亦去除。
所謂含蛋白質液體係病毒去除膜每1m2含有0.25g以上之平均直徑未達100nm之蛋白質之三聚體以上之多聚體，意指滿足以下兩個要件。
(1)藉由動態光散射法(DLS)對使用尺寸排除層析法(SEC)等區分應處理之液體時之三聚體以上之多聚體進行測定，此時之平均直徑未達100nm。
(2)根據由使用尺寸排除層析圖區分應處理之液體時之三聚體以上之多聚體之峰面積所算出之相對面積比、病毒去除膜每1m2應處理之總液量、及總蛋白質濃度，使用下述(1)式算出之應處理之液體中所含之多聚體之量為0.25g以上。
(病毒去除膜每1m2中所含之多聚體量：g/m2)=(每1m2應處理之總液量：L/m2)×(總蛋白質濃度：g/L)×(由層析圖之峰面積算出之三聚體以上之多聚體之相對面積比：%)/100 (1)
一般而言，含有大量多聚體之區分之平均直徑可視為取得常態分佈，於藉由DLS測得之平均直徑未達100nm之情形時，可視為其對象溶液中所含之物質之50%以上包含未達100nm之直徑之粒子。因此，滿足(1)之要件之含蛋白質液體中所含之蛋白質之三聚體以上之多聚體可視為其大部分包含具有未達100nm之平均直徑之粒子。
又，含蛋白質液體中所含之平均直徑未達100nm之三聚體以上之多聚體之含量可藉由將例如SEC等對應於尺寸進行區分之機構、例如如UV(ultraviolet，紫外線)檢測器之能夠將所區分之試樣定量之分析機構、 及例如如DLS之可分析尺寸之機構連結而成之分析系統求出該含量與尺寸。例如根據參考文獻(Biotechnol.Prog.,2015,Vol.31,No.3)，使用將SEC、UV檢測器及DLS連結而成之裝置，特定出含有如UV檢測器單獨體無法檢測出般微量之多聚體之含量。但是，若將含蛋白質液體進行濃縮等而使多聚體之濃度成為高濃度，則利用UV檢測器單獨體亦可將多聚體進行定量。
所謂蛋白質，例如指抗體蛋白質。作為生理活性物質之一例的抗體蛋白質如生化學中之一般定義所述係作為脊椎動物之感染防禦機構之B淋巴球所產生之糖蛋白質分子(亦稱為γ-球蛋白或免疫球蛋白)。例如，實施形態中經純化之抗體蛋白質係作為人之醫藥品而使用，具有與位於作為投予對象之人之體內的抗體蛋白質實質上相同之結構。
抗體蛋白質可為人類抗體蛋白質，亦可為來自人類以外之牛及小鼠等哺乳動物之抗體蛋白質。或者，抗體蛋白質亦可為與人類IgG之嵌合抗體蛋白質、及人類化抗體蛋白質。所謂與人類IgG之嵌合抗體蛋白質係指可變區域來自小鼠等人類以外之生物，但其他恆定區域被置換為來自人類之免疫球蛋白之抗體蛋白質。又，所謂人類化抗體蛋白質係指可變區域中互補性決定區域(complementarity-determining region：CDR)來自人類以外之生物，但其他架構區域(framework region：FR)來自人類之抗體蛋白質。人類化抗體蛋白質之免疫原性較嵌合抗體蛋白質進一步降低。
抗體蛋白質之類別(同型)及子類別並無特別限定。例如抗體蛋白質根 據恆定區域之結構之不同，分類為IgG、IgA、IgM、IgD及IgE之5種類別。但是，實施形態之過濾方法中作為純化對象之抗體蛋白質可為5種類別之任一者。又，於人類抗體蛋白質中，IgG有IgG1至IgG4之4個子類別，IgA有IgA1與IgA2之2個子類別。但是，實施形態之過濾方法中作為純化對象之抗體蛋白質之子類別可為任一者。再者，於Fc區域結合有蛋白質之Fc融合蛋白質等抗體相關蛋白質亦可包含於實施形態之過濾方法中作為純化對象之抗體蛋白質中。
進而，抗體蛋白質亦可根據來源進行分類。但是，實施形態之過濾方法中作為純化對象之抗體蛋白質可為天然之人類抗體蛋白質、藉由基因重組技術所製造之重組人類抗體蛋白質、單株抗體蛋白質、及多株抗體蛋白質之任一者。於該等抗體蛋白質中，作為實施形態之過濾方法中成為純化對象之抗體蛋白質，就作為抗體醫藥之需求或重要性之觀點而言，適宜為人類IgG及單株抗體，但並不限定於此。
經預濾器過濾前之含蛋白質液體之蛋白質濃度為20mg/mL以上、或25mg/mL以上，且為100mg/mL以下、90mg/mL以下、80mg/mL以下、70mg/mL以下、60mg/mL以下、或50mg/mL以下。20mg/mL以上之蛋白質濃度之含蛋白質液體有容易形成直徑未達100nm之蛋白質之多聚體、及直徑為100nm以上之粒子狀物之傾向。例如IgG之多聚體於未與作為病原體之抗原結合之狀態下與補體結合，而使補體異常活化，因此有產生嚴重之副作用之情形。
經預濾器過濾前之含蛋白質液體可含有蛋白質之多聚體。蛋白質之多聚體係複數個蛋白質之單體進行凝聚而形成。蛋白質之多聚體係指例如蛋白質(其本身亦可為二聚體等聚集體)之二聚體及三聚體。本揭示中之「多聚體」係尤其指三聚體以上之多聚體。關於經預濾器過濾前之含蛋白質液體，所含有之蛋白質之平均直徑未達100nm，且病毒去除膜每1m2含有0.25g以上、0.35g以上、0.50g以上、或0.75g以上之三聚體以上之多聚體。若含有0.25g以上之三聚體以上之多聚體，則容易發揮下述預濾器之效果。
經預濾器過濾前之含蛋白質液體可能含有病毒。病毒例如具有10nm以上且30nm以下、或18nm以上且24nm以下之直徑。病毒例如為小病毒。小病毒具有約20nm之直徑。又，經預濾器過濾前之含蛋白質液體可能含有細菌。細菌例如包含鉤端螺旋體屬、桿菌屬、盤尼芽孢桿菌屬、窄食單胞菌屬、蒼白桿菌屬、及假單胞菌屬。
經預濾器過濾前之含蛋白質液體之溶劑例如為水或緩衝液。此處，緩衝液係指含有鹽類之水溶液，且具體而言，可列舉磷酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、及乙酸緩衝液等，但只要為通常所利用之緩衝液，則無特別限定。又，經預濾器過濾前之含蛋白質液體亦可含有例如糖類及鹼性胺基酸等作為添加劑。藉由添加糖類及鹼性胺基酸等，可阻礙多聚體之形成，提高病毒去除膜之過濾效率。經預濾器過濾前之含蛋白質液體之氫離子指數(pH值)例如為4.0以上且8.0以下、4.0以上且7.5以下、或4.0以上且7.0以下。又，經預濾器過濾前之含蛋白質液體之離子強度為0mmol/L 以上且300mmol/L以下、10mmol/L以上且280mmol/L以下、或20mmol/L以上且250mmol/L以下。
利用預濾器過濾前之含蛋白質液體係例如進行過超過濾(UF)及透析過濾(DF)之任一者或兩者之溶液。含蛋白質液體例如使用切向流式(掃流)再循環過濾裝置進行超過濾及透析過濾之任一者或兩者。透析過濾中之透濾體積(diavolume)例如為4。再者，透濾體積係經回收之濾液之體積相對於開始透析過濾時之保持液之體積的比。利用預濾器過濾前之含蛋白質液體可為經機械攪拌之溶液，亦可為一面攪拌一面進行超過濾及透析過濾之任一者或兩者後之溶液。攪拌時間例如為2小時以上、4小時以上、或6小時以上。
若藉由超過濾及透析過濾之至少一者對含蛋白質液體進行過濾，則有容易形成直徑未達100nm之蛋白質之多聚體、及直徑為100nm以上之粒子狀物之傾向。又，直徑未達100nm之蛋白質之多聚體、及直徑為100nm以上之粒子狀物有亦藉由機械攪拌而形成之情形。於血漿區分製劑或生物醫藥品等之純化步驟中，為了提高對於病毒之安全性，有時除利用病毒去除膜之過濾步驟以外，亦組入病毒不活化步驟。作為該情形時所使用之方法，例如有加熱處理、低pH值處理、及溶劑/清潔劑(Solvent/Detergent)處理(以下有時亦記載為S/D處理)等。該等不活化方法藉由使生物成為化學或物理學上不穩定之狀態，而破壞形成病毒粒子之活體物質，但同時亦引起作為目標物之蛋白質之改性或凝聚，有產生含有直徑超過100nm之粒子狀物之大量多聚體之虞。含有該粒子狀物之多聚體 於在S/D處理後繼續進行層析步驟等複數個純化步驟之情形時，於病毒去除步驟之前被去除之可能性較高，但於以接近病毒去除步驟之步驟中進行之情形時，有含有粒子狀物之蛋白質溶液負載於病毒去除膜之可能性。所謂接近病毒去除步驟，係指於病毒去除步驟之上游1步驟或2步驟以內進行S/D處理步驟。已知已改性之蛋白質會使位於周圍之未改性蛋白質改性、凝聚。蛋白質溶液之濃度越高，改性蛋白質與未改性蛋白質之接觸機率越高，因此變得容易產生凝聚。若蛋白質溶液之濃度超過30mg/mL，則合成高分子製病毒去除膜之因堵塞所致之過濾通量之降低變得明顯，而且，即便存在極微量之多聚體，亦可能產生已無法進行過濾之程度之通量降低。例如，IgG之多聚體於未與作為病原體之抗原結合之狀態下與補體結合而使補體異常活化，因此有產生嚴重之副作用之情形。又，一般認為病毒去除膜係藉由將具有實質上不阻止蛋白質而使其透過、另一方面局部地阻止病毒之孔徑分佈的層重疊多層，而分離尺寸相近之病毒與蛋白質(橫木正信，「利用纖維素中空纖維膜之病毒分離」，纖維與工業，55卷(1999)10號p.P338-P342)。但是，若存在尺寸與病毒同等以上之粒子、例如蛋白質之多聚體，則應捕捉病毒之孔徑會捕捉到多聚體，有病毒洩露至濾液中之機率變高之可能性。
過濾含蛋白質液體之預濾器例如為片狀之過濾器。預濾器之孔徑為0.08μm以上、或0.10μm以上，且為0.25μm以下、或0.20μm以下。預濾器例如包含聚醯胺、聚碸系、及氟系樹脂等疏水性樹脂。雖然理論上不受束縛，但推測該等疏水性樹脂會與蛋白質之多聚體產生疏水相互作用，而吸附多聚體。就吸附蛋白質之觀點而言，較佳為聚醯胺(PA)、聚醚碸、 或聚偏二氟乙烯，更佳為聚偏二氟乙烯。藉由使預濾器之孔徑為0.08μm以上，可以較高之透過率過濾含蛋白質液體中之蛋白質單體，提高蛋白質之回收率。又，由於預濾器之孔徑大於多聚體，故而可防止預濾器因多聚體而於早期堵塞。進而，藉由預濾器具有疏水性相互作用，即便預濾器之孔徑大於多聚體，亦可去除含蛋白質液體中之蛋白質之三聚體以上之多聚體，提高其後之利用病毒去除膜之過濾效率及病毒去除性。若於溶液中含有粒子狀物，則有位於其周圍之多聚體與粒子狀物接觸而與粒子狀物一起被預濾器去除之情況，有提高病毒去除膜之過濾通量及病毒去除性能之情形。又，藉由使預濾器之孔徑為0.25μm以下，比表面積變大，與多聚體之接觸面積增加，可充分地確保多聚體之吸附面積。於含蛋白質液體中所含之多聚體較多之情形時，可將該等預濾器組合2種以上，亦可將1種連結複數個。於此情形時，若已知預先含有之多聚體之量，且已知所使用之預濾器之多聚體去除體積，則可求出預濾器所需之合計面積。
預濾器可為單層膜，亦可為包含2層及3層之多層膜。於預濾器為多層膜之情形時，各膜之孔徑可相同亦可不同。例如3層之所有膜之孔徑亦可為0.1μm。
