TWI682937B - 經官能化以供癌症靶向之化學活化的奈米蛋白殼體 - Google Patents

Abstract

本發明提供經修飾之蛋白殼體蛋白質，其等含有至少一部分E型肝炎病毒(HEV)開放閱讀框2(ORF2)，在HEV ORF2或其部分之表面可變環或C端中具有一或多個半胱胺酸殘基。該等經修飾之蛋白殼體蛋白質可用於形成外表面上曝露有半胱胺酸官能基之E型肝炎病毒(HEV)病毒狀顆粒(VLPs)。該等曝露之半胱胺酸官能基可經由其硫醇反應性基團修飾。例如，生物活性劑(諸如細胞靶向配位體)可結合至該一或多個半胱胺酸以靶向遞送化學活化的奈米蛋白殼體。

Description

經官能化以供癌症靶向之化學活化的奈米蛋白殼體 相關申請案之交叉參考

本申請案主張2014年5月19申請之美國臨時申請案第62/000,465號之優先權，出於所有目的將其全部內容以引用的方式併入本文中。

在聯邦政府資助之研發及發展下聲明本發明之權利

本發明係在國立衛生研究院(National Institutes of Health)授予之合約AI095382下經政府支持進行。政府對本發明具有一定權利。

病毒狀顆粒(VLPs)可作為奈米載體以靶向遞送診斷學及治療學方案(諸如DNA/RNA及各種化學療劑)。E型肝炎病毒(HEV)係可引起人類之急性肝臟炎症的腸傳播病毒。HEV病毒狀顆粒(HEV VLPs)係蛋白殼體蛋白質二十面體籠狀物，其可藉由在真核表現系統中表現主要蛋白殼體蛋白質HEV開放閱讀框2(ORF2)而產生。HEV VLPs在酸及蛋白分解環境中穩定，此係HEV之自然傳播途徑所需之特徵。因此，HEV VLPs表示可經開發(例如)以供化學療劑遞送、疫苗接種及/或成像之具有發展前景的奈米載體。

然而，為實現其等作為奈米載體之前景，仍需開發保留在酸及蛋白分解環境中之穩定性以及展示經改變之VLP-表面功能性之HEV VLPs。例如，仍需開發可透過表面曝露靶向部分導向靶細胞或組織 類型之HEV VLPs。本發明實現此需求及其他相關需求。

本發明提供一種經半胱胺酸修飾之HEV VLP支架以改變HEV VLP之表面功能性。

在第一態樣中，本發明提供一種經修飾之蛋白殼體蛋白質，其包括一部分可形成酸及蛋白水解穩定型HEV病毒狀顆粒(VLP)之E型肝炎病毒(HEV)開放閱讀框2(ORF2)蛋白質，其中：該部分HEV ORF2包括HEV ORF2蛋白質之P域；該P域包括至少一個表面可變環及C端；該P域之該至少一個表面可變環或該C端包括半胱胺酸；且當化學衍化該表面可變環或C端半胱胺酸時，該HEV ORF2部分保留其形成酸及蛋白水解穩定型HEV VLP之能力。

在一些實施例中，當該表面可變環或C端半胱胺酸係經烷基化、醯化、芳基化、琥珀醯化、氧化或結合至可偵測之標記或生物活性劑時，該HEV ORF2部分保留其形成酸及蛋白水解穩定型HEV VLP之能力。在一些實施例中，該經修飾之蛋白殼體蛋白質包括至少90%、95%或99%相同於或完全相同於SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6之HEV ORF 2蛋白質之殘基112-608的胺基酸序列。在一些實施例中，該至少一個P域表面可變環或C端半胱胺酸係結合至可偵測之標記。在一些實施例中，該可偵測之標記包括螢光團、超順磁標記、MRI顯影劑、正電子發射同位素或具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇。在一些實施例中，該具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇包括金奈米簇。

在一些實施例中，該至少一個P域表面可變環或C端半胱胺酸係結合至生物活性劑。在一些實施例中，該生物活性劑係異源肽。在一些實施例中，該異源肽係細胞靶向配位體。在一些實施例中，該細胞靶向配位體係癌細胞靶向配位體。在一些實施例中，該癌細胞靶向配 位體係LXY30。在一些實施例中，該癌細胞靶向配位體係結合表現於癌細胞表面上之抗原的抗體。在一些實施例中，該經修飾之蛋白殼體蛋白質之P域表面可變環中或P域C端進一步包括第二半胱胺酸。在一些實施例中，該第二半胱胺酸係結合至化學療劑。

在一些實施例中，該第二半胱胺酸係結合至可偵測之標記。在一些實施例中，結合至該第二半胱胺酸之該可偵測之標記包括螢光團、超順磁標記、MRI顯影劑、正電子發射同位素或具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇。在一些實施例中，結合至該第二半胱胺酸之包括具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇之該可偵測之標記包括金奈米簇。

在一些實施例中，該至少一個P域表面可變環半胱胺酸係經烷基化、醯化、芳基化、琥珀醯化或氧化。在一些實施例中，HEV ORF2之該至少一個P域表面可變環半胱胺酸取代HEV ORF2之Y485、T489、S533、N573或T586或該C端半胱胺酸取代HEV ORF2之殘基608。在一些實施例中，該經修飾之蛋白殼體蛋白質係酸及蛋白水解穩定型HEV VLP之組分。

