TWI686395B

TWI686395B - 作為前列腺癌偵測生物標記的尿液聚胺

Info

Publication number: TWI686395B
Application number: TW107112944A
Authority: TW
Inventors: 黃嘉良
Original assignee: 香港商新生命醫藥科技有限公司
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2020-03-01
Also published as: WO2019076013A1; CN111201224A; TW201917130A; CN111201224B

Abstract

本發明係關於用作前列腺癌生物標記之尿液聚胺及一種用於使用鑭系元素錯合物偵測及定量尿液聚胺的靈敏且特異性方法。

Description

作為前列腺癌偵測生物標記的尿液聚胺

本發明係關於用於偵測及定量尿液聚胺之方法及其中使用之組成物。本文中所描述之方法及組成物適用於診斷患者之前列腺癌。

前列腺癌（Prostate cancer；PCa）為男性中第二最常見的癌症，為主要死亡原因之一且在許多已開發國家（包括許多西歐國家及美國）產生重大的公共衛生影響。

PCa為在全世界越來越顯著之疾病。毫無意外，香港也具有此公共衛生問題。參考香港癌症登記中心（Hong Kong Cancer Registry）、醫院管理局（Hospital Authority）、HKSAR之統計，PCa被列為男性常見癌症的第3名及致命癌症的第5名。鑒於早期、可治療之PCa之潛伏性及其晚期可辨別階段之致死性，迫切需要更靈敏及精確的診斷方法以偵測早期PCa，使得可顯著改良治療結果且拯救更多的生命。

PCa之當前診斷依賴於數位直腸檢查（digital rectal examination；DRE）及血清前列腺特異性抗原（serum prostate specific antigen；PSA）測試，繼之以經直腸超音波前列腺活體組織切片檢查（transrectal ultrasound prostatic biopsy；TRUSPB）確認。儘管DRE程序簡單，但其引起患者不適。DRE亦為研究者依賴性強之技術，對PCa診斷的精確性有待改進。具體言之，DRE並非用於PCa之早期偵測之良好工具，因為大部分DRE陽性PCa結果為晚期結果。儘管PSA測試在偵測早期PCa時展示良好靈敏性，但亦在良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia；BPH）及前列腺炎等患者中觀測到PSA含量升高，其降低PSA對PCa之特異性。

在PSA測試之灰色區域內，陽性預測值具有較小平均值21%。已研發多種的PSA方法（諸如過渡區之PSA密度、自由/總PSA比率、p2PSA及前列腺健康指數）以改良PSA量測之效能。

經直腸超音波檢查指導型前列腺活體組織切片檢查（TRUSPB）為當前最常見的用於PCa診斷之組織學確認的診斷方法。然而，此程序之勞力密集度極高且引起患者顯著不適及併發症。

由於血清PSA測試之不良特異性，許多非PCa患者經歷TRUSPB且因此經歷其潛在併發症。因此，必須研發用於精確、早期PCa篩檢之更有效的偵測套組。

本發明之一個目標在於提供一種用於診斷患者之PCa的方法，其包含偵測一或多種尿液聚胺（諸如腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）及/或精胺（spermine，Spm）。尿液聚胺適用作PCa偵測之生物標記。藉由比較診斷患有PCa之患者、診斷患有良性前列腺增生（BPH）之患者及健康對照組（healthy control；HC）之尿液聚胺濃度來鑑別尿液聚胺之診斷能力。本文亦提供適用於偵測及定量患者之尿液聚胺之量的組成物及方法。

因此，本發明之目標在於研發一種使用鑭系元素錯合物的新穎、高靈敏性和特異性及變色的聚胺示蹤劑，以及檢查來自不同年齡群體及不同前列腺癌階段之患者的聚胺之平均尿液濃度以驗證聚胺為用於早期前列腺癌篩檢之可信的生物標記。

在本發明之第一態樣中，提供式1 化合物：

其中m為1、2或3；

n在每次出現時獨立地為1或2；

p在每次出現時獨立地為1、2、3或4；

Ln為鑭系元素；

各M獨立地選自由以下組成之群：Na、Li及K；或兩個M共同表示Mg或Ca；

Y為-C≡C-或不存在；

R₁ 之各實例獨立地為氫、烷基或環烷基；

R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 、R₆ 及R₇ 各獨立地選自氫、烷基、環烷基及芳基；

R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烯烴及炔烴；或R₈ 及R₉ 共同形成選自由以下組成之群的部分：

、

及

；

R₁₀ 為氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烯烴或炔烴；或R₁₀ 為具有以下結構之部分：

；及

R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烯烴及炔烴；其限制條件為該式1 化合物不包括式2 化合物：

其中Ln為鑭系元素；以及各M係獨立地選自由以下組成之群：Na、Li及K；或兩個M共同表示Mg或Ca。

在第一態樣之第一具體實例中，提供第一態樣之化合物，其中R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 、R₆ 及R₇ 各獨立地選自氫及烷基。

在第一態樣之第二具體實例中，提供第一態樣之化合物，其中R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地為氫、鹵化物、硝基、氰基、醚或烷基。

在第一態樣之第三具體實例中，提供第一態樣之化合物，其中R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫、鹵化物、硝基、氰基、醚及烷基；或R₈ 及R₉ 共同形成選自由以下組成之群的部分：

、

及

，

其中R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地為氫、鹵化物、硝基、氰基、醚或烷基。

在第一態樣之第四具體實例中，提供第一態樣之化合物，其中R₁₀ 為氫、鹵化物、硝基、氰基、醚、二烷基胺基或烷基；或R₁₀ 為具有以下結構之部分：

。

在第一態樣之第五具體實例中，提供第一態樣之第一具體實例之化合物，其中R₁ 、R₃ 及R₆ 之各實例為氫。

在第一態樣之第五具體實例中，提供第一態樣之第二具體實例之化合物，其中R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫、鹵化物、硝基、氰基、醚及烷基；或R₈ 及R₉ 共同形成選自由以下組成之群的部分：

、

及

。

在第一態樣之第六具體實例中，提供第一態樣之第二具體實例之化合物，其中R₁₀ 為氫、鹵化物、硝基、氰基、醚、二烷基胺基或烷基；或R₁₀ 為具有以下結構之部分：

。

在第一態樣之第七具體實例中，提供第一態樣之化合物，其中m 為1、2或3；n在每次出現時獨立地為1或2；p在每次出現時獨立地為1、2、3或4；

Ln為鑭系元素；

Y為-C≡C-；

R₁ 之各實例獨立地為氫或烷基；

R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 、R₆ 及R₇ 各獨立地選自氫及烷基；

R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫及烷基；或R₈ 及R₉ 共同形成選自由以下組成之群的部分：

、

及

；

R₁₀ 為氫、烷基及胺；或R₁₀ 為具有以下結構之部分：

；及

R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地選自氫及烷基。

在第一態樣之第七具體實例中，提供第一態樣之化合物，其中該化合物選自由以下組成之群：

、

、

及

，其中M為鋰或鈉。

在本發明之第二態樣中，提供一種偵測一或多種尿液聚胺之方法，其包含以下步驟： a、提供尿液樣品； b、使該尿液樣品與式1化合物接觸，從而形成測試樣品；以及 c、偵測該測試樣品中是否存在一或多種尿液聚胺。