預濾器亦可於使用之前藉由蒸汽進行滅菌。利用預濾器過濾含蛋白質液體時之壓力例如為25kPa(0.25bar)以下。又，預濾器之滅菌亦可以原位滅菌進行。若進行原位滅菌，則可防止超過濾或透析過濾之純化步驟後之細菌等之污染，確保製劑之安全性。再者，原位滅菌係指不將裝置分解而對裝置內部進行殺菌。
藉由利用預濾器進行過濾，含蛋白質液體中所含之粒子狀物及蛋白質之三聚體以上之多聚體之一部分藉由尺寸排除與疏水性相互作用之兩者而被去除。本揭示中之尺寸排除係指粒徑大於過濾器之孔徑之粒子狀物被捕捉至過濾器而自含蛋白質液體中去除。三聚體以上且直徑未達100nm之多聚體係藉由包含疏水性樹脂之預濾器而自含蛋白質液體中去除。含有於含蛋白質液體中之直徑為50nm以下之病毒大致透過預濾器。有經預濾器過濾後之含蛋白質液體之黏度變得低於經預濾器過濾前之含蛋白質液體之黏度之情形。
利用預濾器之含蛋白質液體之過濾亦可於超過濾(UF)、透析過濾(DF)或切向流(掃流)過濾後進行。
如圖1所示，對至少經預濾器過濾後之含蛋白質液體進行過濾之病毒去除膜10具有：一次側之表面1，其被供給含有蛋白質之溶液；及二次側之表面2，其供透過該病毒去除膜10之透過液排出。
病毒去除膜10於其剖面中具有捕捉病毒之病毒捕捉部位。並不取決於溶液進入之過濾面(一次側之表面1)上之部位，較佳為於剖面中，病毒捕捉部位中之病毒捕捉量均勻。其原因在於，於病毒去除膜之病毒捕捉量因過濾面上之部位而不均勻之情形時，溶液集中於過濾面上之某部位，病毒於該部位上之負載量局部地增加，因此若於高壓條件下進行大體積之過濾，則有病毒自該部位洩漏之可能性。又，於病毒去除膜10具有中空纖維 膜之形狀之情形時，較佳為，於環繞方向上，病毒捕捉部位中之病毒捕捉量並非如圖2所示般不均勻，而如圖3所示般均勻。
進而，病毒去除膜10較佳為捕捉病毒之部位之厚度於病毒捕捉部位內均勻。又，於病毒去除膜10具有中空纖維膜之形狀之情形時，較佳為於環繞方向上，病毒捕捉部位之厚度均勻。若病毒捕捉部位之厚度均勻，則溶液於環繞方向上均勻地擴散而降低病毒洩漏之可能性。
此處，有難以於視覺上檢測出被捕捉至病毒去除膜10之病毒之情形。對此，金膠體具有與病毒相同程度之直徑並且不使光透過，因此容易於視覺上檢測出。因此，例如於利用病毒去除膜10過濾含有金膠體之溶液後，藉由測定病毒去除膜10之剖面中之病毒去除膜10捕捉金膠體之金膠體捕捉部位之相對亮度，可評價病毒去除膜10之特性。
關於病毒去除膜10，自一次側之表面1對病毒去除膜10供給含有直徑20nm之金膠體之溶液而利用病毒去除膜10捕捉金膠體，於在病毒去除膜10之剖面中測定亮度時，亮度之位移之光譜之面積值之標準偏差除以亮度之位移之光譜之面積值之平均值所得的值為0.01以上且1.50以下。該值表示病毒去除膜10中之金膠體之捕捉量之變動係數，越小則表示病毒去除膜10之金膠體捕捉部位中之金膠體之捕捉量之均勻性越高。
關於病毒去除膜10，表示上述變動係數之值為0.01以上且1.50以下、0.01以上且1.20以下、或0.01以上且1.00以下、0.01以上且0.90以 下、或0.01以上且0.80以下。關於變動係數，未達0.01為測定極限。又，若變動係數大於1.50，則溶液可能集中於膜之環繞方向之至少某一部位，因此有病毒洩漏之可能性。
若上述變動係數為0.01以上且1.50以下，則於膜之病毒捕捉部位(關於中空纖維膜為環繞方向)中均勻地捕捉病毒，於負載於病毒去除膜之病毒之總量(病毒相對於蛋白質製劑之峰值量、或總過濾量)增加之情形時，亦可確保較高之病毒去除性能。
上述變動係數係藉由例如以下之方法進行測定。自過濾金膠體溶液後之病毒去除膜切出切片，利用光學顯微鏡測定切片之剖面中經金膠體染色之部分之複數個部位之亮度分佈。由於金膠體吸收光，故而亮度之位移依存於金膠體之捕捉量。再者，亦可視需要自亮度分佈去除背景雜訊。其後，製作橫軸具有膜厚、縱軸具有亮度之位移之圖，算出圖中所呈現之亮度之位移之光譜之面積。進而，將複數個部位之亮度之位移之光譜之面積之標準偏差除以複數個部位之亮度之位移之光譜之面積之平均值，算出所獲得之值作為表示病毒去除膜10中之金膠體捕捉部位之金膠體之捕捉量之變動係數的值。
於濕潤狀態之病毒去除膜10之剖面中，供捕捉直徑20nm以上且30nm以下之金膠體之部位(緻密層)之厚度為10μm以上且30μm以下、10μm以上且29μm以下、10μm以上且28μm以下、10μm以上且20μm以下、11μm以上且20μm以下、12μm以上且20μm以下。直徑20nm以上 且30nm以下之金膠體捕捉部位之厚度厚於30μm表示存在較多直徑20nm以上且30nm以下之金膠體可通過之孔徑較大之孔，且表示孔徑分佈擴大。因此，於過濾壓力(流速)較低之情形時、或包含壓力釋放之停止與開始(Stop and start)、後沖洗(Post-wash)時，病毒洩漏之可能性變高。另一方面，直徑20nm以上且30nm以下之金膠體捕捉部位之厚度薄於10μm表示直徑20nm以上且30nm以下之金膠體可通過之孔較少，孔徑分佈縮小。因此，於較小之範圍內產生蛋白質等之堵塞，由此有過濾中之過濾速度之降低變大、最終之處理量減少之情況，故而欠佳。
直徑20nm以上且直徑30nm以下之金膠體捕捉部位之厚度係藉由例如以下之方法而獲取。自分別過濾直徑20nm及30nm之金膠體溶液後之病毒去除膜切出切片。利用光學顯微鏡測定切片之剖面中經金膠體染色之部分複數個部位之亮度分佈。此處，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜10之一次側之表面1至金膠體捕捉部位之最接近一次側之表面之部分為止的第1距離a。又，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜10之一次側之表面1至金膠體捕捉部位之最接近二次側之表面2之部分為止的第2距離b。
其次，針對複數個部位之各者，算出將第1距離a除以濕潤之病毒去除膜之膜厚c並以百分率所表示之值A(=a/c之百分率表示)，算出複數個部位之值A之平均值作為第1到達度。又，針對複數個部位之各者，算出將第2距離b除以濕潤之病毒去除膜之膜厚c並以百分率表示之值B(=b/c之百分率表示)，算出複數個部位之值B之平均值作為第2到達度。
進而，如下述(2)式所示，將過濾直徑20nm之金膠體後之病毒去除膜之第2到達度之平均值B20與過濾直徑30nm之金膠體後之病毒去除膜之第1到達度之平均值A30的差，乘以過濾直徑20nm之金膠體後之濕潤之病毒去除膜之膜厚之平均值C20與過濾直徑30nm之金膠體而濕潤之病毒去除膜之膜厚之平均值C30的平均值CAVE，算出所獲得之值作為於使直徑20nm之金膠體及直徑30nm之金膠體流通時於病毒去除膜10之剖面中捕捉直徑20nm以上且30nm以下之金膠體的部位之厚度T。金膠體捕捉部位之厚度T亦表達為病毒去除膜之緻密層之厚度T。
T=(B20-A30)×CAVE (2)
再者，於上述方法中，以過濾直徑30nm之金膠體後之病毒去除膜之第1到達位置與過濾直徑20nm之金膠體後之病毒去除膜之第2到達位置之間的區域之厚度之形式求出直徑20nm以上且直徑30nm以下之金膠體捕捉部位，除誤差之範圍以外，若為直徑20nm以上且直徑30nm以下之金膠體，則確認被捕捉至上述範圍。
於濕潤狀態之病毒去除膜10之剖面中，供捕捉直徑15nm之金膠體之部位之厚度(最緻密層)較理想為2μm以上且10μm以下。更佳為3μm以上且10μm以下。若金膠體捕捉部位之厚度厚於10μm，則有不僅含有金膠體之溶液之過濾效率降低，而且含有病毒之溶液之過濾效率降低之傾向。又，若薄於2μm，則於負載於病毒去除膜之病毒之總量(病毒相對於蛋白質製劑之峰值量或總過濾量)增加之情形時，或因伴隨著運轉之過濾壓力之變動，而有病毒洩漏之可能性，故而欠佳。
直徑15nm之金膠體捕捉部位之厚度係藉由例如以下之方法而獲取。自過濾直徑15nm之金膠體溶液後之病毒去除膜切出切片。利用光學顯微鏡測定切片之剖面中經金膠體染色之部分之複數個部位之亮度分佈。此處，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜10之一次側之表面1至金膠體捕捉部位之最接近一次側之表面之部分為止的第1距離d。又，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜10之一次側之表面1至金膠體捕捉部位之最接近二次側之表面2之部分為止之第2距離e。
其次，針對複數個部位之各者，算出將第1距離d除以濕潤之病毒去除膜之膜厚f並以百分率表示之值D(=d/f之百分率表示)，算出複數個部位之值D之平均值作為第1到達度。又，針對複數個部位之各者，算出將第2距離e除以濕潤之病毒去除膜之膜厚f並以百分率表示之值E(=e/f之百分率表示)，算出複數個部位之值E之平均值作為第2到達度。
進而，如下述(3)式所示，將第2到達度之平均值E與第1到達度之平均值D的差乘以過濾後之病毒去除膜之濕潤狀態之膜厚之平均值F，算出所獲得之值作為於使直徑15nm之金膠體流通時於病毒去除膜10之剖面中捕捉直徑15nm之金膠體的部位之厚度T。直徑15nm之金膠體捕捉部位之厚度T亦可表現為病毒去除膜之最緻密層之厚度T。
T=(E-D)×F (3)
於利用病毒去除膜10過濾含有直徑30nm之金膠體之溶液之情形時，於濕潤狀態之病毒去除膜10之剖面中，若利用光學顯微鏡測定捕捉直徑 30nm之金膠體之部位，則例如位於自一次側之表面1起膜厚之15%以上且60%以下、或20%以上且55%以下之部位。若小於膜厚之15%，則病毒或雜質被捕捉於接近膜之一次側表面之位置，引起堵塞之可能性變高，若大於60%，則目標之病毒被捕捉於接近膜之二次側表面之位置，有無法捕捉病毒之可能性。再者，即便於在自一次側之表面1起小於膜厚之15%、或大於60%之區域捕捉到少量直徑30nm之金膠體之情形時，藉由利用光學顯微鏡之觀察，關於自常數(255)減去所測得之亮度分佈所獲得之亮度之位移，於其光譜之絕對值為光譜之絕對值之最大值之10%以下之情形時，就該病毒去除膜之病毒去除能力之觀點而言，該區域之金膠體之捕捉亦可視為誤差之範圍內，因此捕捉直徑30nm之金膠體之部位可視為位於自一次側之表面1起膜厚之15%以上且60%以下之部位者。