在一些實施例中，該酸及蛋白水解穩定型HEV VLP囊封生物活性劑。在一些實施例中，該經囊封之生物活性劑係異源核酸、異源肽、可偵測之標記、非蛋白胺基酸、寡醣、合成大分子或化學療劑。在一些實施例中，該經囊封之可偵測之標記包括螢光團、超順磁標記、MRI顯影劑、正電子發射同位素或具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇。在一些實施例中，包括該具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇之該經囊封之可偵測之標記包括金奈米簇。

在第二態樣中，本發明提供一種組合物，其包括前述態樣或實施例中任一項之經修飾之蛋白殼體蛋白質及醫藥上可接受之賦形劑。在一些實施例中，該組合物包括在HEV ORF2 P域表面可變環或C端內 具有至少一個半胱胺酸之HEV VLP，其化學結合至細胞靶向配位體、生物活性劑或可偵測之標記。該化學結合可導致在半胱胺酸與細胞靶向配位體、生物活性劑或可偵測之標記之間之異源配置。

在第三態樣中，本發明提供一種核酸(例如，經分離之核酸)，其包括編碼前述經修飾之蛋白殼體蛋白質中任何一者之聚核苷酸序列。在第四態樣中，本發明提供一種表現卡匣，其包括可操作連接至編碼前述經修飾之蛋白殼體蛋白質中任何一者之聚核苷酸序列的啟動子(例如，異源啟動子)。在第四態樣中，本發明提供一種細胞(例如，經分離之細胞或宿主細胞)，其包括前述核酸或前述表現卡匣。在第五態樣中，本發明提供一種細胞(例如，經分離之細胞或宿主細胞)，其包括前述經修飾之蛋白殼體蛋白質中之任何一者。在第六態樣中，本發明提供一種生物，其包括前述經修飾之蛋白殼體蛋白質中之任何一者。

在第七態樣中，本發明提供一種製造經修飾之蛋白殼體蛋白質之方法，其包括在適合允許該經修飾之蛋白殼體蛋白質表現之條件下培養前述細胞、經分離之細胞或宿主細胞中之任何一者。在一些實施例中，該方法進一步包括純化該蛋白殼體蛋白質。在一些實施例中，該方法進一步包括衍化該至少一個P域表面可變環或C端半胱胺酸。在一些實施例中，該衍化包括醯化、烷基化、芳基化、琥珀醯化或氧化該P域表面可變環或C端半胱胺酸。在一些實施例中，該衍化包括使生物活性劑結合至該至少一個P域表面可變環或C端半胱胺酸。

在第八態樣中，本發明提供一種將HEV VLP導向靶細胞之方法，其包括使細胞與該HEV-VLP接觸，其中該HEV VLP包括前述經修飾之蛋白殼體蛋白質中之任何一者，其中該HEV VLP進一步包括對靶細胞具有親和力之結合該至少一個P域表面可變環或C端半胱胺酸之細胞靶向部分。在一些實施例中，該HEV VLP進一步包括可偵測之 標記，及該方法進一步包括偵測該可偵測之標記。在一些實施例中，該偵測該可偵測之標記包括偵測螢光團、超順磁標記、MRI顯影劑、正電子發射同位素或具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇。在一些實施例中，該偵測該具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇包括偵測金奈米簇。

在一些實施例中，對靶細胞具有親和力之結合該至少一個P域表面可變環或C端半胱胺酸之細胞靶向部分係異源肽，其包括癌細胞靶向配位體，及該靶細胞係癌細胞。在一些實施例中，該HEV VLP或其組分進入該癌細胞中。在一些實施例中，該HEV VLP囊封生物活性劑，及該方法包括將該生物活性劑遞送至該細胞之細胞內區域。在一些實施例中，該經囊封之生物活性劑係異源核酸、異源肽、可偵測之標記、非蛋白胺基酸、寡醣、合成大分子或化學療劑。在一些實施例中，該經囊封之可偵測之標記包括螢光團、超順磁標記、MRI顯影劑、正電子發射同位素或具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇。在一些實施例中，該經囊封之具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇包括經囊封之金奈米簇。

圖1：(A)描繪HEV ORF 2之表面可接近之可撓性螺圈區域(P域表面可變環)及殘基Y485、T489、S533、N573及T586之位置，其等位於此類可撓性螺圈區域內且經選擇以供半胱胺酸突變。(B)所有經選擇以供半胱胺酸突變之殘基位於P域之表面，殘基Y485、T489、T586在最外表面，及殘基S533及N573在面向VLP 5倍軸之側。

圖2：攜載半胱胺酸置換突變之嵌合HEV VLP的表徵。(A)儘管彼等突變者在VLP拆解後展示相似生物素化，但相較於其他突變位點(即，Y485、T489、S533及T586)，N573處之半胱胺酸突變似乎容許嵌合VLP之有效生物素化。(B)野生型VLP及嵌合VLP對單株抗體 HEP40-4B具有相似結合親和力，同時嵌合VLP對單株抗體HEP230展示低反應性。

