TWI699533B - 可防止非特異性反應、用以萃取並測定醣鏈抗原之免疫層析試驗片、及檢體中之醣鏈抗原之測定方法 - Google Patents
可防止非特異性反應、用以萃取並測定醣鏈抗原之免疫層析試驗片、及檢體中之醣鏈抗原之測定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提供一種免疫層析試驗片，其藉由在於免疫層析試驗片上利用亞硝酸萃取而萃取並測定醣鏈抗原之免疫層析法中，使包含亞硝酸之展開液有效率且持續地與中和試劑接觸進行中和，而防止非特異性反應。
本發明之免疫層析試驗片係包含：樣品墊，其供於添加與亞硝酸鹽或酸性溶液混合而成之檢體；標記物區域，其包含對針對醣鏈抗原之抗體進行標記而成之標記抗體；及檢測區域，其係將上述針對醣鏈抗原之抗體固相化而成；於檢測區域形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體，並測定醣鏈抗原者；並且於上述標記物區域之上游具有含浸有中和試劑之區域，進而於該含浸有中和試劑之區域之上游，於使用與亞硝酸鹽混合而成之檢體時具有含浸有固形狀酸性試劑之區域，於使用與酸性溶液混合而成之檢體時具有含浸有亞硝酸鹽之區域的用以萃取並測定檢體中之醣鏈抗原者，並且含浸有中和試劑之區域之素材係具有吸收性較高，保水性較高，且釋出性較低或釋出性持續之3個特性之濾紙或玻璃濾紙，藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之較低程度或釋出性之持續，而抑制殘留之酸性溶液到達檢測區域或經充分中和之試驗液繼續於檢測區域中持續展開，藉此抑制非特異性反應。
Description
本發明係關於一種能夠在免疫層析試驗片上進行醣鏈抗原之亞硝酸萃取處理的用以萃取並測定醣鏈抗原之免疫層析試驗片。
以免疫層析法為原理之迅速診斷試劑多數被廣泛地用作迅速、簡便地測定病毒或細菌感染症，並決定治療方針之一種手段。
通常之以免疫層析法為原理之迅速診斷試劑藉由使檢體懸浮於檢體懸浮液中之後，將該懸浮液供於免疫層析試驗片，而可迅速、簡便地進行測定。
為了檢測A群β-溶血性鏈球菌(A群β-溶鏈菌)、口腔內鏈球菌等屬於鏈球菌屬之微生物，必須萃取醣鏈抗原，並測定醣鏈抗原。
例如報告有：預先使免疫層析試驗片中包含亞硝酸鈉與中和試劑，將檢體懸浮於乙酸等酸性溶液中並供於免疫層析試驗片，僅憑該操作而於免疫層析試驗片上進行亞硝酸萃取處理(專利文獻1)。
又，亦有預先使免疫層析試驗片中包含酸性試劑與中和試劑，將檢體懸浮於亞硝酸鹽中並供於免疫層析試驗片之方法。
目前市售之利用免疫層析法之A群β-溶血性鏈球菌抗原檢測試劑之多數係利用如下方法：於試驗前將亞硝酸鹽溶液與酸溶液之二液混合而產生酸性之亞硝酸，利用所產生之亞硝酸萃取抗原並用於試驗；或者將含浸有酸性試劑之墊裝入至免疫層析裝置(免疫層析試驗片)中，於免疫層析試驗
片上產生亞硝酸，並萃取抗原。於該方法中，必須中和所產生之酸性之亞硝酸，預先使中和試劑於乾燥狀態下包含於免疫層析試驗片上，並利用該中和試劑中和亞硝酸。
[專利文獻1]國際公開WO2005/121794號公報
目前市售之利用免疫層析法之A群β-溶血性鏈球菌抗原檢測試劑多數將混合亞硝酸鹽溶液與酸溶液而產生之酸性之亞硝酸用於抗原之萃取，萃取抗原所使用之包含亞硝酸之展開液於利用免疫層析試驗片上所含之乾燥狀態之中和試劑進行中和後，進行抗原抗體反應而測定。然而，該先前方法存在產生非特異性之反應之問題。
本發明之目的在於提供一種免疫層析試驗片，其藉由在於免疫層析試驗片上利用亞硝酸萃取而萃取並測定醣鏈抗原之免疫層析法中，使包含亞硝酸之展開液有效率且持續地與中和試劑接觸進行中和，而防止非特異性反應。
本發明者為了解決如下問題而進行了努力研究：採用先前方法時，於免疫層析試驗片上藉由亞硝酸萃取而萃取並測定醣鏈抗原之免疫層析法中，若經過一定時間，則產生非特異性之反應。
本發明者等人發現，採用先前方法時若經過一定時間，則因殘留於免疫層析試驗片之上游之酸中和試劑被耗盡，免疫層析試驗片上之展開液
整體偏酸性，結果產生非特異性之反應。
因此，考慮利用免疫層析試驗片上之中和試劑確實且持續地中和亞硝酸之萃取中所使用之酸，或使殘留於免疫層析試驗片之上游之酸停留於上游而不到達產生抗原抗體反應之檢測區域。
本發明者等人發現，藉由使用如下素材作為含浸有中和試劑之區域所使用之多孔性材料，即便酸經過一定時間後(例如作為判定時間之5分鐘以後)逐漸於測試條之下游展開時亦可維持充分之中和能力，而可抑制非特異性反應，該素材為單位面積重量為10~400g/m2，且厚度為0.1~2.0mm之織物，並且吸收性較高，保水性較高，且能夠長時間(1小時以上)持續地釋出中和劑。進而發現，於使用吸收性與保水性較高，釋出性較低之玻璃濾紙之情形時，於經過一定時間後樣品墊中所含浸之酸移動至中和墊時，會抑制酸自該區域釋出並到達產生抗原抗體反應之檢測區域，結果於陰性之情形時可抑制非特異性反應，於最小檢測感度附近之陽性檢體之情形時，防止線在判定時間以後發生顯色，從而完成了本發明。
即，本發明如下所述。
[1]一種免疫層析試驗片，其係包含：樣品墊，其供於添加與亞硝酸鹽或酸性溶液混合而成之檢體；標記物區域，其包含對針對醣鏈抗原之抗體進行標記而成之標記抗體；及檢測區域，其係將上述針對醣鏈抗原之抗體固相化而成；且於檢測區域形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體，來測定醣鏈抗原；並且於上述標記物區域之上游具有含浸有中和試劑之區域，進而於該含浸有中和試劑之區域之上游，於使用與亞硝酸鹽混合而成之檢體時具有含浸有固形狀酸性試劑之區域，於使用與酸性溶液混合而成之檢體時具有含浸有亞硝酸鹽之區域的用以萃取並測定檢體中之醣鏈抗原
者，並且含浸有中和試劑之區域之素材係具有吸收性較高，保水性較高，且釋出性較低或釋出性持續之3個特性之濾紙或玻璃濾紙，藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之較低程度或釋出性之持續，而抑制殘留之酸性溶液到達檢測區域、或經充分中和之試驗液繼續於檢測區域中持續展開，藉此抑制非特異性反應。
[2]一種免疫層析試驗片，其係包含：樣品墊，其供於添加與亞硝酸鹽或酸性溶液混合而成之檢體；標記物區域，其包含對針對醣鏈抗原之抗體進行標記而成之標記抗體；及檢測區域，其係將上述針對醣鏈抗原之抗體固相化而成；且於檢測區域形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體，來測定醣鏈抗原；並且於上述標記物區域之上游具有含浸有中和試劑之區域，進而於該含浸有中和試劑之區域之上游，於使用與亞硝酸鹽混合而成之檢體時具有含浸有固形狀酸性試劑之區域，於使用與酸性溶液混合而成之檢體時具有含浸有亞硝酸鹽之區域的用以萃取並測定檢體中之醣鏈抗原者，並且含浸有中和試劑之區域之素材為單位面積重量為10~400g/m2，且厚度為0.1~2.0mm之織物。
[3]如[1]或[2]中所記載之免疫層析試驗片，其中上述織物之每1cm/m2之吸水量為10~100μl/cm2，且吸水速度為1.0~5.0μl/sec，進而使1cm/m2之斷片於潤濕之狀態下與檢測區域接觸並靜置5分鐘後之保水量為10~100μl/cm2，使1cm/m2之斷片於潤濕之狀態下與膜片接觸並靜置5
分鐘後之溶液之擴散面積為20mm2以下。
