TWI687433B - 落地生根屬的白粉病抗性基因 - Google Patents

Abstract

本發明係關於能夠為屬於落地生根屬的植物提供白粉病抗性表現型(或白粉病抗性)的蛋白質。本案之白粉病抗性較佳係對抗其中落地生根卵黴係原因性病原體的白粉病感染的抗性。本發明亦關於編碼本發明之蛋白質的核酸序列、或cDNA序列、與基因。本發明進一步關於使用本發明之蛋白質、核酸序列與基因以挑選白粉病抗性落地生根屬植物，諸如落地生根卵黴抗性落地生根屬植物，與關於白粉病抗性落地生根屬植物，諸如落地生根卵黴抗性落地生根屬植物，其包含本發明之蛋白質、本發明之cDNA之mRNA形式或本發明之基因。具體言之，本發明係關於相較於SEQ ID No.1之蛋白質或與其有80%序列一致性的蛋白質，在落地生根屬植物之硫酯酶或類硫酯酶蛋白質中包含一或多個胺基酸取代、刪除、或插入的蛋白質，其中相較於包含SEQ ID No.1或與其有80%序列一致性的蛋白質的落地生根屬植物，該一或多個胺基酸取代、刪除或插入在落地生根屬植物中提供增加的白粉病抗性。

Description

落地生根屬的白粉病抗性基因

本發明係關於能夠為屬於落地生根屬(Kalanchoe)的植物提供白粉病抗性表現型(或白粉病抗性)的蛋白質。本案之白粉病抗性較佳係對抗其中落地生根卵黴(Oidium kalanchoeae)係原因性病原體的白粉病感染的抗性。本發明亦關於編碼本發明之蛋白質的核酸序列、或cDNA序列、與基因。本發明進一步關於使用本發明之蛋白質、核酸序列與基因以挑選白粉病抗性落地生根屬植物，諸如落地生根卵黴抗性落地生根屬植物，與關於白粉病抗性落地生根屬植物，諸如落地生根卵黴抗性落地生根屬植物，其包含本發明之蛋白質、本發明之cDNA之mRNA形式或本發明之基因。

落地生根屬係景天科(Crassulaceae)中的一個屬，其具有約125種熱帶多肉質開花植物。此屬中已知僅有一種發源自美洲、56種發源自東非洲與南非洲且60種發源自馬達加斯加。落地生根屬植物亦於東南亞洲與中國找到。

