TWI718844B - 幾丁聚醣之萃取方法 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種幾丁聚醣的萃取方法,其包含:將魷魚骨粉與第一酸性溶液混合,以獲得混合物;將混合物進行高靜水壓處理,以獲得高靜水壓魷魚骨粉;將高靜水壓魷魚骨粉與第二酸性溶液進行脫鈣處理,得到脫鈣魷魚骨粉;將脫鈣魷魚骨粉與第一鹼性溶液進行脫蛋白處理,得到脫蛋白魷魚骨粉;將脫蛋白魷魚骨粉烘乾得到幾丁質;以及將幾丁質與第二鹼性溶液混合及加熱,並於過濾後烘乾得到幾丁聚醣,其中,高靜水壓處理的壓力為100 MPa至600 MPa。
Description
本發明關於一種萃取方法,具體而言係關於一種幾丁聚醣的萃取方法。
以往在食用魚蝦、螃蟹、魷魚等海鮮之後,無法直接食用的蝦、蟹殼、魷魚軟骨等通常只能作為廢棄物丟棄。然而,隨著環保、綠能的議題受到關注,越來越多人致力研究有效利用這些水產廢棄物的方法,不但可以使資源充分利用、提高水產的附加價值,也可以減少水產廢棄物的數量,進而達到促進環境衛生的目的。
所屬技術領域中已知的是甲殼動物的外殼及軟體海洋動物的軟骨中廣泛存在幾丁質,由於蝦蟹殼的廢棄物產量較大,大部分萃取幾丁質的方法是針對蝦蟹殼的處理,即使欲從軟骨中萃取幾丁質也僅是以處理蝦蟹殼相同的方式進行。然而,值得注意的是從蝦蟹殼中萃取出來的幾丁質是逆平行排列的α-形式,從軟體動物之軟骨萃取出來的幾丁質是平行排列的β-形式。此外,蝦蟹殼原料中含有較多的蛋白質和鈣質,若兩者使用相同的方法進行萃取可能導致過度處理軟骨原料,而並無法有效率地從中萃取出幾丁質。
有鑑於習知技術的缺點,本發明的目的在於提供一種幾丁聚醣之萃取方法,特別是針對以軟體動物之軟骨為原料萃取幾丁聚醣的方法,以從魷魚軟骨中萃取出β-形式的幾丁質,所萃取的幾丁質與其進一步製成的幾丁聚醣能夠廣泛應用於生醫產業、食品加工產業、保健食品產業、化粧品產業、環保產業等各種領域,在產業上更具有利用價值。
根據本發明之目的,本發明提供一種幾丁聚醣之萃取方法,其包含:將魷魚骨粉與第一酸性溶液混合獲得混合物,將混合物進行高靜水壓處理,以獲得高靜水壓魷魚骨粉,將高靜水壓魷魚骨粉與第二酸性溶液進行脫鈣處理,以獲得脫鈣魷魚骨粉,將脫鈣魷魚骨粉與第一鹼性容易進行脫蛋白處理,以獲得脫蛋白魷魚骨粉,將脫蛋白魷魚骨粉烘乾以獲得幾丁質,以及將幾丁質與第一鹼性溶液混合及加熱,並於過濾後烘乾以獲得幾丁聚醣,其中,高靜水壓處理的壓力為100MPa至600MPa。
較佳地,高靜水壓處理的時間為5分鐘至15分鐘。
較佳地,第一酸性溶液為0.5%至2%的醋酸。
較佳地,脫鈣處理係將高靜水壓魷魚骨粉與第二酸性溶液混合1至3小時。
較佳地,高靜水壓魷魚骨粉與第二酸性溶液的固液比為1:10至1:20。
較佳地,脫蛋白處理係將脫鈣魷魚骨粉與第一鹼性溶液混合30分鐘至1.5小時。
較佳地,脫鈣魷魚骨粉與第一鹼性溶液的固液比為1:5至1:15。
較佳地,幾丁質與第二鹼性溶液的固液比為1:5至1:15。
較佳地,第二鹼性溶液的濃度高於第一鹼性溶液。
較佳地,烘乾係在50℃至70℃下進行。
承上所述,本發明之幾丁聚醣萃取方法具有下述優點:
本發明之幾丁聚醣萃取方法係針對軟體海洋動物的軟骨進行萃取,能夠更有效率的從軟體海洋動物的軟骨中萃取出較具有生化活性的β-形式幾丁質,除了能夠將海洋資源充分利用之外,也能夠避免對原料的過度處理。
