KR20200003396A

KR20200003396A - 단백질 함유액의 여과 방법

Info

Publication number: KR20200003396A
Application number: KR1020197034879A
Authority: KR
Inventors: 다쿠마 이와사키; 요시로 요코야마
Original assignee: 아사히 가세이 메디컬 가부시키가이샤
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2018-06-05
Publication date: 2020-01-09
Also published as: US11590452B2; CN110740802B; RU2735437C1; JP6883102B2; CA3066062A1; AU2018284707B2; EP3639911A4; JPWO2018230397A1; CN110740802A; CA3066062C; EP3639911A1; TWI734009B; AU2018284707A8; SG11201911877RA; KR102316263B1; WO2018230397A1; TW201902913A; US20200094190A1; AU2018284707A1

Abstract

20 mg/mL 이상 100 mg/mL 이하의 농도로 단백질을 함유하는 단백질 함유액의 여과 방법으로서, 단백질 함유액을, 구멍 직경이 0.08 ㎛ 내지 0.25 ㎛이며 소수성 수지를 포함하는 프리필터로 여과하는 전여과 공정과, 전여과 공정 후에, 단백질 함유액을 합성 고분자를 포함하는 바이러스 제거막으로 여과하는 바이러스 제거 공정을 포함하며, 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액이, 평균 직경이 100 nm 미만인 단백질의 삼량체 이상의 다량체를, 바이러스 제거막 1 ㎡당 0.25 g 이상 포함하고 있는 방법.

Description

단백질 함유액의 여과 방법

본 발명은 단백질 함유액의 여과 방법에 관한 것이다.

최근, 인간 혈액 유래의 혈장 분획 제제에 더하여, 바이오 의약품에도 바이러스 안전성을 향상시키는 대책이 필요해졌다. 그 때문에 의약품 메이커에서는 제조 공정 중에 바이러스 제거/불활화 공정을 도입하는 검토를 하고 있다. 그 중에서도, 바이러스 제거막을 이용한 여과에 의한 바이러스 제거법은, 유용한 단백질을 변성시키지 않고 바이러스를 저감할 수 있는 유효한 방법이다.

바이러스 중에서도, 특히 파보바이러스는, 혈장 분획 제제 분야에 있어서, 인간 파보바이러스 B19에 의한 감염 사례나 바이오 의약품 분야에서 마우스의 파보바이러스의 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에 대한 오염 사례가 보고되고 있다. 또한, 예컨대 렙토스피라 종(Leptospira species) 등의 미소 박테리아가 바이오 의약에 잔존하는 사례도 보고되어 있다.

소바이러스인 파보바이러스는 엔벨로프를 갖지 않는다는 점에서, 물리 화학적으로 안정적이며, 의약품의 제조 프로세스 중에서 일반적으로 행해지고 있는 불활화 공정인 가열, 저 pH, 화학 약품 처리에 대하여 내성이 있다. 그 때문에, 불활화법과는 상이한 작용 메커니즘의 바이러스 제거 방법으로서, 바이러스 제거막에 의한 바이러스 제거 및 박테리아 제거의 요구가 높아지고 있다.

바이러스 제거용의 여과막으로는, 셀룰로오스와 같은 천연 소재로 이루어진 막, 혹은 폴리불화비닐리덴(PVDF), 폴리에테르술폰(PES)과 같은 합성 고분자 소재로 이루어진 바이러스 제거막이 알려져 있다(예컨대, 특허문헌 1, 2 및 비특허문헌 1 내지 4 참조). 의약품 제조의 현장에서는, 유용한 단백질과 사이즈가 비슷한 소바이러스(예로서 파보바이러스)에 대한 높은 바이러스 제거성을 갖춤과 더불어, 단백질의 높은 여과 효율을 갖는 바이러스 제거막이 요구되고, 바이러스 제거막에 대한 요구는 해마다 엄격해지고 있다.

특허문헌 1: 일본 특허 공개 제2004-277323호 공보 특허문헌 2: 미국 특허 출원 공개 제2016/0176921호 명세서

비특허문헌 1: Manabe. S, Removal of virus through novel membrane filtration method., Dev. Biol. Stand., (1996)88: 81-90. 비특허문헌 2: Brandwein H 등, Membrane filtration for virus removal., Dev Biol (Basel)., (2000)102: 157-63. 비특허문헌 3: Aranha-Creado 등, Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter., Biologicals. (1998) Jun; 26(2): 167-72. 비특허문헌 4: L. Moce-Llivina 등, Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions, Journal of Virological Methods, (2003) April, Vol. 109, Issue 1, Pages 99-101.

최근, CHO를 숙주 세포로서 이용한 생물 제제의 최종 정제 공정에서, 예컨대 렙토스피라 리세라시이(Leptospira licerasiae) 등의 미소 박테리아나 바이러스의 혼입 리스크가 높은 확률로 생기는 것에 관한 우려가 증대되고 있다. 항체 의약에는, 최종 한외 여과/투석 여과(UF/DF) 공정을 거쳐 20 mg/mL로부터 100 mg/mL의 농도로 농축되고, 그 후, 구멍 직경 0.22 ㎛의 제균막을 이용하여 여과되는 제제가 적지 않게 존재한다. 동 공정은 반드시 무균 조건이 아니라, 무멸균, 수동 셋업 환경으로 되어 있다는 점에서, 작업자 유래의 컨테미네이션이나, 최종 버퍼 준비에서의 미소 박테리아나 바이러스 유래의 컨테미네이션의 발생이 우려된다. 그러나, 의약품 제조 공정에서 최종 UF/DF 공정은, 바이러스 제거막에 의한 바이러스 제거 공정 후에 행해지는 것이 일반적이기 때문에, 최종 UF/DF 공정 및 그 후의 0.22 ㎛ 제균막 공정에서는, 미소 박테리아나 바이러스의 제거는 불가능하다. 이러한 관점에서, 안전한 제약 제조의 실현을 위해, 최종 UF/DF 공정 후의 미소 박테리아나 바이러스를 제거하기 위한 공정이 유용하다는 것을 본 발명자들은 발견하였다.

또한, 최종 UF/DF 공정에 의해 얻어지는 고농도의 단백질 용액은, 함유 단백질의 단량체끼리 회합하여 형성되는 다량체를 포함하는 경우가 있다. 특히, 상기와 같은 UF/DF 등의 정제 공정에서는, 전단 응력에 의해 단백질의 응집이 촉진되어, 다량체가 가시적인 입자상물로까지 커지는 경우가 있다. 제약에 포함되는 단백질의 다량체는, 인체에 대하여 부작용을 야기하는 원인으로서 알려져 있어, 제거되는 것이 바람직하다. 또한, 이들 다량체나 입자상물은, 최종 UF/DF 공정 후에 이용되는 바이러스 제거막을 폐색시키는 원인이 된다. 그러나, 이들 다량체나 입자상물은, 일반적으로 0.22 ㎛의 제균막에 의한 제거는 어렵다고 알려져 있고, 상기와 같은 한외 여과 등에 의한 정제 공정 후에 다량체를 제거하는 것에 관해서는 지금까지 충분히 검토되지 않았다.

따라서, 바이러스 제거막을 장전한 바이러스 제거 장치에 의한 단백질 제제 중간 제품의 여과는, 단시간에 보다 많은 양의 단백질을 여과할 수 있고, 다량체를 제거하고 또한 충분히 높은 바이러스 제거 성능으로 바이러스를 제거할 수 있는 것이 이상적이다. 그러나, 예컨대 셀룰로오스로 이루어진 바이러스 제거막은, 0.25 g/㎡ 이상의 다량체가 포함되어 있는 단백질 용액을 여과하더라도 구멍이 잘 막히지 않지만, 20 mg/mL 이상의 고농도의 단백질 용액을 여과하면, 여과 속도가 현저히 저하되기 때문에, 저농도 단백질 용액을 여과하는 경우에 비교하여, 단위 시간당 여과할 수 있는 단백질량이 감소하는 경향이 있다.

또한, 합성 고분자로 이루어진 바이러스 제거막에서는, 내압성이 높고, 실사용 압력을 300 kPa 정도까지 높여도 문제 없지만, 단백질 농도를 20 mg/mL 정도로 높이면 막의 구멍이 막혀서 여과할 수 없게 되어 버리는 문제가 종종 일어날 수 있는 것을 본 발명자들은 발견하였다. 그 때문에, 합성 고분자로 이루어진 바이러스 제거막을 이용하는 경우는, 통상 10 mg/mL 이하의 저농도로 여과가 행해진다(예컨대 특허문헌 1 참조).

이러한 이유로, 각종 크로마토그래피나 최종 한외 여과 등의 정제 공정에 의해 높아진, 높은 단백질 농도의 단백질 제제 중간 제품을 고압으로 바이러스 제거 장치에 흘리는 여과 조건에서의 여과 방법의 연구는 진행되지 않았고, 또한 이 방법에 적합한 바이러스 제거막의 개발도 진행되지 않았다. 따라서, 본 발명은, 고농도로 단백질을 함유하는 단백 함유액을, 높은 효율로 여과할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제의 하나로 한다.

본 발명의 양태에 의하면, 20 mg/mL 이상 100 mg/mL 이하의 농도로 단백질을 함유하는 단백질 함유액의 여과 방법으로서, 단백질 함유액을, 구멍 직경이 0.08 ㎛ 내지 0.25 ㎛이며 소수성 수지를 포함하는 프리필터로 여과하는 전여과 공정과, 전여과 공정 후에, 단백질 함유액을 합성 고분자를 포함하는 바이러스 제거막으로 여과하는 바이러스 제거 공정을 포함하며, 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액이, 평균 직경이 100 nm 미만인 단백질의 삼량체 이상의 다량체를, 바이러스 제거막 1 ㎡당 0.25 g 이상 포함하고 있는 방법이 제공된다.

상기 방법에 있어서, 프리필터가 폴리아미드, 폴리술폰계, 불소계 수지로 이루어진 군에서 선택되는 재료를 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법에 있어서, 프리필터가 폴리에테르술폰 또는 폴리불화비닐리덴을 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법이, 전여과 공정 전의 단백질 함유액이, 단백질의 다량체이며, 직경이 100 nm 이상인 입자상물을 더 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법이, 전여과 공정 전에, 단백질 함유액에 대하여 투석 여과를 행하는 투석 여과 공정을 더 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법이, 전여과 공정 전에, 단백질 함유액에 대하여 한외 여과를 행하는 한외 여과 공정을 더 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법이, 투석 여과 공정 후에, 한외 여과 공정 및 투석 여과 공정을 더 포함하지 않아도 좋다.

상기 방법이, 전여과 공정 전에, 탄젠셜 플로우 여과 장치를 이용하여 여과를 행하는 탄젠셜 플로우 여과 공정을 더 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법이, 전여과 공정 전에, 단백질 함유액을 2시간 이상 교반하는 교반 공정을 더 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법이, 전여과 공정과 바이러스 제거 공정 사이에 다른 공정을 포함하지 않아도 좋다.

상기 방법에 있어서, 전여과 공정 및 바이러스 제거 공정이 연속하여 행해져도 좋다.

상기 방법에 있어서, 프리필터가 시트형의 필터여도 좋다.

상기 방법에 있어서, 프리필터가 다층막을 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법에 있어서, 프리필터가, 각 층에서 필터의 구멍 직경이 상이한 다층막을 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법에 있어서, 프리필터로 여과된 단백질 함유액의 점도가, 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액의 점도보다 낮아도 좋다.

상기 방법에 있어서, 단백질이 항체를 포함하고 있어도 좋다. 항체가 모노클로날 항체여도 좋다.

상기 방법에 있어서, 바이러스 제거막이 폴리불화비닐리덴을 포함하고 있어도 좋다. 바이러스 제거막에 의한 파보바이러스의 대수 제거율(LRV)이 4.0 이상이어도 좋다.

상기 방법에 있어서, 바이러스 제거막이, 프리필터로 여과된 단백질 함유액이 공급되는 일차측의 표면과, 상기 바이러스 제거막을 투과한 투과액이 배출되는 이차측의 표면을 가지며, 일차측으로부터 상기 바이러스 제거막에 직경 20 nm의 금콜로이드를 함유하는 용액을 공급하여 상기 바이러스 제거막으로 금콜로이드를 포착하고, 상기 바이러스 제거막의 단면에서 휘도를 측정하면, 휘도 변위의 스펙트럼의 면적치의 표준편차를 휘도 변위의 스펙트럼의 면적치의 평균치로 나눈 값이 0.01 이상 1.50 이하이며, 상기 바이러스 제거막의 단면에 있어서, 직경 20 nm 이상 직경 30 nm 이하의 금콜로이드가 포착되는 부위의 두께가, 습윤 상태에서 10 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하여도 좋다.

상기 방법에 있어서, 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액의 수소 이온 지수가 4.0 이상 8.0 이하여도 좋다. 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액의 이온 강도가 0 mmol/L 이상 300 mmol/L 이하여도 좋다. 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액이, 당류 및 염기성 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 첨가제를 포함하고 있어도 좋다.

상기 방법에 있어서, 프리필터가 정치 멸균 가능해도 좋다.

본 발명에 의하면, 고농도로 단백질을 함유하는 단백 함유액을 높은 효율로 여과할 수 있는 방법을 제공 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 중공사막의 형상을 갖는 바이러스 제거막의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 참고예에 따른 중공사막의 형상을 갖는 바이러스 제거막에서의 바이러스 포착 부위의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시형태에 따른 중공사막의 형상을 갖는 바이러스 제거막에서의 바이러스 포착 부위의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시형태에 따른 평막의 형상을 갖는 바이러스 제거막의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 제거막의 제조 조건 및 평가 결과를 나타내는 표이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 단백질 입자의 입경 분포를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 다량체 함유액을 사이즈 배제 크로마토그래피 실험했을 때의 흡광도의 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따른 바이러스 제거막의 총 여과량의 경시 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 바이러스 제거막의 여과에 요한 시간을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에 따른 바이러스 제거막의 총 여과량의 경시 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 3 및 비교예 3에 따른 바이러스 제거막의 총 여과량의 경시 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4 및 비교예 4에 따른 바이러스 제거막의 총 여과량의 경시 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 실시예 5, 6 및 비교예 5에 따른 바이러스 제거막의 총 여과량의 경시 변화를 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 바이러스 제거막의 여과에 요한 시간을 나타내는 그래프이다.

이하에 본 발명의 실시형태를 설명한다. 이하의 도면의 기재에서 동일 또는 유사한 부분에는 동일 또는 유사한 부호로 표시하였다. 단, 도면은 모식적인 것이며, 구체적인 치수 등을 정확하게 나타낸 것이 아니다. 따라서, 구체적인 치수 등은 이하의 설명을 대조하여 판단해야 하는 것이며, 도면 상호간에 있어서도 서로의 치수 관계나 비율이 상이한 부분이 포함되어 있는 것은 물론이다.

본 발명의 실시형태에 따른 단백질 함유액의 여과 방법은, 20 mg/mL 이상 100 mg/mL 이하의 농도로 단백질을 함유하는 단백질 함유액의 여과 방법으로서, 단백질 함유액을, 구멍 직경이 0.08 ㎛ 내지 0.25 ㎛이며 소수성 수지를 포함하는 프리필터로 여과하는 전여과 공정과, 전여과 공정 후에, 단백질 함유액을 합성 고분자를 포함하는 바이러스 제거막으로 여과하는 바이러스 제거 공정을 포함하며, 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액이, 평균 직경이 100 nm 미만인 단백질의 삼량체 이상의 다량체를, 바이러스 제거막 1 ㎡당 0.25 g 이상 포함하고 있는 방법이다. 바이러스 제거 공정에서 박테리아도 제거되어도 좋다.

단백질 함유액이, 평균 직경이 100 nm 미만인 단백질의 삼량체 이상의 다량체를, 바이러스 제거막 1 ㎡당 0.25 g 이상 포함한다는 것은, 이하의 2개의 요건을 만족시키는 것을 말한다.

(1) 처리해야 할 액을 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC) 등을 이용하여 분획했을 때의 삼량체 이상의 다량체를, 동적 광산란법(DLS)으로 측정했을 때의 평균 직경이 100 nm 미만인 것.

(2) 처리해야 할 액을 사이즈 배제 크로마토그래피 차트를 이용하여 분획했을 때의 삼량체 이상의 다량체의 피크 면적으로부터 산출되는 상대 면적비와, 바이러스 제거막 1 ㎡당 처리해야 할 총액량과, 총 단백질 농도로부터 하기 (1)식을 이용하여 산출되는, 처리해야 할 액에 포함되는 다량체의 양이 0.25 g 이상인 것.