屬於落地生根屬植物的已知物種為阿黛勒落地生根(Kalanchoe adelae)；樹狀伽藍菜(Kalanchoe arborescens)、極樂鳥(Kalanchoe beauverdii)、仙女之舞(Kalanchoe beharensis)、魚叉葉長壽(Kalanchoe bentii)、長壽花(Kalanchoe blossfeldiana)、布维落地生根(Kalanchoe bouvetii)、銀之太鼓(Kalanchoe bracteata)、長壽山櫻花(Kalanchoe campanulata)、蝴蝶之舞(Kalanchoe crenata)、Kalanchoe crundallii、大葉落地生根(Kalanchoe daigremontiana)、洋吊鐘(Kalanchoe delagoensis)、麋鹿之舞(Kalanchoe dinklagei)、福兔耳(Kalanchoe eriophylla)、圓貝葉(Kalanchoe farinacea)、玉吊鐘(Kalanchoe fedtschenkoi)、紫武藏(Kalanchoe figuereidoi)、紅花伽藍菜(Kalanchoe flammea)、Kalanchoe gastonis、矮生伽藍菜(Kalanchoe glaucescens)、青蔓花(Kalanchoe gracilipes)、花櫟長壽(Kalanchoe grandidieri)、天之羽袖(Kalanchoe grandiflora)、銀勺(Kalanchoe hildebrantii)、金線長壽(Kalanchoe jongmansii)、香長壽(Kalanchoe kewensis)、裂葉伽藍菜(Kalanchoe laciniata)、蕾絲姑娘(Kalanchoe laetivirens)、Kalanchoe lateritia、蝴蝶之舞(Kalanchoe laxiflora)、草薙之劍(Kalanchoe linearifolia)、長花長壽(Kalanchoe longiflora)、Kalanchoe luciae、Kalanchoe macrochlamys、宮燈長壽花(Kalanchoe manginii)、白姬之舞(Kalanchoe marnieriana)、江戶紫(Kalanchoe marmorata)、千兔耳(Kalanchoe millottii)、君子蘭長壽(Kalanchoe miniata)、日蓮之盃(Kalanchoe nyikae)、扁柏長壽(Kalanchoe obtusa)、仙人之舞(Kalanchoe orgyalis)、Kalanchoe peltata、Kalanchoe petitiana、落地生根(Kalanchoe pinnata)、燈籠菜(Kalanchoe porphyrocalyx)、四方蜻蜓(Kalanchoe prolifera)、妙義(Kalanchoe pubescens)、白銀之舞(Kalanchoe pumila)、Kalanchoe quartiniana、扇雀(Kalanchoe rhombopilosa)、長壽果(Kalanchoe robusta)、Kalanchoe rolandi、玫瑰長壽(Kalanchoe rosei)、圓葉伽藍菜(Kalanchoe rotundifolia)、Kalanchoe schizophylla、鋸緣青蟹(Kalanchoe aerrata)、朱蓮(Kalanchoe sexangularis)、Kalanchoe streptantha、Kalanchoe suarezensis、趣蝶蓮(Kalanchoe synsepala)、雙飛蝴蝶(Kalanchoe synsepala f.dissecta)、唐印(Kalanchoe thyrsiflora)、月兔耳(Kalanchoe tomentosa)、洋吊鐘(Kalanchoe tubiflora)、獨葉草(Kalanchoe uniflora)、白蠟長壽(Kalanchoe velutina)與Kalanchoe viguieri。

大部分落地生根屬植物係灌木或多年生草本植物，但有些係一年生的或二年生的。最大型的植物(來自馬達加斯加的仙女之舞)可達到6公尺但是大多的物種係小於1公尺。落地生根屬植物之特徵在於透過在花瓣之內表面上生長新細胞以迫使花瓣向外來打開其花朵以及在花瓣之外側上生長新細胞來關閉花瓣。

落地生根屬植物一般被栽培作為家庭觀賞植物與岩石或多肉質庭園植物。落地生根屬植物係受歡迎的，而此係因為其等易於繁殖、水需求低、以及遠高於營養生長的通常簇生的各種各樣的花色。落地生根節(Bryophyllum)(之前為一個獨立的屬)含有諸如「氣生植物」落地生根的物種。於此等植物中，新的個體在沿著葉子的鋸齒狀邊緣營養生長成小植株(亦稱為珠芽或芽孢)。此等幼小的植物最終脫落並生根。在此屬之物種中尚未發現雄性，其確實會開花並產生種子且通常被稱為百子千孫(Mother of Thousands)。

與其他景天科植物(諸如奇峰錦属(Tylecodon)植物、銀波錦屬(Cotyledon)植物與天錦章屬(Adromischus)植物)一樣，一些落地生根屬物種含有可導致心臟中毒(特別是在草食動物)的蟾蜍強心苷心臟醣苷。此在南非之卡魯(Karoo)地區之許多落地生根屬物種之原生分布區 中係一個特殊的問題，在該處所導致的動物疾病被稱為krimpsiekte(萎縮病)或Cotyledonosis。類似的中毒事件亦已在澳洲發生。

在傳統醫學中，落地生根屬物種已被用於治療病痛，諸如感染、風濕病與發炎。落地生根屬植物萃取物亦具有免疫抑制功效。落地生根已在千里達與托巴哥島被記錄可用於高血壓的傳統醫療。

