TWI729363B

TWI729363B - Neat 1(核旁斑裝配轉錄物1)作為神經退化之治療標的

Info

Publication number: TWI729363B
Application number: TW108109003A
Authority: TW
Inventors: 郭紘志; 吳逸盈
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2021-06-01
Also published as: US20190282605A1; US11357788B2; TW201940696A

Abstract

本發明提供一種減少神經退化及/或TAR DNA結合蛋白43(TAR DNA binding protein 43，TDP43)相關之聚集之方法，其包含減弱核旁斑裝配轉錄物1(Nuclear Paraspeckle Assembly Transcript 1)(NEAT1)或長非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)NEAT1之表現。亦提供用於篩檢在個體中減少神經退化及/或細胞中TDP43相關之聚集、治療或預防神經退化性病症、延遲或預防神經退化性病症發作、或降低發生神經退化性病症之風險以及判定個體是否罹患神經退化性病症或處於發生神經退化性病症之風險下之候選藥劑之方法，其包括量測生物樣本中細胞質NEAT1之存在，其中該存在指示發生神經退化性病症之風險。

Description

NEAT 1(核旁斑裝配轉錄物1)作為神經退化之治療標的

本發明大體上關於在減少神經退化方面之基因表現減弱的領域。特定言之，本發明係關於以下方法之開發：用於藉由減弱核旁斑裝配轉錄物1(Nuclear Paraspeckle Assembly Transcript 1，NEAT1)之表現來治療及/或預防神經退化性病症之方法，及用於篩檢減少神經退化及/或TDP43相關之聚集及/或治療及/或預防神經退化性病症之候選物之方法。

肌肉萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)為成人發病神經退化性病症，由大腦、腦幹及脊髓中運動神經元(motor neuron，MN)之進行性損失所引起。所提出之ALS病理機制仍為未知的，但運動神經元之微環境之改變係由蛋白質聚集、RNA加工、金屬不平衡、氧化應激、麩胺酸興奮性毒性、粒線體功能障礙、神經膠細胞功能障礙、神經發炎、細胞凋亡及片段化高基氏體引起。在過去數十年間，已集中地研究破壞性運動神經元疾病ALS以發現原因且開發治癒手段。已產生轉殖基因嚙齒動物模型用於研究疾病發病機制及開發治療藥物。儘管存在若干種可用藥物，但作用仍為有限的。因此，迫切需要解開潛在治療策略之此複雜性。

當前用於藥物開發之ALS模型化系統不足以用於藥物開發。缺少對患者運動神經元之獲取阻礙了ALS之藥物開發。人類多能幹細胞(human pluripotent stem cell，hPSC)已用於在人類發育以及疾病模型化方面之效益。因此，人類誘導性多能幹細胞(human inducible pluripotent stem cell，iPSC)將克服缺點，提供顯著醫學潛力，且增加ALS方面之知識。活體外細胞誘導之若干問題已妨礙ALS疾病模型化。在再程式化中存在一些技術挑戰。由於細胞群體可變，在研究組與細胞批次之間再現ALS疾病表型之能力不一致。為了消除變化性，譜系特異性報導體提供針對細胞譜系追蹤及下游分析之即時觀測。習知報導體已廣泛用於監測轉錄調節；然而，缺乏染色質複合物及調節元件限制轉錄機制之研究。基因組編輯經由雙股斷裂繼而同源重組來提供用於靶向活體內特異性基因座之工具。精確靶向已藉由使用由成簇規律間隔短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-Cas9介導之成對引導RNA及雙切口改進。疾病突變之基因校正已建立且挽救β-血紅素病、帕金森氏病(Parkinson's disease)及杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)中之疾病表型。在ALS模型化系統中，已校正超氧化歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)及肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma，FUS)之基因突變來鑑別用於巨大治療潛能之新穎疾病發病機制。

ALS之常見病理標誌為TAR DNA結合蛋白43(TAR DNA binding protein 43，TDP43)蛋白病變，且細胞質TDP43包涵物與細胞核TDP43之顯著損失相關聯。此蛋白病變亦發現於其他神經退化性疾病中，包括TDP43陽性額顳葉型退化(frontotemporal lobar degeneration， FTLD)及阿茲海默氏症(Alzheimer's disease，AD)(Lagier-Tourenne,C.及D.W.Cleveland,Rethinking ALS：the FUS about TDP-43.Cell,2009.136(6)：第1001-4頁)。TAR DNA結合蛋白43(TDP43；MIM*605078；43kDa；染色體1 p36.2)為在細胞核與細胞質之間梭移的核RNA結合蛋白，參與轉錄、RNA代謝及加工。TDP43之病理性作用仍為未知的；然而，已提出細胞質TDP43積聚及聚集為此組病症中細胞功能異常及死亡之潛在機制(Paez-Colasante,X.等人，Amyotrophic lateral sclerosis：mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.Nat Rev Neurol,2015.11(5)：第266-79頁)。考慮到理解TDP43之發病機制，已探索參與TDP43核細胞質輸送之路徑且其在ALS患者大腦組織中受到破壞，其中由於RanGAP1之物理相互作用而具有C9orf72六核苷酸重複序列擴增(GGGGCC)。此外，已在ALS及FTLD-TDP死後切片中偵測到TDP43之寡聚物。因此，理解TDP43相關發病機制將有益於早期偵測及藥物開發(Shimonaka,S.等人，Templated Aggregation of TAR DNA-binding Protein of 43kDa(TDP-43)by Seeding with TDP-43 Peptide Fibrils.J Biol Chem,2016.291(17)：第8896-907頁)。解開TDP43聚集已變成用於開發ALS治療性療法之主要焦點之一。最近，已建立若干無細胞系統來探索具有低複雜性結構域之RNA結合蛋白質(包括TDP43、FUS等)之聚集(Ryan,V.H.等人，Mechanistic View of hnRNPA2 Low-Complexity Domain Structure,Interactions,and Phase Separation Altered by Mutation and Arginine Methylation.Mol Cell,2018.69(3)：第465-479頁e7)。迄今為止，已在細胞系統中充分建立及確認TDP43自播(self-seeding)。抗清潔劑之聚集物及裂解之TDP43均可促進TDP43聚集/包涵、纖維化，且促進進一步細胞死亡(Shimonaka,S.等人，Templated Aggregation of TAR DNA-binding Protein of 43kDa(TDP-43)by Seeding with TDP-43 Peptide Fibrils.J Biol Chem,2016.291(17)：第8896-907頁)。然而，仍不存在用於預防TDP43聚集或錯誤定位之有效標的。

隨著下一代測序之進展，已發現長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在各種生物功能中起一定作用且可適用於疾病治療。實際上，已展示許多微小RNA(microRNA)及非編碼RNA與人類疾病相關。若干lncRNA已展示用於包括阿茲海默氏症、帕金森氏病及多發性系統萎縮症之神經退化性疾病之潛力(Lourenco,G.F.等人，Long noncoding RNAs in TDP-43 and FUS/TLS-related frontotemporal lobar degeneration(FTLD).Neurobiol Dis,2015.82：第445-54頁)。ALS/FTLD相關TDP43及FTLD相關FUS均已展示與lncRNA及微小RNA之相互作用及調節。FUS(參與ALS之另一核醣核蛋白(ribonucleoprotein，RNP))已經作為環狀RNA生物合成之調節因子研究(Errichelli,L.等人，FUS affects circular RNA expression in murine embryonic stem cell-derived motor neurons.Nat Commun,2017.8：第14741頁)。