本發明之幾丁聚醣萃取方法能夠得到去乙醯基的程度較高的幾丁質,也就是說所萃取到的幾丁聚醣能夠表現更明顯的生理活性。具體而言,由本發明之方法萃取出的幾丁聚醣具有較佳的螯合鐵能力、還原能力及清除DPPH自由基能力。
S1~S5:步驟
第1圖為本發明之幾丁聚醣之萃取方法的流程圖
第2圖為在不同壓力處理下之幾丁聚醣的1H NMR圖譜。其中a為未處理者、b為一般高壓處理者、c為本案之高靜水壓處理者。
第3圖繪示不同壓力處理所得之幾丁聚醣的DPPH清除能力。
第4圖繪示不同壓力處理所得之幾丁聚醣的還原能力。
第5圖繪示不同壓力處理所得之幾丁聚醣的鐵螯合活性。
第6圖繪示不同處理方式所得之幾丁聚醣的DPPH清除能力。
第7圖繪示不同處理方式所得之幾丁聚醣的還原能力。
第8圖繪示不同處理方式所得之幾丁聚醣的鐵螯合活性。
為使所屬技術領域具有通常知識者理解本發明之幾丁聚醣之萃取方法的技術特徵、具體實施方式及效益,下文中將參照相關圖式搭配實施例更詳細地進行說明。
參照第1圖,為本發明之幾丁聚醣之萃取方法的流程圖。如第1圖所示,本發明之幾丁聚醣的萃取方法包含步驟S1~S5:膨潤處理、高靜水壓處理、脫鈣處理、脫蛋白處理及去乙醯化處理。本發明之幾丁聚醣的萃取方法的原料以魷魚骨粉為例,然而所屬技術領域具有通常知識者應理解的是本發明所使用之原料並不以此為限,也可以使用如墨魚、花枝、烏賊等水生軟體動物的軟骨作為原料。
在步驟S1中進行膨潤處理。將魷魚骨粉與第一酸性溶液混合以獲得混合物。其中,所述魷魚骨粉預先加熱至50℃。所述第一酸性溶液的濃度可以為0.5%至2%,較佳為0.8%至1.5%,更佳為1.0%至1.2%。第一酸性溶液可選自醋酸、鹽酸、及磷酸。
表1所示為當20g的魷魚骨粉與100mL之第一酸性溶液混合,且第一酸性溶液為醋酸、鹽酸或磷酸的情況下,不同濃度的第一酸性溶液對膨潤度的影響(統計以單因子變異數分析(One-way ANOVA)檢定各組間的差異,各欄數值旁標示不同字母代表其之間具有顯著差異P<0.05)
根據表1所示的結果,當酸性溶液在0.5%的濃度下時,使用醋酸、鹽酸或磷酸等不同酸性溶液時,對膨潤度的影響並沒有顯著差異,當酸性溶液濃度上升至1%及2%時,選用鹽酸的組別隨著濃度上升,其膨潤度下降,而選用醋酸及磷酸的組別則隨著濃度上升,其膨潤度增加,其中以醋酸在1%及2%的條件下進行膨潤的效果最佳,且對膨潤度的影響產生顯著差異,然而在相同效果下使用1%醋酸能夠節省原料成本,因此在本發明的一實施例中,膨潤處理S1係將20g的魷魚骨粉與100mL之1%醋酸溶液混合得到混合物。
隨後將所得到的混合物進行步驟S2的高靜水壓處理,即將混合物以軟性包裝袋真空包裝,置於高靜水壓(High hydrostsatic pressure,HHP)系統中的高壓容器中,其中傳遞壓力的介質可以水作為介質。高靜水壓處理S2的壓力可以為100MPa至600MPa,較佳為300MPa至600
MPa,更佳為400MPa至500MPa。進行高靜水壓處理S2的時間可以為5分鐘至15分鐘,較佳為8分鐘至15分鐘,更佳為9分鐘至12分鐘。在本發明的一實施例中,步驟S2的高靜水壓處理以500MPa進行10分鐘,然後瞬間洩壓得到高靜水壓魷魚骨粉。