白粉病本身之表現形式為薄的、表面的、通常帶白色的生長物，其由特別在活植物上產生的微小菌絲(真菌之細絲)組成。於園藝中，白粉病係一種一般由屬於白粉菌目(Erysiphales)的真菌造成的疾病。「白粉病」之名稱亦可更一般性地用於意謂黴菌生長。於技術領域中，白粉病(mildew)亦被稱為白粉病(powdery mildew)且術語白粉病(mildew)與白粉病(powdery mildew)在本文中係可互換地使用。

落地生根屬植物尤其易受白粉病感染。雖然白粉病一般對於植物之生長無害，其確實會使植物變得不好看與無吸引力且因此造成植物育種者之重大經濟損失。

白粉病感染在落地生根屬植物中的主要症狀係在葉、芽、莖、新的幼枝與花朵上的白色滑石粉狀生長物之存在。白粉病真菌偏好感染幼嫩葉但是亦會感染老葉。其他與白粉病聯結的症狀包含葉子發黃、葉子壞死、葉子捲曲、葉子扭曲與過早落葉。被白粉病感染的落地生根屬植物往往變得發育遲緩。嚴重的白粉病感染最終可覆蓋整珠植物。預防白粉病感染可通過栽培性控制方法或殺真菌劑來實現。

以基於栽培的方法與殺真菌劑來在落地生根屬植物中控制白粉病皆有缺點。例如，基於栽培的方法對於落地生根屬植物之商業性生 長與栽培是不實用的而殺真菌劑之缺點係一般已知的，諸如其等對環境的衝擊與自由殺真菌劑造成的選擇壓力而生的抗性白粉病病原體之發展。

考慮到白粉病感染之經濟衝擊，落地生根屬植物育種之技術領域中持續存在著對於白粉病抗性落地生根屬植物(且尤其是對白粉病病原體落地生根卵黴有抗性的落地生根屬植物)的需求。在技術領域中，落地生根卵黴，落地生根卵黴亦被命名為落地生根卵黴(Oidium kalanchoës)或落地生根卵黴(Oidium calanchoeae)。

本發明之目標之一，在其他目標內，係滿足上述技術領域中的需求。

上述目標，在其他目標內，係透過提供編碼提供白粉病抗性的硫酯酶或類硫酯酶蛋白質的白粉病(mildew)(或白粉病(powdery mildew))抗性基因而由本發明滿足。

具體言之，上述目標，在其他目標內與根據第一方面，係透過以下者由本發明滿足：提供一種蛋白質，其相較於SEQ ID No.1之蛋白質或與其有80%序列一致性的蛋白質，在落地生根屬植物之硫酯酶或類硫酯酶蛋白質中包含一或多個胺基酸取代、刪除或插入，其中相較於包含SEQ ID No.1或與其有80%序列一致性的蛋白質的落地生根屬植物，該一或多個胺基酸取代、刪除或插入使在落地生根屬植物中提供增加的白粉病抗性。

本文所描述的蛋白質可被命名為ROK-1蛋白質，因為其為第一個被鑑認出會提供白粉病抗性(且尤其是對白粉病病原體落地生根卵 黴抗性)的蛋白質。

無論編碼性基因係以同型合子或異型合子存在，本發明之增加的白粉病抗性(且尤其是本發明之對落地生根卵黴的抗性)皆可被觀察到。

在本發明之前後文中，在相對應蛋白質提供落地生根屬植物之白粉病抗性的情況下，思量80%至99%的序列一致性百分比，諸如81%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%。

用於本文，序列一致性(在適合的排比後)意指在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3分別的整個長度範圍內一致性胺基酸或核酸之百分比。

根據本發明之此方面之一個尤佳的具體態樣，本發明之蛋白質在SEQ ID No.1之胺基酸1至50中包含一或多個胺基酸取代、刪除或插入。本案之發明人已出人意料地發現本發明之白粉病抗性表現型(諸如對白粉病病原體落地生根卵黴的抗性)尤其可透過修飾SEQ ID No.1之N端區域來提供。本發明較佳係關於位於SEQ ID No.1之位置22及/或位置23的胺基酸取代，更佳係關於位於SEQ ID No.1之位置22及/或23的胺基酸蘇胺酸之取代，最佳係關於位於SEQ ID No.1之位置22及/或23的胺基酸蘇胺酸以胺基酸丙胺酸取代。