(바이러스 제거막 1 ㎡당 포함되는 다량체량: g/㎡)=(1 ㎡당 처리해야 할 총액량: L/㎡)×(총 단백질 농도: g/L)×(크로마트차트의 피크 면적으로부터 산출되는 삼량체 이상의 다량체의 상대 면적비: %)/100 (1)

일반적으로, 다량체를 많이 포함하는 분획에서의 평균 직경은 정규 분포를 취한다고 간주할 수 있고, DLS로 측정한 평균 직경이 100 nm 미만인 경우, 그 대상 용액에 포함되는 물질의 50% 이상이 100 nm 미만의 직경의 입자로 이루어진다고 간주할 수 있다. 따라서, (1)의 요건을 만족시키는 단백질 함유액에 포함되는, 단백질의 삼량체 이상의 다량체는, 그 대부분이 100 nm 미만의 평균 직경을 갖는 입자로 이루어진다고 간주할 수 있다.

또한, 단백질 함유액에 포함되는 평균 직경이 100 nm 미만인 삼량체 이상의 다량체의 함유량은, 예컨대 SEC 등의 사이즈에 따라 분획하는 수단과, 예컨대 UV 검출기와 같은 분획한 시료를 정량 가능한 분석 수단과, 예컨대 DLS와 같은 사이즈를 분석할 수 있는 수단을 연결한 분석계에 의해, 그 함유량과 사이즈를 구하는 것이 가능하다. 예컨대 참고 문헌(Biotechnol. Prog., 2015, Vol. 31, No. 3)에 의하면, SEC과 UV 검출기와 DLS를 연결한 장치를 이용하여, UV 검출기 단일체에서는 검출할 수 없을 정도로 미량 함유되어 있는 다량체의 함유량을 특정하고 있다. 단, 단백질 함유액을 농축하거나 하여 다량체의 농도를 고농도로 하면, UV 검출기 단일체로 다량체의 정량도 가능하다.

단백질이란, 예컨대 항체 단백질이다. 생리 활성 물질의 일례인 항체 단백질은, 생화학에서의 일반적인 정의 그대로, 척추동물의 감염 방어 기구로서 B 림프구가 생산하는 당단백질 분자(감마글로불린 또는 면역글로불린이라고도 함)이다. 예컨대, 실시형태에서 정제되는 항체 단백질은, 인간의 의약품으로서 사용되며, 투여 대상인 인간의 체내에 있는 항체 단백질과 실질적으로 동일한 구조를 갖는다.

항체 단백질은, 인간 항체 단백질이어도 좋고, 인간 이외의 소 및 마우스 등의 포유동물 유래 항체 단백질이어도 좋다. 혹은, 항체 단백질은, 인간 IgG와의 키메라 항체 단백질 및 인간화 항체 단백질이어도 좋다. 인간 IgG와의 키메라 항체 단백질이란, 가변 영역이 마우스 등의 인간 이외의 생물 유래이고, 그 밖의 정상 영역이 인간 유래의 면역글로불린으로 치환된 항체 단백질이다. 또한, 인간화 항체 단백질이란, 가변 영역 중 상보성 결정 영역(complementarity-determining region: CDR)이 인간 이외의 생물 유래이고, 그 밖의 프레임 워크 영역(framework region: FR)이 인간 유래인 항체 단백질이다. 인간화 항체 단백질은, 키메라 항체 단백질보다 면역원성이 더욱 저감된다.

항체 단백질의 클래스(아이소타입) 및 서브 클래스는 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 항체 단백질은, 정상 영역의 구조의 차이에 의해, IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE의 5종류의 클래스로 분류된다. 그러나, 실시형태에 따른 여과 방법이 정제 대상으로 하는 항체 단백질은, 5종류의 클래스 어느 것이어도 좋다. 또한, 인간 항체 단백질에서는, IgG에는 IgG1 내지 IgG4의 4개의 서브 클래스가 있고, IgA에는 IgA1과 IgA2의 2개의 서브 클래스가 있다. 그러나, 실시형태에 따른 여과 방법이 정제 대상으로 하는 항체 단백질의 서브 클래스는 어느 것이어도 좋다. 또, Fc 영역에 단백질을 결합한 Fc 융합 단백질 등의 항체 관련 단백질도, 실시형태에 따른 여과 방법이 정제 대상으로 하는 항체 단백질에 포함될 수 있다.

또한, 항체 단백질은, 유래에 따라서도 분류할 수 있다. 그러나, 실시형태에 따른 여과 방법이 정제 대상으로 하는 항체 단백질은, 천연의 인간 항체 단백질, 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 재조합 인간 항체 단백질, 모노클로날 항체 단백질 및 폴리클로날 항체 단백질 중 어느 것이어도 좋다. 이들 항체 단백질 중에서도, 실시형태에 따른 여과 방법이 정제 대상으로 하는 항체 단백질로는, 항체 의약으로서의 수요나 중요성의 관점에서, 인간 IgG 및 모노클로날 항체가 적합하지만, 이것에 한정되지 않는다.

프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액의 단백질 농도는, 20 mg/mL 이상 혹은 25 mg/mL 이상이며, 100 mg/mL 이하, 90 mg/mL 이하, 80 mg/mL 이하, 70 mg/mL 이하, 60 mg/mL 이하 혹은 50 mg/mL 이하이다. 20 mg/mL 이상의 단백질 농도의 단백질 함유액은, 직경이 100 nm 미만인 단백질의 다량체 및 직경이 100 nm 이상인 입자상물이 형성되기 쉬운 경향이 있다. 예컨대, IgG의 다량체는, 병원체인 항원과 결합하지 않은 상태로 보체와 결합하여 보체를 이상 활성화하기 때문에, 심각한 부작용을 일으키는 경우가 있다.

프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액은 단백질의 다량체를 포함할 수 있다. 단백질의 다량체는, 단백질의 단량체가 복수 응집하여 형성된다. 단백질의 다량체란, 예컨대, 단백질(그 자체는 이량체 등의 회합체여도 좋음)의 이량체 및 삼량체이다. 본 개시에서의 「다량체」란, 특히 삼량체 이상의 다량체를 말한다. 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액은, 함유하는 단백질의 평균 직경이 100 nm 미만이며, 삼량체 이상의 다량체를, 바이러스 제거막 1 ㎡당 0.25 g 이상, 0.35 g 이상, 0.50 g 이상, 혹은 0.75 g 이상 포함하고 있다. 삼량체 이상의 다량체를 0.25 g 이상 포함하고 있으면, 후술하는 프리필터의 효과가 발휘되기 쉽다.

프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액은 바이러스를 포함할 수 있다. 바이러스는, 예컨대 10 nm 이상 30 nm 이하, 혹은 18 nm 이상 24 nm 이하의 직경을 갖는다. 바이러스는, 예컨대 파보바이러스이다. 파보바이러스는 약 20 nm의 직경을 갖는다. 또한, 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액은 세균을 포함할 수 있다. 세균은, 예컨대, 렙토스피라속, 바실러스속, 파에니바실러스속, 스테노트로포모나스속, 오크로박테리움속 및 슈도모나스속을 포함한다.

프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액의 용매는, 예컨대 물이나 완충액이다. 여기서, 완충액이란 염류를 포함하는 수용액이며, 구체적으로는, 인산 완충액, 트리스 완충액 및 아세트산 완충액 등을 들 수 있지만, 통상 이용되는 완충액이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액은, 첨가제로서, 예컨대 당류 및 염기성 아미노산 등을 포함하고 있어도 좋다. 당류 및 염기성 아미노산 등을 첨가하는 것에 의해, 다량체의 형성을 저해하고, 바이러스 제거막의 여과 효율을 향상시킬 수 있다. 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액의 수소 이온 지수(pH)는, 예컨대, 4.0 이상 8.0 이하, 4.0 이상 7.5 이하, 혹은 4.0 이상 7.0 이하이다. 또한, 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액의 이온 강도는, 0 mmol/L 이상 300 mmol/L 이하, 10 mmol/L 이상 280 mmol/L 이하, 혹은 20 mmol/L 이상 250 mmol/L 이하이다.

프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액은, 예컨대, 한외 여과(UF) 및 투석 여과(DF) 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 행해진 용액이다. 단백질 함유액은, 예컨대 탄젠셜 플로우(크로스플로우) 재순환 여과 장치를 이용하여, 한외 여과 및 투석 여과 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 행해진다. 투석 여과에서의 다이아 용량(diavolume)은, 예컨대 4이다. 또, 다이아 용량은, 투석 여과를 시작했을 때의 유지액의 용량에 대한, 회수된 여과액의 용량의 비이다. 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액은, 기계적으로 교반된 용액이어도 좋고, 교반되면서 한외 여과 및 투석 여과 중 어느 한쪽 또는 양쪽이 행해진 용액이어도 좋다. 교반 시간은, 예컨대, 2시간 이상, 4시간 이상 혹은 6시간 이상이다.

단백질 함유액을, 한외 여과 및 투석 여과 중 적어도 하나로 여과하면, 직경이 100 nm 미만인 단백질의 다량체, 및 직경이 100 nm 이상인 입자상물이 형성되기 쉬운 경향이 있다. 또한, 직경이 100 nm 미만인 단백질의 다량체, 및 직경이 100 nm 이상인 입자상물은, 기계적인 교반에 의해서도 형성되는 경우가 있다. 혈장 분획 제제나 바이오 의약품 등의 정제 공정에서는, 바이러스에 대한 안전성을 높이기 위해 바이러스 제거막에 의한 여과 공정 이외에 바이러스 불활화 공정을 넣는 경우가 있다. 이 경우 이용되는 수법으로는, 예컨대, 가열 처리, 저 pH 처리 및 솔벤트/디터전트(Solvent/Detergent) 처리(이하 S/D 처리로 기재하는 경우도 있음) 등이 있다. 이러한 불활화 방법은, 생물을 화학적 또는 물리학적으로 불안정한 상태로 함으로써, 바이러스 입자를 형성하는 생체 물질을 파괴하지만, 동시에 목적물인 단백질의 변성 또는 응집도 야기하여, 직경 100 nm를 초과하는 입자상물을 포함하는 대량의 다량체가 생길 우려가 있다. 이 입자상물을 포함하는 다량체는, S/D 처리 후, 크로마토그래피 공정 등의 복수의 정제 공정이 계속되는 경우에는, 바이러스 제거 공정까지 제거되어 있을 가능성이 높지만, 바이러스 제거 공정에 가까운 공정에서 행해지는 경우에는, 입자상물을 포함하는 단백질 용액이 바이러스 제거막에 부하될 가능성이 있다. 바이러스 제거 공정에 가깝다는 것은, 바이러스 제거 공정의 상류 1 공정 또는 2 공정 이내에 S/D 처리 공정이 행해지는 것을 말한다. 변성한 단백질은 주위에 있는 미변성 단백질을 변성ㆍ응집시켜 버리는 것이 알려져 있다. 단백질 용액이 고농도일수록, 변성 단백질과 미변성 단백질의 접촉 확률이 높아지기 때문에, 응집이 일어나기 쉬워진다. 단백질 용액의 농도가 30 mg/mL를 초과하면, 합성 고분자제의 바이러스 제거막은 구멍이 막혀서 여과 유속의 저하가 현저해지고, 그 위에 극히 미량이라도 다량체가 존재하면, 더 이상 여과할 수 없을 정도의 유속 저하가 생길 수 있다. 예컨대, IgG의 다량체는, 병원체인 항원과 결합하지 않은 상태로 보체와 결합하여, 보체를 이상 활성화하기 때문에, 심각한 부작용을 일으키는 경우가 있다. 또한, 바이러스 제거막은, 단백질을 실질적으로 저지하지 않고 투과시키는 한편, 바이러스를 부분적으로 저지하는 구멍 직경 분포를 갖는 층을 다층 중첩하는 것에 의해, 사이즈가 비슷한 바이러스와 단백질을 분리한다고 알려져 있다(요코기 마사노부, 「셀룰로오스 중공사막에 의한 바이러스 분리」, 섬유와 공업, 55권(1999) 10호 p. P338-P342). 그러나, 만약 바이러스와 사이즈가 동등 이상인 입자, 예를 들면 단백질의 다량체가 존재하면, 바이러스가 포착되어야 하는 구멍 직경에 다량체가 포착되어 버려, 바이러스가 여과액에 누설될 확률이 높아질 가능성이 있다.

단백질 함유액을 여과하는 프리필터는, 예컨대 시트형의 필터이다. 프리필터의 구멍 직경은, 0.08 ㎛ 이상 혹은 0.10 ㎛ 이상이며, 0.25 ㎛ 이하 혹은 0.20 ㎛ 이하이다. 프리필터는, 예컨대, 폴리아미드, 폴리술폰계 및 불소계 수지 등의 소수성 수지를 포함한다. 이론에 속박되는 것이 아니지만, 이들 소수성 수지는, 단백질의 다량체와 소수 상호 작용하여 다량체를 흡착한다고 추측된다. 단백질을 흡착시키는 관점에서, 폴리아미드(PA), 폴리에테르술폰 또는 폴리불화비닐리덴이 바람직하고, 폴리불화비닐리덴이 보다 바람직하다. 프리필터의 구멍 직경이 0.08 ㎛ 이상인 것에 의해, 단백질 함유액 중의 단백질 단량체를 높은 투과율로 여과할 수 있어, 단백질의 회수율이 향상된다. 또한, 다량체보다 프리필터의 구멍 직경이 크기 때문에, 프리필터가 다량체에 의해 조기에 구멍이 막히는 것을 방지할 수 있다. 또한, 프리필터가 소수성 상호 작용을 갖는 것에 의해, 프리필터의 구멍 직경이 다량체보다 크더라도, 단백질 함유액 중의 단백질의 삼량체 이상의 다량체가 제거되고, 그 후의 바이러스 제거막에 의한 여과 효율 및 바이러스 제거성이 향상된다. 입자상물이 용액 중에 포함되면, 그 주위에 있는 다량체는, 입자상물에 접촉하여 입자상물과 함께 프리필터로 제거되는 경우가 있고, 바이러스 제거막의 여과 유속 및 바이러스 제거 성능이 향상되는 경우가 있다. 또한, 프리필터의 구멍 직경이 0.25 ㎛ 이하인 것에 의해, 비표면적이 커지고, 다량체와의 접촉 면적이 증가하여, 다량체의 흡착 면적을 충분히 확보할 수 있다. 단백질 함유액에 포함되는 다량체가 많은 경우는, 이들 프리필터를 2종류 이상 조합해도 좋고, 1종류를 복수개 연결해도 좋다. 그 경우, 미리 함유되는 다량체의 양을 알고 있고, 또한 이용하는 프리필터의 다량체 제거 용량을 알고 있으면, 프리필터의 필요한 합계 면적을 구하는 것이 가능하다.

프리필터는, 단층막이어도 좋고, 2층 및 3층을 포함하는 다층막이어도 좋다. 프리필터가 다층막인 경우, 각 막의 구멍 직경은, 동일해도 좋고 상이해도 좋다. 예컨대, 3층의 모든 막의 구멍 직경이 0.1 ㎛여도 좋다.

프리필터는, 사용되기 전에, 증기에 의해 멸균되어도 좋다. 단백질 함유액을 프리필터로 여과할 때의 압력은, 예컨대 25 kPa(0.25 bar) 이하이다. 또한, 프리필터의 멸균은 정치 멸균으로 행해도 좋다. 정치 멸균하면, 한외 여과 혹은 투석 여과의 정제 공정 후의 박테리아 등의 컨테미네이션을 방지하여, 제제의 안전성을 담보하는 것이 가능하다. 정치 멸균이란, 장치를 분해하지 않고 장치 내부를 살균하는 것을 말한다.

프리필터로 여과함으로써, 단백질 함유액에 포함되어 있던 입자상물 및 단백질의 삼량체 이상의 다량체의 일부가, 사이즈 배제와 소수성 상호 작용의 양방에 의해 제거된다. 본 개시에서의 사이즈 배제란, 필터의 구멍 직경보다 큰 입자 직경의 입자상물이 필터에 포착되어, 단백질 함유액으로부터 제거되는 것을 말한다. 삼량체 이상의 다량체이며 직경 100 nm 미만의 다량체는, 소수성 수지를 포함하는 프리필터에 의해 단백질 함유액으로부터 제거된다. 단백질 함유액에 포함되어 있는 직경이 50 nm 이하인 바이러스는, 대개 프리필터를 투과한다. 프리필터로 여과된 단백질 함유액의 점도는, 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액의 점도보다 낮아지는 경우가 있다.

프리필터에 의한 단백질 함유액의 여과는, 한외 여과(UF), 투석 여과(DF) 혹은 탄젠셜 플로우(크로스플로우) 여과 후에 행해져도 좋다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 적어도 프리필터로 여과된 단백질 함유액을 여과하는 바이러스 제거막(10)은, 단백질을 함유하는 용액이 공급되는 일차측의 표면(1)과, 상기 바이러스 제거막(10)을 투과한 투과액이 배출되는 이차측의 표면(2)을 갖는다.