本發明提供一種減少神經退化及/或TDP43相關之聚集之方法，其包含減弱核旁斑裝配轉錄物1(NEAT1)或LncRNA NEAT1之表現。

本發明亦提供一種選擇與神經退化及/或TDP43相關之聚集相關的所關注基因之方法，其包含提供來自具有TDP43-M337V突變之個體的iPSC，使iPSC分化成運動神經元細胞，剔除運動神經元細胞中之所關注基因，及測定運動神經元細胞中之TDP43相關之聚集，其中TDP43相關之聚集程度升高指示所關注基因可能參與神經退化。

在一個實施例中，所關注基因可利用成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關蛋白(CRISPR associated proteins，Cas)系統剔除，其中至少兩個載體用於分別將Cas酶及與核酸之基因組基因座中之靶序列雜交之RNA輸送至細胞中。

本發明提供一種篩檢減少神經退化及/或細胞中TDP43相關之聚集之候選藥劑的方法，該方法包含：(a)使細胞與候選藥物接觸，及(b)評估細胞中之NEAT1或LncRNA NEAT1之表現量，其中若細胞中之NEAT1或LncRNA NEAT1之表現量低於未處理細胞中之表現量，則該候選藥劑減少神經退化及/或TDP43相關之聚集。候選藥劑可治療或預防神經退化性病症、延遲或預防神經退化性病症發作或降低發生神經退化性病症之風險。

本發明亦提供一種在個體中治療或預防神經退化性病症、延遲或預防神經退化性病症發作或降低發生神經退化性病症之風險的方法，其包含向個體投與減弱、下調或抑制NEAT1表現之藥劑或抑制、沉默或下調LncRNA NEAT1之藥劑。

本發明亦提供一種判定個體是否罹患神經退化性病症或處於發生神經退化性病症之風險下的方法，其包含量測生物樣本中細胞質NEAT1之存在，其中存在指示發生神經退化性病症之風險。該藥劑之一個特定實施例為短核酸分子。

圖1展示用於來源於三名ALS患者之iTDP中之TDP43-M337V校正之CRISPR-Cas9雙切口方法。A，示意圖展示用於校正 TDP43-M337V之CRISPR-Cas9n。說明人類TARDBP基因座之雙切口(紅色箭頭)之示意圖。靶向位點以藍色標記且PAM以紅色標記。B，TDP43-M337V校正之桑格(Sanger sequencing)定序驗證。iTDP#1、iTDP#2及iTDP#3中之TDP43-M337V之代表性層析圖。表示為iTDP#1-C、iTDP#2-C及iTDP#3-C之TDP43的CRISPR-Cas9n校正之層析圖。C，全基因組定序(whole genome sequencing，WGS)分析顯示低gRNA脫靶效應。基於全基因組定序之同基因株中潛在的脫靶基因座修飾之概述。D，藉由免疫染色多能性標記物OCT4、NANOG、TRA1-60及SSEA4對iTDP#2及iTDP#2-C的表徵。

圖2展示TDP43-M337V之再現引起衍生自iTDP之MN的發病機制及神經元退化。A，對MN死亡之TUNEL分析。比例尺：50μm；(a)衍生自iTDP#2及iTDP#2-C之MN中TUNEL分析之代表性影像。(b)SMI32+運動神經元中TUNEL+細胞之定量。B，衍生之MN中的耗氧速率(OCR)；分別與iTDP#2-C及iTDP#3-C相比的iTDP#2及iTDP#3衍生之MN中的相對較低OCR。C，在iTDP衍生之MN中TDP43錯誤定位之ICC分析。比例尺：10μm；(a)iTDP#2及iTDP#2-C衍生之MN中的TDP43錯誤定位之代表性影像。所觀測到之TDP43錯誤定位之模式標記為N=C(細胞核=細胞質之TDP43信號)、N<C(細胞核<細胞質之TDP43信號)及N>C(細胞核>細胞質之TDP43信號)。比例尺：10μm；(b)衍生之MN中TDP43錯誤定位之相對百分比。D，iTDP衍生之MN中TDP43寡聚物之ICC分析。E，iTDP衍生之MN中之TDP43聚集物；(a)iTDP#2及iTDP#2-C衍生之MN中TDP43聚集物之代表性影像；(b)衍生之MN中TDP43聚集物之相對數目。比例尺：10μm。F，在指定時間點下TDP43病理學之 TDP43-M337V引起之進展的定量。G，在衍生之MN中在iTDP#2相對於iTDP#2-C及iTDP#3相對於iTDP#F3-C之間變化的主要細胞路徑。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖3展示CRISPR-Cas9n介導MN報導株之基因嵌入。A，MN分化及表徵；(a)來自iPSC之MN誘導之示意性程序。SB：SB431542；LDN：LDN193189；CHIR：CHIR99021；RA：視黃酸；PUR：嘌嗎啡胺，AA：抗壞血酸，NF：神經營養因子，包括BDNF、GDNF、IGF1及CNTF。BDNF(brain-derived neurotrophic factor)：腦衍生之神經營養因子，GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor)：神經膠細胞衍生之神經營養因子，IGF1(insulin-like growth factor 1)：胰島素樣生長因子1；CNTF(ciliary neurotrophic factor)：睫狀神經營養因子；(b)展示所衍生運動神經元中之神經元標記物之代表性影像；(c)iCTL1、iTDP#2、iTDP#2-C、iTDP#3、iTDP#3-C中HB9+ MN產生之能力。比例尺：50μm。B，GFP基因嵌入MNX1(HB9)報導體產生；(a)示意圖顯示用於MNX1(HB9)上GFP標記之CRISPR-Cas9n。靶向位點以藍色標記且PAM以紅色標記，以及靶向對偶基因用於產生HB9-2a-GFP融合蛋白；(b)GFP基因嵌入MN之表徵。藉由相差表徵GFP基因嵌入運動神經元及藉由免疫染色神經元標記物ISL-1、HB9及SMI32驗證之代表性影像；(c)藉由用HB9抗體免疫染色之HB9-GFP+細胞驗證；比例尺：50μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖4展示LncRNA NEAT1上調且部分位於iTDP衍生之MN的細胞質中。A，iTDP衍生之MN中LncRNA表現之整體分析；(a)在iTDP#3相對於iTDP#3-C中受影響之主要lncRNA表現之熱圖；(b)利用Q- PCR驗證lncRNA表現；(c)在來自iTDP#1相對於iTDP#1-C、iTDP#2相對於iTDP#2-C及iTDP#3相對於iTDP#3-C之衍生之MN中NEAT1之相對表現。B，iTDP衍生之MN之胞溶質中NEAT1表現之原位雜交；(a)衍生之MN中NEAT1之代表性影像；(b)MN中NEAT1+之相對強度；(c)NEAT1+ MN之百分比；(d)細胞質NEAT1+ MN之百分比；比例尺：10μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖5展示NEAT1表現減弱挽救MN退化及TDP43相關之聚集。A，利用Q-PCR驗證iTDP#3衍生之MN中之NEAT1表現減弱。B，藉由原位雜交驗證iTDP#2及iTDP#3衍生之MN中的減弱NEAT1表現。比例尺：10μm。C，TUNEL分析展示減弱NEAT1表現挽救iTDP衍生之MN之退化。比例尺：50μm；(a)衍生自iTDP#3之NEAT1表現減弱MN中TUNEL分析之代表性影像；(b)衍生自iTDP#2及iTDP#3之GFP+神經元中TUNEL+之定量。D，NEAT1表現減弱挽救iTDP#2及iTDP#3衍生之MN中的TDP43聚集物。比例尺：10μm。E，在iTDP#2及iTDP#3衍生之MN中NEAT1與TDP43+聚集物共定位。比例尺：10μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