將上述高靜水壓魷魚骨粉與第二酸性溶液進行步驟S3的脫鈣處理。進一步而言,第二酸性溶液使用鹽酸。第二酸性溶液的濃度可以為0.5%至10%,較佳為3%至9%,更佳為5%至8%。高靜水壓魷魚骨粉與第二酸性溶液的固液比(g/mL)為1:10至1:20,較佳為1:10至1:15,更佳為1:12至1:14。脫鈣處理S3是將高靜水壓魷魚骨粉與第二酸性溶液混合1至3小時,較佳為1.5小時至2.5小時。在本發明的一實施例中,步驟S3的脫鈣處理是將高靜水壓魷魚骨粉以1:14的固液比與6%鹽酸混合2小時,隨後進行過濾並將殘餘之濾渣洗至中性,得到脫鈣魷魚骨粉。
將上述得到的脫鈣魷魚骨粉與第一鹼性溶液混合,進行步驟S4的脫蛋白處理。第一鹼性溶液可以是氫氧化鈉及氫氧化鉀。第一鹼性溶液的濃度可以是1%至20%,較佳為5%至15%,更佳為8%至12%。在步驟S4的脫蛋白處理中,脫鈣魷魚骨粉與第一鹼性溶液的固液比(g/mL)為1:5至1:15,較佳為1:8至1:14,更佳為1:8至1:12。為加快脫蛋白處理的反應速率,脫蛋白處理可以在90℃下進行,較佳為95℃及更佳為100℃。在本發明的一實施例中,脫蛋白處理是將脫鈣魷魚骨粉以1:10的固液比與10%氫氧化鈉混合,在100℃下進行1小時,隨後進行過濾並將殘餘之濾渣洗至中性,得到脫蛋白魷魚骨粉,將其進一步以50℃至70℃烘乾,較佳為
55℃至65℃,更佳為50℃至60℃,以得到幾丁質,並在此步驟中秤重計算幾丁質回收率。
隨後,將幾丁質與第二鹼性溶液混合進行步驟S5的去乙醯化處理。去乙醯化處理的目的在於使幾丁質上的乙醯胺基(-NHCOCH3)轉變為胺基(-NH2),製得幾丁聚醣。其中第二鹼性溶液可以是氫氧化鈉。第二鹼性溶液的濃度可以是20%至70%,較佳為30%至60%,更佳為40%至55%。顯而易見的是,第二鹼性溶液的濃度大於第一鹼性溶液。為加速去乙醯化處理的反應速率,去乙醯化處理可以在90℃下進行,較佳為95℃及更佳為100℃。在本發明的一實施例中,去乙醯化處理是將幾丁質以1:10的固液比與50%氫氧化鈉混合,在100℃下進行4小時,反應結束後進行過濾,並將殘餘之濾渣洗至中性,其進一步以50℃至70℃烘乾,較佳為55℃至65℃,更佳為50℃至60℃以得到幾丁聚醣。
為進一步說明本發明包含高靜水壓處理之幾丁聚醣之萃取方法能夠獲得品質較佳的幾丁聚醣,將以不同方式萃取到的幾丁聚醣之特性進行比較。
以不同壓力進行高靜水壓處理10分鐘的結果如表2所示,所使用之高靜水壓可達最高壓力為500MPa。
根據上述表2之結果得知,比較第1實施例及第2實施例對於去乙醯化程度及黏度的改變並沒有顯著差異,顯示壓力上升至0.12MPa時僅增加幾丁聚醣的產率。比較第2實施例及第3實施例之間的去乙醯化程度、黏度及產率相較均具有顯著差異,但第3實施例中的去乙醯化程度及產率下降。再比較第3實施例及第4實施例之間的去乙醯化程度及產率皆有顯著差異,然而對黏度則沒有顯著差異。其中可能是由於第3實施例的產率之鐘形曲線前移,導致第3實施例與第1實施例的產率之間的差異看似較第1實施例與第2實施例的產率之間的差異大,卻在統計上被判定沒有顯著差異。最後比較第4實施例及第5實施例,在去乙醯化程度、黏度及產率第5實施例相較於第4實施例均具有顯著差異,且第5實施例所得到之幾丁聚醣的去乙醯化程度及產率皆較高且黏度較低,因此使用第5實施例使用的壓力作為實例1進行後續實驗。
將本案實例1(以500MPa進行10分鐘)萃取到的幾丁聚醣與習知的比較例比較,比較例1為未經任何高壓處理,比較例2為經過一般高壓處理(使用殺菌釜,溫度121℃、時間15分鐘、壓力1.2kg/cm2=0.12MPa)。其去乙醯化程度及黏度結果如表3所示。