於利用病毒去除膜10過濾含有直徑20nm之金膠體之溶液之情形時，於濕潤狀態之病毒去除膜10之剖面中，若利用光學顯微鏡測定捕捉直徑20nm之金膠體之部位，則例如位於自一次側之表面1起膜厚之25%以上且85%以下、或30%以上且85%以下之部位。若小於膜厚之25%，則病毒或雜質被捕捉於接近膜之一次側表面之位置，引起堵塞之可能性變高，若大於85%，則目標之病毒被捕捉於接近膜之二次側表面之位置，有無法捕捉病毒之可能性。再者，與直徑30nm之金膠體之情形同樣地，即便於自一次側之表面1起小於膜厚之25%或大於85%之區域觀察到金膠體，藉由利用光學顯微鏡之觀察，關於自常數(255)減去所測得之亮度分佈之亮度之位移，於其光譜之絕對值為光譜之絕對值之最大值之10%以下之情形時，亦可視為誤差之範圍內。
於利用病毒去除膜10過濾含有直徑15nm之金膠體之溶液之情形時，於濕潤狀態之病毒去除膜10之剖面中，若利用光學顯微鏡測定捕捉直徑15nm之金膠體之部位，則例如位於自一次側之表面1起膜厚之60%以上且100%以下或65%以上且100%以下之部位。若小於膜厚之60%，則病毒或雜質被捕捉於接近膜之一次側表面之位置，引起堵塞之可能性變高。再者，與直徑30nm、20nm之金膠體之情形同樣地，即便於自一次側之表面1起小於膜厚之60%之區域觀察到金膠體，藉由利用光學顯微鏡之觀察，關於自常數(255)減去所測得之亮度分佈所獲得之亮度之位移，於為光譜之絕對值之最大值之10%以下之情形時，亦可視為誤差之範圍內。
又，關於直徑30nm、20nm及15nm之金膠體之捕捉位置之測定，始終針對被捕捉至膜之金膠體進行測定。因此，對於未被捕捉至膜而透過膜之金膠體未進行測定。即，並非針對透過膜之所有金膠體測定捕捉位置，而針對被捕捉至膜之金膠體，測定其於膜上之捕捉位置。
於利用病毒去除膜10過濾含有直徑10nm之金膠體之溶液之情形時，於病毒去除膜10之剖面中幾乎未捕捉到直徑10nm之金膠體。該情況可根據如下情況確認，即，於使用光學顯微鏡(Biozero，BZ8100，Keyence公司製造)之觀察中，無法檢測出亮度之光譜作為有意義值。又，亦可根據下述對數去除率(LRV)變低而確認。再者，未捕捉到直徑10nm之金膠體表示可達成IgG等直徑10nm左右之有用蛋白質之較高之透過性。
關於作為病毒去除膜之材質之合成高分子，例如就容易進行壓縮、擠出、射出、吹脹、及吹塑成型等加工，且過濾時之耐壓性優異之方面而言，較佳為熱塑性結晶性樹脂。尤其為了使耐熱性與成型加工性之平衡性良好，較佳為聚烯烴樹脂或氟系樹脂，尤佳為聚偏二氟乙烯樹脂。
再者，該等疏水性熱塑性結晶樹脂容易產生蛋白質等之吸附、膜之污染或堵塞等，引起過濾速度之急遽降低。因此，於使用疏水性樹脂作為病毒去除膜之材質之情形時，為了防止由蛋白質等之吸附所致之堵塞，對膜賦予親水性。為了賦予親水性，較佳為藉由接枝聚合法使膜具備親水性之接枝鏈。
病毒去除膜10例如具有中空纖維膜之形狀。或者，病毒去除膜10亦可如圖4所示般具有平膜之形狀。就即便膜面積較大亦可將膜裝填於容器而製成小型過濾器之方面而言，較佳為中空纖維膜。
圖1所示之病毒去除膜10之膜厚例如於乾燥狀態下為40.0μm以上且60.0μm以下，更佳為42.0μm以上且55.0μm以下。若膜厚薄於40.0μm，則有膜之強度降低而無法耐受過濾壓力之可能性，又，若厚於60.0μm，則有過濾速度降低之可能性。
於病毒去除膜10之剖面中，自一次側朝向二次側，孔隙之孔徑於減少後變得固定，較佳為病毒去除膜10於二次側之最外層附近具有最緻密之層。藉由於最外層附近具有最緻密之層，於過濾壓力(流速)較低之情形、 或以停止&開始、後沖洗方式過濾之情形時，可進一步降低病毒洩漏之可能性。
若利用病毒去除膜10之病毒之對數去除率(LRV：Logarithmic Reduction Value)為例如4.00以上，則藉由膜過濾而充分地去除病毒，故而較佳，若為4.50以上、5.00以上或6.00以上則更佳。若病毒之對數去除率為6.00以上，則認為病毒被去除，且幾乎無病毒洩漏。
利用病毒去除膜10之直徑30nm之金膠體之對數去除率(LRV)例如為1.00以上，較佳為1.20以上。利用病毒去除膜10之直徑20nm之金膠體之對數去除率例如為1.00以上，較佳為1.20以上。利用病毒去除膜10之直徑15nm之金膠體之對數去除率例如為0.10以上，較佳為0.20以上。利用病毒去除膜10之直徑10nm之金膠體之對數去除率例如未達0.10。
利用病毒去除膜10所測得之起泡點例如為1.30MPa以上且1.80MPa以下，更佳為1.40MPa以上且1.80MPa以下、1.45MPa以上且1.80MPa以下、1.50MPa以上且1.80MPa以下。又，病毒去除膜之特性亦可以起泡點(MPa)與用於測定之溶劑之表面張力(N/m)之比表示。於使用表面張力為13.6mN/m之氫氟醚作為浸漬膜之試液之情形時，起泡點與表面張力之比為96以上且133以下。更佳為103以上且133以下、106以上且133以下、110以上且133以下。
起泡點為1.30MPa以下表示存在孔徑較大之孔，尤其於使用病毒去 除膜時，於包含(1)降低壓力之等級之步驟、(2)暫時中斷過濾並再次加壓之步驟(Stop&start)、或(3)於製劑之過濾後暫時中斷過濾且利用緩衝液洗淨之步驟(Post-wash)的條件下，有發現病毒去除性降低之情形，故而欠佳。又，起泡點為1.80MPa以上表示存在孔徑較小之孔，純水透過速度降低，故而欠佳。
利用病毒去除膜10所測得之純水透過速度為30L/m2/hrs/0.1MPa以上且80L/m2/hrs/0.1MPa以下、30L/m2/hrs/0.1MPa以上且60L/m2/hrs/0.1MPa以下、或30L/m2/hrs/0.1MPa以上且55L/m2/hrs/0.1MPa以下。
病毒去除膜亦可於使用之前藉由蒸汽進行滅菌。藉由利用病毒去除膜對經預濾器預過濾之含蛋白質液體進行過濾，可去除含蛋白質液體中所含之病毒。又，亦可去除殘存於含蛋白質液體中之粒子狀物及蛋白質之多聚體。
於上述過濾方法中，亦可於利用預濾器過濾之預過濾步驟與病毒去除步驟之間不包含其他步驟。即，亦可藉由批次處理進行各步驟。又，亦可藉由連續製程進行預過濾步驟與病毒去除步驟。於藉由連續製程進行預過濾步驟與病毒去除步驟之情形時，有抑制隨著時間經過之蛋白質之多聚體之產生、進一步提高利用病毒去除膜之過濾效率之傾向。
具有以上所說明之特性之病毒去除膜例如藉由以下所說明之方法進 行製造。
病毒去除膜之材質所使用之熱塑性樹脂例如為通常之壓縮、擠出、射出、吹脹、及吹塑成型所使用之具有結晶性之熱塑性樹脂。例如可使用聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、聚4-甲基1-戊烯樹脂等聚烯烴樹脂、聚對苯二甲酸乙二酯樹脂、聚對苯二甲酸丁二酯樹脂、聚對萘二甲酸乙二酯樹脂、聚萘二甲酸丁二酯樹脂、聚對苯二甲酸環己烷二甲醇酯樹脂等聚酯樹脂、尼龍6、尼龍66、尼龍610、尼龍612、尼龍11、尼龍12、尼龍46等聚醯胺樹脂、聚偏二氟乙烯樹脂、乙烯/四氟乙烯樹脂、聚氯三氟乙烯樹脂等氟系樹脂、聚苯醚樹脂、及聚縮醛樹脂等。
於上述熱塑性樹脂中，聚烯烴樹脂或氟系樹脂由於耐熱性與成型加工性之平衡性良好，故而較佳，其中尤佳為聚偏二氟乙烯樹脂。此處，聚偏二氟乙烯樹脂係指於基本骨架中含有偏二氟乙烯單元之氟系樹脂，一般而言為簡稱為PVDF之樹脂。作為此種聚偏二氟乙烯樹脂，可使用選自偏二氟乙烯(VDF)之均聚物、或六氟丙烯(HFP)、五氟丙烯(PFP)、四氟乙烯(TFE)、氯三氟乙烯(CTFE)、及全氟甲基乙烯醚(PFMVE)之單體群中之1種或2種單體與偏二氟乙烯(VDF)之共聚物。又，亦可將該均聚物及該共聚物加以混合而使用。於實施形態中，若使用含有30wt%以上且100wt%以下之均聚物之聚偏二氟乙烯樹脂，則微多孔膜之結晶性提高而變得高強度，故而較佳，進而較佳為僅使用均聚物。
實施形態中所使用之熱塑性樹脂之平均分子量較佳為5萬以上且500 萬以下，更佳為10萬以上且200萬以下，進而較佳為15萬以上且100萬以下。該平均分子量係指藉由凝膠滲透層析法(GPC)測定所獲得之重量平均分子量，一般而言，關於如平均分子量超過100萬之樹脂，難以進行準確之GPC測定，因此可採用利用黏度法所獲得之黏度平均分子量取而代之。若重量平均分子量小於5萬，則熔融成型時之熔融張力變小，成形性變差，或膜之力學強度變低，故而欠佳。若重量平均分子量超過500萬，則難以進行均勻之熔融混練，故而欠佳。
實施形態中使用之熱塑性樹脂之聚合物濃度較佳為於含有熱塑性樹脂及塑化劑之組合物中為20wt%以上且90wt%以下，更佳為30wt%以上且80wt%以下，且最佳為35wt%以上且70wt%以下。若聚合物濃度未達20wt%，則產生製膜性降低、無法獲得充分之力學強度等不良情況。又，作為病毒去除用膜，所獲得之微多孔膜之孔徑變大，病毒去除性能變得不充分。若聚合物濃度超過90wt%，則所獲得之微多孔膜之孔徑變得過小，並且孔隙率變小，因此過濾速度降低，不耐於實際應用。
作為實施形態中使用之塑化劑，使用為製造微孔膜之組成且與熱塑性樹脂混合時於樹脂之結晶熔點以上可形成均勻溶液的非揮發性溶劑。此處所謂非揮發性溶劑係指於大氣壓下具有250.0℃以上之沸點者。塑化劑之形態於大致常溫20.0℃下可為液體亦可為固體。又，就製造如用於病毒去除之具有小孔徑且均質之緻密結構層之膜之方面而言，較佳為使用如下塑化劑，即，如於將與熱塑性樹脂之均勻溶液冷卻時於常溫以上之溫度下具有熱誘導型固液相分離點之所謂固液相分離系塑化劑。於塑化劑中亦有 於將與熱塑性樹脂之均勻溶液冷卻時於常溫以上之溫度下具有熱誘導型液液相分離點者，一般而言，於使用液液相分離系之塑化劑之情形時，所獲得之微多孔膜有大孔徑化之傾向。此處所使用之塑化劑亦可為單品或複數個物質之混合物。
測定熱誘導型固液相分離點之方法可藉由使用將含有熱塑性樹脂與塑化劑之特定濃度之組合物預先熔融混練所獲得者作為試樣，並藉由熱分析(DSC)測定該樹脂之發熱峰值溫度而求出。又，測定該樹脂之結晶化點之方法可使用預先將該樹脂熔融混練所獲得者作為試樣，並同樣地藉由熱分析而求出。
作為於製造如用於病毒去除之具有小孔徑且均質之緻密結構層之膜時可較佳地使用之塑化劑，可列舉國際公開第01/28667號所揭示之塑化劑。即，下述(4)式所定義之組合物之相分離點下降常數為0.0℃以上且40.0℃以下之塑化劑，較佳為1.0℃以上且35.0℃以下之塑化劑，進而較佳為5.0℃以上且30.0℃以下之塑化劑。若相分離點下降常數超過40.0℃，則孔徑之均質性或強度降低，故而欠佳。