在第二態樣之第一具體實例中，本文提供第二態樣之方法，其中該尿液樣品係自個體獲得。

在第二態樣之第二具體實例中，本文提供第二態樣之第一具體實例之方法，其中該一或多種尿液聚胺為精胺。

在第二態樣之第三具體實例中，本文提供第二態樣之第一具體實例之方法，其中該偵測是否存在一或多種尿液聚胺的步驟包含測定該一或多種尿液聚胺之濃度。

在第二態樣之第四具體實例中，本文提供第二態樣之第三具體實例之方法，其中該一或多種尿液聚胺為精胺。

在第二態樣之第五具體實例中，本文提供第二態樣之第四具體實例之方法，其進一步包含以下步驟：比較該測試樣品中之精胺之濃度與參考濃度及測定該個體對前列腺癌之易感性是否提高，其中該測試樣品中之精胺之濃度相對於參考樣品之降低表示該個體對前列腺癌之易感性提高。

在第二態樣之第六具體實例中，本文提供第二態樣之第五具體實例之方法，其進一步包含以下步驟：對該個體進行前列腺檢查以測定該個體是否患有前列腺癌及若該個體患有前列腺癌則使用放射線療法或化學療法治療該個體。

在本發明之第三態樣中，提供一種用於治療個體之前列腺癌的方法，其包含以下步驟： d、提供來自該個體之尿液樣品； e、使該尿液樣品與式1化合物接觸，從而形成測試樣品； f、測定該測試樣品中之精胺之濃度； g、比較該測試樣品中之精胺之濃度與參考濃度及測定該個體對前列腺癌之易感性是否提高，其中該測試樣品中之精胺之濃度相對於參考樣品之降低表示該個體對前列腺癌之易感性提高； h、對該個體進行前列腺檢查以測定該個體是否患有前列腺癌；以及 i、若該個體患有前列腺癌，則使用放射線療法或化學療法治療該個體。

在第三態樣之第一具體實例中，本文提供第三態樣之方法，其中測定精胺之濃度的步驟包含比較測試樣品之色彩與經校準參考色彩圖表。

在第三態樣之第二具體實例中，本文提供第三態樣之方法，其中該個體為人類。

發明所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，本文中所描述之本發明除特定描述之彼等內容外允許進行變化及修改。

本發明包括所有此類變化及修改。本發明亦包括本說明書中單獨或共同提及或指出的所有步驟及特徵，以及該等步驟或特徵中之任兩者或更多者的任何及所有組合。

基於隨後描述的綜述，本發明之其他態樣及優勢對於發明所屬技術領域中具有通常知識者而言將是顯而易見。

本發明之範圍不受限於本文中所描述之特定具體實例中之任一者。僅出於例示而呈現以下具體實例。

藉由比較三種尿液聚胺（Put、Spd及Spm）各自在診斷患有PCa之患者、BPH患者及健康患者中之濃度來將其作為用於PCa偵測之生物標記評估。經由良好驗證之層析方法，證實尿液Spm在區分PCa與非癌性疾病病況（包括BPH）中具有有效性，且在使用4.0 ng/mL作為截止點時，其可有助於充當血清PSA測試之第二篩檢工具以解決其高偽陽性率問題。針對此新穎生物標記研發出包含鑭系元素錯合物之套組，且本文描述該套組。第1部分：評估聚胺作為PCa生物標記之作用

臨床樣品

用於臨床樣品收集之患者的三個子集分配如下：診斷患有PCa之患者、診斷患有BPH之患者及HC。自所有個體獲得書面同意書。由香港中文大學之臨床研究倫理委員會（Clinical Research Ethical Committee of the Chinese University of Hong Kong）審查及批准患者參與臨床研究，且嚴格根據由該委員會發佈之指南進行研究。在2014年10月與2016年3月之間，在前列腺活體組織切片檢查之前，在午餐之後的中午時間自具有大於4.0 ng/mL之血清PSA含量的165位男性患者（年齡＞50）獲得尿液樣品。此等患者之尿液樣品僅在其不具有可造成偏差效應之臨床活性尿道感染時才接受。當患者不同意參與研究時，或其臨床上展示其他類型之癌症之證據時，將其自取樣方案排除。

在此等165名患者中，藉由使用TRUSPB作為參考標準，66位經診斷為患有PCa且其餘99位不具有惡性疾病之證據（No evidence of malignancy；NEM）。為了將此等99位NEM患者進一步分類，使用前列腺體積＞30 mL之準則作為準則，發現88位患有BPH，而其餘被視為HC。所有病理學檢查在有經驗的泌尿病理學家監督下於香港的香港中文大學威爾斯親王醫院（Prince of Wales Hospital）進行。

表1展示樣品之所有臨床病理學特徵。所有樣品在-20℃下儲存直至量測。所有量測在收集之後的三個月內進行。

表1、患者之臨床病理學特徵

材料及化學品

自TEDIA獲得甲醇（HPLC/光譜級，＞99.9%）。自ACS獲得乙腈（HPLC級，＞99.9%）。在MilliQ Direct水純化系統（MilliQ Direct Water Purification System）（Millipore公司，美國）中純化水。所有標準化合物（包括1,4-丁二胺（Put，99%）、亞精胺（Spd，＞99.0%）、精胺（Spm，＞99.0%）、1,4-二胺（丁烷-d₈ ）二鹽酸鹽（98原子%D）、亞精胺-(丁烷-d₈ )三鹽酸鹽（98原子%D，95% CP）、精胺-(丁烷-d₈ )四鹽酸鹽（97原子%D，95% CP）及七氟丁酸（HFBA，＞99.0%）購自Sigma-Aldrich（中國香港）且未經進一步純化即使用。自Phenomenex（Strata，100 mg/3 mL，美國）獲得強陰離子交換固相萃取（Strong Anion Exchange solid phase extraction；SPE）濾筒。使用自Eppendorf（5417R，中國香港）獲得之冷凍離心機進行離心。

肌酐之測定

藉由LabAssay^TM 肌酐檢定（日本和光市）測定尿液樣品內之肌酐濃度。簡言之，將尿液樣品及標準物解凍、去蛋白化且離心。分離上清液且在鹼性溶液中與苦味酸反應，以經由賈菲反應（Jaffe reaction）產生紅橘縮合物，如Bonsnes RW, Taussky HH.On the colorimetric determination of creatinine by the Jaffé reaction . J Biol Chem. 1945;158(3):581-9 中所報導。藉由Clariostar單色器微量盤讀取器（BMG Labtech，香港）進行之吸光度量測進行樣品內之全部肌酐之定量。在樣品製備之前，用水以適當稀釋因數稀釋超過校準點之濃縮尿液樣品。測定各樣品至少兩次，其相對標準偏差（Relative standard deviation；RSD）小於15%。

用於測定聚胺之例示性樣品製備

分別在水中製備各聚胺（Put、Spm、Spd）之儲備溶液（5000 µg/mL）。混合三種儲備溶液且稀釋以得到中間標準物（50 µg/mL），其隨後用於在水中以10、25、50、100、250、500、1000 ng/mL之聚胺濃度製備一系列工作標準物。對於內部標準物，在水中個別地製備各聚胺（Put-d₈ 、Spm-d₈ 、Spd-d₈ ）之儲備溶液（5000 µg/mL）。混合三種儲備溶液且在水中稀釋以得到內部標準物（internal standard；IS）工作溶液（1 µg/mL）。