바이러스 제거막(10)은, 그 단면에서, 바이러스가 포착되는 바이러스 포착 부위를 갖는다. 용액이 진입하는 여과면(일차측의 표면(1)) 상의 장소에 상관없이, 단면에서, 바이러스 포착 부위에서의 바이러스 포착량이 균일한 것이 바람직하다. 이것은, 바이러스 제거막의 바이러스 포착량이, 여과면 상의 장소에 따라 불균일한 경우, 여과면 상의 어떤 개소에 용액이 집중되게 되어, 부분적으로 그 개소에 대한 바이러스의 부하량이 증가하게 되므로, 고압 조건 하에서 대용량의 여과를 행하면, 그 개소로부터 바이러스가 샐 가능성이 있기 때문이다. 또한, 바이러스 제거막(10)이 중공사막의 형상을 갖는 경우는, 둘레 방향에 있어서, 바이러스 포착 부위에서의 바이러스 포착량이, 도 2에 나타낸 바와 같이 불균일한 것이 아니라, 도 3에 나타낸 바와 같이 균일한 것이 바람직하다.

또한, 바이러스 제거막(10)은, 바이러스를 포착 부위의 두께가, 바이러스 포착 부위 내에서 균일한 것이 바람직하다. 또한, 바이러스 제거막(10)이 중공사막의 형상을 갖는 경우는, 둘레 방향에 있어서, 바이러스 포착 부위의 두께가 균일한 것이 바람직하다. 바이러스 포착 부위의 두께가 균일하면, 둘레 방향으로 균일하게 용액이 퍼져, 바이러스가 샐 가능성이 저하된다.

여기서, 바이러스 제거막(10)에 포착된 바이러스를 시각적으로 검출하는 것은 어려운 경우가 있다. 이에 비해, 금콜로이드는, 바이러스와 동일한 정도의 직경을 가지면서 광을 투과시키지 않기 때문에, 시각적으로 검출하는 것이 용이하다. 그 때문에, 예컨대, 금콜로이드를 함유하는 용액을 바이러스 제거막(10)으로 여과한 후, 바이러스 제거막(10)의 단면에서의, 바이러스 제거막(10)이 금콜로이드를 포착한 금콜로이드 포착 부위의 상대적인 휘도를 측정하는 것에 의해, 바이러스 제거막(10)의 특성을 평가하는 것이 가능하다.

바이러스 제거막(10)에 관해, 일차측의 표면(1)으로부터 바이러스 제거막(10)에 직경 20 nm의 금콜로이드를 함유하는 용액을 공급하여 바이러스 제거막(10)으로 금콜로이드를 포착하고, 바이러스 제거막(10)의 단면에서 휘도를 측정할 때, 휘도 변위의 스펙트럼의 면적치의 표준편차를 휘도 변위의 스펙트럼의 면적치의 평균치로 나눈 값은, 0.01 이상 1.50 이하이다. 이 값은, 바이러스 제거막(10)에서의 금콜로이드의 포착량의 변동 계수를 나타내고 있고, 작을수록 바이러스 제거막(10)의 금콜로이드 포착 부위에서의 금콜로이드의 포착량의 균일성이 높은 것을 나타내고 있다.

바이러스 제거막(10)에 관해, 상기 변동 계수를 나타내는 값은, 0.01 이상 1.50 이하, 0.01 이상 1.20 이하, 혹은 0.01 이상 1.00 이하, 0.01 이상 0.90 이하, 혹은 0.01 이상 0.80 이하이다. 변동 계수에 관해, 0.01 미만은 측정 한계이다. 또한, 변동 계수가 1.50보다 크면, 막의 둘레 방향의 적어도 어느 1개소에 용액이 집중될 수 있기 때문에, 바이러스가 샐 가능성이 있다.

상기 변동 계수가 0.01 이상 1.50 이하이면, 막의 바이러스 포착 부위(중공사막에 관해서는 둘레 방향)에서 바이러스가 균일하게 포착되게 되고, 바이러스 제거막에 부하하는 바이러스의 총량(바이러스의 단백질 제제에 대한 스파이크량 또는 총 여과량)이 증가한 경우에도 높은 바이러스 제거 성능을 유지할 수 있다.

상기 변동 계수는, 예컨대 이하의 방법에 의해 측정된다. 금콜로이드 용액을 여과한 후의 바이러스 제거막으로부터 절편을 잘라내고, 절편의 단면에서 금콜로이드에 의해 염색된 부분의 복수 개소의 휘도 프로파일을 광학 현미경으로 측정한다. 금콜로이드는 광을 흡수하기 때문에, 휘도의 변위는 금콜로이드의 포착량에 의존한다. 또, 필요에 따라서, 휘도 프로파일로부터 백그라운드 노이즈를 제거해도 좋다. 그 후, 횡축에 막 두께, 종축에 휘도의 변위를 갖는 그래프를 작성하여, 그래프에 나타난 휘도 변위의 스펙트럼의 면적을 산출한다. 또한, 복수 개소에서의 휘도 변위의 스펙트럼의 면적의 표준편차를, 복수 개소에서의 휘도 변위의 스펙트럼의 면적의 평균으로 나눈 값을, 바이러스 제거막(10)에서의 금콜로이드 포착 부위의 금콜로이드의 포착량의 변동 계수를 나타내는 값으로서 산출한다.

습윤 상태의 바이러스 제거막(10)의 단면에서, 직경 20 nm 이상 30 nm 이하의 금콜로이드를 포착하는 부위(치밀층)의 두께는, 10 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하, 10 ㎛ 이상 29 ㎛ 이하, 10 ㎛ 이상 28 ㎛ 이하, 10 ㎛ 이상 20 ㎛ 이하, 11 ㎛ 이상 20 ㎛ 이하, 12 ㎛ 이상 20 ㎛ 이하이다. 직경 20 nm 이상 30 nm 이하의 금콜로이드 포착 부위의 두께가 30 ㎛보다 두꺼운 것은, 직경 20 nm 이상 30 nm 이하의 금콜로이드가 통과할 수 있는 구멍 직경이 큰 구멍이 많이 존재하는 것을 나타내며, 구멍 직경 분포가 넓어진 것을 나타낸다. 그 때문에, 여과압(유속)이 낮은 경우나, 압개방을 포함하는 Stop and start, Post-wash할 때 바이러스가 샐 가능성이 높아진다. 한편, 직경 20 nm 이상 30 nm 이하의 금콜로이드 포착 부위의 두께가 10 ㎛보다 얇은 것은, 직경 20 nm 이상 30 nm 이하의 금콜로이드가 통과할 수 있는 구멍이 적고, 구멍 직경 분포가 좁아진 것을 나타내고 있다. 그 때문에, 단백질 등에 의해 구멍이 막히는 것이 좁은 범위에서 발생함으로써, 여과 중의 여과 속도의 저하가 커져, 최종적인 처리량이 감소하는 경우가 있기 때문에 바람직하지 않다.

직경 20 nm 이상 직경 30 nm 이하의 금콜로이드 포착 부위의 두께는, 예컨대 이하의 방법에 의해 취득된다. 직경 20 nm 및 30 nm의 금콜로이드 용액을 각각 여과한 바이러스 제거막으로부터 절편을 잘라낸다. 절편의 단면에서 금콜로이드에 의해 염색된 부분 복수 개소의 휘도 프로파일을 광학 현미경으로 측정한다. 여기서, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막(10)의 일차측의 표면(1)으로부터, 금콜로이드 포착 부위의 가장 일차측의 표면에 가까운 부분까지의 제1 거리 a를 측정한다. 또한, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막(10)의 일차측의 표면(1)으로부터, 금콜로이드 포착 부위의 가장 이차측의 표면(2)에 가까운 부분까지의 제2 거리 b를 측정한다.

다음으로, 복수 개소의 각각에서, 제1 거리 a를 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께 c로 나누어 백분율로 나타낸 값 A(=a/c의 백분율 표시)를 산출하고, 복수 개소에서의 값 A의 평균치를 제1 도달도로서 산출한다. 또한, 복수 개소의 각각에서, 제2 거리 b를 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께 c로 나누어 백분율로 나타낸 값 B(=b/c의 백분율 표시)를 산출하고, 복수 개소에서의 값 B의 평균치를 제2 도달도로서 산출한다.

또한, 하기 (2)식에 나타낸 바와 같이, 직경 20 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막에서의 제2 도달도의 평균치 B₂₀과, 직경 30 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막에서의 제1 도달도의 평균치 A₃₀의 차에, 직경 20 nm의 금콜로이드를 여과한 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께의 평균치 C₂₀과 직경 30 nm의 금콜로이드를 여과한 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께의 평균치 C₃₀의 평균치 C_AVE를 곱한 값을, 직경 20 nm의 금콜로이드 및 직경 30 nm의 금콜로이드를 유통시켰을 때에, 바이러스 제거막(10)의 단면에서, 직경 20 nm 이상 30 nm 이하의 금콜로이드가 포착되는 부위의 두께 T로서 산출한다. 금콜로이드 포착 부위의 두께 T는, 바이러스 제거막의 치밀층의 두께 T로도 표현된다.

T=(B₂₀-A₃₀)×C_AVE (2)

또, 상기 방법에서는, 직경 20 nm 이상 직경 30 nm 이하의 금콜로이드 포착 부위를, 직경 30 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막에서의 제1 도달 위치와, 직경 20 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막에서의 제2 도달 위치 사이의 영역의 두께로서 구하고 있지만, 오차 범위를 제외하고, 직경 20 nm 이상 직경 30 nm 이하의 금콜로이드라면, 상기 범위에 포착되는 것을 확인하였다.

습윤 상태의 바이러스 제거막(10)의 단면에서, 직경 15 nm의 금콜로이드를 포착하는 부위의 두께(최치밀층)는, 2 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 3 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하이다. 금콜로이드 포착 부위의 두께가 10 ㎛보다 두꺼우면, 금콜로이드 함유 용액뿐만 아니라, 바이러스 함유 용액의 여과 효율이 저하되는 경향이 있다. 또한 2 ㎛보다 얇으면 바이러스 제거막에 부하하는 바이러스의 총량(바이러스의 단백질 제제에 대한 스파이크량 또는 총 여과량)이 증가한 경우나 운전에 따르는 여과 압력의 변동에 의해 바이러스가 샐 가능성이 있기 때문에 바람직하지 않다.

직경 15 nm의 금콜로이드 포착 부위의 두께는, 예컨대 이하의 방법에 의해 취득된다. 직경 15 nm의 금콜로이드 용액을 여과한 바이러스 제거막으로부터 절편을 잘라낸다. 절편의 단면에서 금콜로이드에 의해 염색된 부분 복수 개소의 휘도 프로파일을 광학 현미경으로 측정한다. 여기서, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막(10)의 일차측의 표면(1)으로부터, 금콜로이드 포착 부위의 가장 일차측의 표면에 가까운 부분까지의 제1 거리 d를 측정한다. 또한, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막(10)의 일차측의 표면(1)으로부터, 금콜로이드 포착 부위의 가장 이차측의 표면(2)에 가까운 부분까지의 제2 거리 e를 측정한다.

다음으로, 복수 개소의 각각에서, 제1 거리 d를 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께 f로 나누어 백분율로 나타낸 값 D(=d/f의 백분율 표시)를 산출하고, 복수 개소에서의 값 D의 평균치를 제1 도달도로서 산출한다. 또한, 복수 개소의 각각에서, 제2 거리 e를 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께 f로 나누어 백분율로 나타낸 값 E(=e/f의 백분율 표시)를 산출하고, 복수 개소에서의 값 E의 평균치를 제2 도달도로서 산출한다.

또한, 하기 (3)식에 나타낸 바와 같이, 제2 도달도의 평균치 E와 제1 도달도의 평균치 D의 차에, 여과한 바이러스 제거막의 습윤 상태의 막 두께의 평균치 F를 곱한 값을, 직경 15 nm의 금콜로이드를 유통시켰을 때에, 바이러스 제거막(10)의 단면에서, 직경 15 nm의 금콜로이드가 포착되는 부위의 두께 T로서 산출한다. 직경 15 nm의 금콜로이드 포착 부위의 두께 T는, 바이러스 제거막의 최치밀층의 두께 T로도 표현된다.

T=(E-D)×F (3)

직경 30 nm의 금콜로이드를 함유하는 용액을 바이러스 제거막(10)으로 여과한 경우, 습윤 상태의 바이러스 제거막(10)의 단면에서 직경 30 nm의 금콜로이드가 포착되는 부위는, 광학 현미경으로 측정하면, 예컨대, 일차측의 표면(1)으로부터 막 두께의 15% 이상 60% 이하, 혹은 20% 이상 55% 이하의 지점에 있다. 막 두께의 15%보다 작으면 바이러스나 불순물이 막의 일차측 표면에 가까운 위치에서 포착되어 버려, 구멍이 막힐 가능성이 높아지고, 60%보다 크면, 목적으로 하는 바이러스가 막의 이차측 표면에 가까운 위치에서 포착되어 버려, 바이러스를 포착할 수 없을 가능성이 있다. 또, 일차측의 표면(1)으로부터, 막 두께의 15%보다 작거나 60%보다 큰 영역에, 직경 30 nm의 금콜로이드의 소량이 포착되는 경우라 하더라도, 광학 현미경에 의한 관찰에서 상수(255)로부터 측정한 휘도 프로파일을 뺀 휘도의 변위에 관해, 그 스펙트럼의 절대치가, 스펙트럼 절대치의 최대치의 10% 이하인 경우는, 상기 바이러스 제거막의 바이러스 제거능의 관점에서 상기 영역에서의 금콜로이드의 포착은 오차 범위 내로 간주할 수 있기 때문에, 직경 30 nm의 금콜로이드가 포착되는 부위는, 일차측의 표면(1)으로부터 막 두께의 15% 이상 60% 이하의 지점에 있는 것으로 간주할 수 있다.

직경 20 nm의 금콜로이드를 함유하는 용액을 바이러스 제거막(10)으로 여과한 경우, 습윤 상태의 바이러스 제거막(10)의 단면에서 직경 20 nm의 금콜로이드가 포착되는 부위는, 광학 현미경으로 측정하면, 예컨대, 일차측의 표면(1)으로부터 막 두께의 25% 이상 85% 이하, 혹은 30% 이상 85% 이하의 지점에 있다. 막 두께의 25%보다 작으면 바이러스나 불순물이 막의 일차측 표면에 가까운 위치에서 포착되어 버려, 구멍이 막힐 가능성이 높아지고, 85%보다 크면 목적으로 하는 바이러스가 막의 이차측 표면에 가까운 위치에서 포착되어 버려, 바이러스를 포착할 수 없을 가능성이 있다. 또, 직경 30 nm의 금콜로이드의 경우와 마찬가지로, 일차측의 표면(1)으로부터 막 두께의 25%보다 작거나 85%보다 큰 영역에서 금콜로이드가 관찰되었다 하더라도, 광학 현미경에 의한 관찰에서 상수(255)로부터 측정한 휘도 프로파일을 뺀 휘도의 변위에 관해, 그 스펙트럼의 절대치가, 스펙트럼 절대치의 최대치의 10% 이하인 경우는, 오차 범위 내로 간주할 수 있다.

직경 15 nm의 금콜로이드를 함유하는 용액을 바이러스 제거막(10)으로 여과한 경우, 습윤 상태의 바이러스 제거막(10)의 단면에서 직경 15 nm의 금콜로이드가 포착되는 부위는, 광학 현미경으로 측정하면, 예컨대, 일차측의 표면(1)으로부터 막 두께의 60% 이상 100% 이하, 혹은 65% 이상 100% 이하의 지점에 있다. 막 두께의 60%보다 작으면 바이러스나 불순물이 막의 일차측 표면에 가까운 위치에서 포착되어 버려, 구멍이 막힐 가능성이 높아진다. 또, 직경 30 nm, 20 nm의 금콜로이드의 경우와 마찬가지로, 일차측의 표면(1)으로부터 막 두께의 60%보다 작은 영역에서 금콜로이드가 관찰되었다 하더라도, 광학 현미경에 의한 관찰에서 상수(255)로부터 측정한 휘도 프로파일을 뺀 휘도의 변위에 관해, 스펙트럼 절대치의 최대치의 10% 이하인 경우는 오차 범위 내로 간주할 수 있다.

또한, 직경 30 nm, 20 nm 및 15 nm의 금콜로이드의 포착 위치의 측정에 관해서는, 어디까지나 막에 포착된 금콜로이드에 관해 측정을 행하고 있다. 따라서, 막에 포착되지 않고, 막을 투과한 금콜로이드에 관해서는 측정하지 않는다. 즉, 막에 투과시킨 금콜로이드의 전부에 관해 포착 위치를 측정한 것이 아니라, 막에 포착된 금콜로이드에 관해, 그 막 위의 포착 위치를 측정한 것이다.