圖3：(A)與HEP230之Fab片段複合之HEV wt-VLP的三維密度圖展示為沿5倍軸之等值面，此顯示在兩個5倍相關之突出二聚物之間隙中的額外密度(箭頭)。(B)該密度與該Fab分子之足跡一致。(C)殘基N573(球體模式)位於HEP230之結合位點旁，使得(D)容許每個5倍區域僅一個Fab分子結合。

圖4：兩步驟化學結合方法之示意圖，該方法包含硫醇選擇性反應及經銅催化之疊氮化合物-炔類環化加成(CuAAC)或「點擊化學」反應以形成LXY30-VLPs。本研究已測試兩種方法。方法1：(A)首先完成在Mal-疊氮化合物與炔類-LXY30之間之經銅催化之疊氮化合物-炔類環化加成(CuAAC)反應以形成經馬來醯亞胺連接之LXY30(Mal-LXY30)。(B)然後添加Mal-LXY30以與N573C-VLPs之Cys反應。所有此等化學結合過程後，經LXY30及Cy5.5修飾之N573C-VLP(LXY30-VLP-Cy5.5)保持完整性。方法2：(A)該結合過程藉由在N573C-VLPs之Cys位點處標記化經馬來醯亞胺連接之疊氮化合物(Mal-疊氮化合物)開始至硫醇選擇性反應以建構經疊氮化合物連接之VLPs(疊氮化合物-VLPs)，接著添加LXY30-炔類、抗壞血酸及CuSO4以形成經LXY30連接之VLPs(LXY30-VLPs)。(C)由於活性劑(包含疊氮化合物、抗壞血酸及CuSO4)之存在而自結合過程產生之受損或拆解的LXY30-VLPs可藉由(例如)離心、尺寸排除層析法及類似方法自完整之VLPs中分離。

圖5：結合至MDA-MB-231乳癌細胞之VLP-Cy5.5及LXY30-VLP-Cy5.5之活體外螢光資料。(A)以MDA-MB-231乳癌細胞培養之VLP-Cy5.5或LXY30-VLP-Cy5.5之流動式細胞測量術資料。(B)靶向MDA-MB-231細胞之LXY30-Cy5.5-VLP之NIR螢光影像。使用蔡司共焦螢光 顯微術(Zeiss confocal fluorescence microscopy)獲取藉由Hoechst 33342(藍)著色之核信號及Cy5.5(紅)之信號。

圖6：LXY30化學結構及其結合至U-87MG細胞。加擾(scrambled)LXY30及LXY30均直接結合至FITC，以U-87MG細胞培養並藉由流動式細胞測量術偵測。相較於負對照，LXY30顯示明顯結合至高度表現α3-β1-整聯蛋白之U-87MG細胞。由於非特異性染色自螢光團FITC，因此加擾LXY30顯示最小攝取。

圖7：在以異體移植物植入之裸鼠上之VLP-Cy5.5及LXY30-VLP-Cy5.5奈米顆粒之即時腫瘤靶向特徵的活體內NIR螢光影像。對帶MDA-MB-231乳癌腫瘤之小鼠靜脈內注射當量VLP-Cy5.5或LXY30-VLP-Cy5.5。箭頭表示腫瘤位點。使用配備625nm激發帶通濾波器及700nm發射之柯達(Kodak)多峰成像系統IS2000MM獲得光學成像。

圖8：描繪經設計以將半胱胺酸突變引入HEV ORF 2之P域表面可變環中之引子。加粗具有經取代之胺基酸序列之親代序列。以半胱胺酸編碼序列取代親代胺基酸設計正向5’-3’及反向3’-5’引子。a-e分別代表Y485C、T489C、S533C、N573C及T586C。

圖9：描繪HEV ORF2蛋白殼體蛋白質之P域之表面可變環及C端殘基的位置。(A)描繪HEV ORF 2蛋白殼體蛋白質之P域表面可變環之示意圖。(B)描繪HEV VLP上之P域表面可變環殘基及C端殘基的位置。可將一或多個半胱胺酸放置於指定環或C端殘基內以結合至分子有效負載。

圖10：示意性描繪嵌合HEV ORF2 VLPs作為奈米載體以供藥物遞送之應用。蛋白殼體之週期性、具有反應性部分之表面可接近之胺基酸之存在及蛋白殼體蛋白質二聚物之單鏈版對多樣化肽插入之耐受性可實現藉由化學結合或基因插入密集性重複展示靶向配位體及藉由化學結合展示適配體、醣蛋白等。HEV ORF2 VLPs亦具有可裝載各 種材料(包含DNA質體)之相對大內部體積。相較於其他病毒狀顆粒，HEV ORF2 VLPs具有強結構可塑性及對鈣濃度敏感之穩定性切換。

圖11：Cys-VLP與經硫保護之Au₁₀₂結合。(A)描繪金與Cys-VLP共價結合之兩種方法。(B)Cys-VLP與Au₁₀₂(pMBA)₄₄之直接配位體交換。(C)Cys-VLP與Au₁₀₂-C₆-馬來醯亞胺之馬來醯亞胺結合。(D)具有Au₁₀₂(pMBA)₄₄之Cryo-EM Cys-VLP及經處理之3-D重構。