[4]如[1]至[3]中任一項之免疫層析試驗片，其中藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之持續力，殘留之酸性溶液於到達檢測區域時亦蓄積充分之中和能力，藉此抑制非特異性反應。
[5]如[1]至[4]中任一項之免疫層析試驗片，其中藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之較低程度，而抑制殘留之酸性溶液到達檢測區域，於陰性之情形時抑制非特異性反應，於陽性之情形時防止判定時間以後之線顯色。
[6]如[1]至[5]中任一項之免疫層析試驗片，其中含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域係存在於樣品墊上或塗佈有標記物區域之墊上。
[7]如[1]至[6]中任一項之免疫層析試驗片，其中固形狀酸性試劑係選自由丙二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、檸檬酸及酒石酸所組成之群之中。
[8]如[1]至[7]中任一項之免疫層析試驗片，其中中和試劑為三(羥甲基)胺基甲烷或氫氧化鈉。
[9]如[1]至[8]中任一項之免疫層析試驗片，其中醣鏈抗原為原生動物、真菌、細菌、黴漿菌、立克次體、披衣菌或病毒之醣鏈抗原。
[10]一種檢體中之醣鏈抗原之測定方法，其係使用如[1]至[9]中任一項之免疫層析試驗片，並藉由免疫層析法而測定檢體中之醣鏈抗原之方法，並且包括如下操作：於免疫層析試驗片具有含浸有固形狀酸性試劑之區
域時，將檢體與亞硝酸溶液加以混合，於免疫層析試驗片具有含浸有亞硝酸鹽之區域時，將檢體與酸性溶液加以混合，並添加至上述免疫層析試驗片之樣品墊上，於含浸有固形狀酸性試劑之區域或含浸有亞硝酸鹽之區域，藉由利用亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑之反應所產生之亞硝酸之作用，自檢體萃取醣鏈抗原，且於含浸有中和試劑之區域，將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，於檢測區域，藉由形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體之免疫層析法，藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之較低程度或釋出性之持續，而抑制殘留之酸性溶液到達檢測區域或經充分中和之試驗液繼續於檢測區域中持續展開，藉此抑制非特異性反應，並測定檢體中之醣鏈抗原。
本說明書包含成為本案之優先權基礎之日本專利申請編號2017-049155號之揭示內容。
於本發明之能夠在免疫層析試驗片上進行醣鏈抗原之亞硝酸萃取處理的用以測定A群β-溶血性鏈球菌(A群β-溶鏈菌)抗原之免疫層析試驗片中，於具有吸水性較高，保水性(液體之保持力)較高，液體之釋出性較低或持續釋出之3個特性之素材中，將含浸有中和試劑之墊配置於較抗原萃取部位更靠下游、且較標記部位更靠上游之位置，藉由該構造，可抑制時間經過後之非特異性反應。
1:支持體(包括檢測區域)
2:標記物區域
3:檢測區域
4:樣品墊
5:固形狀酸性試劑區域
6:中和試劑區域
7:吸收帶
8:襯板
圖1A、B係模式性地表示具有固形狀酸性試劑區域及中和試劑區域之免疫層析試驗片(1片墊試驗片)之構造的圖。
圖2A、B係模式性地表示具有固形狀酸性試劑區域及中和試劑區域之免疫層析試驗片(2片墊試驗片)之構造的圖。
以下，詳細地說明本發明。
本發明係關於一種免疫層析試驗片，其為了能夠在免疫層析試驗片上進行醣鏈抗原之亞硝酸萃取處理而進行簡便化，能夠迅速且準確地測定作為被檢測物質之醣鏈抗原。
免疫層析試驗片具備如下等構件：支持體，其具有固定有捕捉被檢測物質(抗原等)之抗體(抗體1)的檢測區域；標記物區域，其具有能夠移動之標記抗體(抗體2)；樣品墊，其供於添加檢體；吸收帶，其吸收經展開之檢體液；及襯板，其係用以將該等構件貼合成1個。
本發明之免疫層析試驗片可收納於收納容器內，利用該收納容器，例如可防止由紫外線或空氣中之濕氣所引起之劣化。又，於使用具有污染性、感染性之檢體試樣之情形時，利用收納容器可防止進行分析之試驗者受到污染或感染。例如只要使用適當之大小之樹脂製殼體作為收納容器，於該殼體中收納本發明之裝置即可。又，可利用樹脂製膜等(頂部積層層(Top laminate))而覆蓋固定有抗原或抗體之試驗片之表面。有將收納容器與收納於其中之試驗片作為一體而稱為免疫層析裝置之情形。
再者，檢測區域之數量及標記物區域中所含之標記抗體之種類並不限定於一個，藉由使用複數個與被檢測物質相對應之抗體，可利用同一試驗片而測定2個以上之抗原。
支持體係具有將用以捕捉被檢測物質(抗原)之抗體固定化之性能的材料，且具有不阻礙液體沿水平方向通行之性能。較佳為具有毛細管作用之多孔性薄膜(膜片)，且係可藉由吸收而輸送液體及分散於其中之成分的材料。構成支持體之材質並無特別限定，例如可列舉：纖維素、硝基纖維素、乙酸纖維素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃纖維、尼龍、聚酮等。其中，更佳為使用硝基纖維素而製成薄膜或膜片者。將固定有抗體之膜片稱為抗體固定化膜片。
標記物區域包含含有標記抗體之多孔性基材，基材之材質可採用通常使用之玻璃纖維(glass fibre)或不織布等。該基材為了含浸大量標記抗體，較佳為厚度0.3mm~0.6mm左右之墊狀。亦將含浸標記抗體並使之乾燥之多孔性基材稱為乾燥墊。
標記抗體之標記多數情況下係使用鹼性磷酸酶或辣根過氧化酶之類的酵素、金膠體之類的金屬膠體、二氧化矽粒子、纖維素粒子、著色聚苯乙烯粒子及著色乳膠粒子等。於使用金屬膠體粒子、著色聚苯乙烯粒子或著色乳膠粒子等著色粒子之情形時，由於該等標記試劑因凝聚而產生著色，故而對該著色進行測定。將固定有抗體之粒子稱為抗體固定化粒子。
檢測區域係指固定有捕捉被檢測物質(抗原)之抗體的支持體之一部分區域。檢測區域設置至少1個固定有用以捕捉抗原之抗體的區域。檢測區域只要含於支持體即可，且只要將抗體固定於支持體上即可。
樣品墊係用以添加檢體之部位，為多孔性材料。樣品墊係位於免疫層析試驗片之最上游之部位。該材料可採用通常使用之濾紙、玻璃纖維、不織布等。為了將大量檢體用於免疫測定，較佳為厚度0.3mm~1mm左右之墊狀。檢體亦包括使檢體懸浮於其他溶液中而獲得之試樣等使用檢體
所製備之試樣。
吸收帶係用以吸收被供於支持體且於檢測區域未參與反應之成分的構件。該材料可使用包含通常之天然高分子化合物、合成高分子化合物等之保水性較高之濾紙、海綿等，為了促進檢體之展開，較佳為吸水性較高者。
襯板係用以將上述所有材料、即支持體、樣品墊、標記物區域、吸收帶等以具體部分重疊之方式加以貼附、固定而成之構件。關於襯板，若以最佳之間隔配置、固定該等材料，則並非必須，但就製造上或使用上之便利性而言，通常較佳為使用襯板。
於本發明之免疫層析試驗片上可進而存在對照顯示區域(構件)。對照顯示區域係表示準確地實施了試驗之部位。例如，對照顯示區域存在於檢測區域之下游，於檢體試樣通過檢測區域並到達對照顯示區域時，因著色等而發出訊號。於對照顯示區域，可預先將與結合有標記載體之抗體結合之物質固相化，亦可將檢體到達時顏色會發生變化之pH值指示劑等試劑固相化。於結合有標記載體之抗體為小鼠單株抗體之情形時，只要使用抗小鼠IgG(Immunoglobulin G，免疫球蛋白G)抗體即可。