圖6展示內源性NEAT1促進TDP43聚集及MN退化。A，示意圖展示在hESC衍生之神經元祖細胞(neuron progenitor，NPC)中CRISPR-a誘導之內源性NEAT1表現。B，NEAT1 gRNA同時轉染之NPC相對於無gRNA中之相對NEAT1表現。C，原位雜交顯示在轉染後第5天由NEAT1 gRNA上調之內源性NEAT1。比例尺：10μm。D，在NEAT1上調之細胞溶解物中，用裂解之凋亡蛋白酶3片段之免疫染色偵測神經細胞死亡。比例尺：10μm。E，神經元死亡之TUNEL分析。F，FISH及ICC 展示在NEAT1 gRNA處理之NPC中增加之TDP43寡聚物及NEAT1共定位。比例尺：10μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

圖7展示NEAT1參與TDP43相關包涵物。A，iTDP#2及iTDP#3衍生之MN中的不溶性TDP43之過度積聚。NEAT1表現減弱降低不溶性TDP43積聚量。B，NEAT1 gRNA靶向之NPC中不可溶TDP43升高。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

圖8展示NEAT1藉由與TDP43及TDP43-M337V之直接相互作用而促進不可溶性。A，NEAT1沉降分析指示與TDP43之相互作用。B，示意圖展示用於研究TDP43及TDP43-M337V之濃度依賴性不可溶性的無細胞系統。C，NEAT1藉由與TDP43或TDP43-M337V之直接相互作用而促進不可溶性。D，由藉由免疫金TEM染色顯現之NEAT1促進之不可溶TDP43及TDP-M337V之形態。箭頭指示經免疫金標記之TDP43或TDP43-M337V。比例尺為200nm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

圖9展示在iPSC中藉由RT-PCR(A及B)及在iTDP#1-C及iTDP#3-C中藉由免疫染色(C)多能標記物OCT4、NANOG、TRA1-60及SSEA4對多能基因表現之表徵。

圖10展示用於產生衍生自iCTL1及iTDP#2之HB9+ MN群體之最佳化RA及PUR濃度。

圖11A展示表徵CRISPR-Cas9n產生HB9：：GFP iPSC株。B展示PCR驗證結果。C展示桑格定序驗證結果。

圖12展示NEAT1表現減弱並不挽救TDP43寡聚。A， NEAT1表現減弱挽救iTDP#3衍生之MN中之TDP43聚集物。B，在iTDP#3衍生之MN中幾個百分比之NEAT1與TDP43+寡聚物共定位。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

雖然下文詳細論述本發明之各種實施例的製造及使用，但應瞭解，本發明提供可體現於廣泛多種特定情形中的許多適用的發明性概念。本文所論述之特定實施例僅用於說明製作及使用本發明之特定方式且不限定本發明之範疇。

為促進對本發明之理解，下文定義多個術語。本文所定義之術語具有如本發明相關領域之一般技術者通常理解之含義。諸如「一(a/an)」及「該」之術語並不意欲僅指單個實體，而是包括其中特定實例可用於說明之通用類別。本文中之術語用於描述本發明之具體實施例，但其使用不對本發明定界，除了如申請專利範圍中所概述。

如本文所使用，術語「基因」係指含有至少一個開放閱讀框架(open reading frame，ORF)的聚核苷酸，該ORF在轉錄及轉譯之後能夠編碼特定多肽或蛋白質。

如本文所使用，術語「減弱基因表現」係指降低基因表現。降低可經由基因修飾或藉由用具有與基因或mRNA轉錄物互補之序列的試劑(諸如短DNA或RNA寡核苷酸)處理而發生。

如本文所使用，術語「短核酸分子」係指能夠調節基因表現之任何核酸分子。術語「短干擾核酸(short interfering nucleic acid)」、「siNA」或「siNA分子」、「短干擾核酸分子」或「短干擾寡核苷酸分子」係指能夠抑制、下調或減弱基因表現的任何核酸分子。通常，短干擾核酸分子主要由RNA構成，且可稱為「短干擾RNA」或「siRNA」。然而，siNA可包括除RNA外之核苷酸，諸如在DNAi(interfering DNA，干擾DNA)或其他經修飾鹼基中。因此，如本文所使用之術語「RNA」意謂包含至少一個核糖核苷酸殘基之分子，且包括雙股RNA、單股RNA、經分離RNA、部分純化、純或合成RNA、以重組方式產生之RNA以及經改變RNA諸如類似物、或天然產生之RNA之類似物。

如本文所使用，術語「雜交」係指核酸之股經由鹼基配對與互補股結合之任何過程。

如本文所使用，術語「處於發生……之風險下」意謂個體傾向於發生病狀或疾病。在某些實施例中，處於發生病狀或疾病風險下之個體展現該病狀或疾病之一或多種症狀，但並未展現足以診斷患有該病狀或疾病之症狀數目。在某些實施例中，處於發生病狀或疾病風險下之個體展現該病狀或疾病之一或多種症狀，但在輕於診斷患有該病狀或疾病所需的程度上。

如本文所使用，術語「預防……發作」意謂在處於發生疾病或病狀之風險下的個體中預防該病狀或疾病發生。在某些實施例中，處於發生疾病或病狀風險下之個體接受與已患有該疾病或病狀之個體所接受之治療類似的治療。

如本文所使用，術語「延遲……發作」意謂為處於發生疾病或病狀之風險下的個體延遲該病狀或疾病發生。在某些實施例中，處於發生疾病或病狀風險下之個體接受與已患有該疾病或病狀之個體所接受之治療類似的治療。

如本文所使用，術語「治療(treat/treating/treatment)」及其他語法同等物包括緩解、抑制或減少症狀，降低或抑制疾病或病狀症狀之嚴重度，減少疾病或病狀症狀之發生率，預防性治療疾病或病狀症狀，減少或抑制疾病或病狀症狀之復發，預防、延遲疾病或病狀症狀之發作，延遲疾病或病狀症狀之復發，使疾病或病狀症狀減退或改善，改善症狀之根本代謝病因，抑制疾病或病狀。該等術語進一步包括實現治療效益。治療效益意指根除或改善所治療之根本病症，及/或根除或改善與根本病症相關之一或多種生理學症狀，使得在患者中觀測到改善。

如本文所使用，術語「預防(prevent/preventing/prevention)」及其他語法同等物包括預防額外症狀，預防症狀之根本代謝病因，抑制疾病或病狀，例如遏制疾病或病狀之發展，且意欲包括預防。該等術語進一步包括獲得預防效益。對於預防效益，視情況向處於發生特定疾病之風險下的患者、向報告出現疾病之一或多種生理學症狀的患者、或向處於疾病復發風險下的患者投與組合物。

如本文所使用，術語「有效量」或「治療有效量」係指足以達成所需結果的至少一種藥劑投藥量，例如在一定程度上減輕所治療之疾病或病狀之一或多種症狀。在某些情況下，該結果為疾病之病徵、症狀或病因之減輕及/或緩解，或生物系統之任何其他所需改變。

如本文所使用，「個體」係指人類或非人類動物。

如本文所使用，術語「候選藥劑」係指任何有機或無機分子，包括經修飾及未經修飾之核酸，諸如反義核酸；RNA干擾劑，諸如siRNA或短髮夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)；肽；肽模擬物；受體；配位體；藥物；前藥；代謝物類似物；及抗體。在一個態樣中，本發明提供一種減少神經退化及/或TDP43相關聚集之方法，其包含減弱 NEAT1或LncRNA NEAT1之表現。

偶聯iPSC及CRISPR提供一種揭開ALS之複雜疾病引發機制以開發潛在的治療策略之有用平台。本發明組合再程式化、iPSC分化方法及基因組工程改造以探索由TDP43-M337V錯義突變調節之lncRNA在人類ALS運動神經元中之作用。本發明已再現ALS表型，包括TDP43病理學之進展、MN死亡及粒線體功能障礙。本發明亦定義在TDP43蛋白病變中之核旁斑裝配轉錄物1(NEAT1)之新穎機制，其促成運動神經元功能障礙且經歷退化。值得注意的是，本發明發現專用於NEAT1轉錄之TDP43錯義突變及在細胞質中後續錯誤定位以進一步與TDP43聚集相關。在細胞及無細胞系統中，細胞質NEAT1充當用於與TDP43直接相互作用之架構且引起進一步聚集。最後，本發明揭示NEAT1在ALS之TDP43蛋白病變中之作用且提出對用於ALS中之治療標的之TDP43聚集之潛在預防。