직경 10 nm의 금콜로이드를 함유하는 용액을 바이러스 제거막(10)으로 여과하는 경우, 바이러스 제거막(10)의 단면에는 직경 10 nm의 금콜로이드는 거의 포착되지 않는다. 이것은, 광학 현미경(Biozero, BZ8100, 키엔스사 제조)을 이용한 관찰에서, 휘도의 스펙트럼을 유의미한 값으로서 검출할 수 없다는 점에서 확인할 수 있다. 또한, 후술하는 대수 제거율(LRV)이 낮아지는 점에서도 확인할 수 있다. 또, 직경 10 nm의 금콜로이드가 포착되지 않는 것은, IgG 등의 직경 10 nm 정도의 유용한 단백의 높은 투과성을 달성할 수 있는 것을 나타내고 있다.

바이러스 제거막의 재질인 합성 고분자로는, 예컨대 압축, 압출, 사출, 인플레이션 및 블로우 성형 등의 가공이 용이한 것, 및 여과 시의 내압성이 우수하다는 점에서 열가소성 결정성 수지가 바람직하다. 특히 내열성과 성형 가공성의 밸런스가 좋기 때문에, 폴리올레핀 수지나 불소계 수지는 바람직하고, 특히 폴리불화비닐리덴 수지는 바람직하다.

또, 이들 소수성의 열가소성 결정 수지는 단백질 등의 흡착, 막의 오염이나 막힘 등이 생기기 쉬워, 여과 속도의 급격한 저하를 야기한다. 그 때문에, 소수성 수지를 바이러스 제거막의 재질로서 이용하는 경우, 단백 등의 흡착에 의한 폐색을 방지하기 위해, 막에는 친수성이 부여된다. 친수성을 부여하기 위해서는, 그래프트 중합법에 의해, 막이 친수성의 그래프트쇄를 구비하는 것이 바람직하다.

바이러스 제거막(10)은, 예컨대 중공사막의 형상을 갖고 있다. 혹은, 바이러스 제거막(10)은, 도 4에 나타낸 바와 같이, 평막의 형상을 갖고 있어도 좋다. 막 면적이 크더라도, 막을 용기에 장전하여 소형의 필터를 작성할 수 있기 때문에 중공사막이 바람직하다.

도 1에 나타내는 바이러스 제거막(10)의 막 두께는, 예컨대, 건조 상태에서 40.0 ㎛ 이상 60.0 ㎛ 이하이며, 보다 바람직하게는 42.0 ㎛ 이상 55.0 ㎛ 이하이다. 막 두께가 40.0 ㎛보다 얇으면 막의 강도가 저하되어, 여과압에 견딜 수 없게 될 가능성이 있고, 또한 60.0 ㎛보다 두꺼우면 여과 속도가 저하될 가능성이 있다.

바이러스 제거막(10)의 단면에서, 일차측으로부터 이차측으로 갈수록, 공공(空孔)의 구멍 직경은 감소한 후 일정해지며, 바람직하게는, 바이러스 제거막(10)은, 이차측의 최외층 부근에 가장 치밀한 층을 갖는다. 최외층 부근에 가장 치밀한 층을 가짐으로써, 여과압(유속)이 낮은 경우나, Stop&start, Post-wash 방식으로 여과를 하는 경우에, 바이러스가 샐 가능성을 보다 저감할 수 있다.

바이러스 제거막(10)에 의한 바이러스의 대수 제거율(LRV: Logarithmic Reduction Value)은, 예컨대 4.00 이상이면, 막 여과에 의해 바이러스가 충분히 제거되기 때문에 바람직하고, 4.50 이상, 5.00 이상 혹은 6.00 이상이면 보다 바람직하다. 바이러스의 대수 제거율이 6.00 이상이면, 바이러스가 제거되어, 거의 바이러스가 새지 않는다고 생각된다.

바이러스 제거막(10)에 의한 직경 30 nm의 금콜로이드의 대수 제거율(LRV)은, 예컨대 1.00 이상, 바람직하게는 1.20 이상이다. 바이러스 제거막(10)에 의한 직경 20 nm의 금콜로이드의 대수 제거율은, 예컨대 1.00 이상, 바람직하게는 1.20 이상이다. 바이러스 제거막(10)에 의한 직경 15 nm의 금콜로이드의 대수 제거율은, 예컨대 0.10 이상, 바람직하게는 0.20 이상이다. 바이러스 제거막(10)에 의한 직경 10 nm의 금콜로이드의 대수 제거율은, 예컨대 0.10 미만이다.

바이러스 제거막(10)에서 측정되는 버블 포인트는, 예컨대, 1.30 MPa 이상 1.80 MPa 이하이며, 보다 바람직하게는 1.40 MPa 이상 1.80 MPa 이하, 1.45 MPa 이상 1.80 MPa 이하, 1.50 MPa 이상 1.80 MPa 이하이다. 또한, 바이러스 제거막의 특성은, 버블 포인트(MPa)와 측정에 이용한 용매의 표면장력(N/m)의 비로서도 나타낼 수 있다. 막을 침지하는 시험액으로서 표면장력이 13.6 mN/m인 하이드로플루오로에테르를 이용한 경우, 버블 포인트와 표면장력의 비는 96 이상 133 이하이다. 보다 바람직하게는 103 이상 133 이하, 106 이상 133 이하, 110 이상 133 이하이다.

버블 포인트가 1.30 MPa 이하인 것은, 구멍 직경이 큰 구멍이 존재하는 것을 나타내며, 특히 바이러스 제거막을 사용할 때에, (1) 압력의 레벨을 낮추는 공정, (2) 여과를 일단 중단하고 재가압하는 공정(Stop&start), 또는 (3) 제제의 여과 후에 여과를 일단 중단하고, Buffer로 세정하는 공정(Post-wash)을 포함하는 조건 하에서는, 바이러스 제거성의 저하가 보이는 경우가 있기 때문에 바람직하지 않다. 또한 버블 포인트가 1.80 MPa 이상인 것은, 구멍 직경이 작은 구멍이 존재하는 것을 나타내며, 순수 투과 속도가 저하되기 때문에 바람직하지 않다.

바이러스 제거막(10)에서 측정되는 순수 투과 속도는, 30 L/㎡/hrs/0.1 MPa 이상 80 L/㎡/hrs/0.1 MPa 이하, 30 L/㎡/hrs/0.1 MPa 이상 60 L/㎡/hrs/0.1 MPa 이하, 혹은 30 L/㎡/hrs/0.1 MPa 이상 55 L/㎡/hrs/0.1 MPa 이하이다.

바이러스 제거막은, 사용되기 전에 증기에 의해 멸균되어도 좋다. 프리필터로 전여과된 단백질 함유액을 바이러스 제거막으로 여과함으로써, 단백질 함유액에 포함되어 있던 바이러스가 제거된다. 또한, 단백질 함유액에 잔존했던 입자상물 및 단백질의 다량체도 제거된다.

상기 여과 방법에서, 프리필터로 여과하는 전여과 공정과, 바이러스 제거 공정 사이에 다른 공정을 포함하지 않도록 해도 좋다. 즉, 각각의 공정을 배치 처리로 행해도 좋다. 또한, 전여과 공정과 바이러스 제거 공정을 연속 프로세스로 행해도 좋다. 전여과 공정과 바이러스 제거 공정을 연속 프로세스로 행하는 경우, 시간 경과에 따르는 단백질의 다량체의 발생이 억제되어, 바이러스 제거막에 의한 여과 효율이 보다 향상하는 경향이 있다.

이상 설명한 특성을 갖는 바이러스 제거막은, 예컨대, 이하에 설명하는 방법에 의해 제조된다.

바이러스 제거막의 재질에 사용되는 열가소성 수지는, 예컨대, 통상의 압축, 압출, 사출, 인플레이션 및 블로우 성형에 사용되는 결정성을 갖는 열가소성 수지이다. 예컨대, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리 4-메틸 1-펜텐 수지 등의 폴리올레핀 수지, 폴리에틸렌테레프탈레이트 수지, 폴리부틸렌테레프탈레이트 수지, 폴리에틸렌나프탈레이트 수지, 폴리부틸렌나프탈레이트 수지, 폴리시클로헥실렌디메틸렌테레프탈레이트 수지 등의 폴리에스테르 수지, 나일론 6, 나일론 66, 나일론 610, 나일론 612, 나일론 11, 나일론 12, 나일론 46 등의 폴리아미드 수지, 폴리불화비닐리덴 수지, 에틸렌/테트라플루오로에틸렌 수지, 폴리클로로트리플루오로에틸렌 수지 등의 불소계 수지, 폴리페닐렌에테르 수지 및 폴리아세탈 수지 등을 사용할 수 있다.

상기 열가소성 수지 중에서, 폴리올레핀 수지나 불소계 수지는, 내열성과 성형 가공성의 밸런스가 좋기 때문에 바람직하고, 그 중에서도 폴리불화비닐리덴 수지는 특히 바람직하다. 여기서, 폴리불화비닐리덴 수지란, 기본 골격에 불화비닐리덴 단위를 포함하는 불소계 수지를 가리키는 것이며, 일반적으로는 PVDF의 약칭으로 불리는 수지이다. 이러한 폴리불화비닐리덴 수지로는, 불화비닐리덴(VDF)의 호모 중합체나, 헥사플루오로프로필렌(HFP), 펜타플루오로프로필렌(PFP), 테트라플루오로에틸렌(TFE), 클로로트리플루오로에틸렌(CTFE) 및 퍼플루오로메틸비닐에테르(PFMVE)의 모노머군에서 선택한 1종 또는 2종의 모노머와 불화비닐리덴(VDF)의 공중합체를 사용할 수 있다. 또한, 상기 호모 중합체 및 상기 공중합체를 혼합하여 사용할 수도 있다. 실시형태에서는, 호모 중합체를 30 wt% 이상 100 wt% 이하 포함하는 폴리불화비닐리덴 수지를 사용하면, 미다공막의 결정성이 향상되고 고강도가 되므로 바람직하고, 호모 중합체만을 사용하면 더욱 바람직하다.

실시형태에서 사용하는 열가소성 수지의 평균 분자량은, 5만 이상 500만 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10만 이상 200만 이하, 더욱 바람직하게는 15만 이상 100만 이하이다. 상기 평균 분자량은 겔퍼미에이션 크로마토그래피(GPC) 측정에 의해 얻어지는 중량 평균 분자량을 가리키는 것이지만, 일반적으로 평균 분자량이 100만을 초과하는 수지에 관해서는, 정확한 GPC 측정이 어렵기 때문에, 그 대용으로서 점도법에 의한 점도 평균 분자량을 채용할 수 있다. 중량 평균 분자량이 5만보다 작으면, 용융 성형 시의 멜트텐션이 작아져 성형성이 나빠지거나, 막의 역학 강도가 낮아지거나 하기 때문에 바람직하지 않다. 중량 평균 분자량이 500만을 초과하면, 균일한 용융 혼련이 어려워지기 때문에 바람직하지 않다.

실시형태에서 사용하는 열가소성 수지의 폴리머 농도는, 열가소성 수지 및 가소제를 포함하는 조성물 중 20 wt% 이상 90 wt% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 30 wt% 이상 80 wt% 이하, 그리고 가장 바람직하게는 35 wt% 이상 70 wt% 이하이다. 폴리머 농도가 20 wt% 미만이 되면, 제막성이 저하되고, 충분한 역학 강도가 얻어지지 않는 등의 문제가 발생한다. 또한, 바이러스 제거용의 막으로는, 얻어지는 미다공막의 구멍 직경이 커져 바이러스 제거 성능이 불충분해진다. 폴리머 농도가 90 wt%를 초과하면, 얻어지는 미다공막의 구멍 직경이 지나치게 작아짐과 더불어 공공률이 작아지기 때문에, 여과 속도가 저하되어 실용에 견딜 수 없다.

실시형태에서 사용하는 가소제로는, 미공막을 제조하는 조성으로 열가소성 수지와 혼합했을 때에 수지의 결정 융점 이상에서 균일 용액을 형성할 수 있는 불휘발성 용매를 이용한다. 여기서 말하는 불휘발성 용매란, 대기압 하에서 250.0℃ 이상의 비점을 갖는 것이다. 가소제의 형태는, 대개 상온 20.0℃에서 액체여도 좋고 고체여도 좋다. 또한, 열가소성 수지와의 균일 용액을 냉각시켰을 때, 상온 이상의 온도에서 열유기형 고액 상분리점를 갖는, 소위 고액 상분리계의 가소제를 이용하는 것이, 바이러스 제거에 이용되는 소구멍 직경의 균질한 치밀 구조층을 갖는 막을 제조하는 데에 있어서 바람직하다. 가소제 중에는, 열가소성 수지와의 균일 용액을 냉각시켰을 때에, 상온 이상의 온도에서 열유기형 액액 상분리점을 갖는 것도 있지만, 일반적으로, 액액 상분리계의 가소제를 이용한 경우는, 얻어진 미다공막은 대공경화하는 경향이 있다. 여기서 이용되는 가소제는 단품 또는 복수의 물질의 혼합물이어도 좋다.

열유기형 고액 상분리점를 측정하는 방법은, 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 소정 농도의 조성물을 미리 용융 혼련한 것을 시료로서 이용하고, 열분석(DSC)에 의해 상기 수지의 발열 피크 온도를 측정함으로써 구할 수 있다. 또한, 상기 수지의 결정화점을 측정하는 방법은, 미리 상기 수지를 용융 혼련한 것을 시료로서 이용하고, 마찬가지로 열분석에 의해 구할 수 있다.

바이러스 제거에 이용되는 소구멍 직경이며 균질한 치밀 구조층을 갖는 막을 제조할 때에 바람직하게 이용되는 가소제로는, 국제 공개 제01/28667호에 개시되어 있는 가소제를 들 수 있다. 즉, 하기 (4)식으로 정의하는 조성물의 상분리점 강하 상수가 0.0℃ 이상 40.0℃ 이하인 가소제이며, 바람직하게는 1.0℃ 이상 35.0℃ 이하의 가소제, 더욱 바람직하게는 5.0℃ 이상 30.0℃ 이하의 가소제이다. 상분리점 강하 상수가 40.0℃를 초과하면, 구멍 직경의 균질성이나 강도가 저하되어 버리기 때문에 바람직하지 않다.

α=100×(Tc₀-Tc)÷(100-C) (4)

식 중, α는 상분리 온도 강하 상수(℃), Tc₀은 열가소성 수지의 결정화 온도(℃), Tc는 조성물의 열유기 고액 상분리점(℃), C는 조성물 중의 열가소성 수지의 농도(wt%)를 나타낸다.

예컨대 열가소성 수지로서 폴리불화비닐리덴 수지를 선택한 경우에는, 프탈산디시클로헥실(DCHP), 프탈산디아밀(DAP), 인산트리페닐(TPP), 인산디페닐크레질(CDP) 및 인산트리크레질(TCP) 등이 특히 바람직하다.

실시형태에서, 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물을 균일 용해시키는 제1 방법은, 상기 수지를 압출기 등의 연속식 수지 혼련 장치에 투입하여, 수지를 가열 용융시키면서 임의의 비율로 가소제를 도입하여 스크류 혼련함으로써 균일 용액을 얻는 방법이다. 투입하는 수지의 형태는, 분말형, 과립형, 펠릿형 중 어느 것이어도 좋다. 또한, 이러한 방법에 의해 균일 용해시키는 경우는, 가소제의 형태는 상온 액체인 것이 바람직하다. 압출기로는, 단축 스크류식 압출기, 이축 이(異)방향 스크류식 압출기 및 이축 동(同)방향 스크류식 압출기 등을 사용할 수 있다.

열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물을 균일 용해시키는 제2 방법은, 헨셜 믹서 등의 교반 장치를 이용하여, 수지와 가소제를 미리 혼합하여 분산시키고, 얻어진 조성물을 압출기 등의 연속식 수지 혼련 장치에 투입하여 용융 혼련함으로써 균일 용액을 얻는 방법이다. 투입하는 조성물의 형태에 관해서는, 가소제가 상온 액체인 경우는 슬러리형으로 하고, 가소제가 상온 고체인 경우는 분말형이나 과립형 등으로 하면 된다.

열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물을 균일 용해시키는 제3 방법은, 브라벤더나 밀 등의 간이형 수지 혼련 장치를 이용하는 방법이나, 그 밖의 배치식 혼련 용기 내에서 용융 혼련하는 방법이다. 상기 방법에 의하면, 배치식의 공정이 되지만, 간이하고 또한 유연성이 높다고 하는 이점이 있다.

실시형태에서, 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물을 열가소성 수지의 결정 융점 이상의 온도로 가열 균일 용해시킨 후, T 다이나 서큘러 다이, 환상 방사구금의 토출구로부터 평막형, 중공사형의 형상으로 압출한 후에, 냉각 고화시켜 막을 성형한다((a)의 공정). 냉각 고화시켜 막을 성형하는 (a)의 공정에서, 치밀 구조층을 형성함과 더불어 막 표면에 인접하여 조대 구조층을 형성한다.