免疫層析試驗片之大小並無特別限定，例如為縱向長度數cm~十數cm，橫向長度數mm~數cm左右。
於上述形態之試驗片中，檢體通過藉由樣品墊、標記物區域、支持體、檢測區域、吸收帶等之一系列連接而形成之多孔性流路。因此，於本形態中，該等均成為檢體移動區域。雖然根據各構成材料之材質或形態，亦可能有檢體不滲透至材料內部而於界面通行之形態，但本說明書中所定義之檢體移動區域並不糾結於材料之內部或界面，因此該形態之試驗片亦
包含於本說明書之範圍內。
於使用本發明之免疫層析試驗片而測定檢體中之醣鏈抗原之情形時，首先需要萃取檢體中之醣鏈抗原。醣鏈抗原之萃取係藉由利用亞硝酸對包含醣鏈抗原之檢體加以處理而進行。亞硝酸可藉由使亞硝酸鈉等亞硝酸鹽與酸混合而產生，只要利用如此而產生之亞硝酸對包含醣鏈抗原之檢體進行處理即可。所萃取之抗原藉由抗原抗體反應而與於免疫層析試驗片上固相化之抗體結合，此時，若反應系中殘留有亞硝酸，則反應系成為酸性，而阻礙抗原抗體反應。因此，需要對反應系之亞硝酸進行中和。
於本發明中，於將亞硝酸鹽與酸加以混合而產生亞硝酸，利用該亞硝酸萃取檢體中之醣鏈抗原，並將亞硝酸加以中和後，使醣鏈抗原與於免疫層析試驗片上固相化之抗體結合，並測定醣鏈抗原之方法中，作為萃取並測定醣鏈抗原之方法，可列舉以下之方法。於任一種方法中，利用亞硝酸所進行之醣鏈抗原之萃取與中和均係於免疫層析試驗片上進行。為了於免疫層析試驗片上進行利用亞硝酸所進行之醣鏈抗原之萃取，只要預先使免疫層析試驗片上含浸酸性試劑或亞硝酸鹽即可。為了於免疫層析試驗片上進行中和，只要預先使免疫層析試驗片上含浸中和試劑即可。
(A)若預先將檢體與酸性溶液混合，並添加至含浸有亞硝酸鹽與中和試劑之免疫層析試驗片之樣品墊上，若混合液到達含浸有亞硝酸鹽之區域，則亞硝酸鹽與酸發生反應，產生亞硝酸，而萃取檢體中之醣鏈抗原。醣鏈抗原之萃取液於免疫層析試驗片上之含浸有中和試劑之區域被中和，醣鏈抗原與於免疫層析試驗片上固相化之抗體結合，而可進行檢測。於該方法中，作為所使用之酸性溶液，可列舉：乙酸、鹽酸、丙二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、檸檬酸、酒石酸等。
(B)若預先將檢體與亞硝酸鹽溶液混合，並添加至包含酸性試劑與中和試劑之免疫層析試驗片之樣品墊上，若混合液到達包含酸性試劑之區域，則亞硝酸鹽與酸發生反應，產生亞硝酸，而萃取檢體中之醣鏈抗原。醣鏈抗原之萃取液於免疫層析試驗片上之含浸有中和試劑之區域被中和，醣鏈抗原與於免疫層析試驗片上固相化之抗體結合，而可進行檢測。
於用以實施上述(A)或(B)之方法之本發明之免疫層析試驗片中，於較標記物區域更靠上游(為檢體流之上游且存在樣品墊之側)處、即樣品墊內或樣品墊與標記物區域之間，含浸有酸性試劑或亞硝酸鹽與中和試劑。於樣品墊內或樣品墊與標記物區域之間含浸有亞硝酸鹽與中和試劑之免疫層析試驗片可用於上述(A)之方法。又，於樣品墊內或樣品墊與標記物區域之間含浸有酸性試劑與中和試劑之免疫層析試驗片可用於上述(B)之方法。再者，作為酸性試劑，可使用固形狀酸性試劑。藉由該等方法，不論供於受檢試樣之試驗之量為何，均能夠準確且特異性地測定受檢試樣中之被檢測物質。
上述固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽可含浸於樣品墊，亦可含浸於樣品墊之外的包含不織布等多孔性材料之墊中，將所獲得之含浸有固形狀酸性試劑之多孔性材料或含浸有亞硝酸鹽之多孔性材料配置於樣品墊與標記物區域之間、即標記物區域之上游側。此處，含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域與樣品墊或標記物區域可接觸亦可不接觸。於本發明中，亦將含浸有試劑之區域稱為含浸有試劑之墊。
上述中和試劑係配置於較含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域更靠下游處。中和試劑可含浸於樣品墊，可含浸於支持體中，亦可含浸於支持體之外的包含不織布(尼龍等)或織物等多孔性材料之墊中，將所獲得
之含浸有中和試劑之多孔性材料配置於含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域與標記物區域之間。即，於標記物區域之上游具有含浸有中和試劑之區域，進而於該含浸有中和試劑之區域之上游具有含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域。
作為含浸中和試劑之區域所使用之多孔性材料之素材，可列舉如下多孔性材料，其具有如下3個特性：為單位面積重量為10~400g/m2，且厚度為0.1~2.0mm之織物，每1cm/m2之吸水量為10~100μl/cm2，且吸水速度為1.0~5.0μl/sec，進而使1cm/m2之斷片於潤濕之狀態下與膜片接觸並靜置5分鐘後之保水量為10~100μl/cm2，較佳為使1cm/m2之斷片於潤濕之狀態下與膜片接觸並靜置5分鐘後之溶液之擴散面積為20mm2以下，即吸水力較高，保水性(液體之保持力)較高，進而液體之釋出性較低或持續釋出。具體而言，可列舉利用纖維素之棉纖維製成之濾紙或利用玻璃纖維製成之玻璃濾紙等。作為此種濾紙，例如可列舉東洋濾紙股份有限公司之No.26-3。又，所使用之濾紙之容積較大，可充分地保持自上游較檢體更慢地到達之酸性溶液。藉由使用此種多孔性材料，能夠含浸可充分地將利用藉由亞硝酸鹽與酸性試劑之反應所產生之亞硝酸萃取了醣鏈抗原之檢體加以中和之量之中和試劑。又，該墊可吸收保持大量液體，且釋出性持續，故而包含殘留於免疫層析試驗片之上游之亞硝酸之溶液於判定時間以後展開時亦可具有充分之中和能力，而可抑制酸性溶液到達將抗體固相化之檢測區域，結果可抑制非特異性反應，於不產生非特異性反應之情況下檢測醣鏈抗原。另一方面，於吸水力較高，保水性較高，釋出性較低之玻璃濾紙之情形時，具體而言，可列舉東洋濾紙股份有限公司之GS-25，由於吸水力較高，故而可含浸更多之中和試劑，保水性較高，釋水性
較低，故而防止酸性溶液到達進行了固相化之檢測區域。其結果為，於陰性之情形時可抑制非特異性反應，於陽性之情形時可防止於判定時間以後之線顯色。
含浸中和試劑之區域所使用之多孔性材料之素材之「單位面積重量」為10~400g/m2。此處，所謂「單位面積重量」係指布等之每單位面積(1m2)之重量。單位面積重量可根據含浸於該墊之中和試劑之量或組成而適當改變。若單位面積重量為30g/m2以下，則空隙率較高，於含浸中和試劑時容易破碎，難以進行免疫層析製造時之處理，故而較佳為單位面積重量50g/m2以上，於單位面積重量為300g/m2以上之情形時，空隙率較低，雖然亦取決於中和試劑之組成，但檢體不會順利地滲透至素材中，無法與中和試劑混合，故而較佳為300g/m2以下。最佳之單位面積重量為250~270g/m2。
又，含浸中和試劑之區域所使用之多孔性材料之素材之「厚度」可為0.1~2.0mm，但厚度可根據含浸於該墊之中和試劑之量或組成而適當改變。於厚度為0.4mm以下之情形時，於含浸中和試劑時容易破碎，難以進行免疫層析製造時之處理，故而作為較佳之厚度，為0.4~0.8mm，容易調節含浸中和試劑之量，且若考慮免疫層析製造時之處理性之容易性，則更佳為0.6mm左右。
「吸水性」較佳為每1cm/m2之吸水量為10~100μl/cm2，且吸水速度為1.0~5.0μl/sec者。關於吸水量與吸水速度，於96孔之EIA(Enzyme immunoassay，酵素免疫分析)板之1孔中準備200μl之進行了著色之溶液(1%Tween 20+紅色102號)，向其中加入將5×60mm之大小之素材貼附於襯板而成之試驗片，將浸漬於溶液中之一端設為試驗片之下端，測定至溶