根據本發明之又另一個尤佳的具體態樣，本發明之蛋白質之胺基酸序列係如於SEQ IID No.2中顯示的胺基酸序列。

根據最佳的具體態樣，根據本發明的蛋白質包含胺基酸序列模體「PATAAEST」。相較之下，不提供白粉病抗性的蛋白質包含(例如)胺基酸序列模體「PATTTEST」。

根據本發明之此第一方面之一個較佳的具體態樣，本發明之落地生根屬植物係選自由以下者所組成的群組：阿黛勒落地生根、樹狀伽藍菜、極樂鳥、仙女之舞、魚叉葉長壽、長壽花、布维落地生根、銀之太鼓、長壽山櫻花、蝴蝶之舞、Kalanchoe crundallii、大葉落地生根、洋吊鐘、麋鹿之舞、福兔耳、圓貝葉、玉吊鐘、紫武藏、紅花伽藍菜、Kalanchoe gastonis、矮生伽藍菜、青蔓花、花櫟長壽、天之羽袖、銀勺、金線長壽、香長壽、裂葉伽藍菜、蕾絲姑娘、Kalanchoe lateritia、蝴蝶之舞、草薙之劍、長花長壽、Kalanchoe luciae、Kalanchoe macrochlamys、宮燈長壽花、白姬之舞、江戶紫、千兔耳、君子蘭長壽、日蓮之盃、扁柏長壽、仙人之舞、Kalanchoe peltata、Kalanchoe petitiana、落地生根、燈籠菜、四方蜻蜓、妙義、白銀之舞、Kalanchoe quartiniana、扇雀、長壽果、Kalanchoe rolandi、玫瑰長壽、圓葉伽藍菜、Kalanchoe schizophylla、鋸緣青蟹、朱蓮、Kalanchoe streptantha、Kalanchoe suarezensis、趣蝶蓮、雙飛蝴蝶、唐印、月兔耳、洋吊鐘、獨葉草、白蠟長壽與Kalanchoe viguieri；較佳係選自由以下者所組成的群組的裝飾性開花落地生根屬植物：長壽花、裂葉伽藍菜、圓葉伽藍菜、K.aromatica、妙義、天之羽袖、K.citrina、K.ambolensis、K.faustii、K.schumacherii、K.pritwitzii、紅花伽藍菜、K.figueredoi、K.rauhii、扁柏長壽、白銀之舞、江戶紫、K.porphyrocalux、金線長壽、落地生根、大葉落地生根、青蔓花、長壽山櫻花、K.latisepela、K.coccinea、玉吊鐘、洋吊鐘(K.tubiflora)、圓葉伽藍菜(K.decumbens)、宮燈長壽花、仙人之舞、蝴蝶之舞、月兔耳與其雜種。

根據第二個方面，本發明係關於編碼本發明之蛋白質的核酸序列，較佳地本發明之核酸序列在SEQ ID No.3之位置64、及/或67具有 核酸取代，諸如以G取代A，更佳地本發明之核酸序列具有如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6中描寫的序列。

根據第三個方面，本發明係關於能夠被轉錄成本發明之核酸序列與本發明之蛋白質的基因。據此，本發明涵蓋在適當的條件下能夠作為用於轉錄mRNA的模版的基因，該mRNA接著被轉譯成本發明之蛋白質序列。

根據第四個方面，本發明係關於使用本發明之蛋白質、核酸序列或基因以挑選白粉病抗性落地生根屬植物。如此挑選可包含鑑認(較佳係在發育的早期)白粉病抗性落地生根屬植物，諸如落地生根卵黴抗性落地生根屬植物，其藉由(例如)雜交、PCR、ELISA、限制酶分析或北方/南方墨漬法，藉此促進現存與新的落地生根屬植物之育種過程。