α=100×(Tc0-Tc)÷(100-C) (4)
式中，α表示相分離溫度下降常數(℃)，Tc0表示熱塑性樹脂之結晶化溫度(℃)，Tc表示組合物之熱誘導固液相分離點(℃)，C表示組合物中之熱塑性樹脂之濃度(wt%)。
例如於選擇聚偏二氟乙烯樹脂作為熱塑性樹脂之情形時，尤佳為鄰 苯二甲酸二環己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DAP)、磷酸三苯酯(TPP)、磷酸甲酚酯二苯酯(CDP)、及磷酸三甲酚酯(TCP)等。
於實施形態中，使含有熱塑性樹脂與塑化劑之組合物均勻溶解之第一方法為如下方法，即，將該樹脂投入至擠出機等連續式樹脂混練裝置中，一面使樹脂加熱熔融一面以任意之比率導入塑化劑並進行螺旋混練，藉此獲得均勻溶液。所投入之樹脂之形態可為粉末狀、顆粒狀、丸狀之任一者。又，於藉由此種方法均勻溶解之情形時，塑化劑之形態較佳為常溫液體。作為擠出機，可使用單軸螺旋式擠出機、雙軸異向螺旋式擠出機、及雙軸同向螺旋式擠出機等。
使含有熱塑性樹脂與塑化劑之組合物均勻溶解之第二方法為如下方法，即，使用享舍爾混合機等攪拌裝置，將樹脂與塑化劑預先混合而使其分散，將所獲得之組合物投入至擠出機等連續式樹脂混練裝置中進行熔融混練，藉此獲得均勻溶液。關於所投入之組合物之形態，於塑化劑為常溫液體之情形時設為漿料狀，於塑化劑為常溫固體之情形時設為粉末狀或顆粒狀狀等即可。
使含有熱塑性樹脂與塑化劑之組合物均勻溶解之第三方法為使用Brabender或研磨機等簡易型樹脂混練裝置之方法、或於其他批次式混練容器內進行熔融混練之方法。根據該方法，成為批次式步驟，具有簡易且柔軟性較高之優點。
於實施形態中，於將含有熱塑性樹脂與塑化劑之組合物加 熱至熱塑性樹脂之結晶熔點以上之溫度並使其均勻溶解後，自T型模頭或圓形模頭、環狀紡絲嘴之吐出口呈平膜狀、中空纖維狀之形狀擠出，其後使其冷卻固化而使膜成型((a)之步驟)。於冷卻固化而使膜成型之(a)之步驟中，形成緻密結構層並且鄰接於膜表面而形成粗大結構層。
於實施形態中，使含有經均勻地加熱溶解之熱塑性樹脂與塑化劑之組合物自吐出口吐出，一面經由氣隙部分，以如下述(5)式所定義之牽引比成為1.0以上且12.0以下之捲取速度捲取該膜，一面使對熱塑性樹脂具有部分之溶解性之100.0℃以上之非揮發性液體接觸膜之一表面，並將另一膜表面進行冷卻，藉此於膜形成粗大結構層與緻密結構層。
牽引比=(膜之捲取速度)/(組合物之於吐出口之吐出速度) (5)
上述牽引比較佳為1.5以上且9.0以下，更佳為1.5以上且7.0以下。若牽引比未達1.0，則因未對膜施加張力故而成型性降低，於超過12.0之情形時，有因膜被拉伸而難以形成充分厚度之粗大結構層之傾向。上述(5)式之組合物之於吐出口之吐出速度係由下述(6)式提供。
組合物之於吐出口之吐出速度=(每單位時間所吐出之組合物之體積)/(吐出口之面積) (6)
吐出速度之較佳範圍為1m/min以上且60m/min以下，更佳為3m/min以上且40m/min以下。於吐出速度未達1m/min之情形時，有產生生產性降低，並且吐出量之變動變大等問題之傾向。反之，於吐出速度超過60m/min之情形時，有因吐出量較多故而於吐出口產生亂流，吐出狀 態變得不穩定之情形。
捲取速度可根據吐出速度而設定，較佳為1m/min以上且200m/min以下，更佳為3m/min以上且150m/min以下。於捲取速度未達1m/min之情形時，有生產性及成型性降低之傾向。又，於捲取速度超過200m/min之情形時，有因冷卻時間變短或施加於膜之張力變大而容易引起膜之斷裂之傾向。
形成粗大結構層之較佳方法為如下方法，即，將含有熱塑性樹脂與塑化劑之組合物自擠出口呈平膜狀或中空纖維狀之膜擠出，使所形成之未硬化之膜之一表面接觸對熱塑性樹脂具有部分之溶解性之非揮發性液體。於此情形時，藉由所接觸之非揮發性液體向膜內部之擴散與熱塑性樹脂之部分之溶解而形成粗大結構層。此處，對熱塑性樹脂具有部分之溶解性之液體係指以50wt%之濃度與熱塑性樹脂混合時於100.0℃以上之溫度下最初可形成均勻溶液之液體，且較佳為於100.0℃以上且250.0℃以下之溫度下可形成均勻溶液之液體，進而較佳為於120.0℃以上且200.0℃以下之溫度下可形成均勻溶液之液體。於使用在未達100.0℃之溫度下均勻溶解之液體作為接觸液體之情形時，有產生為了防止含有熱塑性樹脂與塑化劑之組合物溶液之冷卻固化而導致成型性降低、或粗大結構層變厚至超出需要、或孔徑變得過大等不良情況的情形。於在未達250.0℃之溫度下無法形成均勻溶液之液體之情形時，由於對熱塑性樹脂之溶解性較低而難以形成充分厚度之粗大結構層。又，此處，非揮發性液體係指1個大氣壓(101325Pa)下之沸點超過250.0℃之液體。
例如，於選擇聚偏二氟乙烯樹脂作為熱塑性樹脂之情形時，可適宜地使用酯鏈之碳鏈長為7以下之鄰苯二甲酸酯類、己二酸酯類、癸二酸酯類、酯鏈之碳鏈長為8以下之磷酸酯類、檸檬酸酯類等，尤其可適宜地使用鄰苯二甲酸二庚酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯、己二酸二丁酯、癸二酸二丁酯、磷酸三(2-乙基己基)酯、磷酸三丁酯、及乙醯檸檬酸三丁酯等。
但是，於酯鏈上具有苯基、甲苯基、環己基等環狀結構之塑化劑、即鄰苯二甲酸二環己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DAP)、磷酸三苯酯(TPP)、磷酸甲酚酯二苯酯(CDP)、及磷酸三甲酚酯(TCP)等例外，其等形成粗大結構層之能力較小，故而欠佳。
又，用以導入粗大結構層之接觸液體之溫度為100.0℃以上，較佳為120.0℃以上且熱塑性樹脂與塑化劑之均勻溶液之溫度以下，進而較佳為130.0℃以上且(熱塑性樹脂與塑化劑之均勻溶液之溫度-10.0℃)以下。於該接觸液體之溫度未達100.0℃之情形時，有因對熱塑性樹脂之溶解性較低而難以形成充分厚度之粗大結構層之傾向。於超過熱塑性樹脂與塑化劑之均勻溶液之溫度之情形時，成型性降低。
進而，於膜為中空纖維狀之情形時，由於在該接觸液體通過環狀紡絲嘴內時產生熱移動，故而於環狀紡絲嘴產生溫度不均，其結果為，有於中空纖維之圓周方向上成為不均勻之膜結構之情形。例如，於自環狀紡絲 嘴之側方導入低溫之接觸液體之情形時，導入接觸液體之部分之環狀紡絲嘴之溫度降低，由通過該相對低溫之部位之含有熱塑性樹脂與塑化劑之組合物所形成之膜之部分之孔徑變小，於圓周方向上膜結構之不均勻性增大。為了獲得於中空纖維之圓周方向上均勻之膜結構，較佳為使紡絲嘴之溫度變得均勻，因此較佳為(1)自環狀紡絲嘴之上部導入接觸液體以使接觸液體之溫度之影響於中空纖維之圓周方向上均勻，及/或(2)使環狀紡絲嘴與即將導入至環狀紡絲嘴之前之接觸液體之溫度差變小以使環狀紡絲嘴與接觸液體之間的熱移動變小。於(2)之情形時，較佳為使環狀紡絲嘴與即將導入至環狀紡絲嘴之前之接觸液體之溫度差為80.0℃以下。若溫度差大於80.0℃，則於圓周方向上成為不均勻之膜結構，於負載於病毒去除膜之病毒之總量增加時有病毒洩漏之可能性。
為了使上述環狀紡絲嘴與接觸液體之溫度差變小，考慮利用紡絲嘴附近之調溫、或使含有可塑性樹脂與塑化劑之組成之溫度變低等多種方法，但較佳為將所導入之接觸液體進入至紡絲嘴時之接觸液體之溫度控制為較高之方法。
於僅對微多孔膜之單面導入粗大結構層之情形時，相當於緻密結構層側之另一表面之冷卻方法可依照先前之方法。即，藉由使膜與導熱體接觸而進行冷卻而進行。作為導熱體，可使用金屬、水、空氣、或塑化劑本身。具體而言，可利用如下方法，即，經由T型模頭等將含有熱塑性樹脂與塑化劑之均勻溶液呈片狀擠出，使其與金屬製輥接觸冷卻而形成緻密結構層，且使不與輥接觸之側之膜面與對熱塑性樹脂具有部分之溶解性之非 揮發性液體接觸，藉此形成粗大結構層。又，亦可利用如下方法，即，經由圓形模頭或環狀紡絲嘴等將樹脂與塑化劑之均勻溶液呈圓筒狀或中空纖維狀擠出，使對熱塑性樹脂具有部分之溶解性之非揮發性液體通過該圓筒或中空纖維之內側，藉此於內表面側形成粗大結構層，且使外側與水等冷卻介質接觸而冷卻，藉此形成緻密結構層。
於實施形態之微多孔膜之製造方法中，為了形成小孔徑且均質之緻密結構層，較佳為使冷卻固化時之冷卻速度充分變快。冷卻速度較佳為50.0℃/分鐘以上，更佳為100.0℃/分鐘以上且1.0×105℃/分鐘以下，進而較佳為200.0℃/分鐘以上且2.0×104℃/分鐘以下。作為具體之方法，適宜使用與金屬製冷卻輥或水接觸之方法，尤其與水接觸之方法可藉由水之蒸發而達成急速之冷卻，故而較佳。
又，冷卻固化之介質之溫度並非根據聚合物之分子量等而單一地決定，較佳為較低。例如於與水接觸之情形時，水之溫度為50.0℃以下，更佳為40.0℃以下，更佳為30.0℃以下。有所接觸之介質之溫度越低，則所形成之膜之起泡點變得越高之傾向，於使用病毒去除膜時，(1)於降低壓力(流速)之等級之情形時、(3)暫時中斷過濾並再加壓之(Stop&start)情形時、或(2)包含於製劑之過濾後暫時中斷過濾並利用緩衝液洗淨之步驟(Post-wash)之情形時，均可將病毒去除性維持為較高，故而較佳。
於實施形態之製造法中，較佳為於使含有經均勻地加熱溶解之熱塑性樹脂與塑化劑之組合物自吐出口吐出，使組合物冷卻固化之前，設置氣 隙。於該氣隙中，藉由使所吐出之聚合物溶液之表層冷卻，並且使塑化劑之一部分汽化，而於表層部分形成作為最為緻密之層的最緻密層。氣隙之長度較佳為10mm以上且300mm以下，進而較佳為30mm以上且200mm以下。
氣隙之長度於上述範圍內越小則緻密層之厚度越厚，越大則緻密層之厚度越薄，若為上述範圍內，則可製造病毒去除性能較高且過濾效率較高之膜。
進而，於實施形態之製造方法中，為了去除汽化之塑化劑，亦可於氣隙部設置排氣部，此時必須注意空氣向所吐出之組合物之流動。於接觸所吐出之組合物之空氣之流動存在不均之情形時，組合物之溫度產生不均，結果可能成為結構之局部不均之原因。例如於所吐出之組合物為中空纖維狀之情形時，於自組合物之側方排氣之情形時，排氣部之相反側因空氣之流動而進一步被冷卻，因此容易變得更緻密，產生圓周方向之結構不均。因此，較佳為以相對於所吐出之組合物變得均勻之方式設置排氣部。具體而言，較佳為以空氣之流動相對於所吐出之組合物變得平行之方式設為上方排氣或下方排氣。