本發明定義NEAT1作為用於促進TDP43/TDP43-M337V不可溶性及聚集之架構的新穎作用。NEAT1之操縱提供NEAT1以TDP43聚集依賴性方式促進神經死亡之證據。儘管NEAT1與TDP43聚集相關，但此旁斑基本RNA亦可由於ALS MN中之細胞質NEAT1之異常存在而提供在TDP43-M337V突變ALS中之另一作用。TDP43-M337V錯義突變為患者iPSC衍生之MN中之細胞質TDP43聚集之原因，且NEAT1參與其中作為蛋白質募集之架構。

本發明已展示lncRNA NEAT1起參與細胞質TDP43聚集/包涵物之重要作用。作為架構，NEAT1捕獲TDP43/TDP43-M337V以增加不可溶性且進一步誘發病理性聚集。減少過量NEAT1不僅可挽救細胞質 TDP43聚集，且亦可挽救運動神經元退化。增強正常神經元細胞中之內源性NEAT1表現，藉由兩個細胞讀數再現及驗證細胞死亡。因此，NEAT1可起到治療神經退化性病症(諸如ALS之運動神經元退化)之治療目標作用。因此，在一個態樣中，本發明提供一種減少神經退化及/或TDP43相關之聚集之方法，其包含減弱核旁斑裝配轉錄物1(NEAT1)或LncRNA NEAT1之表現。

在另一態樣中，本發明提供一種選擇與神經退化及/或TDP43相關之聚集相關之所關注基因的方法，其包含提供來自具有TDP43-M337V突變之個體的iPSC，使iPSC分化成運動神經元細胞，剔除運動神經元細胞中之所關注基因，及測定運動神經元細胞中之TDP43相關之聚集，其中TDP43相關之聚集程度升高指示所關注基因可能參與神經退化。

根據本發明，偶聯iPSC及CRISPR提供一種揭開ALS之複雜疾病引發機制以開發潛在的治療策略之有用平台。本發明組合再程式化、iPSC分化方法及基因組工程改造以探索由TDP43-M337V錯義突變調節之基因在人類ALS運動神經元中之作用。因此，與神經退化及/或TDP43相關之聚集相關之所關注基因可利用本發明之方法選擇。iPSC係自具有TDP43-M337V突變之個體獲得。將iPSC中之所關注基因剔除。使iPSC分化成運動神經元細胞，且隨後量測TDP43相關之聚集以判定所關注基因是否參與神經退化。

在一些實施例中，所關注基因可利用成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關蛋白(Cas)系統剔除，其中至少兩個載體用於分別將Cas酶及與核酸之基因組基因座中之靶序列雜交之RNA輸送至細胞中。Cas酶隨後由與基因組基因座中之靶序列雜交之RNA募集以裂解經表現修飾之基因產物。在一些實施例中，Cas酶為II型CRISPR系統酶。在一些實施例中，II型CRISPR系統酶為Cas9酶。在一些實施例中，Cas9酶為肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)或嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)Cas9，且可包括自此等生物體衍生之經突變Cas9。酶可為Cas9同系物或直系同源物。在一些實施例中，CRISPR酶經密碼子最佳化以用於在真核細胞中表現。

在另一態樣中，本發明提供一種用於篩檢減少神經退化及/或細胞中TDP43相關之聚集之候選藥劑的方法，該方法包含：(a)使細胞與候選藥物接觸，及(b)評估細胞中NEAT1或LncRNA NEAT1之表現量，其中若細胞中NEAT1或LncRNA NEAT1之表現量低於未處理細胞中之表現量，則該候選藥劑減少神經退化及/或TDP43相關之聚集。在一個實施例中，候選藥劑可治療或預防神經退化性病症、延遲或預防神經退化性病症發作或降低發生神經退化性病症之風險。

多種不同醫藥/治療劑可與本文所描述之方法結合使用且包括(但不限於)小分子、蛋白質、抗體、肽及核酸。一般而言，適用於本文所描述之方法之藥劑將下調NEAT1或LncRNA NEAT1。

在另一態樣中，本發明提供在個體中治療或預防神經退化性病症、延遲或預防神經退化性病症發作或降低發生神經退化性病症之風險的方法，其包含向個體投與減弱、下調或抑制NEAT1表現之藥劑或抑制、沉默或下調LncRNA NEAT1之藥劑。

在另一態樣中，本發明提供一種判定個體是否罹患神經退化性病症或處於發生神經退化性病症之風險下的方法，其包含量測生物樣本中細胞質NEAT1之存在，其中存在指示發生神經退化性病症之風險。

在一個實施例中，藥劑為短核酸分子。短核酸分子之實例包括(但不限於)短干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短髮夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)及干擾DNA(interfering DNA，DNAi)分子。在某一實施例中，短核酸分子為siRNA。本發明siNA可在存在或不存在其他因子之情況下使用。siNA分子亦可藉由引入2'-O-甲氧基修飾而經化學修飾且因此使得對核酸酶具有抗性。在一些實施例中，短核酸分子具有核苷酸序列SEQ ID NO：1或2。

CCGGGTGAGAAGTTGCTTAGAAACTTTCCCTCGAGGGAAAGTTTCTAAGCAACTTCTCAC TTTTT(SEQ ID NO：1)

CCGGCTGGTATGTTGCTCTGTATGGTAAGCTCGAGCTTACCATACAGAGCAACATACCAGTTTTT(SEQ ID NO：2)

GTGAGAAGTTGCTTAGAAACTTTCC(SEQ ID NO：34)

CTGGTATGTTGCTCTGTATGGTAAG(SEQ ID NO：35)

因此，本發明提供一種短核酸分子，其包含由SEQ ID NO：1、2、34或35或其衍生物組成之核苷酸序列。短核酸分子可減弱NEAT1或LncRNA NEAT1表現，藉此在個體中治療或預防神經退化性病症、延遲或預防神經退化性病症發作或降低發生神經退化性病症之風險。

在一些實施例中，神經退化狀態可包括(但不限於)帕金森氏症且該帕金森氏症包括進行性核上麻痺；阿茲海默氏症；運動神經元疾病(諸如肌肉萎縮性側索硬化(ALS)及脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophies，SMA))；路易體性癡呆(Lewy body dementia)；特發性震顫；多發性硬化症；運動困難；張力障礙；共濟失調；亨廷頓氏病(Huntington's disease)；多發性系統萎縮症；肌陣攣；進行性核上麻痺；雷特症候群(Rhett syndrome)；痙攣；妥瑞症候群(Tourette syndrome)；伯耳氏癱(Bell's palsy)；眼部疱疹；耳疱疹；由於慢性移植物抗宿主疾病而引起的神經退化；及由於病毒及醫原性原因引起的神經退化；或由NEAT1或LncRNA NEAT1上調介導之任何其他神經退化性疾病。

運動神經元疾病(motor neuron disease，MND)為選擇性影響運動神經元(控制身體之隨意肌之細胞)之若干神經退化性病症中之任一者。在一些實施例中，本發明中所描述之運動神經元退化疾病包括肌肉萎縮性側索硬化(ALS)及脊髓性肌萎縮(SMA)。在一些實施例中，ALS為家族性ALS或偶發性ALS。

在另一實施例中，本發明之藥劑可與用於向細胞、組織或生物體投與的非無菌或無菌載劑(諸如適合於向個體投與之醫藥載劑)組合使用。此類組合物包含例如本發明之培養基添加劑或治療有效量之重組病毒及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。此類載劑可包括(但不限於)生理鹽水、緩衝生理鹽水、右旋糖、水、甘油及其組合。調配物應適合投藥模式。