실시형태에서는, 균일하게 가열 용해한 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물을 토출구로부터 토출시키고, 에어갭 부분을 거쳐, 하기 (5)식에 정의하는 드래프트비가 1.0 이상 12.0 이하가 되는 인수 속도로 상기 막을 인수하면서, 열가소성 수지에 대하여 부분적인 용해성을 갖는 100.0℃ 이상의 불휘발성 액체를 막의 한쪽 표면에 접촉시키고, 다른쪽 막 표면을 냉각시킴으로써, 막에 조대 구조층과 치밀 구조층을 형성한다.

드래프트비=(막의 인수 속도)/(조성물의 토출구에서의 토출 속도) (5)

상기 드래프트비는 바람직하게는 1.5 이상 9.0 이하, 보다 바람직하게는 1.5 이상 7.0 이하이다. 드래프트비가 1.0 미만이면 막에 텐션이 가해지지 않기 때문에 성형성이 저하되고, 12.0을 초과하는 경우는, 막이 늘어지기 때문에 충분한 두께의 조대 구조층을 형성하는 것이 어려워지는 경향이 있다. 상기 (5)식의 조성물의 토출구에서의 토출 속도는, 하기 (6)식으로 부여된다.

조성물의 토출구에서의 토출 속도=(단위 시간당 토출되는 조성물의 체적)/(토출구의 면적) (6)

토출 속도의 바람직한 범위는 1 m/분 이상 60 m/분 이하이며, 보다 바람직하게는 3 m/분 이상 40 m/분 이하이다. 토출 속도가 1 m/분 미만인 경우는, 생산성이 저하될 뿐만 아니라, 토출량의 변동이 커지는 등의 문제가 발생하는 경향이 있다. 반대로, 토출 속도가 60 m/분을 초과하는 경우는, 토출량이 많기 때문에 토출구에서 난류가 발생하여, 토출 상태가 불안정해지는 경우가 있다.

인수 속도는 토출 속도에 맞춰 설정할 수 있지만, 바람직하게는 1 m/분 이상 200 m/분 이하이며, 보다 바람직하게는 3 m/분 이상 150 m/분 이하이다. 인수 속도가 1 m/분 미만인 경우는, 생산성 및 성형성이 저하되는 경향이 있다. 또한, 인수 속도가 200 m/분을 초과하는 경우는, 냉각 시간이 짧아지거나, 막에 가해지는 텐션이 커지는 것에 의해 막의 단열(斷裂)이 일어나기 쉬워지는 경향이 있다.

조대 구조층을 형성하는 바람직한 방법은, 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물을 압출구로부터 평막형 또는 중공사형의 막에 압출하여 형성된 미경화막의 한쪽 표면을, 열가소성 수지에 대하여 부분적인 용해성을 갖는 불휘발성 액체에 접촉시키는 방법이다. 이 경우, 접촉한 불휘발성 액체의 막 내부로의 확산과 열가소성 수지의 부분적인 용해에 의해 조대 구조층이 형성된다. 여기서, 열가소성 수지에 대하여 부분적인 용해성을 갖는 액체란, 50 wt%의 농도로 열가소성 수지와 혼합했을 때에 100.0℃ 이상의 온도에서 비로소 균일 용액을 형성할 수 있는 액체이며, 100.0℃ 이상 250.0℃ 이하의 온도에서 균일 용액을 형성할 수 있는 액체가 바람직하고, 120.0℃ 이상 200.0℃ 이하의 온도에서 균일 용액을 형성할 수 있는 액체가 더욱 바람직하다. 100.0℃ 미만의 온도에서 균일 용해되는 액체를 접촉 액체로서 사용한 경우는, 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물 용액의 냉각 고화가 방해되기 때문에 성형성이 저하되거나, 조대 구조층이 필요 이상으로 두꺼워지거나, 혹은 구멍 직경이 지나치게 커지는 등의 문제가 발생하는 경우가 있다. 250.0℃ 미만의 온도에서 균일 용액을 형성할 수 없는 액체의 경우는, 열가소성 수지에 대한 용해성이 낮기 때문에 충분한 두께의 조대 구조층을 형성하는 것이 어렵다. 또한, 여기서 불휘발성의 액체란, 1 기압(101325 Pa)에서의 비점이 250.0℃를 초과하는 액체이다.

예컨대, 열가소성 수지로서 폴리불화비닐리덴 수지를 선택한 경우에는, 에스테르쇄의 탄소쇄 길이가 7 이하인 프탈산에스테르류, 아디프산에스테르류, 세바스산에스테르류, 에스테르쇄의 탄소쇄 길이가 8 이하인 인산에스테르류, 시트르산에스테르류 등을 적합하게 사용할 수 있고, 특히 프탈산디헵틸, 프탈산디부틸, 프탈산디에틸, 프탈산디메틸, 아디프산디부틸, 세바스산디부틸, 인산트리(2-에틸헥실), 인산트리부틸 및 아세틸시트르산트리부틸 등을 적합하게 사용할 수 있다.

단, 예외적으로 에스테르쇄에 페닐기, 크레질기, 시클로헥실기 등의 고리형 구조를 갖는 가소제, 즉 프탈산디시클로헥실(DCHP), 프탈산디아밀(DAP), 인산트리페닐(TPP), 인산디페닐크레질(CDP) 및 인산트리크레질(TCP) 등은 조대 구조층을 형성하는 능력이 작아 바람직하지 않다.

또한, 조대 구조층을 도입시키기 위해 사용되는 접촉 액체의 온도는 100.0℃ 이상, 바람직하게는 120.0℃ 이상, 열가소성 수지와 가소제의 균일 용액의 온도 이하이며, 더욱 바람직하게는 130.0℃ 이상, (열가소성 수지와 가소제의 균일 용액의 온도 -10.0℃) 이하이다. 상기 접촉 액체의 온도가 100.0℃ 미만인 경우는, 열가소성 수지에 대한 용해성이 낮기 때문에 충분한 두께의 조대 구조층을 형성하는 것이 어려워지는 경향이 있다. 열가소성 수지와 가소제의 균일 용액의 온도를 초과하는 경우에는 성형성이 저하된다.

또한, 막이 중공사형인 경우는, 상기 접촉 액체가 환상 방사구금 내를 통과할 때에 열의 이동이 발생하기 때문에, 환상 방사구금에 온도 변동이 발생하고, 그 결과 중공사의 원주 방향으로 불균일한 막구조가 되는 경우가 있다. 예컨대, 환상 방사구금의 측방으로부터 저온의 접촉 액체를 도입한 경우, 접촉 액체가 도입된 부분의 환상 방사구금의 온도가 저하되고, 이 상대적으로 저온인 개소를 통과한 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물로 형성된 막 부분의 구멍 직경이 작아지고, 원주 방향으로 막구조의 불균일성이 증대된다. 중공사의 원주 방향으로 균일한 막구조를 얻기 위해서는, 방사구금의 온도를 균일하게 하는 것이 바람직하고, 그것을 위해서는, (1) 접촉 액체의 온도의 영향을 중공사의 원주 방향으로 균일하게 하기 위해, 환상 방사구금의 상부로부터 접촉 액체를 도입하는 것, 및/또는, (2) 환상 방사구금과 접촉 액체 사이의 열 이동을 작게 하기 위해, 환상 방사구금과, 환상 방사구금에 도입되기 직전의 접촉 액체의 온도차를 작게 하는 것이 바람직하다. (2)의 경우, 환상 방사구금과, 환상 방사구금에 도입되기 직전의 접촉 액체의 온도차를 80.0℃ 이하로 하는 것이 바람직하다. 80.0℃보다 온도차가 크면, 원주 방향으로 불균일한 막구조가 되어, 바이러스 제거막에 부하하는 바이러스의 총량이 증가했을 때에, 바이러스가 샐 가능성이 있다.

상기 환상 방사구금과 접촉 액체의 온도차를 작게 하기 위해서는, 방사구금 근처의 온도 조절을 이용하는 것이나, 가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성의 온도를 낮게 하는 등의 다양한 방법이 생각되지만, 도입하는 접촉 액체를 방사구금에 넣을 때의 접촉 액체의 온도를 높게 제어하는 방법이 바람직하다.

미다공막의 편면에만 조대 구조층을 도입하는 경우, 치밀 구조층측에 상당하는 다른쪽 표면의 냉각 방법은 종래의 방법에 따를 수 있다. 즉, 막을 열전도체에 접촉시켜 냉각시킴으로써 행한다. 열전도체로는, 금속, 물, 공기 또는 가소제 자신을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 균일 용액을 T 다이 등을 통해 시트형으로 압출하고, 금속제의 롤에 접촉 냉각시켜 치밀 구조층을 형성하고, 또한 롤과 접촉하지 않는 측의 막면을 열가소성 수지에 대하여 부분적인 용해성을 갖는 불휘발성의 액체에 접촉시킴으로써 조대 구조층을 형성하는 방법이 이용 가능하다. 또한, 수지와 가소제의 균일 용액을 서큘러 다이나 환상 방사구금 등을 통해 원통형 내지 중공사형으로 압출하고, 상기 원통 내지 중공사의 내측에 열가소성 수지에 대하여 부분적인 용해성을 갖는 불휘발성의 액체를 통과시킴으로써 내표면측에 조대 구조층을 형성하고, 외측을 물 등의 냉각 매체에 접촉시켜 냉각시킴으로써 치밀 구조층을 형성하는 방법도 이용 가능하다.

실시형태에 따른 미다공막의 제조 방법에서, 소구멍 직경이며 균질한 치밀 구조층을 형성하기 위해서는, 냉각 고화시킬 때의 냉각 속도를 충분히 빠르게 하는 것이 바람직하다. 냉각 속도는 50.0℃/분 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100.0℃/분 이상 1.0×10⁵℃/분 이하, 더욱 바람직하게는 200.0℃/분 이상 2.0×10⁴℃/분 이하이다. 구체적인 방법으로는 금속제의 냉각 롤이나 물에 접촉시키는 방법이 적합하게 이용되지만, 특히 물에 접촉시키는 방법이, 물의 증발에 의해 급속한 냉각을 달성할 수 있기 때문에 바람직하다.

또한 냉각 고화시키는 매체의 온도는, 폴리머의 분자량 등에 의해, 일의적으로 결정할 수 없지만 낮은 편이 바람직하다. 예컨대, 물에 접촉시키는 경우에는, 물의 온도는 50.0℃ 이하, 보다 바람직하게는 40.0℃ 이하, 보다 바람직하게는 30.0℃ 이하이다. 접촉시키는 매체의 온도가 낮을수록, 형성되는 막의 버블 포인트가 높아지는 경향이 있고, 바이러스 제거막을 사용할 때에, (1) 압력(유속)의 레벨을 낮추는 경우, (3) 여과를 일단 중단하고 재가압하는(Stop&start) 경우, 또는 (2) 제제의 여과 후, 여과를 일단 중단하고 Buffer로 세정하는 공정(Post-wash)을 포함하는 경우에도, 바이러스 제거성을 높게 유지할 수 있기 때문에 바람직하다.

실시형태에 따른 제조법에서, 균일하게 가열 용해한 열가소성 수지와 가소제를 포함하는 조성물을 토출구로부터 토출시키고, 조성물을 냉각 고화시키기 전에, 에어갭을 설치하는 것이 바람직하다. 이 에어갭에서, 토출된 폴리머 용액의 표층이 냉각됨과 더불어, 가소제의 일부가 기화하는 것에 의해, 표층 부분에 가장 치밀한 층인 최치밀층이 형성된다. 에어갭의 길이는, 10 mm 이상, 300 mm 이하가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 30 mm 이상, 200 mm 이하이다.

에어갭의 길이가 상기 범위 내에서, 작을수록 치밀층의 두께가 두껍고, 클수록 치밀층의 두께가 얇아지고, 상기 범위 내라면, 바이러스 제거 성능이 높고 여과 효율이 높은 막을 제조할 수 있다.

또한, 실시형태에 따른 제조 방법에서, 기화한 가소제를 제거하기 위해 에어갭부에 배기부를 설치해도 좋지만, 이 때, 토출된 조성물에 대한 공기의 흐름에 유의할 필요가 있다. 토출된 조성물에 닿은 공기의 흐름에 변동이 있는 경우, 조성물의 온도에 변동이 생기고, 결과적으로 구조의 국소적인 불균일의 원인이 될 수 있다. 예컨대, 토출된 조성물이 중공사형인 경우에, 조성물의 측방으로부터 배기한 경우, 공기의 흐름에 의해 배기부의 반대측이 더욱 냉각되기 때문에 보다 치밀해지기 쉽고, 원주 방향의 구조 변동이 생긴다. 따라서, 토출된 조성물에 대하여 균일해지도록 배기부를 설치하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 토출된 조성물에 대하여 공기의 흐름이 평행해지도록, 상방 배기 혹은 하방 배기로 하는 것이 바람직하다.

측방 배기의 경우에는, 조성물에 닿는 풍속이, 10 m/s 이하가 바람직하고, 7 m/s, 5 m/s, 3 m/s 이하가 바람직하고, 1 m/s 이하가 보다 바람직하다.

형성된 막으로부터 가소제의 실질적인 부분을 제거하는 공정(b)에서는, 가소제를 제거하기 위해 추출 용제를 사용한다. 추출 용제는 열가소성 수지에 대하여 빈용매이고 가소제에 대하여 양용매이며, 비점이 미다공막의 융점보다 낮은 것이 바람직하다. 이러한 추출 용제로는, 예컨대, 헥산이나 시클로헥산 등의 탄화수소류, 염화메틸렌이나 1,1,1-트리클로로에탄 등의 할로겐화탄화수소류, 에탄올이나 이소프로판올 등의 알콜류, 디에틸에테르나 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 아세톤이나 2-부타논 등의 케톤류 또는 물을 들 수 있다.

실시형태에서, 막으로부터 가소제를 제거하는 제1 방법은, 추출 용제를 넣은 용기 내에 소정의 크기로 절취한 미다공막을 침지하여 충분히 세정한 후에, 부착된 용제를 바람 건조시키거나 또는 열풍에 의해 건조시킴으로써 행한다. 이 때, 침지 조작이나 세정 조작을 복수회 반복하여 행하면 미다공막 중에 잔류하는 가소제가 감소하기 때문에 바람직하다. 또한, 침지, 세정, 건조의 일련의 조작 중에 미다공막의 수축이 억제되기 때문에, 미다공막의 단부를 구속하는 것이 바람직하다.

막으로부터 가소제를 제거하는 제2 방법은, 추출 용제로 채워진 조 내에 연속적으로 미다공막을 넣어, 가소제를 제거하기에 충분한 시간 동안 조 내에 침지하고, 그 후 부착된 용제를 건조시킴으로써 행한다. 이 때, 조 내부를 다단 분할하는 것에 의해 농도차가 부여된 각 조에 순차적으로 미다공막을 넣는 다단법이나, 미다공막의 주행 방향에 대하여 역방향으로부터 추출 용제를 공급하여 농도 구배를 부여하기 위한 향류법과 같은 공지의 수단을 적용하면, 추출 효율을 높일 수 있어 바람직하다. 제1, 제2 방법 모두, 가소제를 미다공막으로부터 실질적으로 제거하는 것이 중요하다. 실질적으로 제거한다는 것은, 분리막으로서의 성능을 손상하지 않을 정도로 미다공막 중의 가소제를 제거하는 것을 가리키며, 미다공막 중에 잔존하는 가소제의 양은 1 wt% 이하가 되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 100 질량ppm 이하이다. 미다공막 중에 잔존하는 가소제의 양은, 가스 크로마토그래피나 액체 크로마토그래피 등으로 정량할 수 있다. 또한, 추출 용제의 온도를, 상기 용제의 비점 미만의 온도, 바람직하게는 (비점 -5.0℃) 이하의 범위 내에서 가온하면, 가소제와 용제의 확산을 촉진할 수 있기 때문에 추출 효율을 높일 수 있어 더욱 바람직하다.

물리적 강도가 우수한 소수성 수지로 이루어진 미다공막은, 높은 여과압에 견딜 수 있는 점에서는, 셀룰로오스 등의 친수성 수지로 이루어진 미다공막과 비교하여 우수한 반면, 단백질 등의 흡착, 막의 오염이나 막힘 등이 생기기 쉬워, 여과 속도의 급격한 저하를 야기한다. 그 때문에, 소수성 수지로 이루어진 미다공막을 이용하는 경우, 단백 등의 흡착에 의한 폐색을 방지하기 위해, 막에 친수성이 부여된다. 실시형태에 따른 제조 방법에서는, 그래프트 중합법에 의해 소수성막의 세공 표면에 친수성 작용기를 도입하여, 단백 등의 흡착성을 저감시키는 것이 바람직하다. 이것은, 그래프트 중합법이 다른 방법(예컨대, 친수성 폴리머를 블렌드에 의한 방법이나 코트하는 방법 등)과 비교하여, 큰 세공부터 작은 세공까지 균일하게 친수화할 수 있는 것, 또는 막의 내표면으로부터 외표면을 고르고 균등하게 친수화할 수 있기 때문이다.