用於測定聚胺之例示性樣品預處理

樣品製備程序遵循由Häkkinen等人Analysis of free, mono- and diacetylated polyamines from human urine by LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2013;941:81-9 研發之方法，進行極少修改。首先，將尿液樣品/標準物自然解凍且在13,000 rpm及室溫下離心5分鐘。將120 μL尿液樣品/標準物上清液及60 μL之IS工作溶液與420 μL之水混合。使550 μL此充分混合溶液通過SPE濾筒，而該SPE濾筒已分別事先使用1 mL甲醇及水進行調節及平衡。之後使450 μL水通過濾筒，以洗提出所有聚胺。隨後將400 µL此等經SPE處理之樣品與100 µL 10% HFBA混合，且最終混合物準備用於儀器分析。當發現尿液樣品過於濃縮且超過校準點, 在樣品製備之前用水以適當稀釋因數稀釋並重新分析。

用於測定聚胺之品質控制樣品

對於樣品分析之各批次，分析三種品質控制（Quality control；QC）工作溶液以驗證校準曲線之精確性及確保各批次之可比較性。使用來自吾人之研究團隊之經分析對照尿液樣品來製備溶液。測定對照組之尿液樣品之聚胺濃度，且隨後同等地混合以得到合併尿液樣品。然後，藉由混合此合併尿液樣品與標準溶液來製備具有不同聚胺濃度範圍（低、中等及高）之三種QC工作溶液。對於低聚胺濃度QC工作溶液，將經SPE處理之合併尿液樣品與經SPE處理之10 ng/mL標準物以1:7比率混合。對於中等聚胺濃度QC工作溶液，將經SPE處理之合併尿液樣品與經SPE處理之100 ng/mL標準物以1:1比率混合。對於高聚胺濃度，QC工作溶液，將經SPE處理之合併尿液樣品與經SPE處理之1000 ng/mL之標準物以1:1比率混合。

穩定性研究

對於穩定性研究，Häkkinen等人先前證明標準混合物及QC樣品在於室溫下儲存六小時後（短期穩定性）、在分別於-20℃下及-80℃下儲存兩個月後（長期穩定性）及在樣品製備之前經歷三個冷凍及解凍循環後（冷凍解凍穩定性）皆穩定。為了進一步驗證，分析標準物及所選尿液樣品內聚胺及肌酐之含量。發現在五個冷凍及解凍循環之後，當在-20℃下儲存時，所有內含物在六個月時間內仍穩定。對於經SPE處理之樣品，其在4℃下儲存時可穩定至少兩天，且在-20℃下儲存時可穩定至一年。

儀器及統計分析

藉由與三重四極質譜儀偶合之超高效液相層析（UPLC-MS/MS）進行聚胺之定量。藉由Agilent 1290 Infinity Quaternary LC系統進行LC分離，同時藉由配備有Agilent Jet Stream技術電噴霧電離源之Agilent 6460 Triple Quadrupole質譜儀進行質量分析。所使用之管柱為用Agilent SB-C18保護管柱（2.1×5 mm，1.8 µm）保護之Agilent EclipsePlus C18 RRHD（2.1×50 mm，1.8 µm）。

LC溶離概況最佳化如下：溶離劑A為具有0.1% HFBA之水，而溶離劑B為具有0.1% HFBA之乙腈。溶離劑A在10分鐘內自95%降低至60%。隨後梯度在1分鐘內自60%溶離劑A降低至10%溶離劑A。然後，保持梯度恆定5分鐘。隨後，梯度在1分鐘內自10%提高至95%，接著保持恆定8分鐘（總運行時間=25分鐘）。

自動取樣器及管柱溫度分別設定為4℃及35℃。藉由用溶離劑B以沖洗孔模式進行3次5秒針洗滌來實現注射。每次注射10 µL。

對於源參數，將乾燥氣體（氮）溫度設定為300℃，且流動速率為5 l/min。霧化器壓力為45 psi。將鞘流氣溫度設定為250℃，且流動速率為11 l/min。將毛細管電壓設定為3500 V。對於質量偵測，進行預定多反應監測（MRM）。MRM轉化之資訊可見於表2中。

表2、Put、Spm、Spd及其對應內部標準物之MRM轉化、停留時間、碎裂器、碰撞能量及單元加速器電壓（*指示定量器轉化）

使用Agilent MassHunter Workstation軟件計算結果。在不進行任何加權情況下線性擬合校準曲線。相關性係數不應小於0.995。各校準點及品質控制工作溶液之接受性值為±30%以確保精確性。對於精確度驗證，在每隔每次注射10個樣品之後，注射250 ng/mL之標準物且校驗其是否可再現（±15%）。

對於統計分析，使用GraphPad Prism 6（GraphPad Software，美國加州聖地亞哥）獲得接受者操作特徵（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）。在基於斯圖登氏t測試（Student's t-test）之比較期間，p值小於0.05（雙尾）被視為在統計上顯著。

結果

尿液聚胺含量

藉由UPLC-MS/MS自所有樣品成功分離及定量Put、Spd、Spm及其對應氘化內部標準物（圖1）。校準曲線皆為令人滿意的，其中r² 不小於0.995（圖5A至圖5C），且通過所有QC量測，其確保在不同天分析之樣品之間的可比較性。隨後針對各患者之尿液肌酐含量標準化其平均尿液聚胺濃度且表示為肌酐之µmol /g（關於肌酐結果，參見表3）。此將補償任何妨礙實際數量量測之多尿過程，參考Jung K. Enzyme activities in urine: how should we express their excretion? A critical literature review. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1991;29:725-9 。

表3、來自所有患者之肌酐結果之概述

表4及圖2A至圖2C展示不同子集之標準化聚胺含量之資料及圖形比較：

表4、不同子集中之標準化聚胺含量的管柱統計。SEM表示平均值之標準誤差。

圖2A至圖2C中之黑色條柱表示各子集之平均值，而誤差條柱表示對應SEM。

在所監測之三種聚胺中，就統計平均值而言（不成對斯圖登氏t測試），與非癌性病例（包括BPH患者及HC）相比，標準化Spm在PCa患者中展示顯著降低。詳言之，平均值在PCa中為1.47，在BPH中為5.87，在HC中為5.43。在t測試中，p值＜0.0001，此意謂在p＜0.05之預設準則下之顯著差異。對於標準化Put及Spd，藉由觀察其分佈或藉由t測試比較其平均值，未觀測到顯著增強或抑制（Put：在PCa中為1.63，在BPH中為1.21，在HC中為0.65；Spd：在PCa中為0.52，在BPH中為0.94，在HC中為2.71）。

接受者操作特徵分析

圖3展示用於評估PCa診斷之篩選後聚胺之診斷能力的三種標準化聚胺之ROC曲線。發現標準化Put、Spd及Spm之AUC分別為0.63±0.05、0.65±0.05及0.83±0.03。具有對應靈敏性及特異性之Spm之臨限值列舉於表5中。

表5、在不同臨限值下標準化Spm之靈敏性及特異性

科學家已長期研究聚胺與癌症之間的關係。通常認為血液或尿液中聚胺含量增加反映快速生長癌症組織/細胞中聚胺合成程度增強，因為其與增加之細胞增殖、降低之細胞凋亡及增加之影響腫瘤侵襲及轉移之基因之表達相關聯。