本發明之藥劑可單獨或與其他化合物(諸如額外治療化合物)結合使用。

醫藥組合物可以任何有效、適宜方式投與，包括例如藉由血管內(i.v.)、肌肉內(i.m.)、鼻內(i.n.)、皮下(s.c.)、經口、經直腸或經陰道內傳遞途徑投與，或藉由可將重組病毒/組合物傳遞至組織之任何方式(例如針或導管)投與。或者，可能需要局部投與以插入神經細胞中。

無需進一步詳細描述，咸信熟習此項技術者可基於本文中之揭示內容最大程度地利用本發明。因此，以下特定實例應理解為僅為描述性的，且不以任何方式限制本發明之其餘部分。

實例

材料及方法

細胞培養：將小鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)及293T細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)、1×非必需胺基酸(non-essential amino acid，NEAA，Invitrogen)、2mM L-麩醯胺酸(Invitrogen)及1×青黴素/鏈黴素(Invitrogen)之DMEM中培養。人類iPSC在DMEM/F12培養基加20% Knockout血清替代物(Invitrogen,Carlsbad,CA)及4-10ng/ml bFGF(Sigma-Aldrich)中在MEF飼養層(2×10⁴個細胞/cm²)上培養。人類體細胞在類似於上文所述之MEF培養基之培養基中培養。對於MEF及BF兩者，低繼代數(小於5次)細胞用於iPSC再程式化。

患者特異性iPSC衍生及表徵：對於此研究，吾人經由皮膚活組織檢查法使用三名ALS患者之皮膚纖維母細胞，一名男性及兩名女性。其中三人診斷為家族性ALS(fALS)，具有TDP43-M337V突變。患者之iPSC衍生藉由先前所描述之人類OCT4、SOX2、KLF4及MYC之過度表現進行。將ESC樣群落分離並表徵，藉由偵測OCT4、SOX2、KLF4及MYC之內源性對應物及用包括OCT4、NANOG、Tral-60及SSEA4之多能性標記物進行免疫染色來進行。衍生自個體iTDP#C、iTDP#D及iTDP#F之iPSC命名為iTDP#1、iTDP#2及iTDP#3。下表1展示患者概況之詳情。

表1：此研究中之ALS患者及對照病例之概況

^a OSKM：OCT4(O)、SOX2(S)、KLF4(K)及C-MYC(M)之轉錄因子。

^b TDP43：TAR DMA結合蛋白(TARDBP)

MN分化：在誘導前一天，iPSC用解離酶(dispase)(1mg/ml)解離且塗鋪於具有hESC培養基之MEF塗鋪之培養皿上。運動神經元基本培養基(motor neuron basal medium，MNBM)含有0.5×DMEM/F12、0.5×神經基本培養基、0.5×N2補充劑、0.5×B27補充劑、1×NEAA及1×glutaMax。在前6天中，用供應有SB431542(2μM)、DMH1(2μM)及CHIR99021(3μM)之MNBM處理細胞。將細胞繼代且轉移至基質膠(matrigel)塗佈之培養皿中，額外供應視黃酸(1μM)及嘌嗎啡胺(purmorphamine，PUR)(1μM)再持續6天。將神經叢簇懸浮培養，且用供應有視黃酸(1μM)及PUR(1μM)之MNSM再處理6天。自第18天起，運動神經元成熟用化合物E(Compound E，0.1μM)、RA(0.1μM)、PUR(0.5μM)、抗壞血酸(400ng/ml)、cAMP(1μM)及10ng/ml神經營養因子(包括CNTF、BDNF、GDNF及IGF)處理。

使用用於HB9報導體及基因校正之雙切口CRISPR/Cas9介導之同源重組靶向iPSC：在目標區域中基於CRISPR設計工具(http：//tools.genomeenginering.org)設計成對引導RNA。對於 TDP43M337V(chr1.11082443)校正，染色體1處之成對引導RNA之序列如下：5'-AACTGCTCTGTAGTGCTGCC-3'(SEQ ID NO：3)及5'-CAGAACCAGTCAGGCCCATCGGG-3'(SEQ ID NO：4)。Cas9切口酶編碼質體為購自Addgene 42335之pX335-U6-嵌合_BB-CBh-hSpCas9n-D10A(pX335)。對於HB9報導體，分析人類MN及胰臟同源盒1(MNX1；同源盒蛋白質HB9)之編碼區，且選擇具有最高特異性及最低脫靶效應之成對引導RNA。染色體7處之成對引導RNA之序列如下：5'-ACGCTGGCGCCGTTGCTGTAGGG-3'(SEQ ID NO：5)及5'-AGGACGACTCGCCGCCCCCGCGG-3'(SEQ ID NO：6)。對於TDP43-M337V(chr1.11082475)校正，利用自主選擇卡匣、GFP及新黴素編碼序列產生野生型TDP43，該等編碼序列由人類延長因子-1 α驅動。對於HB9報導體(chr7：156797547-156802129)，在HB9編碼區之C端處整合2A連接子及GFP編碼序列。藉由自主選擇卡匣、新黴素編碼序列(由人類延長因子1 α驅動)來進行藥物選擇。將基因嵌入卡匣在具有1kb側接同源臂之Cas9雙切口產生之突出物處插入基因座。

NEAT1表現減弱：對於病毒系統中之shNEAT1表現載體，合成特異性靶向NEAT1序列之寡核苷酸(Genedragon)，根據由RNAi core(Academia Sinica,Taiwan)提供之標準黏接方案選殖至pLKO載體中，且藉由定序驗證。靶向序列列於下表2中。藉由用脂染胺及/或CaCl₂短暫轉染在HEK293T細胞中產生攜帶shNEAT1之慢病毒粒子。所誘導之運動神經元經慢病毒感染，且隨後在神經元培養基中培養3天用於進一步實驗。

在轉染前24小時，在Rho激酶(ROCK)抑制劑(Y27632)(Calbiochem)中培養iPSC。如基於脂染胺3000(Life Technology)之製造方案，用1.5μg gRNA及同源基因引導修復(homology-directed repair，HDR)模板共轉染細胞。在轉染後2天處理新黴素，且在10天之後分離細胞群落。為驗證編輯，進行PCR及桑格定序(Sanger sequencing)。全基因組定序分析揭露gRNA對iTDP中TDP43-M337V(chr1.11082475)校正之高特異性。

量測完整細胞呼吸：使用Seahorse XF24細胞外通量分析儀(Seahorse Bioscience,North Billerica,MA,USA)基於製造商之方案量測完整細胞呼吸。以40,000個細胞/孔之密度將MN塗鋪在經基質膠(BD Biosciences)塗佈之XF24組織培養盤上。在基本條件下量測耗氧速率(Oxygen consumption rates，OCR)以評估最大氧化能力。

TUNEL分析：將MN解離且接種於經基質膠塗佈之蓋玻片上用於TUNEL分析，藉由使用DeadEnd^TM螢光TUNEL系統套組或DeadEnd^TM比色TUNEL系統(Promega,Wisconsin,USA)進行。細胞凋亡DNA片段在3'末端經由重組末端脫氧核苷酸轉移酶(recombinant Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，rTdT)用以催化方式併入之螢光素-12-dUTP可視化。

順序免疫螢光及RNA螢光原位雜交：針對人類NEAT使用標記有Quasar 570染料(Biosearch technologies,Petaluma,CA,USA)之探針進行FISH分析。基於製造商方案依序進行順序免疫螢光及FISH。簡言之，細胞用4%多聚甲醛固定10分鐘，在0.1% Triton-X100中通透化10分鐘，且依序與初級及二級抗體一起培育。再進行固定10分鐘，隨後在37℃下，用125nM Quasar 570結合之NEAT1探針進行RNA螢光原位雜交。