於側方排氣之情形時，接觸組合物之風速較佳為10m/s以下，較佳為7m/s、5m/s、3m/s以下，更佳為1m/s以下。
於自所形成之膜去除塑化劑之實質部分之步驟(b)中，為了去除塑化 劑，使用萃取溶劑。萃取溶劑對於熱塑性樹脂為不良溶劑，且對於塑化劑為良溶劑，較佳為沸點低於微多孔膜之熔點。作為此種萃取溶劑，例如可列舉：己烷或環己烷等烴類、二氯甲烷或1,1,1-三氯乙烷等鹵代烴類、乙醇或異丙醇等醇類、二乙醚或四氫呋喃等醚類、丙酮或2-丁酮等酮類、或水。
於實施形態中，自膜去除塑化劑之第一方法係藉由如下方式進行：將切取成特定大小之微多孔膜浸漬於加入有萃取溶劑之容器中，經充分洗淨後，使所附著之溶劑風乾或利用熱風使其乾燥。此時，若反覆進行多次浸漬之操作或洗淨之操作，則殘留於微多孔膜中之塑化劑減少，故而較佳。又，為了於浸漬、洗淨、乾燥之一系列操作中抑制微多孔膜之收縮，較佳為約束微多孔膜之端部。
自膜中去除塑化劑之第二方法係藉由如下方式進行：將微多孔膜連續地送入至裝滿萃取溶劑之槽中，且為了去除塑化劑而耗費充分之時間浸漬於槽中，然後使所附著之溶劑乾燥。此時，若應用如多段法、或逆流法之公知方法，則可提高萃取效率，故而較佳，上述多段法係向藉由將槽內部進行多段分割而產生了濃度差之各槽依序送入微多孔膜；上述逆流法係自相對於微多孔膜之移行方向為相反之方向供給萃取溶劑而用以賦予濃度梯度。於第一、第二方法中，重要的是均將塑化劑自微多孔膜實質性地去除。所謂實質性地去除，係指以無損作為分離膜之性能之程度去除微多孔膜中之塑化劑，殘存於微多孔膜中之塑化劑之量較佳為成為1wt%以下，進而較佳為100質量ppm以下。殘存於微多孔膜中之塑化劑之量可藉由氣 相層析法或液相層析法等進行定量。又，若將萃取溶劑之溫度於未達該溶劑之沸點之溫度、較佳為(沸點-5.0℃)以下之範圍內進行加溫，則可促進塑化劑與溶劑之擴散，因此可提高萃取效率，故而更佳。
關於物理強度優異之包含疏水性樹脂之微多孔膜，就可耐受較高之過濾壓力之方面而言，較包含纖維素等親水性樹脂之微多孔膜優異，另一方面，容易產生蛋白質等之吸附、膜之污染或堵塞等，而引起過濾速度之急遽降低。因此，於使用包含疏水性樹脂之微多孔膜之情形時，為了防止由蛋白質等之吸附所致之堵塞，而對膜賦予親水性。於實施形態之製造方法中，較佳為藉由接枝聚合法對疏水性膜之細孔表面導入親水性官能基，而降低蛋白質等之吸附性。其原因在於，接枝聚合法與其他方法(例如摻合親水性聚合物之方法或塗佈親水性聚合物之方法等)相比，可自較大之細孔至較小之細孔均勻地親水化，或可自膜之內表面至外表面無不均地均等地親水化。
又，接枝聚合係藉由化學鍵結賦予親水性，因此與其他方法相比，對於處理液溶質之可能性較低，故而較佳。所謂接枝聚合法，係如下反應，即藉由游離輻射或化學反應等方法使高分子微多孔膜生成自由基，以該自由基為起始點而使單體與該膜進行接枝聚合。
於實施形態中，為了使高分子微多孔膜生成自由基，可採用任意方法，但為了使膜整體均勻地生成自由基，較佳為游離輻射之照射。作為游離輻射之種類，可利用γ射線、電子束、β射線、及中子射線等，於在工業 規模下之實施中，最佳為電子束或γ射線。游離輻射係自鈷60、鍶90、及銫137等放射性同位素，或藉由X射線拍攝裝置、電子束加速器及紫外線照射裝置等而獲得。
游離輻射之照射線量較佳為1kGy以上且1000kGy以下，更佳為2kGy以上且500kGy以下，最佳為5kGy以上且200kGy以下。若未達1kGy，則無法均勻地生成自由基，若超過1000kGy，則有引起膜強度之降低之情況。
一般而言，利用游離輻射之照射之接枝聚合法大致分為預照射法與同時照射法，該預照射法係於膜生成自由基後，繼而使其與反應性化合物接觸；該同時照射法係於使膜與反應性化合物接觸之狀態下使膜生成自由基。於實施形態中，可應用任意之方法，較佳為低聚物之生成較少之預照射法。
於實施形態中，使用具有1個乙烯基之親水性乙烯基單體與視需要之交聯劑作為反應性化合物，並使其與生成自由基之高分子微多孔膜接觸。接觸之方法可以氣相進行亦可以液相進行，較佳為以均勻地進行接枝反應之液相接觸之方法。為了使接枝反應更均勻地進行，於使具有1個乙烯基之親水性乙烯基單體預先溶解於溶劑中後使用交聯劑之情形時，較佳為於使親水性乙烯基單體與交聯劑預先溶解於溶劑中後與高分子微多孔膜接觸。
如上所述，於實施形態之親水性微多孔膜之製造方法中，使具有1個乙烯基之親水性乙烯基單體與高分子微多孔膜進行接枝聚合，而對細孔表面賦予親水性，降低蛋白質等生理活性物質之吸附。實施形態中之具有1個乙烯基之親水性乙烯基單體係指於大氣壓下於25.0℃之純水中混合1體積%時均勻溶解之具有1個乙烯基之單體。作為該親水性乙烯基單體，例如可列舉：丙烯酸羥基丙酯、丙烯酸羥基丁酯等具有羥基或具有成為其前驅物之官能基之乙烯基單體、乙烯基吡咯啶酮等具有醯胺鍵之乙烯基單體、丙烯醯胺等具有胺基之乙烯基單體、聚乙二醇單丙烯酸酯等具有聚乙二醇鏈之乙烯基單體、甲基丙烯酸三乙基銨乙酯等具有陰離子交換基之乙烯基單體、及甲基丙烯酸磺丙酯等具有陽離子交換基之乙烯基單體等。
於實施形態中，於上述親水性乙烯基單體中，使用具有1個以上之羥基或成為其前驅物之官能基之乙烯基單體使膜之後退接觸角降低，故而較佳。更佳為使用丙烯酸羥基丙酯、甲基丙烯酸2-羥基乙酯等丙烯酸或甲基丙烯酸與多元醇之酯類、烯丙醇等具有不飽和鍵之醇類、及乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯等烯醇酯類等，最佳為使用丙烯酸羥基丙酯、甲基丙烯酸2-羥基乙酯等丙烯酸或甲基丙烯酸與多元醇之酯類。接枝有丙烯酸羥基丙酯之親水性微多孔膜之後退接觸角較低，且可獲得充分之球蛋白透過性能。
溶解具有1個乙烯基之親水性乙烯基單體及視需要使用之交聯劑的溶劑只要為可均勻溶解者，則無特別限定。作為此種溶劑，例如可列舉乙醇或異丙醇、第三丁醇等醇類、二乙醚或四氫呋喃等醚類、丙酮或2-丁酮等酮類、水、或其等之混合物等。
使具有1個乙烯基之親水性乙烯基單體、及視需要使用之交聯劑溶解時之濃度較佳為3體積%~30體積%，更佳為3體積%~20體積%，最佳為3體積%~15體積%。若為3體積%以上之濃度，則可獲得充分之親水性，故而較佳。若超過30體積%，則有因親水化層掩埋孔之情形，有透過性能降低之傾向，故而欠佳。
使接枝聚合時所使用之具有1個乙烯基之親水性乙烯基單體、及視需要使用之交聯劑溶解於溶劑中所得的反應液之量相對於高分子微多孔膜1g較佳為1×10-5m3以上且1×10-3m3以下。若反應液之量為1×10-5m3以上且1×10-3m3以下，則可獲得均勻性充分之膜。接枝聚合時之反應溫度一般而言係於20.0℃以上且80.0℃以下進行，但並無特別限定。
實施形態係對疏水性微多孔膜導入適當之親水化層，實現高蛋白質透過性。為此，接枝於疏水性微多孔膜之接枝率較佳為3%以上且50%以下，進而較佳為4%以上且40%以下，最佳為6%以上且30%以下。若接枝率未達3%，則膜之親水性不足，引起伴隨著蛋白質之吸附的過濾速度之急遽降低。若超過50%，則相對較小之孔被親水化層掩埋，無法獲得充分之過濾速度。此處，所謂接枝率係由下述(7)式所定義之值。
接枝率(%)=100×{(接枝後之膜質量-接枝前之膜質量)/接枝前之膜質量} (7)
[製造例1至11] (病毒去除膜之製造)
使用享舍爾混合機將包含聚偏二氟乙烯樹脂(Kureha股份有限公司製造，KF#1300)49wt%與鄰苯二甲酸二環己酯(北廣化學股份有限公司製造)51wt%之組合物於室溫下攪拌混合而獲得粉體，自漏斗投入該粉體，使用雙軸擠出機(26mmΦ，L/D=50)於210.0℃下進行熔融混合使其均勻溶解後，自調溫至225.0℃之包含內直徑0.8mm、外直徑1.05mm之環狀孔口之紡絲嘴以吐出速度4.2g/min呈中空纖維狀擠出，經過氣隙後，使其於經調溫為圖5所示之凝固浴溫度之水浴中冷卻固化，以50m/min之速度捲取於繞線軸。此時，於中空纖維之內部以7.1g/min之速度流動作為中空劑之鄰苯二甲酸二丁酯(大八化學工業股份有限公司製造)。於製造例1至11中，鄰苯二甲酸二丁酯係自紡絲嘴之側方導入，即將進入紡絲嘴之前之溫度與自紡絲嘴吐出時之溫度為圖5所示之值。又，於經過氣隙時，自側方接觸中空纖維之風速為2.7m/s。其後，利用2-丙醇(Tokuyama股份有限公司製造)將鄰苯二甲酸二環己酯及鄰苯二甲酸二丁酯萃取去除，於將所附著之2-丙醇替換為水後，於浸漬於水中之狀態下使用高壓蒸汽滅菌裝置實施125.0℃之熱處理4小時。其後，於將所附著之水替換為2-丙醇後，於60.0℃下進行真空乾燥，藉此獲得中空纖維狀之微多孔膜。於自萃取至乾燥之步驟中，為了防止收縮，將膜固定為定長狀態進行處理。
繼而，對上述微多孔膜進行利用接枝法之親水化處理。反應液係使用將丙烯酸羥基丙酯(大阪有機化學工業股份有限公司製造)以成為8體積%之方式溶解於3-丁醇(純正科學股份有限公司試劑特級)之25體積%水溶 液中，於保持為45.0℃之狀態下，通入氮氣20分鐘者。首先，於氮氣環境下，一面利用乾冰將該微多孔膜冷卻至-60.0℃以下，一面以Co60為線源照射γ射線至少25kGy。照射後之膜於在13.4Pa以下之減壓下靜置15分鐘後，使上述反應液與該膜於45.0℃下接觸，靜置1小時。其後，利用2-丙醇將膜洗淨，於60.0℃下進行真空乾燥，藉此獲得微多孔膜。確認到於所獲得之膜與水接觸時，水自發地滲透至細孔內。評價所獲得之膜之性能，將結果示於圖5。
於製造例1至11中，中空劑之入口溫度與出口之溫度差、氣隙長度、凝固浴溫度為圖5所示之值。又，僅於製造例6中，鄰苯二甲酸二丁酯係自紡絲嘴之中央部導入。該等以外之膜之製造條件於製造例1至11中相同。
(病毒去除膜之物性) (1)中空纖維之外徑、內徑、膜厚
中空纖維形狀之微多孔膜之外徑、內徑係藉由使用實體顯微鏡(Molitec股份有限公司製造之SCOPEMAN503)以210倍之倍率拍攝該膜之垂直割斷面而求出。膜厚係以中空纖維之外直徑與內直徑之差之1/2之形式計算。將結果示於圖5。
(2)起泡點
測定藉由依據ASTM F316-86之起泡點法求出之起泡點(Pa)。使用表面張力為13.6mN/m之氫氟醚(3M公司製造Novec(註冊商標)7200)作為浸漬膜之試液。起泡點係將有效長度8cm之一根中空纖維膜設置於起泡點 測定裝置後，對中空部側逐漸提昇壓力，設為透過膜之氣體流量成為2.4E-3升/分鐘時之壓力。將結果示於圖5。