圖12：示意性描繪用以囊封量子點於HEV ORF2 VLP(頂)中之方法。相較於無包裝之VLPs，經鐵氧體包裝之VLPs之透射電子顯微鏡影像顯示更暗強度。

I.定義

如本說明書及隨附申請專利範圍中使用，除非上下文明確另有所指，否則單數形式「一、「一個」及「該」包含複數參照。

「E型肝炎病毒」或「HEV」係指病毒、病毒類型或病毒類，其i)引起水媒性、傳染性肝炎；ii)就血清特徵而言，係不同於A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)或D型肝炎病毒(HDV)及iii)含有基因體區域，其與插入pTZKF1(ET1.1)(嵌埋於大腸桿菌(E.coli)菌株中之質體，其以登錄號67717存放在美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC))中之1.33kb cDNA同源。

參考HEV，術語「蛋白殼體蛋白質」及「經修飾之蛋白殼體蛋白質」係指成熟或經修飾(例如，經截短、重組突變或化學衍化)的HEV開放閱讀框2(ORF2)多肽。如本文使用，提及此類ORF2多肽或蛋白質意指包含全長多肽及其片段，亦包含對該等ORF2蛋白質所作之任何取代、缺失或插入或其他修飾。該等蛋白殼體蛋白質必須可形成病毒狀顆粒(VLP)。通常，該蛋白殼體蛋白質含有HEV ORF2之至少殘基 112-608，然而該蛋白殼體蛋白質可耐受各種額外之取代、缺失或插入，只要其等耐受而不消除VLP形成。

在一實施例中，術語「經修飾之蛋白殼體蛋白質」係指蛋白殼體蛋白質或其部分，其中HEV ORF2之P域之表面可變環係經修飾以併入一或多個野生型蛋白殼體蛋白質序列中原本不存在之半胱胺酸。此外或另一選擇，術語「經修飾之蛋白殼體蛋白質」係指蛋白殼體蛋白質或其部分，其中HEV ORF2之C端(例如，位置608)係經修飾以併入野生型蛋白殼體蛋白質序列中原本不存在之半胱胺酸。此外或另一選擇，術語「經修飾之蛋白殼體蛋白質」係指蛋白殼體蛋白質或其部分，其中半胱胺酸(例如，HEV ORF 2之P域之表面可變環的半胱胺酸或在位置608處重組引入之半胱胺酸)係經化學衍化以共價結合至該蛋白質之至少一個異源原子或分子。可插入半胱胺酸使得HEV ORF2蛋白質長度增加，或半胱胺酸可取代P域表面可變環及/或C端之一或多個殘基。

通常，經修飾之蛋白殼體蛋白質保留形成HEV VLPs之能力。在一些情況下，該一或多個半胱胺酸係結合至生物活性劑(例如，諸如肽LXY30之細胞靶向配位體)。P域表面可變環包含HEV ORF 2(SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6)之(例如)殘基475-493、殘基502-535、殘基539-569、殘基572-579及殘基581-595中之一或多者。P域表面可變環進一步包含多肽之殘基，該多肽包括至少約80%、85%、90%、95%、99%或更多相同於SEQ ID NOS：1、2、3、4、5或6中之一或多者且對應於SEQ ID NOS：1、2、3、4、5或6之殘基475-493、殘基502-535、殘基539-569、殘基572-579及殘基581-595中之一或多者之胺基酸序列。

如本文使用，術語「病毒狀顆粒」(VLP)係指藉由蛋白殼體蛋白質形成之二十面體殼(例如，T1或T3)。VLPs由於缺乏病毒基因體而 係非傳染性的。「VLP」係指非複製性二十面體病毒殼，其衍生自E型肝炎病毒蛋白殼體蛋白質HEV ORF2、其部分。一經在合適之表現系統中重組表現該蛋白質，VLPs可自發形成。在一些實施例中，VLP係形成自經修飾之蛋白殼體蛋白質，例如，在HEV ORF2或其部分之表面可變環中含有一或多個半胱胺酸殘基之蛋白殼體蛋白質。HEV VLP可含有經修飾及/或未經修飾之HEV ORF2蛋白質之混合物。

在HEV VLP上下文中，術語「酸及蛋白水解穩定型」係指HEV VLP耐受哺乳類動物消化系統中之酸及蛋白水解環境。評估酸及蛋白水解穩定性之方法係描述於Jariyapong等人，2013中且包含(但不限於)使HEV VLP經受酸(例如，pH為或約為6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5或2)及/或蛋白水解環境(例如，胰蛋白酶及/或胃蛋白酶)並藉由電子顯微術、凝膠過濾層析法或其他合適方法檢測經接觸之HEV VLP以判定是否保留HEV VLP之四級結構(例如，T=1、T=3、二十面體、十二面體等)。可在酸及/或蛋白水解條件下將HEV VLPs(例如，經修飾或未經修飾)之群體培養一段合適之時間(例如，至少為或至少約為1、2、3、4、5、10、15、20、30、45或60分鐘)及然後測試以判定四級結構保留程度。在本文中，酸及蛋白水解穩定型經修飾之HEV VLP係指當作為VLPs群體在酸及/或蛋白水解條件下培養並藉由電子顯微術分析時，至少該VLPs群體之10%、25%、50%、75%、90%、95%、99%或100%保留其等四級結構的經修飾之HEV VLP。