NEAT1沉降分析(pulldown assay)：如先前所描述產生NEAT1構築體。活體外轉錄用生物素標記且基於TranscriptAid T7高產率轉錄套組(ThermoFisher)之說明書進行。純化之轉錄物準備好用於沉降。將MN分化且在第27天至第28天用N-Mer哺乳動物蛋白質提取試劑(ThermoFisher)溶解。依據Pierce^TM磁性RNA-蛋白質沉降套組(ThermoFisher)之說明書，使用200微克細胞溶解物用於沉降。產物準備進行免疫墨點法。

免疫螢光：為了免疫染色iPSC運動神經元，使細胞在經基質膠塗佈之蓋玻片上生長，且進行以下步驟：在4% PFA中固定，在0.2% Triton X-100中通透化且在2% BSA中阻斷。將初級抗體在4℃下培育隔夜(TDP43及磷酸(409/410)-TDP43，Proteintech 10782-2-AP及22309-1-ap；TUJ1，COVACE PRB-435p；MAP2，Chemicon，AB5622；ChAT chemicon，AB144p；SMI32 COVANCE，SMI-32p；GFP，abcam ab13970及裂解之凋亡蛋白酶-3，Cell signaling 9661)。人類ESC及iPSC在蓋玻片上培養，且藉由與4%多聚甲醛一起在室溫下培育20分鐘進行固定。經固定細胞接著用PBS洗滌且在室溫下使用非離子清潔劑(0.1% Triton X-100及0.2% Tween-20)在PBS中通透化40分鐘。經通透化細胞藉由與2%山羊血清(Invitrogen)一起培育1小時進行阻斷，用含有0.01% Tween-20(PBST)之PBS洗滌，且與初級抗體一起培育。所用初級抗體包括抗PAX6(Abcam；Ab5790)、抗NANOG(Abcam；Ab21624)、抗OCT4(Millipore；MAB4401)(Santa Cruz，sc-9081)、抗TRA-1-60(Chemicon；MAB4360)；抗SSEA4(Millipore，MAB43040)。細胞接著用PBST洗滌且與已與適當螢光結合之二級抗體一起培育。使用Vectashield H-1200封固培養基(Vector Laboratories)封固經染色樣本，且使用螢光顯微鏡(Leica)捕捉影像。使用metamorph以恆定強度臨限值處理及計算陽性信號數。

不可溶蛋白質部分：在第30天收集分化之MN，且用提供蛋白酶抑制劑之M-PER哺乳動物蛋白質提取試劑(Thermo Fisher)溶解。

混合物(Sigma-Aldrich)。在用Bioruptor(開：30秒，關：30秒，10次)(diagenode)音波處理之後，樣本在4℃下以16,000×g離心10分鐘。將集結粒再懸浮於2×樣本緩衝液中且用Bioruptor(開：30秒，關：30秒，30次)音波處理，且保存不溶性部分。在轉染之後第6天如上處理CRISPRa誘導之NPC。

神經分化及CRISPRa：使用1mg/ml解離酶(ThermoFisher)解離人類ESC H9(WiCell,Madison,WI)，且在hES培養基(杜爾貝克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)/F12、20% KnockOut血清替代物(knockout serum replacement)、1%非必需胺基酸、2mM L-麩醯胺酸、100mM 2-巰基乙醇)中形成胚狀體(EB)持續4天。在N2培養基[DMEM/F12、N2補充劑、1%非必需胺基酸、2mM L-麩醯胺酸及20ng/ml鹼性纖維母細胞生長因子(均購自Invitrogen)]中再誘導神經分化持續2天。將神經球轉移至新的經組織-培養物-處理之培養皿中再持續8天。接著，神經祖細胞(NPC)用 TrypLE(Invitrogen)解離且保持於具有運動神經元基本培養基(MNBM)之基質膠塗佈之培養皿中以供進一步使用。

CRISPRa(dCas9活化)係基於與效應子-VP64-P65-Rta(Sp-dCas9-VPR)(Addgene 63798)融合之dCas9。基於CRISPR設計工具(http：//tools.genomeenginering.org)，在NEAT1轉錄起始位點上游，設計十一個gRNA。NEAT1 gRNA之序列展示於表3中。使來自px335之Cas9切口酶缺失以產生用於gRNA構築體之px335-U6。對於在NPC中之NEAT1活化，對於1×10⁶使用2.5μg Sp-dCas9-VPR及0.5μg各gRNA。在轉染後第3天收集細胞。用TRizol(Invitrogen)提取總RNA以用於NEAT1上調之qPCR分析。用於NEAT1表現之qPCR引子對圍繞NEAT1上每3kb設計在且列於表4中。

用於蛋白聚集之無細胞系統：將Flag-TDP43插入pIVEX2.3[36]上。藉由突變誘發(KAPA HiFi，KAPABIOSYSTEM)在flag-TDP43上在1006A>G處修飾flag-TDP43-M337V構築體。對於flag-TDP43及flag-TDP43-M337V在真核無細胞系統中表現，質體在攪拌下在30℃下應用於兔網狀球溶解物活體外轉錄/轉譯持續2小時(TNT T7快速偶聯轉錄/轉譯系統，Promega)。再用22小時進行TDP43及TDP43-M337V之自聚集。人類NEAT1構築體在pcDNA3.1主鏈中產生且經純化(TranscriptAid T7高產率轉錄套組，Thermo Fisher Scientific)。對於NEAT1促進蛋白質聚集，在flag-TDP43及flag-TDP43-M337V表現後在30℃下再應用經純化RNA持續22小時。混合物以16,000×g離心20分鐘以分離可溶性(上清液，標示為S)及不可溶部分(集結粒，標示為P)，以便用抗FLAG M2(F3165，Sigma)進行西方墨點法。藉由方程式S/(S+P)獲得不可溶性。

TEM免疫金染色：將來自無細胞混合物之集結粒再懸浮且用去離子水稀釋至10倍體積以供隨後使用。將新鮮等分試樣10μL各樣本封固於輝光充電的碳塗佈之銅網格上持續3分鐘且用精細擦拭片乾燥。隨後，將網格浸漬於含有抗FLAG M2單株抗體(1：5000)(Sigma)之溶液中持續一小時。為了標記12-nm-免疫金-連接之抗體(1：20)(abcam)，將網格在石蠟膜上展示一小時。在用去離子水洗滌之後，用2%乙酸鈾醯染色網格30秒且準備成像。使用在120kV下操作之FEI Tecnai G2 TF20 TWIN電子顯微鏡記錄TEM影像。

實例1 來源於三名ALS患者之iPSC中之TDP43-M337V校正

吾人已收集及鑑別來自三名在M337V處攜帶TDP43異型接合突變之家族性ALS患者(表示為iTDP#C、iTDP#D及iTDP#F)之皮膚纖維母細胞。iPSC係藉由將四個轉錄因子(OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC)轉導至來源於個別患者之皮膚纖維母細胞中進行衍生且表示為iTDP#1、iTDP#2及iTDP#3。患者概況描述於表1中。多能性之驗證首先藉由偵測包括OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC之內源性多能轉錄物進行。為了判定ALS表型是否由TDP43-M337V引起，CRISPR-Cas9雙切口方法用於校正SNP對偶基因上之1006G>A。圖1A中展示成對引導RNA(gRNA)之靶向位點。考慮到gRNA脫靶效應及靶向效率，將Cas9切口酶及同源重組與選擇標記物一起調適。已進行桑格定序以用於驗證個別iTDP及其基於親本iTDP之校正株(表示為iTDP#1-C及iTDP#2-C及iTDP#3-C)中之TDP43-M337V突變(圖1B)。藉由用於改進HDR的額外處理(包括RS-1及SCR-7)，吾人校正iTDP之效率高達40.3%(表5)。藉由全基因組定序，吾人觀察到比較各iTDP與參考基因組序列，在gRNA-A及B之381個潛在脫靶位點當中高達157個SNP/INDEL位置。在吾人之方法中，在iTDP#1相對於iTDP#1-C、iTDP#2相對於iTDP#2-C及iTDP#3相對於iTDP#3-C之間將SNP/INDEL消除至小於2個(圖1C)。使用多能標記物藉由細胞形態及包括OCT4、NANOG、Tra1-60及SSEA4之免疫螢光染色表徵iTDP#1-C及iTDP#2-C及iTDP#3-C之次純系(圖1D及圖9)。