在Russell DH. Increased polyamine concentrations in the urine of human cancer patients. Nat New Biol. 1971;233(39):144-5 中首先報導各種實體腫瘤中尿液聚胺含量之增加，該等實體腫瘤包括卵巢畸胎瘤、直腸癌瘤、淋巴肉瘤、骨原性肉瘤及急性骨髓細胞性白血病。Kyoko Hiramatsu等人N¹ ,N¹² -Diacetylspermine as a Sensitive and Specific Novel Marker for Early- and Late-Stage Colorectal and Breast Cancers. Clin Cancer Res. 2005;11(8):2986-90 報導早期及晚期結腸直腸癌及乳癌患者中N¹ ,N¹² -二乙醯基精胺增加且證實其作為用於此等癌症之新穎標記物之作用。在子宮頸癌之情況下，Lee等人Altered urinary profiles of polyamines and endogenous steroids in patients with benign cervical disease and cervical cancer. Cancer Lett. 2003;201(2):121-31 證實Put、Spd及Spm中聚胺含量之顯著升高。對於肝癌，Liu等人Determination of polyamine metabolome in plasma and urine by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method: Application to identify potential markers for human hepatic cancer. Anal Chim Acta. 2013;791:36-45 監測患者之血漿及尿液中聚胺、聚胺前驅體及分解代謝物之間的含量差異。藉由仔細地分析此等結果，實際上可觀測到不同種類之聚胺視癌症類型而展示不同變化。癌症病例引致尿液聚胺含量升高這個結論顯然不夠精準。

然而，極少的報導集中於偵測PCa對尿液聚胺含量之效應，該效應又可提供用於此增加之常見癌症之潛在診斷工具。在1975年，Fair等人Urinary polyamine levels in the diagnosis of carcinoma of the prostate. J Urol. 1975;114(1):88-92 藉由電泳報導PCa患者中之尿液Spd含量之顯著升高（但Put及Spm未顯著升高）。Horn等人Relationship of urinary polyamines to tumor activity and tumor volume in patients. Cancer Res. 1984;44(10):4675-8 在1984年藉由使用螢光偵測器進行之LC分析來自在乳房、胃、前列腺、女性生殖道具有腫瘤或未知來源之轉移性癌瘤患者之尿液Spd及Put含量，產生不確定的結論。隨著分析領域的發展，在本發明中，藉由UPLC-MS/MS評估三種天然聚胺：Put、Spd及Spm作為用於PCa之篩檢之尿液生物標記的潛在能力。經由經良好驗證之使用單獨的氘化內部標準物校正各聚胺之基質效應之方法，認為該分析表現更加可靠。

根據關於PCa研究之先前文獻之結果，尿液Spm含量下降之觀測實際上為合理的。儘管僅檢驗有限數目之組織標本，但van der Graaf等人Proton MR spectroscopy of prostatic tissue focused on the detection of spermine, a possible biomarker of malignant behavior in prostate cancer. MAGMA 2000;10(3):153-9 藉由用螢光偵測器進行之高效液相層析報導與正常及良性增生性前列腺組織相比，腫瘤前列腺組織中之Spm含量降低。Swanson等人Proton HR-MAS spectroscopy and quantitative pathologic analysis of MRI/3D-MRSI-targeted postsurgical prostate tissues. Magn Reson Med. 2003;50(5): 944-54 亦藉由質子高解析度變角度旋轉核磁共振光譜及定量病理組織學報導前列腺組織樣品中之Spm含量降低。高惡性癌症前列腺組織可由於Spm及檸檬酸酯之濃度降低而與低惡性癌症組織不同，如由GF Giskeødegård等人Spermine and citrate as metabolic biomarkers for assessing prostate cancer aggressiveness. PLoS One 2013;8(4):e62375 報導。除直接監測前列腺組織以外，Serkova等人The metabolites citrate, myo-inositol, and spermine are potential age-independent markers of prostate cancer in human expressed prostatic secretions. Prostate. 2008;68(6), 620-8 報導在表現前列腺分泌之人類中，檸檬酸酯、肌醇及Spm為PCa之潛在重要標記物，且其與對照組樣品相比在PCa患者中皆展示降低之含量。關於此等前述研究計劃，可預見尿液Spm含量之降低，因為尿液代表與來自前列腺之剝離之癌細胞及分泌之前列腺產物緊密相關之體液。本質上，尿液具有易於獲得及收集方式為非侵襲性之優點。因此，由於減少非必要活體組織切片檢查及為患者安排適當療法，適用的尿液PCa生物標記對當前醫學情形為具有吸引力的。

為了說明PCa患者中Spm含量下降，確切機制缺乏清楚的證據且仍在研究中。Schipper等人Polyamines and prostatic cancer. Biochem Soc Trans. 2003;31(2):375-80 提出一種可能的解釋，即由癌細胞增殖引起之細胞組織變化最終引起內腔體積降低，其又降低前列腺組織、前列腺液或甚至尿液中之所分泌化合物量。但此難以解釋為何僅尿液Spm含量下降。Leo等人Non-destructive quantitation of spermine in human prostate tissue samples using HRMAS 1H NMR spectroscopy at 9.4 T. FEBS Letters. 2001;494(1-2):112-6 報導Spm為針對前列腺癌生長之推薦內生抑制劑，且發現Spm含量與正常前列腺上皮細胞之體積百分比之間的線性相關性，如藉由病理組織學定量。且在近期研究中，提出聚胺代謝，或更具體言之，聚胺分解代解之失調可涉及癌發生。在前驅體前列腺發炎性萎縮病灶及早期前列腺上皮內贅生性病灶中觀測到精胺氧化酶（SMO）及亞精胺/精胺N¹ -乙醯基轉移酶（SSAT）表現之增加，其引起Spm含量損耗（圖4）。

此假設亦由在由SSAT之酶促作用引起之泌尿生殖器惡性病患者中觀測到尿液二乙醯基精胺含量顯著增加來支持，如由Hiramatsu等人Diagnostic and prognostic usefulness of N¹ , N⁸ -diacetylspermidine and N¹ , N¹² -diacetylspermine in urine as novel markers of malignancy. J Cancer Res Clin Oncol. 1997;123(10):539-45 報導。因此，如本文中所描述，尿液Spm降低之觀測符合前述之發現及推薦機制。在不受理論束縛之情況下，假設SMO及SSAT之作用彼此抵消，因此未發現Spd之顯著變化。

然而，與GF Giskeødegård等人Spermine and citrate as metabolic biomarkers for assessing prostate cancer aggressiveness. PLoS One 2013;8(4):e62375 報導前列腺Spm含量可用作生物標記以評定PCa侵襲性不同，可根據本文所揭示之資料產生尿液Spm是否展示類似的癌症級分化能力之決定性結論。根據該等結果，與低惡性癌症（GS＜6）相比，觀測到高惡性癌症（GS=8-10）中之下降，儘管不明顯（高惡性癌症中1.23對比低惡性癌症中1.47；p=0.611）。實情為，其與根據用於PCa診斷之TRUSPB工作之診斷性生物標記起類似作用。

PSA測試仍遠不足以作為主要篩檢測試。已證實其引起過度診斷，尤其對於展示灰色區域中之值的患者。舉例而言，單獨的血清PSA顯示一般靈敏性及特異性分別為65%及47%。Li等人Macrophage inhibitory cytokine 1 biomarker serum immunoassay in combination with PSA is a more specific diagnostic tool for detection of prostate cancer. PLoS One. 2015;10(4):e0122249 在其研究中報導甚至更差的靈敏性及特異性（靈敏性=54.8%，特異性=57.1%，AUC=0.684）。Ferro等人Prostate Health Index (Phi) and Prostate Cancer Antigen 3 (PCA3) significantly improve prostate cancer detection at initial biopsy in a total PSA range of 2-10ng/mL. PLoS One 2013;8(7):e67687 之另一項大規模研究證實全部PSA僅產生0.52±0.07之AUC值。當關注PSA＞4.0 ng/mL之患者時，PSA測試展示最佳篩檢效能（AUC=0.73±0.04；參見圖6），但其仍不及本文中所描述之尿液Spm測試方法。靈敏性及特異性分別為67.05%及68.75%。因此，尿液Spm能夠充當針對血清PSA＞4.0 ng/mL之男性的第二篩選測試，以區分PCa及非癌性病例，包括用於補充PSA測試之BPH。