或者，該HEV VLP可經由經口途徑遞送至個體及藉由偵測及/或定量以下各物評估遞送效率：(i)在HEV VLP內對抗原之免疫反應；(ii)結合至HEV VLP、重組引入至HEV VLP內或藉由HEV VLP囊封之可偵測之標記；或(iii)因對細胞遞送締合至(例如，重組引入至、結合至或經囊封)HEV VLP之生物活性劑所致之生物反應。在本文中，酸及蛋白水解穩定型經修飾之HEV VLP係指保留未經修飾之HEV VLP 之至少10%、25%、50%、75%、90%、95%、99%或100%之經口遞送效率及/或細胞進入活性之經修飾之HEV VLP。

如在描述兩種元件之相對位置之文中所用，術語「異源」係指兩種元件諸如核酸(例如，啟動子或蛋白質編碼序列)或蛋白質(例如，HEV ORF2蛋白質或其部分或經修飾之蛋白殼體蛋白質及另一蛋白質)無法自然發現於相同相對位置。因此，基因之「異源啟動子」係指無法自然操作連接至該基因的啟動子。

已知E型肝炎病毒(HEV)引起嚴重之急性肝臟衰竭。HEV屬於肝炎病毒科(Hepeviridae)家族中之肝炎病毒(Hepevirus)屬。HEV含有約7.2-kb之單股正義RNA分子。該RNA係經3'聚腺苷酸化且包含三個開放閱讀框(ORF)。ORF1編碼位於基因體之5'半邊中之病毒非結構化蛋白質。ORF2編碼位於基因體之3'端之蛋白質形成病毒蛋白殼體。ORF3編碼與ORF1之C端及ORF2之N端重疊之13.5-kDa蛋白質。ORF3係關於膜及細胞骨架部分。

如本文使用，術語「囊封」或「經囊封」係指異源物質(諸如異源核酸或蛋白質、化學療劑、成像劑、鐵氧體奈米顆粒等)包封於本文定義之VLPs內。

術語「生物活性劑」係指靶向特定生物位置(靶向試劑)及/或提供一些可在活體內或活體外證明之局部或全身性生理或藥理效應之任何試劑、藥物、化合物或其混合物。非限制性實例包含藥物、激素、疫苗、抗體、抗體片段、維生素及輔助因子、多醣、碳水化合物、類固醇、脂質、脂肪、蛋白質、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸及核酸(例如，mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、DNA、cDNA、反義建構、核糖酵素等)。

「醫藥上可接受」或「藥理上可接受」材料係非生物上有害或在其他方面非所需之材料，即，該材料可連同本發明之蛋白殼體蛋白 質或HEV VLPs或組合物投與至個體而不產生任何非所需之生物效應之材料。該材料亦不以有害之方式與含有該材料之組合物之任何組分相互影響。

術語「賦形劑」係指任何可能存在於本發明組合物之成品劑型中之大體上附屬物質。例如，術語「賦形劑」包含媒劑、黏合劑、崩解劑、填充劑(稀釋劑)、潤滑劑、助流劑(流動增強劑)、助壓縮輔劑、染料、甜味劑、防腐劑、懸浮劑/分散劑、成膜劑/塗料、調味劑及印刷油墨。

術語「佐劑」係指當結合抗原投與時增加對抗原之免疫反應但單獨投與時不產生對抗原之免疫反應之化合物。佐劑可藉由若干機制(包含補充淋巴細胞、刺激B及/或T細胞及刺激巨噬細胞)增加免疫反應。

對抗原或組合物之「免疫原性反應」係對受關注組合物中存在之抗原之體液及/或細胞免疫反應在個體中之發展。出於本發明之目的，「體液免疫反應」係指藉由抗體分子介導之免疫反應，而「細胞免疫反應」係藉由T-淋巴細胞及/或其他白血球介導之反應。細胞免疫之一個重要態樣涉及藉由細胞溶解T-細胞(「CTL」s)之抗原特異性反應。CTLs對肽抗原具有特異性，該等肽抗原締合藉由主要組織相容性複合物(MHC)編碼並表現於細胞表面上之蛋白質而存在。CTLs幫助引發及促進破壞細胞內微生物或溶解經此類微生物感染之細胞。細胞免疫之另一態樣涉及藉由輔助T-細胞之抗原特異性反應。輔助T-細胞發揮幫助刺激非特異性效應子細胞抵抗表面上展示肽抗原締合MHC分子之細胞之功能，並集中該活性。「細胞免疫反應」亦係指藉由經活化之T-細胞及/或其他白血球產生之細胞介素、趨化介素及其他此類分子(包含彼等衍生自CD4+及CD8+T-細胞者)的產生。因此，免疫學反應可包含以下效應中之一或多者：藉由B-細胞產生抗體；及 /或活化特異性導向存在於受關注組合物或疫苗中之抗原之抑制T-細胞及/或γ△ T-細胞。此等反應可助於中和感染性及/或介導抗體-補體或抗體依賴性細胞之細胞毒性(ADCC)以向免疫宿主提供保護。可使用此項技術中熟知的標準免疫分析及中和分析判定此類反應。