(3)純水透過速度
測定利用定壓端點過濾之溫度25.0℃之純水之透過量，由膜面積、過濾壓力(0.1MPa)、及過濾時間，如下述(8)式所示般進行計算，作為純水透過速度。將結果示於圖5。
純水透過速度(L/m2/hrs/0.1MPa)=透過量÷(膜面積×過濾時間) (8)
(使用金膠體之病毒去除膜之評價) (1)金膠體溶液之製備
購入分別含有粒徑為10、15、20、及30nm之金膠體之溶液(Cytodiagnostics公司製造)。其次，以利用紫外、可見分光光度計UVmini-1240(島津製作所製造)所測得之各金膠體溶液之與金膠體對應之最大吸收波長下之吸光度成為0.25之方式，利用注射用蒸餾水、聚氧乙烯-萘醚(1.59vol%)、及聚(4-苯磺酸鈉)(0.20vol%)對金膠體溶液進行稀釋。
(2)金膠體溶液之過濾
藉由製造例之病毒去除膜，於196kPa之加壓下，對所製備之金膠體溶液之各40mL進行過濾。病毒去除膜之過濾面積為0.001m2。
(3)利用病毒去除膜之金膠體之去除率之測定
使用紫外、可見分光光度計UVmini-1240(島津製作所製造)，對金膠體溶液各者測定金膠體之最大吸收波長下之過濾前之金膠體溶液之吸光度A與濾液之吸光度B，算出由下述(9)式所提供之製造例之利用病毒去除膜之金膠體之對數去除率(LRV)。將結果示於圖5。
LRV=log10(A/B) (9)
(4)金膠體捕捉部位之均勻性之測定
自過濾金膠體溶液後之製造例之病毒去除膜切出切片(厚度為8μm)，藉由光學顯微鏡(Biozero，BZ8100，Keyence公司製造)測定切片之剖面中被金膠體染色之部分之16個部位之亮度分佈。其次，自常數(255)減去所測得之亮度分佈。其後，製作橫軸具有膜厚(100分率)、縱軸具有亮度之位移之曲線圖，算出曲線圖中所呈現之亮度之位移之光譜之面積。進而，將16個部位之亮度之位移之光譜之面積之標準偏差除以16個部位之亮度之位移之光譜之面積之平均值，算出所獲得之值作為表示製造例之病毒去除膜中之金膠體捕捉部位之金膠體之捕捉量之變動係數的值。將僅流過直徑20nm之金膠體時之結果示於圖5。顯示製造例之病毒去除膜中之金膠體捕捉部位之金膠體之捕捉量之均勻性較高。又，於製造例中，有中空劑之入口溫度與出口溫度之溫度差於接觸熱塑性樹脂與塑化劑之均勻溶液之前後越小，則金膠體捕捉部位之金膠體之捕捉量之均勻性變得越高之傾向，又，藉由自紡絲嘴之中央部加入中空劑，有金膠體捕捉部位之金膠體之捕捉量之均勻性變高之傾向。
(5)金膠體捕捉部位之厚度之測定
自分別過濾20及30nm之金膠體溶液後之濕潤狀態之病毒去除膜切出切片(厚度為8μm)。藉由光學顯微鏡(Biozero，BZ8100，Keyence公司製造)測定濕潤狀態之切片之剖面中被金膠體染色之部分之16個部位之亮度分佈。此處，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜之一次側之表面至捕捉金膠體之部位之最接近一次側之表面之部分為止之第1距離a。又，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜之一次側之表面至捕捉金膠體之部位之最接近二次側之表面之部分為止的第2距離b。
其次，針對16個部位各者，算出將第1距離a除以濕潤狀態之病毒去除膜之膜厚c並以百分率表示之值A(=a/c之百分率表示)，並算出16個部位之值A之平均值作為第1到達度。又，針對16個部位之各者，算出將第2距離b除以濕潤狀態之病毒去除膜之膜厚c並以百分率表示之值B(=b/c之百分率表示)，並算出16個部位之值B之平均值作為第2到達度。
進而，如下述(10)式所示，將過濾直徑20nm之金膠體後之病毒去除膜之第2到達度之平均值B20與過濾直徑30nm之金膠體後之病毒去除膜之第1到達度之平均值A30的差，乘以過濾直徑20nm之金膠體後之濕潤狀態之病毒去除膜之膜厚之平均值C20與過濾直徑30nm之金膠體後之濕潤狀態之病毒去除膜之膜厚之平均值C30的平均值CAVE，算出所獲得之值作為病毒去除膜中之金膠體捕捉部位之厚度T。金膠體捕捉部位之厚度T亦表達為病毒去除膜之緻密層之厚度T。將結果示於圖5。
T=(B20-A30)×CAVE (10)
於上述方法中，使用過濾直徑20nm之金膠體後之病毒去除膜與過濾直徑30nm之金膠體後之病毒去除膜之至少2個病毒去除膜，測定緻密層之厚度。但是，亦可僅使用1個病毒去除膜而測定緻密層之厚度。於此情形時，使用1個病毒去除膜，對含有直徑20nm及30nm兩者之金膠體之金膠體溶液進行過濾。或者，於使用1個病毒去除膜過濾直徑20nm之金膠體溶液後，過濾直徑30nm之金膠體溶液。
其後，自過濾直徑20nm及30nm之金膠體溶液後之病毒去除膜切出切片，藉由光學顯微鏡(Biozero，BZ8100，Keyence公司製造)測定切片之剖面中被金膠體染色之部分之16個部位之亮度分佈。此處，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜之一次側之表面至金膠體捕捉部位之最接近一次側之表面之部分為止的第1距離a1。又，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜之一次側之表面至金膠體捕捉部位之最接近二次側之表面之部分為止的第2距離b1。
其次，針對16個部位各者，算出將第1距離a1除以濕潤之病毒去除膜之膜厚c並以百分率表示之值A1(=a1/c1之百分率表示)，並算出16個部位之值A1之平均值作為第1到達度。又，針對16個部位各者，算出將第2距離b1除以濕潤之病毒去除膜之膜厚c並以百分率表示之值B1(=b1/c1之百分率表示)，並算出16個部位之值B1之平均值作為第2到達度。
進而，如下述(11)式所示，算出將病毒去除膜之第2到達度之平均值 B1與病毒去除膜之第1到達度之平均值A1的差乘以濕潤之病毒去除膜之膜厚之平均值C所得的值作為病毒去除膜之金膠體捕捉部位之厚度T。確認到由(10)式算出之厚度T與由(11)式算出之厚度T之間未產生較大之差。
T=(B1-A1)×C (11)
(6)最緻密層之厚度之測定
自過濾直徑15nm之金膠體溶液後之濕潤狀態之病毒去除膜切出切片(厚度為8μm)。藉由光學顯微鏡(Biozero，BZ8100，Keyence公司製造)測定濕潤狀態之切片之剖面中被金膠體染色之部分之16個部位之亮度分佈。此處，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜之一次側之表面至捕捉金膠體之部位之最接近一次側之表面之部分為止的第1距離d。又，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜之一次側之表面至捕捉金膠體之部位之最接近二次側之表面之部分為止的第2距離e。
其次，針對16個部位各者，算出將第1距離d除以濕潤狀態之病毒去除膜之膜厚f並以百分率表示之值D(=d/f之百分率表示)，並算出16個部位之值D之平均值作為第1到達度。又，針對16個部位各者，算出將第2距離e除以濕潤狀態之病毒去除膜之膜厚f並以百分率表示之值E(=e/f之百分率表示)，並算出16個部位之值E之平均值作為第2到達度。
進而，如下述(12)式所示，算出將過濾直徑15nm之金膠體後之病毒去除膜之第2到達度之平均值E與第1到達度之平均值D的差乘以過濾後之濕潤狀態之病毒去除膜之膜厚之平均值F所獲得之值，作為病毒去除膜之 15nm金膠體捕捉部位(最緻密層)之厚度T。
T=(E-D)×F (12)
(7)病毒去除膜之金膠體捕捉部位之粒徑依存性之測定
自分別過濾直徑15nm、20nm及30nm之金膠體溶液後之病毒去除膜切出切片(厚度為8μm)。藉由光學顯微鏡(Biozero，BZ8100，Keyence公司製造)測定切片之剖面中被金膠體染色之部分之16個部位之亮度分佈。此處，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜之一次側之表面至捕捉金膠體之部位之最接近一次側之表面之部分為止的第1距離a。又，於膜厚方向上，測定自病毒去除膜之一次側之表面至捕捉金膠體之部位之最接近二次側之表面之部分為止的第2距離b。
其次，針對16個部位各者，算出將第1距離a除以濕潤之病毒去除膜之膜厚c並以百分率表示之值A(%)，並算出16個部位之值A(%)之平均值作為第1到達度。又，針對16個部位各者，算出將第2距離b除以濕潤之病毒去除膜之膜厚c並以百分率表示之值B(%)，並算出16個部位之值B(%)之平均值作為第2到達度。關於直徑15nm、20nm及30nm之金膠體之各者，將第1到達度之平均值與第2到達度之平均值示於圖5。再者，在圖5中，左側之數值表示第1到達度之平均值，右側之數值表示第2到達度之平均值。再者，關於直徑30nm、20nm及15nm之金膠體之捕捉位置之測定，始終針對由膜所捕捉到之金膠體進行測定，並非針對未被捕捉至膜之金膠體進行測定。
(病毒去除膜之病毒去除能力) (1)含有病毒之蛋白質溶液之製備
使用多株抗體(人類IgG)(Venoglobulin-IH，Benesis公司製造)，獲得以抗體濃度成為10mg/mL之方式經注射用水(大塚製藥)稀釋而成之抗體溶液。又，使用1mol/L NaCl水溶液將鹽濃度調整至0.1mol/L。進而，使用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH，將氫離子指數(pH值)調整至4.0，將其作為蛋白質溶液。於所獲得之蛋白質溶液中添加豬小病毒(PPV，社團法人動物用生物學製劑協會)1.0vol%並充分攪拌，而獲得含有病毒之蛋白質溶液。
(2-1)含有病毒之蛋白質溶液之過濾(通常)
於196kPa之過濾壓力下，使用所製造之膜面積0.001m2之病毒去除膜進行含有病毒之蛋白質溶液之端點過濾直至過濾量達到150L/m2。
(2-2)含有病毒之蛋白質溶液之過濾(捕捉體積)
於196kPa之過濾壓力下，使用所製造之膜面積0.001m2之病毒去除膜，進行含有病毒之蛋白質溶液之端點過濾。過濾壓力係於供給液容器側設置壓力計而測得。每15L/m2採集濾液，實施過濾直至最大病毒負載量成為14.0(Log10(TCID50/m2))。
(3)病毒去除率之測定