液到達試驗片之上端為止之時間，進而於溶液到達上端後，立即取出試驗片，並測定殘留於孔中之液量。吸水量係自200μl減去殘留於孔中之液量，並除以素材之每1cm2面積而獲得之液量，吸水速度係根據吸水量/至到達上端為止所耗費之時間而求出。作為含浸中和試劑之區域所使用之多孔性材料之素材，較佳為吸水量較多，且吸水速度較慢之素材。雖然亦取決於固形狀酸性試劑之濃度與含水量，但於吸水量為30μl/cm2以下之情形時，亦考慮未將作為免疫層析試驗片所需之中和試劑完全含浸之情形，故而具體而言，吸水量較佳為30μl/cm2以上。含浸中和試劑之區域所使用之多孔性材料之素材之吸水速度會影響萃取檢體中之醣鏈抗原之時間及中和萃取後之試驗液之時間。萃取醣鏈抗原之時間於某種程度上可利用固形狀酸性試劑之素材或者組成進行調節，但並不完全，故而含浸中和試劑之區域所使用之素材之吸水速度成為對充分之醣鏈抗原之萃取及中和而言重要之要素。具體而言，吸水速度較佳為1.0~5.0μl/sec，更佳之吸水速度為2.0μl/sec以下。
「保水性」可藉由如下方法獲得：將含浸中和試劑之區域所使用之多孔性材料之素材之1cm/m2之斷片置於膜片上，向其中添加70μl之溶液(1%Tween 20+紅色102號)，並測定靜置5分鐘前後之重量。保水性之液量根據所添加之溶液之組成(界面活性劑或蛋白量)而有所變化，於利用1%Tween 20溶液進行試驗之情形時之保水量較佳為10~100μl/cm2，更佳之保水量為15μl/cm2以上。
「釋出性」係藉由如下方法進行測定：將含浸中和試劑之區域所使用之多孔性材料之素材之1cm/m2之斷片置於膜片上，向其中添加70μl之溶液(1%Tween 20+紅色102號)，並求出靜置5分鐘後於膜片上擴散之溶
液之面積。面積根據所添加之溶液之組成(界面活性劑或蛋白量)而有所變化，於利用1%Tween 20溶液進行試驗之情形時之面積為30mm2以下，更佳之釋出性為20mm2以下。
此處，含浸有中和試劑之區域與含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域或標記物區域可接觸亦可不接觸。
將含浸有固形狀酸性試劑之區域稱為固形狀酸性試劑區域，將含浸有亞硝酸鹽之區域稱為亞硝酸鹽區域，將含浸有中和試劑之區域稱為中和試劑區域或鹼性試劑區域。
具有固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域與中和試劑區域之免疫層析試驗片於支持體上自上游起具有樣品墊、固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域、中和試劑區域、標記物區域、檢測區域及吸收帶，固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域可位於樣品墊上。又，關於樣品墊、固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域、中和試劑區域、標記物區域、檢測區域及吸收帶，相鄰之區域彼此可接觸亦可不接觸。進而，固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域、中和試劑區域、標記物區域並非必須含浸於各自獨立之多孔性材料中，亦可使複數個或所有區域含浸於同一多孔性材料中。
本發明中所使用之固形狀酸性試劑係於常溫下為固形狀者，且係於高溫下不會揮發者。
作為本發明中所使用之較佳之固形狀酸性試劑，可列舉：丙二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、檸檬酸、酒石酸。
又，作為本發明中所使用之較佳之固形狀酸性試劑，例如若使用檸檬酸之類的元數較多之酸，則能夠以更少之量進行萃取。又，若為相同之元數，則酸解離常數更小之例如順丁烯二酸、酒石酸之效率良好。
又，作為本發明中所使用之較佳之固形狀酸性試劑，較佳為不會使免疫層析試驗片上著色之試劑、具體為於乾燥狀態下為白色或不易因乾燥熱或氧化而著色之試劑。
作為本發明中所使用之亞硝酸鹽，可列舉亞硝酸鈉、亞硝酸鉀等。
本發明中所使用之固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之使用量、即含浸於免疫層析試驗片之量並無特別限定，通常免疫層析試驗片之每一試驗片為0.01μg~1mg左右，較佳為0.1μg~0.1mg左右。但較佳為根據所使用之固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之種類、檢體懸浮溶液之組成或添加量等，而選擇獲得效果之最佳量。
為了使固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽含浸於樣品墊或多孔性材料，將固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽一次性溶解，並加以塗佈、乾燥。
本發明中所使用之中和試劑係於常溫下為固形狀者，且係於高溫下不會揮發者。
作為本發明中所使用之較佳之中和試劑，可列舉：三(羥甲基)胺基甲烷(Tris-Hydroxymethyl Aminomethane)、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉、於鹼性區域具有緩衝能力之古德緩衝液。
本發明中所使用之中和試劑之使用量、即含浸於免疫層析試驗片之量並無特別限定，通常免疫層析試驗片之每一試驗片為0.01μg~1mg左右，較佳為0.1μg~0.1mg左右。但較佳為根據所使用之中和試劑之種類、檢體懸浮溶液之組成或添加量等，而選擇獲得效果之最佳量。
為了使中和試劑含浸於樣品墊或多孔性材料，只要將中和試劑一次性溶解，並將溶液塗佈於樣品墊或多孔性材料，其後使之乾燥即可。
圖1及圖2係表示典型之免疫層析試驗片之較佳之一形態之圖。圖1及
圖2所示之免疫層析試驗片係含浸有固形狀酸性試劑及中和試劑之免疫層析試驗片，但亦可含浸亞硝酸鹽代替固形狀酸性試劑，於該情形時，成為含浸有亞硝酸鹽及中和試劑之免疫層析試驗片。若為本領域業者，則可適當設計並製造含浸有亞硝酸鹽及中和試劑之免疫層析試驗片。再者，免疫層析試驗片並不限定於圖1及圖2所示者。於圖1及圖2中，1係指支持體，2係指標記物區域，3係指檢測區域，4係指樣品墊，7係指吸收帶，8係指襯板。又，可於整個試驗片上貼附頂部積層層(Top laminate)。
圖1A及圖2A為俯視圖，圖1B及圖2B為切斷剖視圖。於圖1之例中，於利用樹脂等製成之襯板8上分別積層有形成有1個檢測區域3之支持體1、吸收帶7、標記物區域2、樣品墊4等。並且，如圖1所示，吸收帶7之一端部與支持體1之一端部、支持體1之另一端部與標記物區域2之一端部、標記物區域2之另一端部與樣品墊4之一端部分別相互重疊，於樣品墊4之上游部含浸有固形狀酸性試劑，略微隔開距離而於樣品墊之下游部含浸有中和試劑。將含浸有固形狀酸性之試劑之區域稱為固形狀酸性試劑區域5，將含浸有中和試劑之區域稱為中和試劑區域6。於該試驗片中，樣品墊兼作固形狀酸性試劑區域5及中和試劑區域6。即，固形狀酸性試劑區域及中和試劑區域存在於樣品墊上。於該試驗片中，由於固形狀酸性試劑區域及中和試劑區域係設置為1片多孔性材料(墊)狀，故而有時稱為1片墊試驗片。於圖2之例中，於標記物區域2之上游存在固形狀酸性試劑區域5及/或中和試劑區域6，且該等相互重疊，藉此形成連續之橫向流動之流路。於圖2所示之試驗片中，固形狀酸性試劑區域5兼作樣品墊。即，固形狀酸性試劑區域存在於樣品墊上。於該試驗片中，由於固形狀酸性試劑區域及中和試劑區域係設置為各自獨立之2片多孔性材料(墊)狀，故而有時稱為2