根據表3之結果可以得到比較例1及比較例2的處理之間對於去乙醯化程度及黏度皆沒有顯著差異,即以滅菌釜進行一般高壓處理與未經任何高壓處理的結果沒有顯著差異。但實例1相較於比較例1及比較例2具有較高的去乙醯化程度,所製得的幾丁聚醣具有較佳的生理活性。此外,實例1相較於比較例1及比較例2具有顯著較低的黏度,更有利於後續應用。
參照第2圖,為在不同壓力處理下之幾丁聚醣的1H NMR圖譜。其中a為未處理者(比較例1)、b為一般高壓處理者(比較例2)、c為本案之高靜水壓處理者(實例1)。在的1H NMR圖譜中,幾丁聚醣於δ1.8ppm有甲基(methyenyl group)(H-2)質子會與胺基(amine group)鏈結。於δ1.90ppm處為N-乙醯葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)。如第2圖所示,比較例1、比較例2及實例1於δ1.90ppm處的N-乙醯葡萄糖胺分別為9.16%、9.83及7.26%,即經過本案的高靜水壓處理者具有較高的去乙醯化程度。此外,於δ3.52-3.71ppm處的甲基(H-3,4,5,6)有質子。在三種不同處理所得到幾丁聚醣的光譜,以比較例1的波峰較為寛廣,其次為比較例2及實例1,由此結果可得知高靜水壓處理魷魚骨所得到幾丁聚醣可得到較小分子量,也佐證了上述表3本案的幾丁聚醣黏度較低的結果。
參照第3圖至第5圖,分別繪示不同壓力處理所得之幾丁聚醣的DPPH清除能力、還原能力及鐵螯合活性。
DPPH為抗氧化能力的一項重要指標,幾丁聚醣的抗氧化能力的測試方法為先分別配製0.2-1mg/mL幾丁聚醣及2-10mg/mL低分子量幾丁聚醣溶液(溶於1%醋酸)。取0.5mL樣品(加入0.5mL 0.1mM DPPH自由基甲醇溶液,將此混合液均勻混合並於室溫下避光30分鐘,以分光光度計測定其517nm吸收。並以維他命C(ascorbic acid)作為控制組,清除自由基能力計算如下:清除能力(%)=[1-(樣品之吸光度(absorbance of sample)/控制組之吸光度(absorbance of control)]x100。所得到之結果繪示在第3圖中,如第3圖所示,比較例2的清除DPPH百分比較比較例1高,而實例1清除DPPH的百分比較比較例1及比較例2的百分比高,顯示出本案實例1萃取出的幾丁聚醣具有優於比較例1及比較例2的效果,則本案實例1的抗氧化能力最佳。
幾丁聚醣的還原能力的測試方法為分別取1mL幾丁聚醣溶液(0.2-1mg/mL)及低分子量幾丁聚醣溶液(2-10mg/mL),加入1mL的0.2M磷酸鈉緩衝液(pH 6.6)及1mL的1%(w/v)赤血鹽(potassium ferricyanide)混合,於50℃靜置20分鐘,再加入1ml 10%三氯乙酸(trichloroacetic acid)(TCA)溶液,混合後以4,000rpm離心10分鐘,取1mL上清液,加入1mL蒸餾水及0.3mL的0.1%(w/v)氯化鐵溶液混合,於10分鐘反應後測定在700nm下的吸光值。並以維他命C作為對照組,吸光值愈高表示還原力越強。所得到之結果如第4圖所示,比較例2具有較比較例1佳的還原能力,顯示壓力處理能夠提升幾丁聚醣的還原能力,然而本案實例1之還原能力又優於比較例2,則說明本案實例1的幾丁聚醣相較於習知壓力處理的幾丁聚醣有更佳的還原能力。