基於本發明之第一部分來總結，評估三種主要尿液聚胺作為PCa生物標記之潛在作用。在Put、Spd及Spm中，Spm顯示對PCa之出色的診斷效能，尤其對於具有升高之血清PSA含量（當比較其在PCa及BPH患者中之含量時）之患者。其AUC值為0.83±0.03。此可有助於由血清PSA測試之特異性不良引起之當前醫學挑戰。且藉由吾人研發之基於鑭系元素之生物探針，吾人可實現簡單及快速的用於PCa篩檢之定量。

本發明提供一種偵測一或多種尿液聚胺之方法，其包含以下步驟： a、提供尿液樣品；以及 b、偵測該測試樣品中是否存在一或多種尿液聚胺。

在某些具體實例中，尿液聚胺為Put、Spm及Spd中之至少一者。

該尿液樣品可自個體獲得。該個體可為任何動物，諸如哺乳動物、嚙齒動物、犬、貓、馬、牛、豬、靈長類動物（例如，非人類靈長類動物）或人類。

在某些具體實例中，該樣品自男性獲得。在某些具體實例中，男性之PSA大於約2.0 ng/mL、3.0 ng/mL、4.0 ng/mL、5.0 ng/mL、6.0 ng/mL、7.0 ng/mL、8.0 ng/mL、9.0 ng/mL或10.0 ng/mL。

在某些具體實例中，男性之PSA範圍在約2.0 ng/mL至約10.0 ng/mL、約3.0 ng/mL至約10.0 ng/mL或4.0 ng/mL至約10.0 ng/mL內。

尿液樣品可視情況經預處理，例如以移除潛在之干擾性分析物及/或蛋白質，如本文中所描述以便改良例如精確性、處置容易性等。

適用於測定樣品中之聚胺之量的任何方法可用以測定一或多種尿液聚胺之含量。適當方法之選擇為一般技術人員所熟知。用於偵測及/或測定一或多種聚胺（例如，精胺）之含量的方法包括（但不限於）核磁共振（nuclear magnetic resonance；NMR）、質譜分析（mass spectrometry；MS）、高效液相層析（high performance liquid chromatography；HPLC）、超效液相層析（ultra-performance liquid chromatography；UPLC）、等度HPLC、梯度HPLC、正相層析、反相HPLC、尺寸排外層析、離子交換層析、毛細管電泳法、微流控、層析、氣相層析法（gas chromatography；GC）、薄層層析（thin-layer chromatography；TLC）、固定化金屬離子親和性層析（immobilized metal ion affinity chromatography；IMAC）、親和性層析、免疫檢定、酶促方法、比色檢定、使用閘極延伸有機場效電晶體（organic field-effect transistor；OFET）感測器之化學感測、使用半導體感測器之化學感測及重力分析。

在某些具體實例中，本文中所描述之式1化合物及方法用於偵測及/或測定一或多種尿液聚胺（例如，精胺）之含量。

在某些具體實例中，用於偵測一或多種尿液聚胺（例如，精胺）之方法涉及美國非臨時申請案第15/784,269號中所描述之組成物及方法，該非臨時申請案揭示用於使用鑭系元素錯合物及DNA加帽金奈米粒子偵測精胺的比色方法。

本文所提供之方法及組成物亦可用於偵測自懷疑患有乳癌之個人獲得的樣品中之精胺。在此等具體實例中，該樣品可為包含懷疑為癌性之乳房組織的活體組織切片。因此，本文中所描述之方法及組成物可結合偵測乳房組織中之精胺及測定個體對乳癌之易感性使用。

本文所提供之方法及組成物亦可用於偵測自任何可能來源獲得之樣品中存在的任何類型的聚胺，且因此不限於尿液樣品。樣品可自任何來源獲得，例如植物、土壤、廢物流、水、土壤、空氣、醫藥、化妝品、生物製劑、化學品、肉、食物、飲料等。

偵測一或多種尿液聚胺之方法可進一步包含以下步驟：比較測試樣品中之精胺之濃度與參考濃度及測定個體對前列腺癌之易感性是否提高，其中測試樣品中之精胺之濃度相對於參考樣品的降低表示個體對前列腺癌之易感性提高。

在某些具體實例中，表示個體對前列腺癌之易感性提高的測試樣品中之精胺之濃度低於約1.8 ng/mL、約1.7 ng/mL、約1.6 ng/mL、約1.5 ng/mL、約1.4 ng/mL、約1.3 ng/mL、約1.2 ng/mL、約1.1 ng/mL或約1.0 ng/mL。

在某些具體實例中，表示個體對前列腺癌之易感性提高的測試樣品中之精胺之濃度為約1.1 ng/mL至約1.5 ng/mL或約1.2 ng/mL至約1.5 ng/mL。

在本文所提供之方法之某些具體實例中，AUC概率值為至少約60%或高於60%表示前列腺癌。本發明涵蓋可計算AUC值且從而以概率預測前列腺癌的方法，所述概率大於約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、73%、74%、74%、75%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%或大於85%。

在某些具體實例中，AUC值為約60%至約86%、約65%至約86%、約70%至約86%、約75%至約86%、約80%至約86%、約82%至約86%、約84%至約86%或約84%至約85%。

在某些具體實例中，AUC值為至多約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、73%、74%、74%、75%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%或85%。

在本文所提供之方法的某些具體實例中，方法之靈敏性為約70%至約80%、約70%至約75%或約75%至約80%。

在本文所提供之方法的某些具體實例中，方法之特異性為約70%至約81%、約73%至約81%或約70%至約73%。

在本文所提供之方法的某些具體實例中，方法之靈敏性為約70%至約80%，且對應特異性為約81%至約70%；方法之靈敏性為約70%至約75%，且對應特異性為約81%至約73%；或方法之靈敏性為約75%至約80%，且對應特異性為73%至約70%。

在樣品中之一或多種尿液聚胺之濃度表示個體對前列腺癌靈敏的情況下，一或多個確認前列腺癌測試可用於確認個體是否患有前列腺癌。因此，描述之方法可進一步包含以下步驟：對個體進行一或多個前列腺癌檢查以測定（例如，確認）個體是否患有前列腺癌。

前列腺癌檢查可為用於診斷前列腺癌之任何前列腺癌測試，諸如直腸指檢、前列腺特異性抗原測試、前列腺活體組織切片檢查、Transrectal Ultrasound Guided Prostate Biopsy (TRUSPB)、前列腺磁共振成像（magnetic resonance imaging；MRI）掃描及其組合。

若該一或多種確認前列腺癌測試確認個體患有前列腺癌，則可治療個體之前列腺癌。因此，本文所提供之方法可進一步包含以下步驟：治療個體之前列腺癌。

對於前列腺癌，存在多個治療選項，且正研發新的治療選項。在當前實踐中，針對患有篩檢偵測之局部前列腺癌之男性的三種最常見治療選項為手術移除前列腺（根除性前列腺切除術）、放射線療法（外粒子束放射線療法、質子束療法或近程療法）等。