片墊試驗片。於固形狀酸性試劑區域之上游可進而存在樣品墊。又，於圖2所示之試驗片中，固形狀酸性試劑區域5及中和試劑區域6係含浸於各自獨立之多孔性材料中，但可如圖1之試驗片之樣品墊般，於同一多孔性材料(墊)上之上游部設置固形狀酸性試劑區域5，且於下游部設置中和試劑區域6。
基於圖1之形態，對本發明之試驗片之使用方法進行說明。以下之使用方法係將檢體與亞硝酸溶液混合，並使用含浸有固形狀酸性試劑與中和試劑之免疫層析試驗法進行測定之方法，但將檢體與酸性溶液混合，並使用含浸有亞硝酸鹽與中和試劑之免疫層析試驗法進行測定之方法亦可參考以下之使用方法之說明而實施。
測定係藉由如下方式開始：將檢體或使用檢體所製備之試樣與亞硝酸鹽溶液接觸混合，使檢體懸浮於亞硝酸鹽溶液中，並添加至樣品墊而供給。此時，只要將檢體5~100μL與0.1M~8M之亞硝酸鹽0.01~2mL混合，並向樣品墊供給5~200μL即可。作為亞硝酸鹽，可列舉亞硝酸鈉、亞硝酸鉀等。
供於樣品墊4之包含作為被檢測物質之醣鏈抗原之檢體藉由毛細管作用向樣品墊4上之固形狀酸性試劑區域5及中和試劑區域6展開，進而沿水平方向依序向標記物區域2、支持體1、吸收帶7展開。於固形狀酸性試劑區域5，混合至檢體中之亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑區域5上之固形狀酸性試劑發生反應，產生游離之亞硝酸，並藉由該亞硝酸之作用自檢體萃取醣鏈抗原。所萃取之醣鏈抗原與酸性之展開溶液一併展開移動至中和試劑區域6，於中和試劑區域6包含醣鏈抗原之酸性之展開溶液之pH值被中和而調整為中性區。其結果為，醣鏈抗原於中性條件下進而展開移動至下游。
於標記物區域2，隨著檢體試樣之展開，標記抗體被釋出至溶液中而向支持體1展開。於檢體試樣中存在醣鏈抗原之情形時，於支持體1之檢測區域3，利用捕捉抗體特異性地捕捉醣鏈抗原，並且醣鏈抗原亦藉由特異性反應與標記抗體形成複合體。藉此，於檢測區域3，形成介隔有醣鏈抗原之抗體之三明治(sandwich)，而可於檢測區域3測定標記抗體-醣鏈抗原複合物。
根據使用本發明之免疫層析試驗片之方法，檢體中之醣鏈抗原之萃取係於免疫層析試驗片上進行，故而無需於使用免疫層析試驗片之測定之前預先萃取檢體中之醣鏈抗原，而可於1個步驟中測定檢體中之醣鏈抗原。
於本發明之方法中，成為檢體之活體試樣並無特別限定，可列舉：血清、血漿、血液、尿液、糞便、唾液、組織液、腦脊髓液、拭子液等體液等或其稀釋物。
於使用本發明之免疫層析試驗片之方法中，成為測定對象之被檢測物質係可藉由免疫分析、即利用抗原抗體反應之分析進行測定之醣鏈抗原。作為抗原，可列舉藉由亞硝酸萃取處理而萃取之存在於細菌之細胞壁之醣鏈抗原即多醣體等。包含該等物質之原生動物、真菌、細菌、黴漿菌、立克次體、披衣菌、病毒等亦可加以測定。藉由使用本發明之免疫層析試驗片之方法，可確認於被試驗體之活體試樣中是否含有源自原生動物、真菌、細菌、黴漿菌、立克次體、披衣菌、病毒等之醣鏈抗原，於含有醣鏈抗原情形時，可判斷為被試驗體罹患有由原生動物、真菌、細菌、黴漿菌、立克次體、披衣菌、病毒等所引起之感染症。例如，可檢測有無感染A群β-溶血性鏈球菌(釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes))、大腸桿
菌、嗜肺性退伍軍人桿菌、曲狀桿菌等。
又，利用於亞硝酸鹽與酸之反應中所產生之亞硝酸萃取醣鏈抗原而獲得之檢體被含浸有中和試劑之墊吸收而相對較長地滯留於該墊內，為了確實地進行中和，可於標記部位之上游設置具有控制檢體試樣溶液於免疫層析試驗片上之展開之物性及特性之成為濾紙或玻璃濾紙之代替之構件。即，於本發明中，含浸中和試劑之區域所使用之多孔性材料之素材視需要可進行預處理，又，為了控制親水度、疏水度，亦可使中和試劑中含有各種藥劑或粉體，或將上述物性或特性以外之素材加工為本發明中所記述之物性或特性之範圍內。作為所含浸之藥劑，可列舉：界面活性劑、蛋白質、樹脂、化學合成高分子等。作為可附加與濾紙或玻璃濾紙同樣之特徵之構件，可列舉尼龍等不織布。
又，於本發明中，於固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域與中和試劑區域相互重疊而接觸之情形時，以插入至固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域與中和試劑區域之間之方式設置阻止液體通過之片材。藉由設置片材，可發揮出以下之3個效果。
(A)於試驗片之保存時可抑制鄰接之2個區域中之試劑之移動。其結果為，可防止由固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽與中和試劑之接觸所引起之反應。其結果為，可提高試劑之穩定性。
(B)又，於添加與亞硝酸鹽或酸性試劑混合之檢體時，可防止由檢體到達固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域，其後即刻移動至中和試劑區域所引起之不充分之醣鏈抗原之萃取。即，包含檢體之液體自固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域向中和試劑區域移動之速度降低，延長包含檢體之液體停留於固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域中之時間，其結果為，充
分地萃取醣鏈抗原而提高測定感度。
(C)進而，於添加與亞硝酸鹽或酸性試劑混合之檢體時，可防止檢體到達固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域，其後即刻移動至中和試劑區域，包含移動之檢體之液體逆流至固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域，降低固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之活性，萃取效率降低。即，防止包含暫時到達中和試劑區域之檢體之液體逆流至固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域，防止固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之活性之降低，高效率地進行利用亞硝酸所進行之醣鏈抗原之萃取處理，而提高測定感度。
設置於固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域與中和試劑區域之間之片材之素材只要為阻止液體通過之素材，則不受限定，例如可使用PET(聚對苯二甲酸乙二酯)片材、聚乙烯片材等樹脂製片材。樹脂製片材亦稱為樹脂製膜。
片材亦可以固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域與中和試劑區域部分地接觸而重疊之方式設置。於該情形時，固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域與中和試劑區域之重疊之部分之長度較佳為儘量縮短，例如為5mm以下，較佳為3mm以下，進而較佳為2mm以下。