또한 그래프트 중합에서는, 화학 결합에 의해 친수성을 부여하고 있기 때문에, 처리액에 대하여 용질할 가능성이 다른 방법과 비교하여 낮기 때문에 바람직하다. 그래프트 중합법이란, 전리성 방사선이나 화학 반응 등의 수단에 의해 고분자 미다공막에 라디칼을 생성시키고, 그 라디칼을 개시점으로 하여, 상기 막에 모노머를 그래프트 중합시키는 반응이다.

실시형태에서, 고분자 미다공막에 라디칼을 생성시키기 위해서는 어떠한 수단도 채용할 수 있지만, 막 전체에 균일한 라디칼을 생성시키기 위해서는, 전리성 방사선의 조사가 바람직하다. 전리성 방사선의 종류로는, γ선, 전자선, β선 및 중성자선 등을 이용할 수 있지만, 공업 규모에서의 실시에는 전자선 또는 γ선이 가장 바람직하다. 전리성 방사선은 코발트 60, 스트론튬 90 및 세슘 137 등의 방사성 동위체로부터, 또는 X선 촬영 장치, 전자선 가속기 및 자외선 조사 장치 등에 의해 얻어진다.

전리성 방사선의 조사선량은, 1 kGy 이상 1000 kGy 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 2 kGy 이상 500 kGy 이하, 가장 바람직하게는 5 kGy 이상 200 kGy 이하이다. 1 kGy 미만이면 라디칼이 균일하게 생성되지 않고, 1000 kGy를 초과하면 막 강도의 저하를 야기하는 경우가 있다.

전리성 방사선의 조사에 의한 그래프트 중합법에는, 일반적으로 막에 라디칼을 생성한 후, 이어서 그것을 반응성 화합물과 접촉시키는 전조사법과, 막을 반응성 화합물과 접촉시킨 상태로 막에 라디칼을 생성시키는 동시 조사법으로 크게 나뉜다. 실시형태에서는 어떠한 방법도 적용할 수 있지만, 올리고머의 생성이 적은 전조사법이 바람직하다.

실시형태에서는, 반응성 화합물로서 1개의 비닐기를 갖는 친수성 비닐 모노머와, 필요에 따라서 가교제를 이용하여, 라디칼을 생성한 고분자 미다공막에 접촉시킨다. 접촉시키는 방법은 기상에서도 액상에서도 행할 수 있지만, 그래프트 반응이 균일하게 진행되는 액상에서 접촉시키는 방법이 바람직하다. 그래프트 반응을 더욱 균일하게 진행시키기 위해, 1개의 비닐기를 갖는 친수성 비닐 모노머를 미리 용매 중에 용해시키고 나서 가교제를 이용하는 경우는, 친수성 비닐 모노머와 가교제를 미리 용매 중에 용해시키고 나서 고분자 미다공막과 접촉시키는 것이 바람직하다.

상기와 같이, 실시형태에 따른 친수성 미다공막의 제조 방법에서는, 고분자 미다공막에, 1개의 비닐기를 갖는 친수성 비닐 모노머를 그래프트 중합하고, 세공 표면에 친수성을 부여하여, 단백질 등의 생리 활성 물질의 흡착을 저감시킨다. 실시형태에서의 1개의 비닐기를 갖는 친수성 비닐 모노머란, 대기압 하에서 25.0℃의 순수에 1 체적% 혼합시켰을 때에 균일 용해되는 1개의 비닐기를 갖는 모노머이다. 상기 친수성 비닐 모노머로는, 예컨대, 히드록시프로필아크릴레이트, 히드록시부틸아크릴레이트 등의 히드록실기를 갖는, 또는 그 전구체가 되는 작용기를 갖는 비닐 모노머, 비닐피롤리돈 등의 아미드 결합을 갖는 비닐 모노머, 아크릴아미드 등의 아미노기를 갖는 비닐 모노머, 폴리에틸렌글리콜모노아크릴레이트 등의 폴리에틸렌글리콜쇄를 갖는 비닐 모노머, 메타크릴산트리에틸암모늄에틸 등의 음이온 교환기를 갖는 비닐 모노머 및 메타크릴산술포프로필 등의 양이온 교환기를 갖는 비닐 모노머 등을 들 수 있다.

실시형태에서는, 상기 친수성 비닐 모노머 중에서도, 1개 이상의 히드록실기, 또는 그 전구체가 되는 작용기를 갖는 비닐 모노머를 이용하는 것이, 막의 후퇴 접촉각을 저하시켜 바람직하다. 보다 바람직하게는, 히드록시프로필아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트 등의 아크릴산 또는 메타크릴산과 다가 알콜의 에스테르류, 알릴알콜 등의 불포화 결합을 갖는 알콜류, 및 아세트산비닐, 프로피온산비닐 등의 에놀에스테르류 등을 이용하고, 가장 바람직하게는 히드록시프로필아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트 등의 아크릴산 또는 메타크릴산과 다가 알콜의 에스테르류를 이용한다. 히드록시프로필아크릴레이트를 그래프트한 친수성 미다공막은, 후퇴 접촉각이 낮고, 또한 충분한 글로불린 투과 성능을 얻을 수 있다.

1개의 비닐기를 갖는 친수성 비닐 모노머, 및 필요에 따라서 이용하는 가교제를 용해하는 용매는, 균일 용해할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 용매로서, 예컨대, 에탄올이나 이소프로판올, t-부틸알콜 등의 알콜류, 디에틸에테르나 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 아세톤이나 2-부타논 등의 케톤류, 물, 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있다.

1개의 비닐기를 갖는 친수성 비닐 모노머, 및 필요에 따라서 이용하는 가교제를 용해시킬 때의 농도는, 3 체적%부터 30 체적%까지가 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 체적%부터 20 체적%, 가장 바람직하게는 3 체적%부터 15 체적%이다. 3 체적% 이상의 농도라면 충분한 친수성을 얻을 수 있어 바람직하다. 30 체적%를 초과하면 친수화층에 의해 구멍이 메워지는 경우가 있고, 투과 성능이 저하되는 경향이 있어 바람직하지 않다.

그래프트 중합 시에 이용하는, 1개의 비닐기를 갖는 친수성 비닐 모노머, 및 필요에 따라서 이용하는 가교제를 용매에 용해시킨 반응액의 양은, 고분자 미다공막 1 g에 대하여 1×10^-5 ㎥ 이상 1×10^-3 ㎥ 이하가 바람직하다. 반응액의 양이 1×10^-5 ㎥ 이상 1×10^-3 ㎥ 이하이면 균일성이 충분한 막을 얻을 수 있다. 그래프트 중합 시의 반응 온도는, 일반적으로 20.0℃ 이상 80.0℃ 이하에서 행해지지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.

실시형태는, 소수성 미다공막에 적절한 친수화층을 도입하여, 높은 단백 투과성을 실현한다. 그 때문에, 소수성 미다공막에 그래프트되는 그래프트율은, 바람직하게는 3% 이상, 50% 이하, 더욱 바람직하게는 4% 이상, 40% 이하, 가장 바람직하게는 6% 이상, 30% 이하이다. 그래프트율이 3% 미만이면 막의 친수성이 부족하여, 단백질의 흡착에 따르는 여과 속도의 급격한 저하를 야기한다. 50%를 초과하면, 비교적 작은 구멍이 친수화층에 의해 메워져, 충분한 여과 속도를 얻을 수 없다. 여기서, 그래프트율이란 하기 (7)식으로 정의되는 값이다.

그래프트율(%)=100×{(그래프트 후의 막 질량-그래프트 전의 막 질량)/그래프트 전의 막 질량} (7)

[제조예 1 내지 11]

(바이러스 제거막의 제조)

폴리불화비닐리덴 수지(주식회사 쿠레하 제조, KF#1300) 49 wt%, 프탈산디시클로헥실(호코 케미컬 주식회사 제조) 51 wt%로 이루어진 조성물을, 헨셜 믹서를 이용하여 실온에서 교반 혼합한 분체를 호퍼로부터 투입하고, 이축 압출기(26 mmφ, L/D=50)를 이용하여 210.0℃에서 용융 혼합하여 균일 용해한 후, 225.0℃로 온도가 조절된 내경 0.8 mm, 외경 1.05 mm의 환상 오리피스로 이루어진 방사구금으로부터 토출 속도 4.2 g/분으로 중공사형으로 압출하고, 에어갭을 거친 후, 도 5에 나타내는 응고욕 온도로 조절된 수욕 중에서 냉각 고화시켜, 50 m/분의 속도로 실패에 감았다. 이 때, 중공사의 내부에는 중공제로서 프탈산디부틸(다이하치 화학 공업 주식회사 제조)을 7.1 g/분의 속도로 흘렸다. 제조예 1 내지 11에서, 프탈산디부틸은 방사구금의 측방으로부터 도입하고, 방사구금에 들어가기 직전의 온도와 방사구금으로부터 토출되었을 때의 온도는, 도 5에 나타내는 값이었다. 또한, 에어갭일 때에, 중공사에 측방으로부터 닿는 풍속은 2.7 m/s였다. 그 후, 2-프로판올(주식회사 토쿠야마 제조)로 프탈산디시클로헥실 및 프탈산디부틸을 추출 제거하고, 부착된 2-프로판올을 물로 치환한 후, 수중에 침지한 상태로 고압 증기 멸균 장치를 이용하여 125.0℃의 열처리를 4시간 실시하였다. 그 후, 부착된 물을 2-프로판올로 치환한 후, 60.0℃에서 진공 건조시킴으로써 중공사형의 미다공막을 얻었다. 추출로부터 건조에 이르기까지의 공정에서는, 수축을 방지하기 위해 막을 정장(定長) 상태로 고정하여 처리를 행하였다.

계속해서, 상기 미다공막에 대하여, 그래프트법에 의한 친수화 처리를 행하였다. 반응액은, 히드록시프로필아크릴레이트(오사카 유기 화학 공업 주식회사 제조)를 8 체적%가 되도록, 3-부탄올(준세이 과학(주) 시약 특급)의 25 체적% 수용액에 용해시키고, 45.0℃로 유지한 상태로 질소 버블링을 20분간 행한 것을 이용하였다. 우선, 질소 분위기 하에서 상기 미다공막을 드라이아이스로 -60.0℃ 이하로 냉각시키면서, Co60을 선원으로서 γ선을 적어도 25 kGy를 조사하였다. 조사 후의 막은, 13.4 Pa 이하의 감압 하에 15분간 정치한 후, 상기 반응액과 상기 막을 45.0℃에서 접촉시켜 1시간 정치하였다. 그 후, 막을 2-프로판올로 세정하고, 60.0℃에서의 진공 건조에 의해 미다공막을 얻었다. 얻어진 막은 물에 접촉시켰을 때에 자발적으로 세공 내에 물이 침투하는 것을 확인하였다. 얻어진 막의 성능을 평가한 결과를 도 5에 나타낸다.

제조예 1 내지 11에서, 중공제의 입구 온도와 출구의 온도차, 에어갭 길이, 응고욕 온도는 도 5에 나타내는 값이었다. 또한 제조예 6에 관해서만, 프탈산디부틸은 방사구금의 중앙부로부터 도입하였다. 이들 이외의 막의 제조 조건은, 제조예 1 내지 11에서 동일하였다.

(바이러스 제거막의 물성)

(1) 중공사의 외경, 내경, 막 두께

중공사 형상의 미다공막의 외경, 내경은, 상기 막의 수직 할단면을 실체 현미경(모리테크(주) 제조 SCOPEMAN503)을 사용하여 210배의 배율로 촬영하는 것에 의해 구하였다. 막 두께는 중공사의 외경과 내경의 차의 1/2로서 계산하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

(2) 버블 포인트

ASTM F 316-86에 준거한 버블 포인트법에 의해 구해지는 버블 포인트(Pa)를 측정하였다. 막을 침지하는 시험액으로서 표면장력이 13.6 mN/m인 하이드로플루오로에테르(3M사 제조 Novec(등록상표) 7200)를 이용하였다. 버블 포인트는, 유효 길이 8 cm의 중공사막 1개를 버블 포인트 측정 장치에 셋팅한 후, 중공부측의 압력을 서서히 올리고, 막을 투과하는 가스 유량이 2.4E-3리터/분이 되었을 때의 압력으로 하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

(3) 순수 투과 속도

정압 데드엔드 여과에 의한 온도 25.0℃의 순수의 투과량을 측정하고, 막 면적, 여과 압력(0.1 MPa) 및 여과 시간으로부터, 하기 (8)식과 같이 계산하여 순수 투과 속도로 하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

순수 투과 속도(L/㎡/hrs/0.1 MPa)=투과량÷(막 면적×여과 시간) (8)

(금콜로이드를 이용한 바이러스 제거막의 평가)

(1) 금콜로이드 용액의 조제

입경이 10, 15, 20 및 30 nm인 금콜로이드를 각각 포함하는 용액(Cytodiagnostics사 제조)을 구입하였다. 다음으로, 자외ㆍ가시분광 광도계 UVmini-1240(시마즈 제작소 제조)로 측정한 각 금콜로이드 용액의 금콜로이드에 따른 최대 흡수 파장에서의 흡광도가 0.25가 되도록, 금콜로이드 용액을, 주사용 증류수, 폴리옥시에틸렌-나프틸에테르(1.59 vol%), 및 폴리(4-스티렌술폰산나트륨)(0.20 vol%)으로 희석하였다.

(2) 금콜로이드 용액의 여과

조제한 금콜로이드 용액의 각각 40 mL를, 196 kPa의 가압 하에서, 제조예에 따른 바이러스 제거막으로 여과하였다. 바이러스 제거막의 여과 면적은 0.001 ㎡였다.

(3) 바이러스 제거막에 의한 금콜로이드의 제거율의 측정

자외ㆍ가시분광 광도계 UVmini-1240(시마즈 제작소 제조)을 이용하여, 금콜로이드 용액의 각각에 관해, 금콜로이드의 최대 흡수 파장에서의 여과 전의 금콜로이드 용액의 흡광도 A와, 여과액의 흡광도 B를 측정하여, 하기 (9)식으로 부여된, 제조예에 따른 바이러스 제거막에 의한 금콜로이드의 대수 제거율(LRV)을 산출하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

LRV=log₁₀(A/B) (9)

(4) 금콜로이드 포착 부위의 균일성의 측정

금콜로이드 용액을 여과한 후의 제조예에 따른 바이러스 제거막으로부터 절편(두께는 8 ㎛)을 잘라내고, 절편의 단면에서 금콜로이드에 의해 염색된 부분 16개소의 휘도 프로파일을 광학 현미경(Biozero, BZ8100, 키엔스사 제조)으로 측정하였다. 다음으로, 상수(255)로부터 측정한 휘도 프로파일을 빼었다. 그 후, 횡축에 막 두께(백분율), 종축에 휘도의 변위를 갖는 그래프를 작성하여, 그래프에 나타난 휘도 변위의 스펙트럼의 면적을 산출하였다. 또한, 16개소에서의 휘도 변위의 스펙트럼의 면적의 표준편차를, 16개소에서의 휘도 변위의 스펙트럼의 면적의 평균으로 나눈 값을, 제조예에 따른 바이러스 제거막에서의 금콜로이드 포착 부위의 금콜로이드의 포착량의 변동 계수를 나타내는 값으로서 산출하였다. 직경 20 nm의 금콜로이드만을 흘렸을 때의 결과를 도 5에 나타낸다. 제조예에 따른 바이러스의 제거막에서의 금콜로이드 포착 부위에서의 금콜로이드의 포착량의 균일성이 높은 것이 나타났다. 또한, 제조예 중에서도, 중공제의 입구 온도와 출구 온도의 온도차가, 열가소성 수지와 가소제의 균일 용액과 접촉하는 전후에서 작을수록 금콜로이드 포착 부위에서의 금콜로이드의 포착량의 균일성이 높아지는 경향이 있고, 또한, 방사구금의 중앙부로부터 중공제를 넣음으로써 금콜로이드 포착 부위에서의 금콜로이드의 포착량의 균일성이 높아지는 경향이 있었다.

(5) 금콜로이드 포착 부위의 두께의 측정

20 및 30 nm의 금콜로이드 용액을 각각 여과한 습윤 상태의 바이러스 제거막으로부터 절편(두께는 8 ㎛)을 잘라냈다. 습윤 상태의 절편의 단면에서 금콜로이드에 의해 염색된 부분 16개소의 휘도 프로파일을 광학 현미경(Biozero, BZ8100, 키엔스사 제조)으로 측정하였다. 여기서, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막의 일차측의 표면으로부터, 금콜로이드가 포착된 부위의 가장 일차측의 표면에 가까운 부분까지의 제1 거리 a를 측정하였다. 또한, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막의 일차측의 표면으로부터, 금콜로이드가 포착된 부위의 가장 이차측의 표면에 가까운 부분까지의 제2 거리 b를 측정하였다.