因此，治療前列腺癌之方法可包括手術、輻射、冷凍手術、溫熱療法、荷爾蒙治療、化學療法、疫苗、光動力療法及其他免疫療法或其組合。

治療前列腺癌之方法亦可包括預防或延遲前列腺癌之發展或進展的預防法。

前列腺癌治療亦包括監測個體之前列腺癌的嚴重度及/或進展。若嚴重度惡化及/或周圍環境決定，則可治療個體之前列腺癌。

第2部分：用於Spm感測之鑭系元素錯合物之合成

研發一系列鑭系元素化合物（1），其適用於尿液聚胺之比色定量及定性分析。

其中m為1、2或3；

n在每次出現時獨立地為1或2；

p在每次出現時獨立地為1、2、3或4；

Ln為鑭系元素；

Y為-C≡C-或不存在；

R₁ 之各實例獨立地為氫、烷基或環烷基；

、

及

；

；及

R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烯烴及炔烴。在某些具體實例中，本文中所描述之式1化合物不包括式2化合物：

其中Ln為鑭系元素；以及

各M獨立地選自由以下組成之群：Na、Li及K；或兩個M共同表示Mg或Ca。

在某些具體實例中，Ln為選自由以下組成之群的鑭系元素：La、Ce、Pr、Nd、Pr、Nd、Pm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb及Lu。該鑭系元素可為任何氧化態。例示性氧化態包括（但不限於）+2、+3及+4。在某些具體實例中，該鑭系元素處於+3氧化態。在某些具體實例中，該鑭系元素為Eu³⁺ 。

在某些具體實例中，R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 、R₆ 及R₇ 獨立地選自氫及烷基。在某些具體實例中，R₂ 、R₄ 、R₅ 及R₇ 獨立地為烷基；且R₃ 及R₆ 為氫。

在某些具體實例中，R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基及雜芳基；或R₈ 及R₉ 共同形成選自由以下組成之群的部分：

及

，

其中R₁₂ 獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基及雜芳基。

及

，

其中R₁₂ 獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基及雜芳基；且R₁₀ 為胺或由以下部分表示：

。

在某些具體實例中，本文中提供由式3表示的化合物：

其中m為1、2或3；

n在每次出現時獨立地為1或2；

p在每次出現時獨立地為1、2、3或4；

Ln為鑭系元素；

Y為-C≡C-或不存在；

R₁ 之各實例獨立地為氫、烷基或環烷基；

R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烯烴及炔烴；

R₁₀ 為氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烯烴或炔烴；以及

R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烯烴及炔烴。

在某些具體實例中，本文中所描述之式3化合物不包括式2化合物：

其中Ln為鑭系元素；以及

在式3化合物之某些具體實例中，Y為-C≡C-；R₁ 之各實例獨立地為氫或烷基；R₂ 、R₄ 、R₅ 及R₇ 獨立地為烷基；R₃ 及R₆ 為氫；R₈ 及R₉ 獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基及雜芳基；以及R₁₀ 為氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基。

在式3化合物之某些具體實例中，R₁ 為氫；R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 、R₆ 及R₇ 獨立地選自氫及烷基；R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基及雜芳基；R₁₀ 為氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基；以及R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基及雜芳基。

在式3化合物之某些具體實例中，R₁ 為氫；R₂ 、R₄ 、R₅ 及R₇ 各獨立地選自氫及烷基；R₃ 及R₆ 為氫；R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基及雜芳基；R₁₀ 為氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基；以及R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基及雜芳基。

在某些具體實例中，式3化合物為以下化合物：

，

其中M為鋰或鈉。

在某些具體實例中，本文中提供由式4表示的化合物：

其中m為1、2或3；

n在每次出現時獨立地為1或2；

p在每次出現時獨立地為1、2、3或4；

Ln為鑭系元素；

Y為-C≡C-或不存在；

R₁ 之各實例獨立地為氫、烷基或環烷基；

R₈ 及R₉ 共同形成選自由以下組成之群的部分：

、

及

，以及

；或

R₈ 及R₉ 各獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烯烴及炔烴，且R₁₀ 為具有以下結構之部分：

；以及

在式4化合物之某些具體實例中，R₁ 為氫；R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 、R₆ 及R₇ 各獨立地選自氫及烷基；以及R₁₁ 及R₁₂ 之各實例獨立地選自氫、鹵化物、氰基、硝基、羥基、醚、硫醚、胺、醯胺、醯胺基、酯、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基及烯烴。

在某些具體實例中，式4化合物選自由以下組成之群：

、

及

，其中M為鋰或鈉。

式1化合物可使用多種習知方法合成。在以下流程中描繪採用[4+2]迪爾斯-阿德反應（Diels-Alder reaction）之例示性合成順序。

可藉由視情況結合進一步合成轉換適當修改起始材料來製備其他式1化合物。製備其他式1化合物所需之適當起始材料及必需進一步合成轉換的選擇為一般發明所屬技術領域中具有通常知識者之熟知技能。

在不希望受理論束縛的情況下，認為在結合多個聚對亞苯乙烯（PPE）鏈（亦即，式1化合物之上部）以形成具有增強鏈間激子遷移之緊密結合聚集體方面，Put及正丁胺之有效性明顯比Spm及Spd低。因此，基於非特異性靜電相互作用之化學感測物在類似分析物之間仍可展現一些選擇性，其中高意謂其更好地結合於Spm（+4價）及Spd（+3價）且不太好地結合於腐胺（+2價）及正丁胺（+1價）（圖7A至圖7B）。

亦提供測試裝置，其包含適用於測定樣品中的一或多種尿液聚胺之含量多式1化合物。測試裝置可為測試條帶或試紙。圖14至圖15E描繪適用於測定樣品中的一或多種尿液聚胺之含量的測試條帶。測試條帶包含式1化合物。

圖14至圖15E中之測試條帶亦可結合用於偵測尿液聚胺之酶促方法使用。

在某些具體實例中，本文提供適用於測定樣品中的一或多種尿液聚胺之含量的套組，其包含式1化合物及用於進行本文所描述之方法的說明書。

在某些具體實例中適用於測定樣品中的一或多種尿液聚胺之含量的套組包含：測試裝置，諸如包含式1化合物之試紙或測試條帶；及用於使用測試條帶進行本文所描述之方法的說明書。

在某些具體實例中，套組進一步包含經校準參考色彩圖表，其提供測試樣品之色彩與測試樣品中一或多種尿液聚胺之濃度之間的相關性。

在某些具體實例中，套組進一步包含針對精胺之ROC圖表及/或表格及AUC圖表/表格中之至少一者，其使測試樣品中的精胺之濃度與個體患前列腺癌之可能性相關。

新近研發之發色團與鑭系元素錯合物之接合經由線性/兩個光子激發顯示聚胺之強結合及特異性選擇性

化合物1經合成具有聚胺特異性結合位點。所結合之系統控制基於三口井之配位體之三重態且提供配位體之綠光發射。化合物1中之兩個陰離子基團（圖7B）用於結合於正電荷聚胺，其在熱力學上有利。多陽離子性分析物可中斷錯合物中結合之系統。在390 nm下激發時，可自化合物1獲得四個結構紅光f-f（⁵ D₀ →⁷ F_J ，J=1-6）發射帶（圖8A至圖8C）。在DMSO:H₂ O之溶液中，化合物2之量子產率（Φ）及使用壽命分別為0.05及0.83 ms。在錯合物與Spm及Spd（50 M）結合之後，發射強度及量子產率增加超過30%（腫瘤血液樣品中Spm及Spd之濃度分別為約10 M及46 M）。