在CRISPR-Cas9雙切口及iPSC技術兩者之發展中，吾人產生三對iPSC以探索由TDP43-M337V異型接合突變引起之家族性ALS。此方法提供一組iPSC用於未來在最小基因變化下研究TDP43-M337V引起之ALS發病機制。吾人亦成功地改進CRISPR-Cas9對iPSC之效率以及用於改進HDR之藥物選擇及小分子。

*SCR7，(5,6-雙((E)-苯亞甲基胺基)-2-硫酮基-2,3-二氫嘧啶-4(1H)-酮)以接合酶IV依賴性方式抑制NHEJ

*RS-1，(3-((苯甲基胺基)磺醯基)-4-溴-N-(4-溴苯基)苯甲醯胺)，經由刺激HDR複合物中RADS1來增強HDR

實例2 在iTDP衍生之運動神經元中再現TDP43-M337V引起之TDP43病理學及神經元退化

基於所報導之方案在小調整下進行運動神經元分化(圖 3A(a))。自第12天起，藉由將視黃酸(RA)及嘌嗎啡胺(SHH信號傳導促效劑)自0.5μM增加至1μM來升高大量MN(圖10)。在圖3A(b)中，藉由包括MAP2、TUJ1、ISL-1、HB9、SMI32及ChAT之免疫染色進行MN驗證。藉由比較每一對衍生之MN之間的計數之細胞數目，產生HB9⁺ MN之能力不受TDP43-M337V影響(圖3A(c))。

在家族性ALS患者中報導TDP43中病原性突變。ALS中之定義之病理學包括細胞凋亡、粒線體功能障礙及TDP43錯誤定位/寡聚/聚集。為測定TDP43-M337V在吾人培養條件下是否表現ALS表型，吾人首先研究致死性MN退化。在活體外MN誘導之第25天，針對退化性MN進行TUNEL分析。在SMI32⁺ MN中，TUNEL⁺細胞在iTDP#2及iTDP#3中分別為約15%及17%。在iTDP#2-C及iTDP#3-C中，TUNEL⁺細胞分別減少至8%及7.3%(圖2A)。對於粒線體功能，TDP43-M337V亦促進分別相對於iTDP#2-C及iTDP#3-C的iTDP#2及iTDP#3中耗氧速率降低。吾人之資料表明TDP43-M337V作為降低MN存活率之原因，且TDP43-M337V之異型接合突變顯著驅使MN走向粒線體功能障礙及細胞死亡。

TDP43錯誤定位/寡聚/聚集(ALS之標誌)已報導為ALS死後組織中之抗清潔劑及細胞質前包涵物。在額顳葉型退化-TDP死後組織中，偵測到TDP43寡聚物。在圖2C中，TDP43之亞細胞分佈藉由計數在第28天在SMI-32⁺神經元中含有細胞質TDP43信號之相對細胞數而揭示TDP43-M337V導致TDP43錯誤定位。作為圖2C(a)中之代表性影像，基於來自一個MN之細胞核及細胞質中之相對TDP43強度，在吾人之系統中觀測到三個類型之TDP43錯誤定位。然而，細胞核TDP43表現為衍生自包括iTDP#1-C、iTDP#2-C及iTDP#3-C之經校正iPSC之MN中的TDP43分佈之主力軍。在圖2D中，在iTDP#2及iTDP#3中亦已鑑別出細胞質球形TDP43寡聚物，且相對於iTDP#2-C及iTDP#3-C升高。有趣的是，TDP43寡聚物主要位於iTDP#2及iTDP#3衍生之MN之神經元胞體中。在吾人系統中亦藉由用磷光體(409/410)-TDP43免疫染色觀測到異常TDP43包涵物(圖2E)。相對於iTDP#2-C及iTDP#3-C，在衍生自iTDP#2及iTDP#3之MN中鑑別出增加的包涵物數目。包涵物分佈於神經元胞體、軸突及遠端軸突中。為了鑑別TDP43蛋白病變之進展，吾人量測以上觀測且在MN誘導之不同時間點觀測到之TDP43事件。在第28天，相對於iTDP#3-C衍生之MN，在iTDP#3衍生之MN中，TDP43錯誤定位及寡聚物顯著增加。磷光體(409/410)-TDP43在第34天顯著增加。

如吾人及他人已描述，iPSC衍生之運動神經元之純度可變。為了更好地理解MN特異性疾病機制，CRISPR-Cas9已成功地應用於產生由內源性轉錄區域驅動之HB9報導體(圖3B(a))。吾人藉由Cas9雙切口靶向染色體7處之HB9 C端編碼區，產生5'突出物。藉由引入具有自發選擇卡匣之帶有2A-GFP之供體質體，HDR同時出現以便精確插入。藉由PCR及之後的桑格定序驗證精確插入(圖11)。精確插入及報導MN之效率高達40%(表4)。圖3B(b,c)指示HB9：：GFP⁺細胞亦表現MN標記物，藉由用MN標記物ISL-1、HB9及SMI-32免疫染色驗證。定量地，高於60%之HB9⁺細胞在GFP⁺細胞中表現。吾人之GFP標記之HB9細胞在活體外分化期間精確報導MN產生。因此，進行FACS，以便藉由可視化GFP分離HB9⁺ MN，且將其應用於微陣列分析以便探索HB9⁺ MN特異性機制。進行轉錄陣列之整體分析，且其他ALS相關細胞路徑亦在吾人平台中重現，包括RNA代謝、RNA/蛋白質輸送及神經纖毛相關路徑，吾人在此研究中不探索該等路徑(圖2F)。

綜合而言，吾人在吾人平台中已再現ALS表型作用。儘管吾人此時無法揭示其他原因，但MN退化開始係歸因於TDP43-M337V異型接合突變。重要的是，TDP43錯誤定位、寡聚及聚集顯著增加且在iTDP衍生之MN中觀測到。單一蛋白質改變差異揭示於TDP43-M337V中，其中突變體在C端低複雜性結構域上。吾人之模型提供用於研究由TDP43-M337V引起之下游機制的適當平台及開發ALS藥物之可能性。

實例3 內源性NEAT1增強細胞質TDP43聚集及運動神經元死亡

TDP43已知為RNA結合蛋白，參與RNA處理、代謝等。在來自經純化HB9⁺ MN之lncRNA表現之整體微陣列分析中，在iTDP#3與iTDP#3-C之間鑑別出某些lncRNA中之畸變。如圖4A中所見，在iTDP#3衍生之MN中鑑別出若干相異lncRNA。藉由定量RT-PCR驗證，吾人已鑑別出，NEAT1之轉錄物在三種iTDP中上調。進行RNA原位雜交以驗證SMI32⁺ MN中之NEAT1表現模式。在分別與iTDP#2-C及iTDP#3-C相比之iTDP#2及iTDP#3中，觀測到NEAT1之相對較高強度。在具有NEAT1之細胞之比例中觀測到類似結果。有趣的是，亦在衍生自iTDP#1、iTDP#2及iTDP#3之MN中觀測到細胞質NEAT1；然而，在基因校正之後大部分NEAT1在細胞核中(圖4B(a))。