準備自美國培養細胞系統保存機構(ATCC)獲取並培養之PK-13細胞(ATCC No.CRL-6489)。又，準備於56.0℃之水浴中加熱30分鐘而滅活後 之牛血清(Upstate公司製造)3vol%、與含有青黴素/鏈黴素(+10000Units/mL青黴素、+10000μg/mL鏈黴素，Invitrogen製造)1vol%之D-MEM(Invitrogen製造，高葡萄糖)之混合液。以下，將該混合液稱為3vol%FBS/D-MEM。其次，利用3vol%FBS/D-MEM將PK-13細胞進行稀釋，製備細胞濃度2.0×105(細胞/mL)之稀釋細胞懸濁液。其次，準備10片96孔圓底細胞培養盤(Falcon公司製造)，於所有孔中分注稀釋細胞懸濁液各100μL。
針對分注有稀釋細胞懸濁液之細胞培養盤之每8孔，分別分注含有病毒之蛋白質溶液之濾液及該濾液之10倍、102倍、103倍、104倍及105倍稀釋液、與原液之102倍、103倍、104倍、105倍、106倍及107倍稀釋液各100μL。其後，於處在37.0℃、5%二氧化碳下之培養箱中配置細胞培養盤，將細胞培養10天。
針對培養了10天之細胞，使用以下所說明之紅血球吸附法(病毒實驗學 總論 國立預防衛生研究所學友會編，參照p.173)，進行50%組織培養感染值(TCID50)之測定。首先，利用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)(-)(日水製藥股份有限公司製造，藉由製品附帶說明書所記載之方法而製備)將雞保存血(Nippon Biotest製造)稀釋至5倍後，將經稀釋之雞保存血以2500rpm、4.0℃進行5分鐘離心而分離紅血球並使之沈澱。其後，將上清液抽吸去除，再次利用PBS(-)將包含所獲得之紅血球之沈澱物稀釋至200倍。
其次，於細胞培養盤之全部孔中分注紅血球沈澱物之PBS(-)稀釋液各100μL，並靜置2小時。其後，利用目視確認紅血球有無吸附於所培養之細胞組織之表面，將確認到吸附者作為產生了病毒感染之孔來進行計數，將未確認到吸附者作為未產生病毒感染之孔來進行計數。進而，針對分注有含有病毒之蛋白質溶液之濾液及該濾液之稀釋液、與原液稀釋液各者之每個孔，確認病毒感染之比率，藉由Reed-Muench法(病毒實驗學總論，國立預防衛生研究所學友會編，參照p.479-480)，算出log10(TCID50/mL)作為感染值，使用下述(13)式及(14)式算出病毒之對數去除率(LRV)。將結果示於圖5。
LRV=log10(C0/CF) (13)
此處，C0表示利用病毒去除膜過濾前之原液(含有病毒之蛋白質溶液)中之感染值，CF表示利用病毒去除膜過濾後之濾液中之感染值。
包含壓力釋放(Stop&Start)之製程之LRV：LRV=log10(C0×150/(CF100×100+CF50×50)) (14)
此處，C0表示利用病毒去除膜過濾前之原液(含有病毒之蛋白質溶液)中之感染值，CF100表示利用病毒去除膜於壓力釋放前以100mL/0.001m2過濾後之濾液池中之感染值，CF50表示利用病毒去除膜於壓力釋放後靜置3小時，進行再加壓並以50mL/0.001m2過濾後之濾液池中之感染值。
(4)最大捕捉體積之算出
於病毒去除率之測定中，根據獲得大於檢測極限之值時之過濾量(=最大過濾體積)，藉由下述(15)式之算出方法算出病毒去除膜之最大捕捉 體積。
最大捕捉體積(Log10(TCID50/m2))=原液之感染值Log10((TCID50/mL)×最大過濾體積(L/m2)×1000) (15)
若最大捕捉體積為10.0之11.5次方以上，則即便病毒對病毒去除膜之負載量增加，亦不會產生病毒去除率之降低，故而較佳。進而，若為10.0之12次方以上、12.5次方以上、13.0次方以上則更佳。
又，如圖5所示，均勻性較高，且隨著緻密層變厚，最大捕捉體積增加。
(含多聚體液體之製作)
使用人類免疫球蛋白製劑(獻血Venoglobulin IH5%靜注，日本血液製劑機構)，製備球蛋白終濃度2%、氯化鈉濃度100mmol/L之溶液。該溶液之pH值為4.5。藉由1mol/L鹽酸水溶液使該溶液於室溫下降低至pH值2.5，靜置1小時後，利用1mol/L之氫氧化鈉水溶液恢復至pH值4.5，並靜置24小時，藉此使球蛋白之一部分成為多聚體。再者，於本實施例中，為了使蛋白質改性，使用過於嚴酷之條件下之pH值處理使粒子狀物產生。以下，將該含有多聚體之溶液設為溶液A。
藉由動態光散射法測定溶液A中所含之粒子之平均直徑，結果所算出之平均直徑為74.3nm。測定係使用Malvern公司製造之ZetaSizerNano。 將結果示於圖6。測定時之光量(照射光之衰減條件)、距光源之距離及總測定時間(累計次數及每一累計次數之測定時間)係利用裝置之自動設定功能，又，於測定溫度為25.0℃、測定角度為173°之條件下進行。
又，將溶液A供於尺寸排除層析法分析，結果以由所獲得之圖之峰面積算出之相對面積比計含有16.5%之單體、5.6%之二聚體、77.8%之三聚體以上之多聚體。再者，於本實施例中，製作含有多聚體之溶液，由於為添加至蛋白質溶液中之模型實驗，故而未實施對利用尺寸排除層析法分析區分之試樣之平均直徑之測定。於尺寸排除層析法之實施中，使用高效液相層析儀(Prominence，島津製作所)與管柱(TSK gel G3000SWXL，Tosoh，排除極限分子量：500,000Da)。移動相包含0.3mol/L、pH值6.9之磷酸緩衝劑、0.2mol/L之精胺酸-HCl及0.1mol/L之NaCl。將測定結果之一例示於圖7。圖7之(1)之波峰表示球蛋白之三聚體以上之多聚體，(2)之波峰表示球蛋白之二聚體，(3)之波峰表示單體。由層析圖之波峰之面積算出各單體及多聚體之比率，將其設為相對面積比。於以下之實施例中亦相同，使用相對面積比%表示單體及多聚體等之濃度。測定溫度為25℃，測定時間為20分鐘，流速為1.0mL/min。於以下之單體及多聚體之比率之分析中，該等條件亦相同。再者，於以下之實施例中，如上所述，使用溶液中之蛋白質之大部分含有三聚體以上之多聚體之蛋白質溶液A，確認到溶液A中之粒子之平均直徑未達100nm及由三聚體以上之多聚體之峰面積算出之相對面積比後，以各實施例中應處理之溶液中所含之平均直徑未達100nm之蛋白質之三聚體以上之多聚體於病毒去除膜每1m2中成為0.25g/m2之方式，製備應處理之溶液而進行實驗。
(實施例1)
使用人類免疫球蛋白製劑(獻血Venoglobulin IH5%靜注，日本血液製劑機構)製備球蛋白終濃度30mg/mL、氯化鈉濃度50mmol/L、pH值5.3之溶液25mL，於該溶液中以含有0.3mg之多聚體之方式添加溶液A。
準備膜面積為10cm2，包含聚偏二氟乙烯(PVDF)，且孔徑為0.1μm的Durapore(微孔)作為預濾器，對所製備之溶液全部量進行0.2bar定壓過濾。準備於與製造例5相同之條件下製造且膜面積為3cm2之病毒去除膜，對所獲得之濾液進行3bar定壓過濾，結果如圖8所示，過濾所製備之25mL全部量需要65分鐘。於圖9中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(比較例1)
對與實施例1中所製備之溶液相同之溶液，不進行利用預濾器之過濾，而直接利用病毒去除膜進行3bar定壓過濾，結果如圖8所示，花費3小時亦僅過濾約9.6mL，根據該曲線預測，過濾25mL全部量需要4900小時以上。此時，負載於病毒去除膜之多聚體於每1m2中為1g。於圖9中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(實施例2)
藉由與實施例1相同之方法，製備球蛋白終濃度30mg/mL、氯化鈉濃度50mmol/L、pH值5.3之溶液25mL，於該溶液中以含有多聚體1.03 mg之方式添加溶液A。
準備將膜面積為5cm2、包含聚醯胺且孔徑0.1μm之膜積層3層而成之VirosartMax(Sartorius Stedim)作為預濾器，進行0.2bar定壓過濾。預濾器係準備2個，並以相對於處理液之總量為一半量之12.5mL自第1個過濾器重新連接於第2個過濾器。利用於與製造例5相同之條件下製造且膜面積為3cm2之病毒去除膜，對所獲得之濾液進行3bar定壓過濾，結果如圖10所示，過濾所製備之25mL全部量需要128分鐘。於圖9中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(比較例2)
對與實施例2中所製備之溶液相同之溶液，不進行利用預濾器之過濾，而直接利用病毒去除膜進行3bar定壓過濾，結果如圖10所示，花費3小時亦僅過濾約7.7mL，根據該曲線預測，過濾25mL全部量而言需要150,000小時以上。此時，負載於病毒去除膜之多聚體於每1m2中為3.4g。於圖9中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(實施例3)
藉由與實施例1相同之方法，製備球蛋白終濃度30mg/mL、氯化鈉濃度50mmol/L、pH值5.3之溶液25mL，於該溶液中以含有0.15mg多聚體之方式添加溶液A。作為預濾器，準備作為膜面積為5.8cm2、包含聚醚碸且孔徑0.2μm之膜的Supor(Pall)，進行0.2bar定壓過濾。預濾器係準備2個，並以相對於處理液之全部量為一半量之12.5mL自第1個過濾器重新 連接於第2個過濾器。利用於與製造例5相同之條件下製造且膜面積為3cm2之病毒去除膜，對所獲得之濾液進行3bar定壓過濾，結果如圖11所示，過濾所製備之25mL全部量需要180分鐘。於圖9中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(比較例3)
對與實施例3中所製備之溶液相同之溶液，不進行利用預濾器之過濾，而直接利用病毒去除膜進行3bar定壓過濾，結果如圖11所示，花費3小時亦僅過濾約15.9mL，根據該曲線預測，過濾25mL全部量需要1850小時以上。此時，負載於病毒去除膜之多聚體於每1m2中為0.5g。於圖9中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(實施例4)
藉由與實施例1相同之方法，製備球蛋白終濃度30mg/mL、氯化鈉濃度50mmol/L、pH值5.3之溶液25mL，於該溶液中以含有0.3mg多聚體之方式添加溶液A。