用Spm及Spd滴定銪化合物（2）

在化合物1與聚胺結合之後，可在UV激發下觀測到顯著f-f發射增強（圖8A及圖8B）。用對照銪化合物進行對照實驗（圖7A）；在添加聚胺之情況下未觀測到顯著發射變化（圖8C之插圖-不存在用於聚胺之陰離子結合位點之對照化合物之主結構）。在各種Spm濃度下，藉由⁵ D₀ →⁷ F₂ 發射強度測定化合物1與聚胺之間的結合率（1:1）及常數（3×10^-5 M）。監測聚胺之結合之壽命變化而非發射（藉助於時控系統，反應毫秒壽命變化對於新一代原位聚胺感測物極有可能；其可消除體液/血液樣品中之奈秒/微秒干擾）。

鑭系元素化合物針對Spm及Spd之選擇性

化合物2針對Spm及Spd相較於其他生物活性陽離子（諸如K⁺ 、Na⁺ 、Ca²⁺ ）及其他生物胺之選擇性呈現於圖8B中。此由於此等生物胺可干擾聚胺對所提出錯合物之現場反應而尤其重要。未觀測到其他生物胺及陽離子之顯著干擾。化合物2對Spm及Spd之選擇性顯著大於其他常見生物活性陽離子及生物胺（圖8B）。亦用對照銪錯合物（其在所有所測試之生物胺及陽離子存在下皆不展現任何顯著⁵ D₀ →⁷ F₂ 發射增強）進行對照實驗。

用10位前列腺癌患者之尿液樣品進行初步臨床試驗

收集來自前列腺癌患者之超過150份尿液樣品且藉由標準方案分析其Spm含量（藉由賈菲方法獲得肌酐含量且藉由LC-MS/MS檢驗聚胺含量）。已繪製大量聚胺之校準曲線（圖9A），諸如Spm（圖9B）及Spd，且將此等聚胺含量之濃度排序。所測定之含量與Häkkinen博士在2014年之發現類似。

選擇一系列前列腺癌患者之尿液樣品用於臨床前試驗。藉由LC預先測定其聚胺含量且展示於圖9A至圖9B中。在圖10中，化合物1（10 mM水溶液）之相片展示10位前列腺癌患者之尿液樣品在UV光下之色彩變化。藉由LCMS及內部標準物評估尿液樣品之聚胺濃度。

實驗方面，將2 mL患者尿液樣品添加至1 mL銪感測物溶液中（Eu感測物之最終濃度將為50 µM）。將樣品置放於光譜螢光計中且監測反應發射及發射壽命信號變化。本發明者亦監測提出錯合物之發射光譜，使用來自健康志願者之尿液作為對照組。

如圖11中所示，將使用標準添加方法進行由吾人研發之生物探針進行之定量，該方法為用於解決基質效應問題之常用方法。簡言之，將量測尿液樣品中聚胺之信號且以濃度=x標繪結果。量測2種摻入含量之讀數，通常為原始濃度之1倍及2倍。摻入含量之濃度分別以x+A及x+B書寫。在外推至x軸處之零信號時，可測定x軸上尿液樣品中聚胺之濃度。

藉由斯圖登氏t測試比較由兩種方法獲得之平均值，其中P＜0.05視為統計上顯著。由發光錯合物及HPLC-MS/MS獲得之讀數之間不存在顯著差異（P＜0.05），且此等讀數在小範圍內變化（%RSD＜10）。本發明者可得出本發明者之發光錯合物在偵測尿液樣品中之聚胺方面靈敏且可靠的結論。將使用在Origin中運行之標準統計套件進行對Spm/Spd濃度之取樣頻率變化之分析。使用方程式模型化高斯分佈（Gaussian distribution）。

材料及儀器

所有化學品自Aldrich（中國香港）及Meryer（中國上海）獲取。藉由混合相同莫耳比之磷酸、硼酸及乙酸製備布里頓-羅賓遜（Britton-Robinson；BR）緩衝液，且隨後使用氫氧化鈉溶液調節pH值。根據其他處方製備人造尿液。所有標準溶液用Milli-Q水製備。尿液樣品自香港中文大學威爾斯親王醫院收集。

藉由Zetasizer Nano-ZS90系統（Malvern Instruments，中國上海）實現動態光散射（Dynamic Light Scattering；DLS）及ζ電位量測。使用Cary 8453 UV-Vis光譜儀（Agilent，中國香港）記錄UV-Vis吸收光譜。使用MicroCal PEAQ-ITC自動系統（Malvern Instruments，中國上海）實現等溫滴定量熱法研究。

對於尿液樣品分析，藉由Agilent 1290 Infinity Quaternary LC系統進行液相層析分離，而藉由配備有Agilent Jet Stream技術電噴霧電離源之Agilent 6460 Triple Quadrupole質譜儀（Agilent，中國香港）進行質量分析。用KS 260 Basic定軌振盪器（IKA，中國香港）進行所有培育。

樣品預處理程序

簡言之，使尿液樣品天然解凍且在13000 rpm及25℃下離心5分鐘。隨後，使其穿過強陰離子交換固相萃取濾筒（Phenomenex, Strata，100 mg/3mL，美國）以截留不合需要之有機酸、酚化合物及碳水化合物。然後，用濃過氯酸處理溶液以進行進一步去蛋白作用，隨後藉由使用氫氧化鉀溶液中和以形成不可溶的過氯酸鉀鹽來移除濃過氯酸。最終，再將其離心以獲得上清液，用0.22 uM PES過濾器過濾且在水中進一步稀釋。

藉由UPLC-MS/MS進行之Spm之定量偵測

藉由與三重四極質譜儀偶合之超高效液相層析（UPLC-MS/MS）進行Spm之定量。藉由Agilent 1290 Infinity Quaternary LC系統進行LC分離，同時藉由配備有Agilent Jet Stream技術電噴霧電離源之Agilent 6460 Triple Quadrupole質譜儀進行質量分析。所使用之管柱為用Agilent SB-C18保護管柱（2.1×5 mm，1.8 µm）保護之Agilent EclipsePlus C18 RRHD（2.1×50 mm，1.8 µm）。

對於源參數，將乾燥氣體（氮）溫度設定為300℃，且流動速率為5 L/min。霧化器壓力為45 psi。將鞘流氣溫度設定為250℃，且流動速率為11 L/min。將毛細管電壓設定為3500 V。對於質量偵測，進行預定多反應監測（MRM）。

式1化合物對水溶液中之Spm/Spd之結合親和力及選擇性的測定

經由螢光及螢光壽命滴定在溶液中及中生物培養基中以目標Spm/Spd之各種濃度（模擬尿液/血液中的Spm含量1.2 µM/Spd含量11.9 µM）檢驗研發之式1化合物（包括以下化合物A至化合物E）。亦測定此等感測物對Spm/Spd之生理學特性及偵測極限。在達到平衡之後進行量測，且監測銪之發射。以分析物濃度之函數形式標繪關於I₀ /(I-I₀ ) （其中I 及I₀ 分別為所量測之發光強度及空白發光強度）之發光反應。對於測定多種分析物加成物之結合強度，將一系列具有已知濃度之分析物溶液以各種濃度與Spm/Spd溶液混合。根據y截距與由使用本尼希-希爾德布蘭德方程（Benesi-Hildebrand equations）最佳擬合之線獲得之斜率之間的比率評估結合常數K_B 。可由各種機制誘導在與Spm/Spd結合之後，鑭系元素錯合物之信號變化，諸如電子轉移過程（雷姆-韋勒方程（Rehm-Weller equation））及氧化還原電位，且已應用藉由閃光光解進行之短暫吸收來理解引起本發明之鑭系元素系統標記Spm/Spd之後信號之變化的機制。