다음으로, 16개소의 각각에서, 제1 거리 a를 습윤 상태의 바이러스 제거막의 막 두께 c로 나누어 백분율로 나타낸 값 A(=a/c의 백분율 표시)를 산출하고, 16개소에서의 값 A의 평균치를 제1 도달도로서 산출하였다. 또한, 16개소의 각각에서, 제2 거리 b를 습윤 상태의 바이러스 제거막의 막 두께 c로 나누어 백분율로 나타낸 값 B(=b/c의 백분율 표시)를 산출하고, 16개소에서의 값 B의 평균치를 제2 도달도로서 산출하였다.

또한, 하기 (10)식에 나타낸 바와 같이, 직경 20 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막에서의 제2 도달도의 평균치 B₂₀과, 직경 30 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막에서의 제1 도달도의 평균치 A₃₀의 차에, 직경 20 nm의 금콜로이드를 여과한 습윤 상태의 바이러스 제거막의 막 두께의 평균치 C₂₀과 직경 30 nm의 금콜로이드를 여과한 습윤 상태의 바이러스 제거막의 막 두께의 평균치 C₃₀의 평균치 C_AVE를 곱한 값을, 바이러스 제거막에서의 금콜로이드 포착 부위의 두께 T로서 산출하였다. 금콜로이드 포착 부위의 두께 T는, 바이러스 제거막의 치밀층의 두께 T라고도 표현된다. 결과를 도 5에 나타낸다.

T=(B₂₀-A₃₀)×C_AVE (10)

상기 방법에서는, 직경 20 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막과, 직경 30 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막의 적어도 2개의 바이러스 제거막을 이용하여, 치밀층의 두께를 측정하였다. 단, 하나의 바이러스 제거막만을 이용하여 치밀층의 두께를 측정하는 것도 가능하다. 이 경우, 하나의 바이러스 제거막을 이용하여, 직경 20 nm 및 30 nm의 양방의 금콜로이드를 포함하는 금콜로이드 용액을 여과한다. 혹은, 하나의 바이러스 제거막을 이용하여, 직경 20 nm의 금콜로이드 용액을 여과한 후, 직경 30 nm의 금콜로이드 용액을 여과한다.

그 후, 직경 20 nm 및 30 nm의 금콜로이드 용액을 여과한 바이러스 제거막으로부터 절편을 잘라내고, 절편의 단면에서 금콜로이드에 의해 염색된 부분 16개소의 휘도 프로파일을 광학 현미경(Biozero, BZ8100, 키엔스사 제조)으로 측정한다. 여기서, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막의 일차측의 표면으로부터, 금콜로이드 포착 부위의 가장 일차측의 표면에 가까운 부분까지의 제1 거리 a₁을 측정한다. 또한, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막의 일차측의 표면으로부터, 금콜로이드 포착 부위의 가장 이차측의 표면에 가까운 부분까지의 제2 거리 b₁을 측정한다.

다음으로, 16개소의 각각에서, 제1 거리 a1을 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께 c로 나누어 백분율로 나타낸 값 A₁(=a₁/c₁의 백분율 표시)을 산출하고, 16개소에서의 값 A₁의 평균치를 제1 도달도로서 산출한다. 또한, 16개소의 각각에서, 제2 거리 b₁을 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께 c로 나누어 백분율로 나타낸 값 B₁(=b₁/c₁의 백분율 표시)을 산출하고, 16개소에서의 값 B₁의 평균치를 제2 도달도로서 산출한다.

또한, 하기 (11)식에 나타낸 바와 같이, 바이러스 제거막에서의 제2 도달도의 평균치 B₁과, 바이러스 제거막에서의 제1 도달도의 평균치 A₁의 차에, 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께의 평균치 C를 곱한 값을, 바이러스 제거막에서의 금콜로이드 포착 부위의 두께 T로서 산출한다. (10)식에서 산출되는 두께 T와, (11)식에서 산출되는 두께 T의 사이에, 큰 차는 생기지 않는 것이 확인되었다.

T=(B₁-A₁)×C (11)

(6) 최치밀층의 두께의 측정

직경 15 nm의 금콜로이드 용액을 여과한 습윤 상태의 바이러스 제거막으로부터 절편(두께는 8 ㎛)을 잘라냈다. 습윤 상태의 절편의 단면에서 금콜로이드에 의해 염색된 부분 16개소의 휘도 프로파일을 광학 현미경(Biozero, BZ8100, 키엔스사 제조)으로 측정하였다. 여기서, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막의 일차측의 표면으로부터, 금콜로이드가 포착된 부위의 가장 일차측의 표면에 가까운 부분까지의 제1 거리 d를 측정하였다. 또한, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막의 일차측의 표면으로부터, 금콜로이드가 포착된 부위의 가장 이차측의 표면에 가까운 부분까지의 제2 거리 e를 측정하였다.

다음으로, 16개소의 각각에서, 제1 거리 d를 습윤 상태의 바이러스 제거막의 막 두께 f로 나누어 백분율로 나타낸 값 D(=d/f의 백분율 표시)를 산출하고, 16개소에서의 값 D의 평균치를 제1 도달도로서 산출하였다. 또한, 16개소의 각각에서, 제2 거리 e를 습윤 상태의 바이러스 제거막의 막 두께 f로 나누어 백분율로 나타낸 값 E(=e/f의 백분율 표시)를 산출하고, 16개소에서의 값 E의 평균치를 제2 도달도로서 산출하였다.

또한, 하기 (12)식에 나타낸 바와 같이, 직경 15 nm의 금콜로이드를 여과한 바이러스 제거막에서의 제2 도달도의 평균치 E와 제1 도달도의 평균치 D의 차에, 여과한 습윤 상태의 바이러스 제거막의 막 두께의 평균치 F를 곱한 값을, 바이러스 제거막에서의 15 nm 금콜로이드 포착 부위(최치밀층)의 두께 T로서 산출하였다.

T=(E-D)×F (12)

(7) 바이러스 제거막의 금콜로이드 포착 부위의 입경 의존성의 측정

직경 15 nm, 20 nm 및 30 nm의 금콜로이드 용액을 각각 여과한 바이러스 제거막으로부터 절편(두께는 8 ㎛)을 잘라냈다. 절편의 단면에서 금콜로이드에 의해 염색된 부분 16개소의 휘도 프로파일을 광학 현미경(Biozero, BZ8100, 키엔스사 제조)으로 측정하였다. 여기서, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막의 일차측의 표면으로부터, 금콜로이드가 포착된 부위의 가장 일차측의 표면에 가까운 부분까지의 제1 거리 a를 측정하였다. 또한, 막 두께 방향에서, 바이러스 제거막의 일차측의 표면으로부터, 금콜로이드가 포착된 부위의 가장 이차측의 표면에 가까운 부분까지의 제2 거리 b를 측정하였다.

다음으로, 16개소의 각각에서, 제1 거리 a를 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께 c로 나누어 백분율로 나타낸 값 A(%)를 산출하고, 16개소에서의 값 A(%)의 평균치를 제1 도달도로서 산출하였다. 또한, 16개소의 각각에서, 제2 거리 b를 습윤한 바이러스 제거막의 막 두께 c로 나누어 백분율로 나타낸 값 B(%)를 산출하고, 16개소에서의 값 B(%)의 평균치를 제2 도달도로서 산출하였다. 직경 15 nm, 20 nm 및 30 nm의 금콜로이드의 각각에 관해, 제1 도달도의 평균치와 제2 도달도의 평균치를 도 5에 나타낸다. 또, 도 5에서, 좌측의 수치가 제1 도달도의 평균치를 나타내고, 우측의 수치가 제2 도달도의 평균치를 나타내고 있다. 또, 직경 30 nm, 20 nm 및 15 nm의 금콜로이드의 포착 위치의 측정에 관해, 어디까지나 막에 의해 포착된 금콜로이드에 관해 측정한 것이며, 막에 포착되지 않은 금콜로이드에 관해 측정하는 것은 아니다.

(바이러스 제거막의 바이러스 제거능)

(1) 바이러스 함유 단백질 용액의 조제

폴리클로날 항체(인간 IgG)(베노글로불린-IH, 베네시스사 제조)를 이용하여, 항체 농도가 10 mg/mL이 되도록 주사용수(오쯔카 제약)로 희석한 항체 용액을 얻었다. 또한, 1 mol/L NaCl 수용액을 이용하여 염 농도를 0.1 mol/L로 조정하였다. 또한, 0.1 mol/L HCl 또는 0.1 mol/L NaOH를 이용하여, 수소 이온 지수(pH)를 4.0으로 조정하고, 이것을 단백질 용액으로 하였다. 얻어진 단백질 용액에, 돼지 파보바이러스(PPV, 사단법인 동물용 생물학적 제제 협회)를 1.0 vol% 첨가하고 잘 교반하여, 바이러스 함유 단백질 용액을 얻었다.

(2-1) 바이러스 함유 단백질 용액의 여과(통상)

196 kPa의 여과 압력으로, 제조한 막 면적 0.001 ㎡의 바이러스 제거막을 이용하여, 여과량이 150 L/㎡에 도달할 때까지, 바이러스 함유 단백질 용액의 데드엔드 여과를 행하였다.

(2-2) 바이러스 함유 단백질 용액의 여과(포착 용량)

196 kPa의 여과 압력으로, 제조한 막 면적 0.001 ㎡의 바이러스 제거막을 이용하여, 바이러스 함유 단백질 용액의 데드엔드 여과를 행하였다. 여과 압력은 공급액 용기측에 압력계를 설치하여 측정하였다. 15 L/㎡마다 여과액을 채취하고, 최대로 바이러스 부하량이 14.0(Log₁₀(TCID₅₀/㎡))이 될 때까지 여과를 실시하였다.

(3) 바이러스 제거율의 측정

아메리카 배양세포 계통 보존 기관(ATCC)으로부터 입수하여 배양한 PK-13 세포(ATCC No. CRL-6489)를 준비하였다. 또한, 56.0℃의 수욕에서 30분간 가열하여 비동화시킨 후의 소혈청(Upstate사 제조) 3 vol%와, 페니실린/스트렙토마이신(+10000 Units/mL 페니실린, +10000 μg/mL 스트렙토마이신, 인비트로젠 제조) 1 vol% 함유 D-MEM(인비트로젠 제조, 고(高)글루코오스)의 혼합액을 준비하였다. 이하, 이 혼합액을 3 vol% FBS/D-MEM이라고 한다. 다음으로, PK-13 세포를 3 vol% FBS/D-MEM으로 희석하고, 세포 농도 2.0×10⁵(세포/mL)의 희석 세포 현탁액을 조제하였다. 다음으로, 96웰 환저 세포 배양 플레이트(Falcon사 제조)를 10장 준비하고, 모든 웰에 희석 세포 현탁액을 100 μL씩 분주하였다.

희석 세포 현탁액을 분주한 세포 배양 플레이트의 8웰마다, 바이러스 함유 단백질 용액의 여과액 및 동 여과액의 10배, 10²배, 10³배, 10⁴배 및 10⁵배 희석액과, 원액의 10²배, 10³배, 10⁴배, 10⁵배, 10⁶배 및 10⁷배 희석액의 각각을, 100 μL씩 분주하였다. 그 후, 37.0℃, 5% 이산화탄소 분위기 하에 있는 인큐베이터 중에 세포 배양 플레이트를 배치하고, 세포를 10일간 배양하였다.

10일간 배양한 세포에 대하여, 이하 설명하는 적혈구 흡착법(바이러스 실험학 총론 국립 예방 위생 연구소 학우회편, p.173 참조)을 이용하여, 50% 조직 배양 감염치(TCID50)의 측정을 행하였다. 우선, 닭 보존혈(일본 바이오테스트 제조)을 PBS(-)(닛스이 제약 주식회사 제조, 제품에 첨부된 설명서에 기재된 방법으로 조제)로 5배로 희석한 후, 희석한 닭 보존혈을 2500 rpm, 4.0℃로 5분간 원심하여 적혈구를 분리하고 침전시켰다. 그 후, 상청을 흡인 제거하여, 얻어진 적혈구를 포함하는 침전물을 다시 PBS(-)로 200배로 희석하였다.

다음으로, 적혈구 침전물의 PBS(-) 희석액을, 세포 배양 플레이트의 전체 웰에 100 μL씩 분주하고 2시간 정치하였다. 그 후, 배양한 세포 조직의 표면에 대한 적혈구의 흡착 유무를 육안으로 확인하여, 흡착이 확인된 것을 바이러스 감염이 일어난 웰, 흡착이 확인되지 않은 것을 바이러스 감염이 일어나지 않은 웰로서 세었다. 또한, 바이러스 함유 단백질 용액의 여과액 및 동 여과액의 희석액과, 원액 희석액의 각각이 분주된 웰마다, 바이러스 감염의 비율을 확인하고, Reed-Muench법(바이러스 실험학 총론, 국립 예방 위생 연구소 학우회편, p. 479-480 참조)에 의해, 감염가로서 log₁₀(TCID₅₀/mL)을 산출하고, 하기 (13)식 및 (14)식을 이용하여 바이러스의 대수 제거율(LRV)을 산출하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

LRV=log₁₀(C₀/C_F) (13)

여기서, C₀은, 바이러스 제거막으로 여과하기 전의 원액(바이러스 함유 단백질 용액) 중의 감염가를 나타내고, C_F는 바이러스 제거막으로 여과한 후의 여과액 중의 감염가를 나타낸다.

압력 개방(Stop&Start)을 포함하는 프로세스의 LRV:

LRV=log₁₀(C₀×150/(C_F100×100+C_F50×50)) (14)

여기서, C₀은, 바이러스 제거막으로 여과하기 전의 원액(바이러스 함유 단백질 용액) 중의 감염가를 나타내고, C_F100은 바이러스 제거막으로 압개방 전까지 100 mL/0.001 ㎡ 여과한 후의 여과액 풀 중의 감염가, C_F50은 바이러스 제거막으로 압개방 후 3시간 정치하고, 재가압하여 50 mL/0.001 ㎡ 여과한 후의 여과액 풀 중의 감염가를 나타낸다.

(4) 최대 포착 용량의 산출

바이러스 제거율의 측정에서, 검출 한계보다 큰 값이 얻어졌을 때의 여과량(=최대 여과 용량)으로부터 하기 (15)식의 산출 방법으로 바이러스 제거막의 최대 포착 용량을 산출하였다.

최대 포착 용량(Log₁₀(TCID₅₀/㎡))=원액의 감염가 Log₁₀((TCID₅₀/mL)×최대 여과 용량(L/㎡)×1000) (15)

최대 포착 용량이 10.0의 11.5승 이상이면, 바이러스 제거막에 대한 바이러스의 부하량이 증가하였다 하더라도, 바이러스 제거율의 저하가 없어지기 때문에 바람직하다. 또한 10.0의 12승 이상, 12.5승 이상, 13.0승 이상이면 더욱 바람직하다.

또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 균일성이 높아지고 치밀층이 두꺼워짐에 따라서, 최대 포착 용량은 증가하였다.

(다량체 함유액의 제작)

인간 면역글로불린 제제(헌혈 베노글로불린 IH 5% 정맥 주사, 일본 혈액 제제 기구)를 이용하여, 글로불린 종농도 2%, 염화나트륨 농도 100 mmol/L의 용액을 조제하였다. 이 용액의 pH는 4.5였다. 본 용액을 실온에서 1 mol/L 염산 수용액에 의해 pH 2.5로 저하시켜 1시간 정치한 후, 1 mol/L의 수산화나트륨 수용액으로 pH 4.5로 되돌려 24시간 정치함으로써 글로불린의 일부를 다량체로 하였다. 또, 본 실시예에서는, 단백질을 변성시키기 위해, 가혹한 조건에서의 pH 처리를 이용하여 입자상물을 발생시켰다. 이하 이 다량체 함유 용액을 용액 A로 한다.

용액 A에 포함되는 입자의 평균 직경을 동적 광산란법으로 측정한 바, 산출되는 평균 직경은 74.3 nm였다. 측정에는 Malvern사 제조, ZetaSizerNano를 이용하였다. 결과를 도 6에 나타낸다. 측정 시의 광량(조사광의 감쇠 조건), 광원으로부터의 거리 및 총 측정 시간(적산횟수 및 1 적산횟수당의 측정 시간)은 장치의 자동 설정 기능을 이용하고, 또한, 측정 온도는 25.0℃, 측정 각도는 173°로 행하였다.