本發明之用途較佳係用於挑選選自由以下者所組成的群組的白粉病抗性落地生根屬植物：阿黛勒落地生根、樹狀伽藍菜、極樂鳥、仙女之舞、魚叉葉長壽、長壽花、布维落地生根、銀之太鼓、長壽山櫻花、蝴蝶之舞、Kalanchoe crundallii、大葉落地生根、洋吊鐘、麋鹿之舞、福兔耳、圓貝葉、玉吊鐘、紫武藏、紅花伽藍菜、Kalanchoe gastonis、矮生伽藍菜、青蔓花、花櫟長壽、天之羽袖、銀勺、金線長壽、香長壽、裂葉伽藍菜、蕾絲姑娘、Kalanchoe lateritia、蝴蝶之舞、草薙之劍、長花長壽、Kalanchoe luciae、Kalanchoe macrochlamys、宮燈長壽花、白姬之舞、江戶紫、千兔耳、君子蘭長壽、日蓮之盃、扁柏長壽、仙人之舞、Kalanchoe peltata、Kalanchoe petitiana、落地生根、燈籠菜、四方蜻蜓、妙義、白銀之舞、Kalanchoe quartiniana、扇雀、長壽果、Kalanchoe rolandi、玫瑰長壽、圓葉伽藍菜、Kalanchoe schizophylla、 鋸緣青蟹、朱蓮、Kalanchoe streptantha、Kalanchoe suarezensis、趣蝶蓮、雙飛蝴蝶、唐印、月兔耳、洋吊鐘、獨葉草、白蠟長壽與Kalanchoe viguieri；更佳係選自由以下者所組成的群組的裝飾性開花落地生根屬植物：長壽花、裂葉伽藍菜、圓葉伽藍菜、K.aromatica、妙義、天之羽袖、K.citrina、K.ambolensis、K.faustii、K.schumacherii、K.pritwitzii、紅花伽藍菜、K.figueredoi、K.rauhii、扁柏長壽、白銀之舞、江戶紫、K.porphyrocalux、金線長壽、落地生根、大葉落地生根、青蔓花、長壽山櫻花、K.latisepela、K.coccinea、玉吊鐘、洋吊鐘、圓葉伽藍菜、宮燈長壽花、仙人之舞、蝴蝶之舞、月兔耳與其雜種。

根據第五個方面，本發明係關於包含本發明之蛋白質、本發明之核酸序列或本發明之基因的植物、原生質體或植物部分。本發明之植物、原生質體或植物部分較佳係選自(或獲自)選自由以下者所組成的群組的植物：阿黛勒落地生根、樹狀伽藍菜、極樂鳥、仙女之舞、魚叉葉長壽、長壽花、布维落地生根、銀之太鼓、長壽山櫻花、蝴蝶之舞、Kalanchoe crundallii、大葉落地生根、洋吊鐘、麋鹿之舞、福兔耳、圓貝葉、玉吊鐘、紫武藏、紅花伽藍菜、Kalanchoe gaatonis、矮生伽藍菜、青蔓花、花櫟長壽、天之羽袖、銀勺、金線長壽、香長壽、裂葉伽藍菜、蕾絲姑娘、Kalanchoe lateritia、蝴蝶之舞、草薙之劍、長花長壽、Kalanchoe luciae、Kalanchoe macrochlamys、宮燈長壽花、白姬之舞、江戶紫、千兔耳、君子蘭長壽、日蓮之盃、扁柏長壽、仙人之舞、Kalanchoe peltata、Kalanchoe petitiana、落地生根、燈籠菜、四方蜻蜓、妙義、白銀之舞、Kalanchoe quartiniana、扇雀、長壽果、Kalanchoe rolandi、玫瑰長壽、圓葉伽藍菜、Kalanchoe schizophylla、鋸緣青蟹、朱蓮、 Kalanchoe streptantha、Kalanchoe suarezensis、趣蝶蓮、雙飛蝴蝶、唐印、月兔耳、洋吊鐘、獨葉草、白蠟長壽與Kalanchoe viguieri；較佳係選自由以下者所組成的群組的裝飾性開花落地生根屬植物：長壽花、裂葉伽藍菜、圓葉伽藍菜、K.aromatica、妙義、天之羽袖、K.citrina、K.ambolensis、K.faustii、K.schumacherii、K.pritwitzii、紅花伽藍菜、K.figueredoi、K.rauhii、扁柏長壽、白銀之舞、江戶紫、K.porphyrocalux、金線長壽、落地生根、大葉落地生根、青蔓花、長壽山櫻花、K.latisepela、K.coccinea、玉吊鐘、洋吊鐘、圓葉伽藍菜、宮燈長壽花、仙人之舞、蝴蝶之舞、月兔耳與其雜種。