又，亦可以固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域與中和試劑區域不接觸之方式設置片材，且將含浸有酸性試劑或亞硝酸鹽之墊設為被覆於PET片材上之形狀。於該情形時，只要中和區域被片材完全覆蓋，且於該片材上設置固形狀酸性試劑區域或亞硝酸區域即可。於該情形時，固形狀酸性試劑區域或亞硝酸區域內之液體不會直接移動至中和區域，而是在流經片材上後到達中和試劑區域。
片材例如只要僅設置於固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域與中和
試劑區域之間即可。另一方面，於以覆蓋免疫層析試驗片之上側之方式貼附樹脂製片材作為頂部層壓片材時，於固形狀酸性試劑區域或亞硝酸區域以外、固形狀酸性試劑區域或亞硝酸區域兼作樣品墊之情形時，只要以覆蓋樣品墊以外之中和試劑區域、標記物區域、支持體、檢測區域、吸收帶之方式貼附頂部層壓片材，且將固形狀酸性試劑區域或亞硝酸鹽區域貼附於貼附於中和試劑部分之上部之頂部層壓片材之上部即可。
即，本發明包含以下之發明。
[1]一種免疫層析試驗片，其係包含：樣品墊，其供於添加與亞硝酸鹽或酸性溶液混合而成之檢體；標記物區域，其包含對針對醣鏈抗原之抗體進行標記而成之標記抗體；及檢測區域，其係將上述針對醣鏈抗原之抗體固相化而成；且於檢測區域形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體，來測定醣鏈抗原；並且於上述標記物區域之上游具有含浸有中和試劑之區域，進而於該含浸有中和試劑之區域之上游，於使用與亞硝酸鹽混合而成之檢體時具有含浸有固形狀酸性試劑之區域，於使用與酸性溶液混合而成之檢體時具有含浸有亞硝酸鹽之區域的用以萃取並測定檢體中之醣鏈抗原者，並且於含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域與含浸有中和試劑之區域之間，插入有樹脂製片材，以抑制兩區域間之試劑之移動或檢體溶液之移動。
[2]如[1]之免疫層析試驗片，其中於樣品墊上存在含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域。
[3]如[1]或[2]之免疫層析試驗片，其中以含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域與含浸有中和試劑之區域部分地接觸之方式，插入有樹脂
製片材。
[4]如[1]或[2]之免疫層析試驗片，其中以含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域與含浸有中和試劑之區域不接觸之方式，插入有樹脂製片材。
[5]如[2]至[4]中任一項之免疫層析試驗片，其中於免疫層析試驗片上之最上游於樣品墊上存在含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域，且利用樹脂製片材覆蓋樣品墊以外之區域，於含浸有中和試劑之區域之上部之樹脂製片材之上部，存在含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之樣品墊。
[6]如[1]至[5]中任一項之免疫層析試驗片，其中固形狀酸性試劑係選自由丙二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、檸檬酸及酒石酸所組成之群之中。
[7]如[1]至[6]中任一項之免疫層析試驗片，其中中和試劑為三(羥甲基)胺基甲烷或氫氧化鈉。
[8]如[1]至[7]中任一項之免疫層析試驗片，其中醣鏈抗原為原生動物、真菌、細菌、黴漿菌、立克次體、披衣菌或病毒之醣鏈抗原。
[9]一種檢體中之醣鏈抗原之測定方法，其係使用如[1]至[8]中任一項之免疫層析試驗片，並藉由免疫層析法而測定檢體中之醣鏈抗原之方法，並且包括如下操作：於免疫層析試驗片具有含浸有固形狀酸性試劑之區域時，將檢體與亞硝酸溶液加以混合，於免疫層析試驗片具有含浸有亞硝酸鹽之區域時，將檢體與酸性溶液加以混合，並添加至上述免疫層析試驗片之樣品墊上，於含浸有固形狀酸性試劑之區域或含浸有亞硝酸鹽之區域，藉由利用亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑之反應所產生之亞硝酸之作用，自檢體萃取
醣鏈抗原，且於含浸有中和試劑之區域，將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，於檢測區域，藉由形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體之免疫層析法，控制檢體於免疫層析試驗片上展開之速度或方向，而控制利用酸性試劑、亞硝酸鹽及中和試劑所進行之處理，並測定檢體中之醣鏈抗原。
又，本發明之免疫層析裝置亦可將添加口設置為較寬。
例如，收納有縱向長度為5~9cm，較佳為7cm，橫向長度為0.3~0.7cm，較佳為0.5cm之免疫層析試驗片之先前之免疫層析裝置(QuickNavi(商標)-Strep A、DENKA SEIKEN)之添加口係設置為具有約3.5mm×約5.5mm(19.25mm2)之尺寸之大致矩形之添加口，收納相同之尺寸之免疫層析試驗片之本發明之免疫層析裝置之添加口係設置為具有約3.5mm×約11mm(38.5mm2)之尺寸之大致矩形之添加口。由於免疫層析裝置及收納於其中之免疫層析試驗片之大小成為大致類似尺寸，故而於長度為橫向3cm、縱向9cm之免疫層析裝置中具有為大致矩形且3~5mm×8~15mm(24~75mm2)之添加口之免疫層析裝置係添加口較寬之免疫層析裝置，可發揮出本發明之免疫層析裝置之效果。添加口之較長之邊係與層析試驗片之較長之邊平行之邊，即沿著檢體試樣溶液之流動方向之邊。有時將添加口之較長之邊之長度稱為添加口長，將較短之邊之長度稱為添加口寬。上述例為大致矩形之添加口之情形，但添加口之形狀可為三角形亦可為圓形。於以面積表示本發明之免疫層析裝置之添加口之大小之情形時，為24~75mm2，較佳為35~75mm2。
於先前之免疫層析法中，於利用設置於免疫層析試驗片上之檢體處理試劑進行檢體處理時，試樣溶液與含浸有檢體處理試劑之區域接觸之面
積較少，故而檢體處理能力較弱，並且一面緩慢展開免疫層析試驗片，一面進行檢體處理，故而於最初展開之試樣溶液與其後展開之試樣溶液間產生檢體處理試劑之濃度差。因此，無法確實地進行檢體處理。
由於本發明之免疫層析裝置設置有較寬之添加口，故而可於短時間內向免疫層析上之含浸有檢體處理試劑之區域、即含浸有固形狀酸性試劑之區域或含浸有亞硝酸之區域一次性供給大量檢體試樣溶液。其結果為，可促進免疫層析試驗片上之醣鏈抗原之萃取。可一次性供給之檢體試樣溶液為10μL~200μL。
其結果為，不產生由時間差所引起之檢體處理試劑之濃度差，故而可促進免疫層析上之檢體處理，而確實且高效率地進行。
於本發明之免疫層析裝置中，以於添加口與位於其下之樣品墊之間無間隙之方式構成，以避免試樣自添加口溢出。
本發明之免疫層析裝置係設置有較寬之添加口，而一次性供給大量檢體試樣溶液。又，於作為添加口之外輪廓之邊緣部分有一定之高度(1~5mm)，所供給之檢體試樣溶液係暫時貯存於添加口內。