如本文使用，術語「宿主」係指人類及其他動物。

術語「黏膜遞送」係關於組合物遞送至黏膜，諸如胃腸道之黏膜(例如，口腔或唇黏膜)或呼吸道之黏膜(例如，鼻黏膜)。

II.經修飾之蛋白殼體蛋白質之產生與純化及VLP形成

本發明之一個態樣係關於用於產生及純化蛋白殼體蛋白質及衍生自其等之VLPs之方法(參見Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.Li TC,Yamakawa Y,Suzuki K,Tatsumi M,Razak MA,Uchida T,Takeda N,Miyamura T.,J Virol.1997 Oct；71(10)：7207-13.Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.Li TC,Takeda N,Miyamura T,Matsuura Y,Wang JC,Engvall H,Hammar L,Xing L,Cheng RH.J Virol.2005 Oct；79(20)：12999-3006.Niikura M等人，Chimeric recombinant hepatitis E virus-like particles as an oral vaccine vehicle presenting foreign epitopes.Virology 2002；293：273-280)。在一個實施例中，該等蛋白殼體蛋白質係經修飾之蛋白殼體蛋白質及衍生自其之VLPs係經半胱胺酸修飾之HEV VLPs。例如，該等經修飾之蛋白殼體蛋白質在HEV ORF2或其部分之表面可變環中含有一或多個半胱胺酸殘基。

可使用各種表現系統表現本發明之蛋白殼體蛋白質。可用於產生本發明之病毒狀顆粒之表現系統之實例包含(但不限於)細菌性表現系統(例如，大腸桿菌(Escherichia coli))、昆蟲細胞、酵母菌細胞及哺乳動物細胞。較佳之本發明之表現系統包含使用昆蟲細胞之桿狀病 毒表現系統。(例如)用於處理及製備桿狀病毒載體及桿狀病毒DNA之一般方法及昆蟲細胞培養程序概述於A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures中。

本發明之蛋白殼體蛋白質可選殖至桿狀病毒載體中並用以感染合適之宿主細胞(參見，例如，O'Reilly等人，「Baculovirus Expression Vectors：A Lab Manual」，Freeman & Co.1992.)。可用含有編碼本發明之蛋白殼體蛋白質之聚核酸之轉移載體轉形昆蟲細胞系(例如，Sf9或Tn5)。該轉移載體包含(例如)線性化桿狀病毒DNA及含有所需多核苷酸之質體。為製造重組桿狀病毒，可以線性化桿狀病毒DNA及質體共轉染宿主細胞系。

可根據此項技術中之標準技術(參見，Li TC等人，J Virol.1997 Oct；71(10)：7207-13.Li TC等人，J Virol.2005 Oct；79(20)：12999-3006.Niikura M等人，Virology 2002；293：273-280)進行本發明之病毒狀顆粒之純化。然後將經純化之VLPs再懸浮於合適之緩衝劑中。

在一些實施例中，該等經修飾之蛋白殼體蛋白質或衍生自其之VLPs可化學結合至一或多種生物活性劑。例如，可使用此項技術中已知的方法醯化、烷基化、芳基化、琥珀醯化或氧化該等蛋白殼體蛋白質之一或多個半胱胺酸殘基。在一些情況下，可使用馬來醯亞胺官能基結合一或多個半胱胺酸殘基以將生物活性劑共價結合至半胱胺酸之硫醇部分。在一些情況下，該生物活性劑可使用點擊化學修飾以引入馬來醯亞胺官能基。例如，該生物活性劑之炔類衍生物可在CuSO₄及抗壞血酸之存在下與馬來醯亞胺-疊氮化合物接觸以產生馬來醯亞胺生物活性劑。然後可使馬來醯亞胺與經修飾之蛋白殼體蛋白質之一或多個半胱胺酸接觸以共價連接兩個分子。在一些情況下，該結合係在未組裝成VLP之蛋白殼體蛋白質上進行(例如，在EDTA、EGTA及/或諸如DTT或β巰基乙醇之還原劑的存在下)。在一些情況下，該結合 係在組裝成VLP之蛋白殼體蛋白質上進行結合。

III.生物活性劑之囊封

本發明之另一態樣係關於將一或多種生物活性劑囊封於HEV病毒狀顆粒(例如經半胱胺酸修飾之HEV VLPs)中(參見DNA vaccine-encapsulated virus-like particles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal and systemic immune responses by oral administration,Gene Therapy 2004.11,628-635.S Takamura,M Niikura,T-C Li,N Takeda,S Kusagawa,Y Takebe,T Miyamura及Y Yasutomi)。可使用此項技術中之任何標準技術將異源核酸、蛋白質、多肽、化學療劑、成像劑、奈米顆粒等囊封於本發明之VLPs中。一般程序涉及(1)拆解由本發明之蛋白殼體蛋白質形成之VLPs；及(2)在生物活性劑之存在下重構VLPs。熟習此項技術者應知曉較佳在囊封程序前具有純化之VLPs。特佳在囊封程序前使VLPs清除或大體上清除任何不欲物質(例如核酸)。