為獲得對ALS發病機制中NEAT1之進一步理解，引入基於慢病毒之shRNA以減弱iTDP#2及iTDP#3衍生之MN中之NEAT1表現。圖5A及圖5B指示轉錄物中NEAT1表現減弱效率及細胞比例(SMI32⁺)。如圖5C中所示，在衍生自iTDP#2及iTDP#3之NEAT1表現減弱MN中MN退化之進展延遲。iTDP#2-shNEAT1及iTDP#2-C之死亡率類似。藉由計數減弱基因表現之MN中TUNEL⁺之細胞數目，亦在iTDP#3衍生之MN中觀測到來自NEAT1表現減弱之相同挽救能力。為探索NEAT1相關之細胞死亡是否參與TDP43病理學，探索iTDP衍生之MN中之shNEAT1。如文獻中所示，ALS中之細胞質TDP43聚集及包涵增加(Brettschneider,J.等人，Stages of pTDP-43 pathology in amyotrophic lateral sclerosis.Ann Neurol,2013.74(1)：第20-38頁)。在圖2A(a)、A(b)、B、C(a)、C(b)、D(a)、D(b)、E(a)、E(b)、F及G中，吾人亦在衍生自iTDP#2及iTDP#3之MN中再現TDP43寡聚物及包涵物(磷酸-TDP43)之表型。在衍生自iTDP#2及iTDP#3之NEAT1表現減弱MN中，觀測到具有TDP43包涵物之細胞數目減少(圖5D)。在TDP43寡聚物中未觀測到此挽救結果(圖12)。在文獻(Tollervey,J.R.等人，Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.Nat Neurosci,2011.14(4)：第452-8頁)及吾人之圖8中之NEAT1沉降分析中，觀測到TDP43與NEAT1之間的相互作用。在衍生自iTDP#2及iTDP#3之MN中，在NEAT1病灶存在之情況下，TDP43內涵物募集至細胞質。TDP43及NEAT1在細胞質中之共定位高達70%。然而，在iTDP#2及iTDP#3衍生之NEAT1表現減弱之MN中未觀測到此相互作用(圖5E)。綜合而言，此等結果證明NEAT1參與iTDP#2及iTDP#3衍生之MN中的TDP43聚集及神經元退化。藉由短髮夾RNA減少NEAT1會挽救TDP43聚集及進一步退化。

為了研究NEAT1在促進TDP43聚集中之作用，採用CRISPRa技術增強衍生自人類胚胎幹細胞H9之活體外分化NPC之NEAT1表現。用於NEAT1活化之dCas9及gRNA之論證展示於圖6A中。使用靶向NEAT1轉錄起始位點(TSS)上游之gRNA之混合物以及與VP64-p65-Rta融合之dCas9以便募集轉錄活化因子。藉由與僅dCas9之NPC相關的定量RT-PCR及RNA原位雜交進行NEAT1增強之驗證(圖6B及圖6C)。由於NEAT1_2之長度，擴增NEAT1上之八個位點以用於全長NEAT1_2之轉錄確認。針對NEAT1_2 nts 3800-11700，設計用於RNA原位雜交之探針。如圖6C中所示，在gRNA存在下，NEAT1_1及NEAT1_2兩者之RNA計數增加。為使NEAT1與TDP43聚集之間的關聯可視化，在經轉染之NPC中進行TDP43之免疫染色。在CRISPRa-NEAT1細胞中，TUNEL⁺細胞自10%增加至25%(圖6D)。亦在NEAT1上調之NPC中觀測到裂解之凋亡蛋白酶3(圖6E)。此外，由磷酸-TDP43偵測到之TDP43包涵物與細胞質中之NEAT1相關且共定位(圖6F)。總而言之，此等資料表明，NEAT1促進神經元細胞中之細胞質TDP43聚集及細胞死亡。

在來源於ALS患者之死後及經誘導之MN中，已報導抗清潔劑TDP43(Neumann,M.等人，Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.Science,2006.314(5796)：第130-3頁)。為了分析其中可能涉及NEAT1之生物化學特性，針對TDP43，對清潔劑不可溶部分進行免疫墨點法。在衍生自iTDP#2及iTDP#3之MN中，不可溶TDP43之量升高。在衍生自iTDP#2及iTDP#3之NEAT1表現減弱MN中挽救TDP43不可溶性(圖7A)。CRISPRa-NEAT1亦用於確認NEAT1參與TDP43不可溶性。

總而言之，NEAT1可在介導ALS發病機制中起重要作用，包括細胞死亡、TDP43聚集及包涵物。使用短髮夾RNA減弱NEAT1表現可挽救以上ALS病理學，同時增強NEAT1表現募集。因此，靶向NEAT1可破壞TDP43聚集及進一步細胞死亡。

實例4 NEAT1直接相互作用且促進TDP43及TDP43-M337V兩者聚集

吾人首先執行NEAT1沉降以測試NEAT1與TDP43之間的相互作用(圖8A)。接著，吾人檢查NEAT1是否直接與野生型TDP43及/或TDP43-M337V相互作用。無細胞系統用於藉由在兔網狀球溶解物系統中活體外轉錄/轉譯來產生TDP43或TDP43-M337V蛋白質(Huang,Y.C.等人，Inhibiiion of TDP-43 aggregation by nucleic acid binding.PLOS One,2013.8(5)：第e64002頁)。藉由增加輸入質體來促進重組TDP43及TDP43-M337V之不可溶性，其已展示為病理性TDP43呈濃度依賴性方式之自播能力(圖8B)。接著，將NEAT1 RNA與TDP43或TDP43-M337V一起共培育。令人感興趣的是，NEAT1以濃度依賴方式促進TDP43及TDP43-M337V兩者之不可溶性(圖8C)。藉由在不可溶集結粒中之TEM免疫金染色，吾人觀測到NEAT1奈米結構與TDP43或TDP43-M337V共聚集(免疫金粒子)。因此，NEAT1可作為用於增加TDP43及TDP43-M337V兩者之不可溶性的架構提供，其增強用於病理性聚集物形成之TDP43及TDP43-M337V之低複雜度結構域之相互作用。

總體而言，此等資料表明NEAT1直接與TDP43或TDP43-M337V相互作用且引起蛋白質聚集。靶向NEAT1之作用可能為破壞TDP43相關之聚集物以及進一步預防運動神經元退化。

<110> 中央研究院

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Claims

一種短核酸分子，其是由SEQ ID NO：1、2、34或35或其經2'-O-甲氧基修飾組成之核苷酸序列。
一種如請求項1之短核酸分子的用途，其用於製造供在個體中減少TAR DNA結合蛋白43(TAR DNA binding protein 43，TDP43)相關之聚集，以治療神經元細胞死亡或治療神經元退化、治療或預防神經退化性病症、延遲或預防神經退化性病症之發作或降低發生神經退化性病症之風險用的藥物。
如請求項2之用途，其中該神經退化性病症為：帕金森氏症；阿茲海默氏症；肌肉萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)；脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophies，SMA)；路易體性癡呆；特發性震顫；多發性硬化症；運動困難；張力障礙；共濟失調；亨廷頓氏病；多發性系統萎縮症；肌陣攣；進行性核上麻痺；雷特症候群(Rhett syndrome)；痙攣；妥瑞症候群(Tourette syndrome)；伯耳氏癱(Bell’s palsy)；眼部疱疹；耳疱疹；由於慢性移植物抗宿主疾病而引起的神經退化；或由於病毒及醫原性原因引起的神經退化。
如請求項2之用途，其中該神經退化性病症為運動神經元疾病(MND)。
如請求項4之用途，其中該神經退化性病症為ALS或SMA。
如請求項5之用途，其中該ALS為家族性ALS或偶發性ALS。