其結果為，至檢體試樣溶液之全部被免疫層析試驗片吸收為止較耗費時間，故而有時試樣溶液未被免疫層析試驗片吸收而向免疫層析試驗片外溢出。
本發明之免疫層析之裝置中，對於支持樣品墊之襯板，為了不使試樣自添加口溢出，利用與添加口之外輪廓尺寸同等或大於其之外輪廓尺寸之襯板支持樣品墊，藉此利用襯板將樣品墊向添加口壓抵之力發揮作用，而可以於添加口與樣品墊之間無間隙之方式構成，因此可防止試樣溶液之漏出。
又，於樣品墊之厚度存在差異之情形時，樣品墊之厚度較薄之部位容易出現與添加口之間隙，而容易產生試樣溶液之漏出。
於本發明中，對於樣品墊之較薄之部位將裝置之容器之台座設計為較高，且對於較厚之部位將台座設計為較低，即便於墊之厚度存在差異之情形時亦能夠以於添加口與墊之間無間隙之方式構成，因此可防止試樣溶液之漏出。
其結果為，可高效率地進行免疫層析試驗片上之醣鏈抗原之萃取。
即，本發明包含以下之發明。
[1]一種免疫層析裝置，其係包含用以萃取並測定檢體中之醣鏈抗原之免疫層析試驗片與收納該試驗片之容器，且於試驗片之下述樣品墊上具有檢體添加口者，該免疫層析試驗片包含：樣品墊，其供於添加與亞硝酸鹽或酸性溶液混合而成之檢體；標記物區域，其包含對針對醣鏈抗原之抗體進行標記而成之標記抗體；及檢測區域，其係將上述針對醣鏈抗原之抗體固相化而成；且於檢測區域形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體，來測定醣鏈抗原；並且於上述標記物區域之上游具有含浸有中和試劑之區域，進而於該含浸有中和試劑之區域之上游，於使用與亞硝酸鹽混合而成之檢體時具有含浸有固形狀酸性試劑之區域，於使用與酸性溶液混合而成之檢體時具有含浸有亞硝酸鹽之區域，並且(i)具有較寬之檢體添加口，該檢體添加口係用於保持所添加之檢體試樣溶液，並以短時間向上述含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域供給檢體試樣溶液，藉此促進利用亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑所進行之醣鏈抗原之萃取，(ii)於添加口與樣品墊之間無間隙，以避免試樣自添加口溢出。
[2]如[1]之免疫層析裝置，其中免疫層析裝置之檢體添加口具有24~75mm2之尺寸。
[3]如[1]或[2]之免疫層析裝置，其中藉由使免疫層析試驗片上之含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽、或者中和試劑之墊包含疏水性較高之素材，來延緩檢體試樣溶液之展開時間，而促進利用亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑所進行之醣鏈抗原之萃取。
[4]如[3]之免疫層析裝置，其中疏水性較高之素材係選自由聚乙烯、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、嫘縈及尼龍所組成之群之中。
[5]如[1]或[2]之免疫層析裝置，其中藉由使免疫層析試驗片上之含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽、或者中和試劑之墊包含親水度較高之素材，來延緩檢體試樣溶液之展開時間，而促進利用亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑所進行之醣鏈抗原之萃取。
[6]如[5]之免疫層析裝置，其中親水度較高之素材係有厚度之濾紙。
[7]如[1]至[6]中任一項之免疫層析裝置，其中藉由向免疫層析試驗片上之含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽、或者中和試劑之墊添加界面活性劑，來調節檢體試樣溶液之展開時間，而促進利用亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑所進行之醣鏈抗原之萃取。
[8]如[7]之免疫層析裝置，其中界面活性劑係選自由聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、膽酸鈉、去氧膽酸、月桂基硫酸鈉及十二烷基苯磺酸鈉所組成之群之中。
[9]如[1]至[8]中任一項之免疫層析裝置，其中藉由向免疫層析試驗片上之含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽、或者中和試劑之墊添加具有固定化作用之高分子化合物，來調節檢體試樣溶液之展開時間，而促進利用
亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑所進行之醣鏈抗原之萃取。
[10]如[9]之免疫層析裝置，其中具有固定化作用之高分子化合物為PVA(Polyvinyl Alcohol，聚乙烯醇)或PLL(Poly-L-Lysine，聚L-離胺酸)。
[11]如[1]至[10]中任一項之免疫層析裝置，其中含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域係存在於樣品墊上或者塗佈形成有標記物區域之墊上。
[12]如[1]至[11]中任一項之免疫層析裝置，其中固形狀酸性試劑係選自由丙二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、檸檬酸及酒石酸所組成之群之中。
[13]如[1]至[12]中任一項之免疫層析裝置，其中中和試劑為三(羥甲基)胺基甲烷或氫氧化鈉。
[14]如[1]至[13]中任一項之免疫層析裝置，其中中和試劑為三(羥甲基)胺基甲烷或氫氧化鈉。
[15]一種檢體中之醣鏈抗原之測定方法，其係使用如[1]至[14]中任一項之免疫層析裝置，並藉由免疫層析法而測定檢體中之醣鏈抗原之方法，並且包括如下操作：於免疫層析裝置具有含浸有固形狀酸性試劑之區域時，將檢體與亞硝酸溶液加以混合，於免疫層析裝置具有含浸有亞硝酸鹽之區域時，將檢體與酸性溶液加以混合，並添加至上述免疫層析裝置之樣品墊上，
於含浸有固形狀酸性試劑之區域或含浸有亞硝酸鹽之區域，藉由利用亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑之反應所產生之亞硝酸之作用，自檢體萃取醣鏈抗原，且於含浸有中和試劑之區域，將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液
加以中和，
於檢測區域，藉由形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體的免疫層析法而促進醣鏈抗原之萃取，並測定檢體中之醣鏈抗原。
藉由以下之實施例具體地說明本發明，但本發明不受該等實施例之限定。
於以下之實施例中，%於並未特別說明之情形時表示w/v%。
實施例1
1.抗釀膿鏈球菌(A群β-溶血性鏈球菌)抗體向硝基纖維素膜片(支持體)之固定化
準備以成為1.0mg/mL之方式利用純化水對抗釀膿鏈球菌抗體進行稀釋而成之溶液及抗兔IgG抗體，分別於利用PET(聚對苯二甲酸乙二酯)膜加襯而成之硝基纖維素膜片之樣品墊側以線狀塗佈抗釀膿鏈球菌抗體，於吸收帶側以線狀塗佈抗兔IgG抗體。其後，將硝基纖維素膜片以45℃乾燥30分鐘，而獲得抗釀膿鏈球菌抗體固定化膜片。於本實施例中，將該膜片稱為「抗體固定化膜片」。
2.抗釀膿鏈球菌抗體向著色聚苯乙烯粒子之固定化