또한, 용액 A를 사이즈 배제 크로마토그래피 분석에 제공한 바, 얻어진 차트의 피크 면적으로부터 산출되는 상대 면적비로 단량체를 16.5%, 이량체를 5.6%, 삼량체 이상의 다량체를 77.8% 포함하고 있었다. 또, 본 실시예에서는, 다량체 함유 용액을 작성하여, 단백질 용액에 첨가하는 모델 실험을 위해, 사이즈 배제 크로마토그래피 분석으로 분획한 시료에 대한 평균 직경의 측정은 실시하지 않았다. 사이즈 배제 크로마토그래피법의 실시에는, 고속 액체 크로마토그래프(Prominence, 시마즈 제작소)와, 컬럼(TSK gel G3000SWXL, 도소, 배제 한계 분자량: 500,000 Da)을 이용하였다. 이동상은, 0.3 mol/L, pH 6.9의 인산 버퍼와, 0.2 mol/L의 아르기닌-HCl과, 0.1 mol/L의 NaCl을 포함하고 있었다. 측정 결과의 일례를 도 7에 나타낸다. 도 7의 (1)의 피크는 글로불린의 삼량체 이상의 다량체를 나타내고 있고, (2)의 피크는 글로불린의 이량체를 나타내고 있고, (3)의 피크는 단량체를 나타내고 있다. 크로마트차트의 피크의 면적으로부터 각각의 단량체 및 다량체의 비율을 산출하여, 이것을 상대 면적비로 하였다. 이하의 실시예에서도 동일하며, 단량체 및 다량체 등의 농도를 상대 면적비%를 이용하여 나타낸다. 측정 온도는 25℃, 측정 시간은 20분, 유속은 1.0 mL/분이었다. 이하의 단량체 및 다량체의 비율의 분석에서도, 이들 조건은 동일하다. 또, 이하의 실시예에서는, 전술한 바와 같이, 용액 중의 단백질의 대부분이 삼량체 이상의 다량체를 포함하는 단백질 용액 A를 이용하여, 용액 A 중의 입자의 평균 직경이 100 nm 미만인 것과, 삼량체 이상의 다량체의 피크 면적으로부터 산출되는 상대 면적비를 확인한 후, 각 실시예에서 처리해야 할 용액에 포함되는 평균 직경 100 nm 미만인 단백질의 삼량체 이상의 다량체가, 바이러스 제거막 1 ㎡당 0.25 g/㎡가 되도록, 처리해야 할 용액을 조제하여 실험을 행하였다.

(실시예 1)

인간 면역글로불린 제제(헌혈 베노글로불린 IH 5% 정맥 주사, 일본 혈액 제제 기구)를 이용하여 글로불린 종농도 30 mg/mL, 염화나트륨 농도 50 mmol/L, pH 5.3의 용액을 25 mL 조제하고, 상기 용액에 다량체를 0.3 mg 함유하도록 용액 A를 첨가하였다.

조제한 용액 전량을, 프리필터로서, 막 면적이 10 ㎠이고 폴리불화비닐리덴(PVDF)을 포함하며 구멍 직경이 0.1 ㎛인 듀라포어(밀리포어)를 준비하여, 0.2 bar 정압 여과하였다. 얻어진 여과액을, 제조예 5와 동일한 조건으로 제조되고 막 면적이 3 ㎠인 바이러스 제거막을 준비하여 3 bar 정압 여과한 바, 도 8에 나타낸 바와 같이, 조제한 25 mL 전량 여과하는 데 65분이 필요하였다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 9에 나타낸다.

(비교예 1)

실시예 1에서 조제한 용액과 동일한 용액에 대하여, 프리필터에 의한 여과를 행하지 않고, 직접 바이러스 제거막으로 3 bar 정압 여과한 바, 도 8에 나타낸 바와 같이, 3시간 걸리더라도 약 9.6 mL밖에 여과할 수 없어, 이 곡선으로부터 25 mL 전량 여과하는 데 4900시간 이상이 필요하다고 예상되었다. 이 때 바이러스 제거막에 부하된 다량체는 1 ㎡당 1 g이다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 9에 나타낸다.

(실시예 2)

실시예 1과 동일한 방법으로, 글로불린 종농도 30 mg/mL, 염화나트륨 농도 50 mmol/L, pH 5.3의 용액을 25 mL 조제하고, 상기 용액에 다량체를 1.03 mg 함유하도록 용액 A를 첨가하였다.

프리필터로서, 막 면적이 5 ㎠이고 폴리아미드를 포함하는 0.1 ㎛의 구멍 직경인 막이 3층 적층된 VirosartMax(싸토리우스 스테딤)를 준비하여, 0.2 bar 정압 여과하였다. 프리필터는 2개 준비하여, 처리액의 전량에 대하여 절반량인 12.5 mL에서 1개째의 필터로부터 2개째의 필터로 바꿔서 접속하였다. 얻어진 여과액을, 제조예 5와 동일한 조건으로 제조되고 막 면적이 3 ㎠인 바이러스 제거막으로 3 bar 정압 여과한 바, 도 10에 나타낸 바와 같이, 조제한 25 mL 전량 여과하는 데 128분이 필요하였다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 9에 나타낸다.

(비교예 2)

실시예 2에서 조제한 용액과 동일한 용액에 대하여, 프리필터에 의한 여과를 행하지 않고, 직접 바이러스 제거막으로 3 bar 정압 여과한 바, 도 10에 나타낸 바와 같이, 3시간 걸리더라도 약 7.7 mL밖에 여과할 수 없어, 이 곡선으로부터 25 mL 전량 여과하는 데 150,000시간 이상이 필요하다고 예상되었다. 이 때 바이러스 제거막에 부하된 다량체는 1 ㎡당 3.4 g이다. 본 시험 결과를 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 9에 나타낸다.

(실시예 3)

실시예 1과 동일한 방법으로, 글로불린 종농도 30 mg/mL, 염화나트륨 농도 50 mmol/L, pH 5.3의 용액을 25 mL 조제하고, 상기 용액에 다량체를 0.15 mg 함유하도록 용액 A를 첨가하였다. 프리필터로서, 막 면적이 5.8 ㎠이고 폴리에테르술폰을 포함하는 0.2 ㎛의 구멍 직경의 막인 Supor(폴)을 준비하여, 0.2 bar 정압 여과하였다. 프리필터는 2개 준비하여, 처리액의 전량에 대하여 절반량인 12.5 mL에서 1개째의 필터로부터 2개째의 필터로 바꿔서 접속하였다. 얻어진 여과액을, 제조예 5와 동일한 조건으로 제조되고 막 면적이 3 ㎠인 바이러스 제거막으로 3 bar 정압 여과한 바, 도 11에 나타낸 바와 같이, 조제한 25 mL 전량 여과하는 데 180분이 필요하였다. 본 시험 결과를 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 9에 나타낸다.

(비교예 3)

실시예 3에서 조제한 용액과 동일한 용액에 대하여, 프리필터에 의한 여과를 행하지 않고, 직접 바이러스 제거막으로 3 bar 정압 여과한 바, 도 11에 나타낸 바와 같이, 3시간 걸리더라도 약 15.9 mL밖에 여과할 수 없어, 이 곡선으로부터 25 mL 전량 여과하는 데 1850시간 이상이 필요하다고 예상되었다. 이 때 바이러스 제거막에 부하된 다량체는 1 ㎡당 0.5 g이다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 9에 나타낸다.

(실시예 4)

실시예 1과 동일한 방법으로, 글로불린 종농도 30 mg/mL, 염화나트륨 농도 50 mmol/L, pH 5.3의 용액을 25 mL 조제하고, 상기 용액에 다량체를 0.3 mg 함유하도록 용액 A를 첨가하였다.

프리필터로서, 막 면적이 4.8 ㎠이고 나일론을 포함하는 0.2 ㎛의 구멍 직경인 막 시린지 필터 NY(코닝)를 준비하여, 0.2 bar 정압 여과하였다. 프리필터는 2개 준비하여, 처리액의 전량에 대하여 절반량인 12.5 mL에서 1개째의 필터로부터 2개째의 필터로 바꿔서 접속하였다. 얻어진 여과액을, 제조예 5와 동일한 조건으로 제조되고 막 면적이 3 ㎠인 바이러스 제거막으로 3 bar 정압 여과한 바, 도 12에 나타낸 바와 같이, 3시간 동안 17.2 mL 여과할 수 있었다. 이 곡선으로부터 25 mL 전량 여과하는 데 약 47시간 걸린다고 추측되었다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 9에 나타낸다.

(비교예 4)

실시예 4에서 조제한 용액과 동일한 용액에 대하여, 프리필터에 의한 여과를 행하지 않고, 직접 바이러스 제거막으로 3 bar 정압 여과한 바, 도 12에 나타낸 바와 같이, 3시간 걸리더라도 약 9.6 mL밖에 여과할 수 없어, 이 곡선으로부터 25 mL 전량 여과하는 데 4900시간 이상이 필요하다고 예상되었다. 이 때 바이러스 제거막에 부하된 다량체는 1 ㎡당 1 g이다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 9에 나타낸다.

(실시예 5)

프리필터로서, 막 면적이 10 ㎠이고 폴리불화비닐리덴(PVDF)을 포함하며 0.1 ㎛의 구멍 직경인 듀라포어(밀리포어)를 준비하였다. 이것을, 제조예 5와 동일한 조건으로 제조되고 막 면적이 3 ㎠인 바이러스 제거막의 상류에 연결하고, 바이러스 제거막에 가해지는 압력을 3 bar가 되도록 조정하면서 정압 여과한 바, 도 13에 나타낸 바와 같이, 조제한 25 mL 전량 여과하는 데 84분이 필요하였다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 14에 나타낸다.

(실시예 6)

실시예 5와 동일한 용액에 대하여, 프리필터로서, 막 면적이 5 ㎠이고 폴리아미드를 포함하는 0.1 ㎛의 구멍 직경인 막이 3층 적층된 VirosartMax(싸토리우스 스테딤)를 2개 직렬로 연결한 것을 준비하였다. 이것을, 제조예 5와 동일한 조건으로 제조되고 막 면적이 3 ㎠인 바이러스 제거막의 상류에 연결하고, 바이러스 제거막에 가해지는 압력을 3 bar가 되도록 조정하면서 정압 여과한 바, 도 13에 나타낸 바와 같이, 조제한 25 mL 전량 여과하는 데 340분이 필요하였다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 14에 나타낸다.

(비교예 5)

실시예 5와 동일한 용액에 대하여, 프리필터를 이용하지 않고 직접 제조예 5와 동일한 조건으로 제조되고 막 면적이 3 ㎠인 바이러스 제거막의 상류에 연결하고, 압력을 3 bar가 되도록 조정하면서 정압 여과한 바, 도 13에 나타낸 바와 같이, 6시간 걸리더라도 약 9.6 mL밖에 여과할 수 없어, 이 곡선으로부터 25 mL 전량 여과하는 데 150,000시간 이상이 필요하다고 예상되었다. 이 때 바이러스 제거막에 부하된 다량체는 1 ㎡당 3.4 g이다. 본 시험 결과를, 막 면적당 총 여과량으로 환산한 결과를 도 14에 나타낸다.

(다량체 존재 하에서의 바이러스 제거막의 바이러스 제거능)

(1) 다량체 및 바이러스 함유 단백질 용액의 조제

폴리클로날 항체(인간 IgG)(베노글로불린 IH, 베네시스사 제조)를 이용하여, 항체 농도가 30 mg/mL이 되도록 주사용수(오쯔카 제약)로 희석한 항체 용액을 300 mL 얻었다. 또한, 1 mol/L NaCl 수용액을 이용하여 염 농도를 0.1 mol/L로 조정하였다. 또한, 0.1 mol/L HCl 또는 0.1 mol/L NaOH를 이용하여 수소 이온 지수(pH)를 4.0으로 조정하고, 이것을 단백질 용액으로 하였다. 얻어진 단백질 용액이 다량체를 0.1125 mg 함유하도록 단백질 용액에 용액 A를 첨가하고, 또한 돼지 파보바이러스(PPV, 사단법인 동물용 생물학적 제제 협회)를 3.0 vol% 첨가하고 잘 교반하여, 다량체 및 바이러스 함유 단백질 용액을 얻었다.

(실시예 7)

196 kPa의 여과 압력으로, 제조한 막 면적 0.0003 ㎡의 바이러스 제거막의 전단에 프리필터로서 VirosartMax(싸토리우스 스테딤)를 연결하여, 다량체 및 바이러스 함유 단백질 용액의 데드엔드 여과를 행하였다. 전량 여과를 행한 여과액에는 바이러스가 검출되지 않았다.

(비교예 6)

실시예 1과 동일한 용액을 프리필터를 이용하지 않고 데드엔드 여과를 행한 바, 도중 60 mL 정도 여과한 지점에서 급격하게 여과 속도가 저하되어, 더 이상은 여과를 행하는 것이 어려웠기 때문에, 약 80 mL 여과 시점에서 여과를 중단하였다. 중단할 때까지 얻어진 여과액에는 바이러스가 검출되고, 바이러스 제거막이 바이러스를 완전히 제거하지 못하였다. 이 때 전량 여과하였다면, 바이러스 제거막에 부하된 다량체는 바이러스 제거막 1 ㎡당 0.375 g이다.

1: 일차측의 표면
2: 이차측의 표면
10: 바이러스 제거막

Claims

20 mg/mL 이상 100 mg/mL 이하의 농도로 단백질을 함유하는 단백질 함유액의 여과 방법으로서,
상기 단백질 함유액을, 구멍 직경이 0.08 ㎛ 내지 0.25 ㎛이며 소수성 수지를 포함하는 프리필터로 여과하는 전여과 공정과,
상기 전여과 공정 후에, 상기 단백질 함유액을 합성 고분자를 포함하는 바이러스 제거막으로 여과하는 바이러스 제거 공정을 포함하며,
상기 전여과 공정이 이루어지기 전의 상기 단백질 함유액이, 평균 직경이 100 nm 미만인 상기 단백질의 삼량체 이상의 다량체를, 상기 바이러스 제거막 1 ㎡당 0.25 g 이상 포함하고 있는 것인 여과 방법.
제1항에 있어서, 상기 프리필터가 폴리아미드, 폴리술폰계 및 불소계 수지로 이루어진 군에서 선택되는 재료를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 프리필터가 폴리에테르술폰 또는 폴리불화비닐리덴을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정 전의 단백질 함유액이, 상기 단백질의 다량체이며, 평균 직경이 100 nm 이상인 입자상물을 더 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정 전에, 상기 단백질 함유액에 대하여 투석 여과를 행하는 투석 여과 공정을 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정 전에, 상기 단백질 함유액에 대하여 한외 여과를 행하는 한외 여과 공정을 더 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 투석 여과 공정 후에, 한외 여과 공정 및 투석 여과 공정을 더 포함하지 않는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정 전에, 탄젠셜 플로우 여과 장치를 이용하여 여과를 행하는 탄젠셜 플로우 여과 공정을 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정 전에, 상기 단백질 함유액을 2시간 이상 교반하는 교반 공정을 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정과 상기 바이러스 제거 공정 사이에 다른 공정을 포함하지 않는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정 및 상기 바이러스 제거 공정이 연속하여 행해지는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프리필터가 시트형의 필터인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프리필터가 다층막을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프리필터가, 각 층에서 필터의 구멍 직경이 상이한 다층막을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프리필터로 여과된 단백질 함유액의 점도가, 상기 프리필터로 여과되기 전의 단백질 함유액의 점도보다 낮은 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 모노클로날 항체를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 제거막이 불소계 수지를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 제거막이 폴리불화비닐리덴을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 제거막에 의한 파보바이러스의 대수 제거율(LRV)이 4.0 이상인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 제거막이,
상기 프리필터로 여과된 상기 단백질 함유액이 공급되는 일차측의 표면과,
상기 바이러스 제거막을 투과한 투과액이 배출되는 이차측의 표면
을 가지며,
상기 일차측으로부터 상기 바이러스 제거막에 직경 20 nm의 금콜로이드를 함유하는 용액을 공급하여 상기 바이러스 제거막으로 상기 금콜로이드를 포착하고, 상기 바이러스 제거막의 단면에서 휘도를 측정하면, 상기 휘도 변위의 스펙트럼의 면적치의 표준편차를 상기 휘도 변위의 스펙트럼의 면적치의 평균치로 나눈 값이 0.01 이상 1.50 이하이며,
상기 바이러스 제거막의 단면에 있어서, 직경 20 nm 이상 직경 30 nm 이하의 금콜로이드가 포착되는 부위의 두께가, 습윤 상태에서 10 ㎛ 이상 30 ㎛ 이하인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액의 수소 이온 지수가 4.0 이상 8.0 이하인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액의 이온 강도가 0 mmol/L 이상 300 mmol/L 이하인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전여과 공정이 이루어지기 전의 단백질 함유액이, 당류 및 염기성 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 첨가제를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프리필터가 정치 멸균 가능한 것인 방법.