幾丁聚醣的螯合鐵離子能力的測試方法為分別取1mL幾丁聚醣溶液(0.2-1mg/mL)及低分子量幾丁聚醣溶液(2-10mg/mL)與3.7mL甲醇混合,加入0.1mL的2mM氯化亞鐵及0.2mL的5mM菲洛嗪(ferrozine),於37℃下靜置20分鐘後,測定在562nm下的吸光值。吸光值愈低顯示螯合金屬離子能力愈強,並以EDTA作為對照組。螯合能力(%)=[(在562nm下控制組的吸光值(absorption)(A562nm_控制組))-(在562nm下樣品的吸光值(A562nm_樣品))/(在562nm下控制組的吸光值)]x100。所得到之結果繪示於第5圖中,從第5圖的結果可以看出,幾丁聚醣的螯合活性在比較例2中優於比較例1,而本案實例1又更優於比較例2,顯示其中本案的實例1具有最佳的鐵螯合活性。
綜上所述,使用本案的高靜水壓處理相較於習知高壓處理能夠得到DPPH清除能力、還原能力及鐵螯合活性效果更佳的幾丁聚醣。
進一步地,以發明之幾丁聚醣之萃取方法得到的幾丁聚醣可以進一步製成低分子幾丁聚醣。取1g幾丁聚醣溶於1%醋酸溶液,加熱至70℃攪拌至溶解,然後添加6%及9% H2O2加熱3小時,再置於70℃下超音波振盪15分鐘,以1N NaOH調整pH至10,反應完成後抽氣過濾,將濾液以四倍95%酒精沉澱,置於4℃冷藏、離心,收集沉澱物,即為低分子幾丁聚醣。
比較魷魚軟骨經高靜水壓及過氧化氫處理後的幾丁聚醣產率及去乙醯程度(%)之結果以平均值±標準誤差(mean±SD)示於表4。
根據表4之結果顯示出在比較例1、比較例1-1及比較例1-2之間以及實例1、實例2及實例3之間幾丁聚醣的產率隨著H2O2的添加濃度上升而上升,雖然去乙醯化程度隨著H2O2的添加濃度上升而下降,但實例1至3相較於比較例1、比較例1-1及比較例1-2皆具有顯著較高的幾丁聚醣產率及去乙醯化程度。由此可以證實HHP及H2O2的加入有助於幾丁聚醣產率及去乙醯化程度的提升。。
進一步根據前述方法比較不同處理所得的幾丁聚醣脂質結合能力、保水能力及溶解度,其結果以平均值±標準誤差(mean±SD)示於如表5。其中,市售幾丁聚醣(beta-type chitosan)從誠麗實業股份有限公司購得。
參照表5之結果,將實例1與比較例1比較時,脂質結合能力與溶解度皆有顯著提升,保水能力則沒有顯著差異,顯示HHP有助於增加脂質結合能力與溶解度。將實例1與比較例3比較時,脂質結合能力及保水能力皆有顯著提升,溶解度則沒有顯著差異,顯示經過本發明之處理的幾丁聚醣相較於市售幾丁聚醣具有較佳的脂質結合能力及保水能力。將實例2及實例3與實例1比較時,脂質結合能力、保水能力及溶解度皆有顯著提升,也就是說加入H2O2有助於增加脂質結合能力、保水能力及溶解度,但加入6%或是9%的H2O2在增加脂質結合能力、保水能力及溶解度上則沒有顯著差異。
第6圖至第8圖繪示不同處理方式所得之幾丁聚醣的DPPH清除能力、還原能力及鐵螯合活性。如第6圖所示,DPPH為抗氧化能力的一項重要指標,在本實驗中DPPH清除效果以維他命C作為正對照組,比較例3的DPPH清除效果最差,接著是比較例1-1及比較例1-2、實例1、實例2及實
例3,由此結果可以得知將樣品進行高靜水壓處理及9%的H2O2處理的DPPH清除效果最佳。
參照第7圖繪示不同處理方式下所得到之幾丁聚醣的還原能力,以維他命C作為正對照組,可以觀察到在比較例3、比較例1-1及比較例1-2之間差異不大,雖然實例1、實例2及實例3之間也沒有太大差異,但是實例1、實例2及實例3的還原能力普遍較比較例3、比較例1-1及比較例1-2高,顯示出經過高靜水壓處理的組別的還原能力普遍較未經高靜水壓處理的組別更佳,其中以實例3還原能力最佳,即高靜水壓處理搭配9%的H2O2處理可以得到還原能力最佳的幾丁聚醣。