以成為1.0mg/mL之方式利用純化水對抗釀膿鏈球菌抗體進行稀釋，以成為0.1%之方式向其中添加著色聚苯乙烯粒子，攪拌後，以成為1%之方式添加碳二醯亞胺，進而進行攪拌。藉由離心操作去除上清液，使之再懸浮於50mM三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)(pH值9.0)、3%BSA(Bull Serum Albumin，牛血清蛋白)中，而獲得結合有0.04%抗釀膿鏈球菌抗體之著色聚苯乙烯粒子懸浮液。於本實施例中，將該粒子稱為「抗體固定化粒
子」。
3.結合有抗釀膿鏈球菌抗體之著色聚苯乙烯粒子之塗佈、乾燥
將特定量之2中所製作之抗體固定化粒子懸浮液塗佈於不織布上，以45℃乾燥30分鐘。於本實施例中，將所獲得之不織布稱為「乾燥墊」。
4.中和試劑(鹼性試劑)之塗佈
以30μL/cm將作為中和試劑(鹼性試劑)之3M Trizma(商標名)Base(三(羥甲基)胺基甲烷)、1.5% Triton X100塗佈於表1所示之構件上。
5.含浸有固形狀酸性試劑之不織布之製作
以13μL/cm將作為固形狀酸性試劑之1.0M酒石酸、0.5% Triton X100塗佈於不織布(Unitika：Elves)上。於塗佈後立即以45℃乾燥1小時，而獲得含浸有固形狀酸性試劑之不織布。
6.釀膿鏈球菌檢測用免疫層析試驗片之製作
將1中所製作之抗體固定化膜片、3中所製作之乾燥墊、4中所製作之中和試劑(鹼性試劑)墊、5中所製作之固形狀酸性試劑墊與其他構件(襯板、吸收帶)貼合並切割成寬度5mm，設為釀膿鏈球菌檢測用免疫層析試驗片。於本實施例中，將使用含浸有固形狀酸性試劑及中和試劑(鹼性試劑)之濾紙作為樣品墊之試驗片稱為「本發明免疫層析試驗片」。再者，免疫層析試驗片係沿著檢體流向，自上游起具備含浸有固形狀酸性試劑之不織布、含浸有中和試劑(鹼性試劑)之不織布、乾燥墊(標記物區域)、抗體固定化膜片(檢測區域)、及吸收帶者。
7.測定
向本發明免疫層析試驗片上滴加75μL之添加有作為陰性檢體之pH值指示劑(酚紅)之2M亞硝酸鈉溶液，並於5分鐘~60分鐘後進行判定。
將結果示於表1。
根據表1之結果可知，作為塗佈中和試劑(鹼性試劑)之構件，較佳為具有以下之特性之構件。
(1)物性(單位面積重量及厚度)
單位面積重量為10以上~400g/m2，且厚度為0.1~2.0mm，較佳為單位面積重量為50以上且300g/m2以下，且厚度為0.4~0.8mm，更佳為單位面積重量為250g，厚度為0.6mm左右。
(2)吸水性
具有每1cm2之吸水量為10μl/cm2~100μl/cm2且吸水速度為1.0μl/sec~5μl/sec、較佳為30μl/cm2以上之吸水量且吸水速度為2μl/sec以下、更佳為吸水量為30μl/cm2以上且吸水速度為1.5μl/sec以下之吸水性。
(3)保水性
具有於潤濕之狀態下與膜片接觸，5分鐘後之保水性(每1cm2)為3μl/cm2~100μl/cm2，較佳為15μl/cm2以上之吸水性。
物性與吸水性只要為上述範圍內即可，保水性或保持性並非必須特性，但較佳為亦具有保水性及保持性。
[表1]
使用本發明之免疫層析裝置，能夠高感度且準確地檢測A群β-溶血性鏈球菌之感染。
本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請係直接藉由引用而併入本說明書中。
Claims (9)
- 一種免疫層析試驗片，其係包含：樣品墊，其供於添加與亞硝酸鹽或酸性溶液混合而成之檢體；標記物區域，其包含對針對醣鏈抗原之抗體進行標記而成之標記抗體；及檢測區域，其係將上述針對醣鏈抗原之抗體固相化而成；且於檢測區域形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體，來測定醣鏈抗原；並且於上述標記物區域之上游具有含浸有中和試劑之區域，進而於該含浸有中和試劑之區域之上游，於使用與亞硝酸鹽混合而成之檢體時具有含浸有固形狀酸性試劑之區域，於使用與酸性溶液混合而成之檢體時具有含浸有亞硝酸鹽之區域的用以萃取並測定檢體中之醣鏈抗原者，並且含浸有中和試劑之區域之素材係具有吸收性較高，保水性較高，且釋出性較低或釋出性持續之3個特性之濾紙或玻璃濾紙，其單位面積重量為50~300g/m2，厚度為0.4~0.8mm，每1cm/m2之吸水量為30~100μl/cm2，吸水速度為1.0~2.0μl/sec，使1cm/m2之斷片於潤濕之狀態下與檢測區域接觸並靜置5分鐘後之保水量為15~100μl/cm2，且使1cm/m2之斷片於潤濕之狀態下與膜片接觸並靜置5分鐘後之溶液之擴散面積為20mm2以下，藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之較低程度或釋出性之持續，而抑制殘留之酸性溶液到達檢測區域、或經充分中和之試驗液繼續於檢測區域中持續展開，藉此抑制非特異性反應。
- 如請求項1之免疫層析試驗片，其中含浸有中和試劑之區域之素材為單位面積重量為250~270g/m2。
- 如請求項1或2之免疫層析試驗片，其中藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之持續力，殘留之酸性溶液於到達檢測區域時亦蓄積充分之中和能力，藉此抑制非特異性反應。
- 如請求項1或2之免疫層析試驗片，其中藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之較低程度，而抑制殘留之酸性溶液到達檢測區域，於陰性之情形時抑制非特異性反應，於陽性之情形時防止判定時間以後之線顯色。
- 如請求項1或2之免疫層析試驗片，其中含浸有固形狀酸性試劑或亞硝酸鹽之區域係存在於樣品墊上或塗佈有標記物區域之墊上。
- 如請求項1或2之免疫層析試驗片，其中固形狀酸性試劑係選自由丙二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、檸檬酸及酒石酸所組成之群之中。
- 如請求項1或2之免疫層析試驗片，其中中和試劑為三(羥甲基)胺基甲 烷或氫氧化鈉。
- 如請求項1或2之免疫層析試驗片，其中醣鏈抗原為原生動物、真菌、細菌、黴漿菌、立克次體、披衣菌或病毒之醣鏈抗原。
- 一種檢體中之醣鏈抗原之測定方法，其係使用如請求項1至8中任一項之免疫層析試驗片，並藉由免疫層析法而測定檢體中之醣鏈抗原之方法，並且包括如下操作：於免疫層析試驗片具有含浸有固形狀酸性試劑之區域時，將檢體與亞硝酸溶液加以混合，於免疫層析試驗片具有含浸有亞硝酸鹽之區域時，將檢體與酸性溶液加以混合，並添加至上述免疫層析試驗片之樣品墊上，於含浸有固形狀酸性試劑之區域或含浸有亞硝酸鹽之區域，藉由利用亞硝酸鹽與固形狀酸性試劑之反應所產生之亞硝酸之作用，自檢體萃取醣鏈抗原，且於含浸有中和試劑之區域，將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，於檢測區域，藉由形成抗體-醣鏈抗原-標記抗體之複合體之免疫層析法，藉由含浸有中和試劑之區域之吸水性之較高程度及保水性之較高程度，而充分將包含上述醣鏈抗原之酸性溶液加以中和，藉由含浸有中和試劑之區域之釋出性之較低程度或釋出性之持續，而抑制殘留之酸性溶液到達檢測區域或經充分中和之試驗液繼續於檢測區域中持續展開，藉此抑制非特異性反應，並測定檢體中之醣鏈抗原。
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