作為預濾器，準備膜面積為4.8cm2、包含尼龍且孔徑0.2μm之膜注射器式過濾器NY(Corning)，進行0.2bar定壓過濾。預濾器係準備2個，並以相對於處理液之全部量為一半量之12.5mL自第1個過濾器重新連接於第2個過濾器。利用於與製造例5相同之條件下製造且膜面積為3cm2之病毒去除膜，對所獲得之濾液進行3bar定壓過濾，結果如圖12所示，以3小時可過濾17.2mL。根據該曲線推測，過濾25mL全部量花費約47小 時。於圖9中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(比較例4)
對與實施例4中所製備之溶液相同之溶液，不進行利用預濾器之過濾，而直接利用病毒去除膜進行3bar定壓過濾，結果如圖12所示，花費3小時亦僅過濾約9.6mL，根據該曲線預測，過濾25mL全部量需要4900小時以上。此時，負載於病毒去除膜之多聚體於每1m2中為1g。於圖9中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(實施例5)
藉由與實施例1相同之方法，製備球蛋白終濃度30mg/mL、氯化鈉濃度50mmol/L、pH值5.3之溶液25mL，於該溶液中以含有1.03mg多聚體之方式添加溶液A。
作為預濾器，準備膜面積為10cm2、包含聚偏二氟乙烯(PVDF)且孔徑為0.1μm之Durapore(微孔)。將其連結於在與製造例5相同之條件下製造且膜面積為3cm2之病毒去除膜之上游，一面以施加於病毒去除膜之壓力成為3bar之方式進行調整，一面進行定壓過濾，結果如圖13所示，過濾所製備之25mL全部量需要84分鐘。於圖14中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(實施例6)
對於與實施例5相同之溶液，作為預濾器，準備將積層有3層之膜面積為5cm2、包含聚醯胺且孔徑為0.1μm之膜的VirosartMax(Sartorius Stedim)以2個串聯連結而成者。將其連結於在與製造例5相同之條件下製造且膜面積為3cm2之病毒去除膜之上游，一面以施加於病毒去除膜之壓力成為3bar之方式進行調整一面進行定壓過濾，結果如圖13所示，過濾所製備之25mL全部量需要340分鐘。於圖14中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(比較例5)
對於與實施例5相同之溶液，不使用預濾器而直接連結於在與製造例5相同之條件下製造且膜面積為3cm2之病毒去除膜之上游，一面以壓力成為3bar之方式進行調整一面進行定壓過濾，結果如圖13所示，花費6小時亦僅過濾約9.6mL，根據該曲線預測，過濾25mL全部量需要150,000小時以上。此時，負載於病毒去除膜之多聚體於每1m2中為3.4g。於圖14中表示將本試驗結果每單位膜面積換算成總過濾量所得之結果。
(多聚體存在下之病毒去除膜之病毒去除能力) (1)含有多聚體及病毒之蛋白質溶液之製備
使用多株抗體(人類IgG)(Venoglobulin-IH，Benesis公司製造)，獲得以抗體濃度成為30mg/mL之方式利用注射用水(大塚製藥)稀釋之抗體溶液300mL。又，使用1mol/L NaCl水溶液將鹽濃度調整為0.1mol/L。進而，使用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH將氫離子指數(pH值)調整為4.0，將其作為蛋白質溶液。以所獲得之蛋白質溶液含有多聚體0.1125mg 之方式於蛋白質溶液中添加溶液A，進而添加豬小病毒(PPV，社團法人動物用生物學製劑協會)3.0vol%並充分攪拌，從而獲得含有多聚體及病毒之蛋白質溶液。
(實施例7)
以196kPa之過濾壓力，於所製造之膜面積0.0003m2之病毒去除膜之前段連結作為預濾器之VirosartMax(Sartorius Stedim)，而進行含有多聚體及病毒之蛋白質溶液之端點過濾。於進行全量過濾之濾液中未檢測到病毒。
(比較例6)
不使用預濾器而對與實施例1相同之溶液進行端點過濾，結果於中途過濾60mL左右時過濾速度急遽地降低，其後難以進行過濾，因此於過濾約80mL之時間點中斷過濾。於中斷之前所獲得之濾液中檢測出病毒，病毒去除膜未能完全去除病毒。此時，若進行全量過濾，則負載於病毒去除膜之多聚體於病毒去除膜每1m2中為0.375g。

Claims (28)

  1. 一種含蛋白質液體之過濾方法，其係以20mg/mL以上且100mg/mL以下之濃度含有蛋白質之含蛋白質液體的過濾方法，該方法包括：預過濾步驟，其係利用孔徑為0.08μm至0.25μm且為疏水性樹脂之預濾器對上述含蛋白質液體進行過濾；病毒去除步驟，其係於上述預過濾步驟後，利用包含聚烯烴樹脂或氟系樹脂之病毒去除膜對上述含蛋白質液體進行過濾；且進行上述預過濾步驟之前之上述含蛋白質液體係上述病毒去除膜每1m2含有0.25g以上之平均直徑未達100nm之上述蛋白質之三聚體以上之多聚體。
  2. 如請求項1之方法，其中上述疏水性樹脂係選自由聚醯胺、聚碸系、及氟系樹脂所組成之群中之材料。
  3. 如請求項2之方法，其中上述疏水性樹脂係聚醚碸或聚偏二氟乙烯。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述預過濾步驟之前之含蛋白質液體進而含有粒子狀物，該粒子狀物係上述蛋白質之多聚體且平均直徑為100nm以上。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中於上述預過濾步驟之前，進而包含對上述含蛋白質液體進行透析過濾之透析過濾步驟。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中於上述預過濾步驟之前，進而包含對上述含蛋白質液體進行超過濾之超過濾步驟。
  7. 如請求項5之方法，其中於上述透析過濾步驟之後，進而不包含超過濾步驟。
  8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中於上述預過濾步驟之前，進而包含使用切向流式過濾裝置進行過濾之切向流式過濾步驟。
  9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中於上述預過濾步驟之前，進而包含將上述含蛋白質液體攪拌2小時以上之攪拌步驟。
  10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中於上述預過濾步驟與上述病毒去除步驟之間不包含其他步驟。
  11. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述預過濾步驟及上述病毒去除步驟係連續地進行。
  12. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述預濾器為片狀之過濾器。
  13. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述預濾器包含多層膜。
  14. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述預濾器包含過濾器之孔徑於各層不同之多層膜。
  15. 如請求項1至3中任一項之方法，其中經上述預濾器過濾後之含蛋白質液體之黏度低於經上述預濾器過濾前之含蛋白質液體之黏度。
  16. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述蛋白質含有抗體。
  17. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述蛋白質含有單株抗體。
  18. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述病毒去除膜包含聚偏二氟乙烯。
  19. 如請求項1至3中任一項之方法，其中利用上述病毒去除膜之小病毒之對數去除率(LRV)為4.0以上。
  20. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述病毒去除膜具有：一次側之表面，其被供給經上述預濾器過濾後之上述含蛋白質液體；及二次側之表面，其供透過該病毒去除膜之透過液排出；自上述一次側對該病毒去除膜供給含有直徑20nm之金膠體之溶液而利用該病毒去除膜捕捉上述金膠體，並於該病毒去除膜之剖面測定亮度 時，上述亮度之位移之光譜之面積值之標準偏差除以上述亮度之位移之光譜之面積值之平均值所得的值為0.01以上且1.50以下；且於該病毒去除膜之剖面中，供捕捉直徑20nm以上且直徑30nm以下之金膠體之部位之厚度於濕潤狀態下為10μm以上且30μm以下。
  21. 如請求項1至3中任一項之方法，其中進行上述預過濾步驟之前之含蛋白質液體之氫離子指數為4.0以上且8.0以下。
  22. 如請求項1至3中任一項之方法，其中進行上述預過濾步驟之前之含蛋白質液體之離子強度為0mmol/L以上且300mmol/L以下。
  23. 如請求項1至3中任一項之方法，其中進行上述預過濾步驟之前之含蛋白質液體含有包含選自由糖類及鹼性胺基酸所組成之群中之至少一種的添加劑。
  24. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述預濾器能夠進行原位滅菌。
  25. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述含蛋白質液體之濃度為25mg/mL以上且100mg/mL以下之濃度。
  26. 如請求項4之方法，其中上述含蛋白質液體之濃度為25mg/mL以上且100mg/mL以下之濃度。
  27. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述含蛋白質液體之濃度為30mg/mL以上且100mg/mL以下之濃度。
  28. 如請求項4之方法，其中上述含蛋白質液體之濃度為30mg/mL以上且100mg/mL以下之濃度。
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