測試化合物：

該等結合及選擇性實驗之結果呈現於下表中。對含有500 ppb最後一欄中所列之胺之樣品進行選擇性檢定。

工業應用

本發明係關於用於前列腺癌生物標記之尿液聚胺之偵測。特定而言，本發明提供一種新穎、高靈敏性和特異性及變色的聚胺示蹤劑，其使用鑭系元素錯合物作為早期前列腺癌篩檢之前列腺癌診斷生物標記，其在臨床診斷中具有極大的應用潛力。

無

基於本文所描述之各種具體實例之以下描述，當結合隨附圖式時，本發明之上述及其他目標及特徵將變得顯而易見，其中：

圖 1 展示1,000 ppb混合聚胺標準之重疊UPLC-MS/MS SRM層析圖（展示0-10分鐘）。Put（大峰值，t_R =4.3 min），Put-d₈ （小峰值，t_R =4.3 min），Spd（大峰值，t_R =6.6 min），Spd-d₈ （小峰值，t_R =6.6），Spm（大峰值，t_R =7.8 min）及Spm-d₈ （小峰值，t_R =7.8 min）。

圖 2A 展示PCa、BPH及HC中標準化Put值之分佈。

圖 2B 展示PCa、BPH及HC中標準化Spd值之分佈。

圖 2C 展示PCa、BPH及HC中標準化Spm值之分佈。

圖 3 展示標準化Put、Spd及Spm值之接受者操作特徵分析。

圖 4 展示聚胺代謝路徑（僅關注Put、Spd及Spm）。

圖 5A 展示Put之校準圖表（r² =0.9996）。

圖 5B 展示Spd之校準圖表（r² =0.9993）。

圖 5C 展示Spm之校準圖表（r² =0.9995）。

圖 6 展示血清PSA測試之接受者操作特徵曲線。

圖 7A 展示例示性鑭系元素錯合物1之化學結構。

圖 7B 展示基於變色鑭系元素之聚胺化學感測物之示意圖，其中設計基於經聚胺活化之f-f發射。

圖 8A 展示在化合物2（1 µM）與Spm（1 µM）結合之後的Eu發射增強。

圖 8B 展示在化合物2（1 µM）與Spd（50 µM）結合之後的Eu發射增強。

圖 8C 展示化合物2針對Spm及Spd相較於DMSO水溶液（3%-DMSO）中之各種生物胺及陽離子之選擇性。

圖 9A 展示10位前列腺癌患者之尿液樣品中Spm含量之校準。

圖 9B 展示用於UV測試的10位所選前列腺癌患者之尿液樣品中Spm含量之濃度。

圖 10 展示銪化合物2（10 μM水溶液）之相片，展示10位前列腺癌患者之尿液樣本在UV激發下之色彩變化。檢驗一份來自研究生之尿液樣品作為對照實驗。

圖 11 展示用於定義尿液樣品中聚胺之濃度的標準加成方法。

圖 12A 展示在去蛋白作用之前，四份尿液樣品之基質效應。

圖 12B 展示在去蛋白作用之後，四份尿液樣品之基質效應。

圖 12C 展示在去蛋白作用及使DNA濃度增加至100 nM之後，四份尿液樣品之基質效應。

圖 13 展示尿液、空白組（H₂ O）及人造尿液之基質效應之比較。

圖 14 展示包含本文所描述之化合物的例示性PCa生物標記感測條帶的示意圖。

圖 15A 展示具有癌症指示之例示性PCa診斷條帶的圖解。

圖 15B 展示具有非癌症指示之例示性PCa診斷條帶的圖解。

圖 15C 展示具有無效結果之例示性PCa診斷條帶的圖解。

圖 15D 展示具有無效結果之例示性PCa診斷條帶的圖解。

圖 15E 展示具有無效結果之例示性PCa診斷條帶的圖解。

Claims

一種式1化合物：
其中，m為1或2；n為1；p在每次出現時獨立地為1或2；Ln為鑭系元素；各M獨立地選自由以下組成之群：Na、Li及K；或兩個M共同表示Mg或Ca；Y為-C≡C-；R₁之各實例獨立地為氫或烷基；R₂、R₃、R₄、R₅、R₆及R₇各獨立地選自氫與烷基；R₈及R₉各獨立地選自氫與烷基；或R₈及R₉共同形成具有以下結構的部分：
R₁₀為氫、胺、或烷基；或R₁₀為具有以下結構之部分：
；及R₁₁及R₁₂之各實例獨立地選自氫和烷基；其限制條件為該式1化合物不包括式2化合物：
其中，Ln為鑭系元素；以及各M獨立地選自由以下組成之群：Na、Li及K；或兩個M共同表示Mg或Ca。
如請求項1所述之化合物，其中R₂、R₄、R₅、及R₇各獨立地為烷基且R₃與R₆為氫。
如請求項1所述之化合物，其中R₁₁及R₁₂之各實例為氫。
如請求項1所述之化合物，其中R₈及R₉各為氫；或R₈及R₉共同形成具有以下結構的部分：
其中R₁₂為氫。
如請求項1所述之化合物，其中R₁₀為氫或二烷基胺基；或R₁₀為具有以下結構之部分：
如請求項2所述之化合物，其中R₁、R₃及R₆之各實例為氫。
如請求項3所述之化合物，其中R₈及R₉共同形成具有以下結構的部分：
如請求項3所述之化合物，其中R₁₀為氫或二烷基胺基；或R₁₀為具有以下結構之部分：
如請求項1所述之化合物，其中m為1；n為1；p為1；Ln為Eu；各M獨立地選自由以下組成之群：Na、Li及K；Y為-C≡C-； R₁之各實例獨立地為氫或烷基；R₂、R₄、R₅、及R₇各獨立地選自氫及烷基；R₃與R₆各為氫；R₈及R₉各獨立地選自氫及烷基；或R₈及R₉共同形成具有以下結構的部分：
R₁₀為氫或二烷基胺；或R₁₀為具有以下結構之部分：
；及R₁1及R₁₂之各實例獨立地選自氫及烷基。
如請求項1所述之化合物，其中該化合物選自由以下組成之群：

其中M為鋰或鈉。
一種偵測一或多種尿液聚胺之方法，其包含以下步驟：a、提供尿液樣品；b、使該尿液樣品與如請求項1所述之化合物接觸，從而形成測試樣品；及c、偵測該測試樣品中是否存在一或多種尿液聚胺。
如請求項11所述之方法，其中該尿液樣品係自個體獲得。
如請求項12所述之方法，其中該一或多種尿液聚胺為精胺(spermine)。
如請求項12所述之方法，其中該偵測是否存在一或多種尿液聚胺之步驟包含測定該一或多種尿液聚胺之濃度。
如請求項14所述之方法，其中該一或多種尿液聚胺為精胺。