可使用此項技術中之任何標準技術進行VLPs之拆解。可在生理條件下產生重構病毒狀顆粒(參見美國專利公開案第20080131928號)。通常，病毒狀顆粒之拆解需要分裂VLPs組裝之試劑，諸如還原劑或螯合劑(參見美國專利公開案第20040152181號)。熟習此項技術者應知曉影響組裝及拆解之因素及條件包含：pH、離子強度、病毒蛋白殼體蛋白質之轉譯後修飾、雙硫鍵及二價陽離子鍵結等。例如，對多瘤病毒(Brady等人，J.Virol,23：717-724,1977)及輪狀病毒(Gajardo等人，J.Virol,71：2211-2216,1997)，已顯示陽離子鍵結(特別係鈣)在保持病毒體完整性中之重要性。此外，雙硫鍵顯示對穩定多瘤病毒(Walter等人，Cold Spring Har Symp.Quant.Biol,39：255-257,1975；Brady等人，J.Virol,23：717-724,1977)及SV40病毒(Christansen等人，J.Virol,21：1079-1084,1977)重要。此外，已知諸 如pH及離子強度等因素影響多瘤病毒蛋白殼體穩定性，藉由影響靜電相互作用推測(Brady等人，J.Virol,23：717-724,1977；Salunke等人，Cell,46：895-904,1986；Salunke等人，Biophys.J,56：887-900,1980)。此外，已知一些病毒蛋白殼體蛋白質之轉譯後修飾可影響蛋白殼體穩定性及組裝，例如醣苷化、磷酸化及乙醯化(Garcea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80：3613-3617,1983；Xi等人，J.Gen.Virol,72：2981-2988,1991)。因此，有許多相關因素可影響蛋白殼體穩定性、組裝及拆解。

較佳地，藉由移除鈣離子拆解本發明之VLPs(參見，Touze A,Coursaget P.In vitro gene transfer using human papillomavirus-like particles.Nucleic Acids Res 1998；26：1317-1323；Takamura等人，DNA vaccine-encapsulated virus-like particles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal and systemic immune responses by oral administration.Gene Therapy 2004；11：628-635)。根據本發明，還原劑或螯合劑或兩者用以拆解VLPs。可使用各種還原劑。還原劑之較佳實施例包含(但不限於)二硫蘇糖醇(DTT)。可使用各種螯合劑，例如，乙二醇四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。VLP拆解條件之實例包含(但不限於)以下：藉由含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM EGTA及20mM二硫蘇糖醇之緩衝劑培養30分鐘以中斷經純化之VLPs。

熟習此項技術者亦將知曉無需(儘管較佳)完全拆解VLPs以囊封生物活性劑。技術者亦將知曉在其他情況下，較佳部分拆解VLPs。根據本發明，可控制用於部分拆解VLPs之條件以仍容許生物活性劑之有效囊封。可藉由單獨使用還原劑(例如，20mM DTT)處理VLPs完成VLPs之部分拆解(Sapp等人，J.Gen.Virol.,76：2407-2412,1995.)。根據本發明，一經完全或部分拆解VLPs，則可藉由在生物活性劑之存 在下重組裝VLPs進行生物活性劑之囊封。在一些情況下，可有利地利用具有淨負電荷之生物活性劑以增強囊封。例如，核酸具有淨負電荷且相較於具有正或中性電荷之化合物，可優先囊封。

在本發明之一些實施例中，藉由向經中斷之VLPs重新補充鈣離子達成VLPs之重組裝。或者，藉由移除還原劑或螯合劑達成VLPs之重組裝。視需要，可調節諸如pH及離子強度因素、本發明中描述之其他因素以達成VLPs之有效重組裝及生物活性劑之有效囊封。

在一些實施例中，如下進行囊封：室溫下培養30min後，向經中斷之VLP製劑中添加在50mM Tris-HCl緩衝劑(pH 7.5)及150mM NaCl中之生物活性劑。然後藉由以濃度不斷增大直至最終濃度高達5mM之CaCl₂培養1h重折疊經中斷之VLP製劑。VLPs係藉由超速離心粒化並再懸浮於10mM鉀-MES緩衝劑(pH 6.2)中。為評估經囊封之試劑之量，經重折疊及經純化之VLPs係純化自任何未經囊封之生物活性劑並用EGTA(1mM)中斷。可使用上清液之吸光度或其他合適之方法偵測生物活性劑。

在一些實施例中，待囊封之生物活性劑或成像劑係結合至蛋白殼體化信號(encapsidation signal)。例如，對應於HEV開放閱讀框1之密碼子35-59之RNA元件係強大之蛋白殼體化信號，其容許在活體外與HEV蛋白殼體蛋白質(包含如本文描述之HEV ORF2 VLP之經截短及/或經半胱胺酸修飾版)進行特異性相互作用。為使用VLP作為治療劑或成像劑之載劑，可在蛋白殼體自組裝之前使用以諸如前述RNA元件之HEV蛋白殼體化信號標記該試劑(例如，化學療劑)之化學連接子(例如，LC-SPDP或適配體、終樹狀體(telodendrimer))。

在一些實施例中，囊封可偵測之標記(成像劑)。該可偵測之標記可係可藉由各種機制(包含化學、酵素、免疫或放射方式)偵測附接其之分子之部分。可偵測之標記之一些實例包含螢光分子(諸如螢光 素、玫瑰紅、德州紅(Texas Red)及藻紅素)及酵素分子(諸如山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶及β半乳糖苷酶)，其等允許基於螢光發射或藉由該酵素催化之化學反應之產物之偵測。亦可將涉及各種同位素諸如3H、125I、35S、14C或32P之放射性標記附接至合適之分子以能夠藉由任何合適之記錄放射性之方法(諸如自動放射顯跡術)進行偵測。參見，例如，Tijssen，「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Burdon及van Knippenberg編，Elsevier(1985)，第9 20頁。引入標記、標記化過程及標記偵測亦可見於Polak及Van Noorden，Introduction to Immunocytochemistry，第2版，Springer Verlag，NY(1997)；及Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.出版之組合手冊及目錄(1996)中。其他可偵測之標記包含(但不限於)超順磁性標記(例如，鐵氧體)、造影增強劑(例如，MRI造影劑)、原子簇(例如，金簇)及類似物。