本發明將在本發明之尤佳具體態樣之以下實施例中進一步詳細敘述。於該等實施例中，參考圖式，其中：

圖1：顯示提供白粉病抗性的根據本發明的硫酯酶蛋白質(上面的序列)與SEQ ID No.1之硫酯酶蛋白質(下面的序列)之排比。兩個蛋白質間的一致序列在中間的行顯示；圖2：顯示關於呈同型合子與異型合子形式的在SEQ ID No.3之位置64(SNP_14)與67(SNP_17)的位置找到的核苷酸序列的本案之白粉病抗性之盒狀圖。對於位置67，非編碼性核苷酸被顯示，即C/C；T/C與T/T分別代替編碼性核苷酸G/G；A/G；A/A。

實施例

使落地生根卵黴白粉病抗性長壽花親本植物(其代表性種子係在2015年3月2日以寄存編號NCIMB 42379寄存在NCIMB Ferguson Building，Craibstone Estate，巴克斯本，亞伯丁AB21 9YA，英國)與白粉病敏感性長壽花植物雜交與獲得分離子代。藉由以落地生根卵黴感染約4週齡的植物來分析子代之落地生根卵黴抗性。隨後，使經感染的植物在以下條件下生長約4週：溫度：白天20℃/晚上18℃；相對濕度：白天60%/晚上80%；晝長：20個小時(人工光，其強度在1000與2000勒克斯)。

接著以目視以1至9的等級評分植物之白粉病敏感性/抗性，藉此1表示完全的白粉病敏感性而9表示完全的白粉病抗性(無可目視可見的感染)。

分析子代顯示所觀察到的白粉病抗性表現型與在編碼硫酯酶蛋白質或類硫酯酶蛋白質的基因之編碼序列之位置64與67的兩個核苷酸取代有關連。如於圖1中描寫的，兩個核苷酸取代皆造成在硫酯酶蛋白質或類硫酯酶蛋白質之N端區域的胺基酸取代。

以上分離族群中的白粉病表現型之分析係在以下表1與圖2中概述。

<110> 荷蘭商杜曼集團責任有限公司(Dummen Group B.V.)

<120> 落地生根屬的白粉病抗性基因

<140> 105105423

<141> 2016-02-24

<150> EP15157519.8

<151> 2015-03-04

<160> 8

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 197

<212> PRT

<213> 長壽花

<400> 1

<210> 2

<211> 197

<212> PRT

<213> 長壽花

<400> 2

<210> 3

<211> 594

<212> DNA

<213> 長壽花

<400> 3

<210> 4

<211> 594

<212> DNA

<213> 長壽花

<400> 4

<210> 5

<211> 594

<212> DNA

<213> 長壽花

<400> 5

<210> 6

<211> 594

<212> DNA

<213> 長壽花

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 長壽花

<400> 7

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 長壽花

<400> 8

Claims (3)

1. 一種蛋白質，其具有SEQ ID No.2之胺基酸序列。
2. 一種核酸，其編碼根據申請專利範圍第1項的蛋白質。
3. 一種基因，其具有根據申請專利範圍第2項的核酸或編碼根據申請專利範圍第1項的蛋白質。

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