第8圖繪示不同處理方式下所得到之幾丁聚醣的鐵螯合活性,以EDTA作為正對照組,螯合活性由低至高分別是比較例3、比較例1-1、實例1、比較例1-2、實例2及實例3,其中實例3的螯合活性最佳之外,甚至接近於作為正對照之EDTA的效果,顯示高靜水壓處理搭配9%的H2O2處理可以得到鐵螯合活性最佳的幾丁聚醣。
綜上所述,HHP處理有助於提升幾丁聚醣的產率,搭配9%的H2O2處理時能夠改善幾丁聚醣的去乙醯程度、脂質結合能力、保水能力及溶解度,相較於市售劑一般處理的幾丁聚醣能夠具有更佳的DPPH清除能力、還原能力及鐵螯合活性。
以上所述僅為舉例性,而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇,而對其進行之等效修改或變更,均應包含於申請專利範圍中。
S1~S5:步驟
Claims (10)
- 一種幾丁聚醣之萃取方法,其包含:將一魷魚骨粉與一第一酸性溶液混合以進行膨潤處理,以獲得一混合物,其中,該第一酸性溶液選自醋酸、鹽酸及磷酸且濃度為0.5%至2%;將該混合物進行一高靜水壓處理,以獲得一高靜水壓魷魚骨粉;將該高靜水壓魷魚骨粉與一第二酸性溶液進行一脫鈣處理,以獲得一脫鈣魷魚骨粉;將該脫鈣魷魚骨粉與一第一鹼性溶液進行一脫蛋白處理,以獲得一脫蛋白魷魚骨粉;將該脫蛋白魷魚骨粉烘乾以獲得一幾丁質;以及將該幾丁質與一第二鹼性溶液混合及加熱,並於過濾後烘乾以獲得幾丁聚醣,其中,該高靜水壓處理的壓力為100MPa至600MPa。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該高靜水壓處理的時間為5分鐘至15分鐘。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該第一酸性溶液為0.5%至2%的醋酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,該脫鈣處理係將該高靜水壓魷魚骨粉與該第二酸性溶液混合1至3小時。
- 如申請專利範圍第4項所述之方法,其中該高靜水壓魷魚骨粉與該第二酸性溶液的固液比為1:10至1:20。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該脫蛋白處理係將該脫鈣魷魚骨粉與該第一鹼性溶液混合30分鐘至1.5小時。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法,其中該脫鈣魷魚骨粉與該第一鹼性溶液的固液比為1:5至1:15。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該幾丁質與該第二鹼性溶液的固液比為1:5至1:15。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該第二鹼性溶液的濃度高於該第一鹼性溶液。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該烘乾係在50℃至70℃下進行。
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