在一些實施例中，囊封生物活性劑。在一些情況下，該生物活性劑係化學療劑。合適之化學療劑包含(但不限於)細胞毒性藥物。可用於本發明中之細胞毒性藥物之實例包含：烷基化藥物，諸如環磷醯胺、依弗醯胺、苯丁酸氮芥、黴法蘭、白消安(busulfan)、洛莫司汀(lomustine)、卡莫司汀(carmustine)、氮芥(莫司汀(mustine))、雌莫司汀(estramustine)、蘇消安(treosulfan)、噻替哌(thiotepa)、二溴甘露醇(mitobronitol)；細胞毒性抗生素，諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、伊達比星(idarubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone、mitozantrone)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素(dactinomycin)及絲裂黴素(mitomycin)；抗代謝藥，諸如胺甲喋呤、卡培他濱(capecitabine)；阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、克拉屈濱(cladribine)、吉西他 濱(gemcitabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、雷替曲塞(raltitrexed、tomudex)、甲巰嘌呤(mercaptopurine)、替加氟(tegafur)及硫鳥嘌呤(tioguanine)；長春花生物鹼(vinca alkaloids)，諸如長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)及依託泊苷(etoposide)；其他腫瘤藥物，諸如安吖啶(amsacrine)、六甲蜜胺(altretamine)、左旋門冬醯胺酶(crisantaspase)、達卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide)、羥基脲(hydroxycarbamide、hydroxyurea)、噴司他丁(pentostatin)，鉑化合物包含：卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin)、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、甲基苄肼(procarbazine)、雷佐生(razoxane)；紫杉烷包含：多西他賽(docetaxel)及紫杉醇(paclitaxel)；拓樸異構酶I抑制劑包含伊立替康(iriotecan)及拓樸特肯(topotecan)、曲妥珠單抗(trastuzumab)及維甲酸(tretinoin)。在一些情況下，前述成像劑及/或生物活性劑或其組合中之一或多者可經由硫醇鍵另外或替代性結合至P域表面可變環或C端中之半胱胺酸(例如，重組引入之半胱胺酸)。在一些情況下，前述成像劑及/或生物活性劑或其組合中之一或多者可經由硫醇鍵另外或替代性結合至P域表面可變環或C端中之第二半胱胺酸(例如，重組引入之半胱胺酸)。

當使用蛋白殼體蛋白質之不同構造時，VLPs之尺寸可變化。例如，可調節蛋白殼體蛋白質之N端部分以增大或減小VLPs之尺寸及囊封能力。在本發明之一些實施例中，在構造HEV VLP中，利用融合至一部分HEV ORF 2蛋白質之N端之一部分HEV ORF 3蛋白質調節VLPs之尺寸。通常，HEV VLP係形成自一部分HEV ORF2，其具有HEV ORF 2之至少殘基112-608。

IV.醫藥組合物、調配物及投與

本發明亦提供醫藥組合物或生理組合物，其等包括藉由本發明 之蛋白殼體蛋白質形成之經半胱胺酸修飾的HEV VLP。此類醫藥或生理組合物亦包含一或多種醫藥上或生理上可接受之賦形劑或載劑。本發明醫藥組合物適用於各種藥物遞送系統中。適用於本發明中之調配物見於Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA，第17版(1985)中。為簡單回顧用於藥物遞送之方法。參見Langer,Science 249：1527-1533(1990)。

可向宿主投與本發明組合物及賦形劑。對本發明有用之賦形劑包含(但不限於)媒劑、黏合劑、崩解劑、填充劑(稀釋劑)、潤滑劑、助流劑(流動增強劑)、助壓縮劑、染料、甜味劑、防腐劑、懸浮劑/分散劑、成膜劑/塗料、調味劑及印刷油墨。

各種佐劑可視宿主種類用以增強免疫學反應，且包含(但不限於)Freund's(完整及不完整)、諸如氫氧化鋁之礦物凝膠、諸如溶血卵磷脂、複合多元醇、多價陰離子、肽、油乳化液、釘形貝血藍蛋白、二硝基酚之表面活性物質及諸如BCG(卡介苗)及短小棒狀桿菌之潛在有用之人類佐劑。此項技術中亦熟知此類佐劑。可與本發明組合物共同投與之其他佐劑包含(但不限於)單磷醯脂質免疫調節劑、AdjuVax 100a、QS 21、QS 18、CRL1005、鋁鹽、MF 59及病毒體佐劑技術。該等佐劑亦可包括此等物質之混合物。

本發明組合物及方法之一個優點係可在不投與佐劑之情況下投與本發明組合物以刺激免疫反應。因此，在一些情況下，在不投與佐劑之情況下向宿主投與本發明組合物。

本發明之另一優點係本發明組合物適用於經口遞送。因為黏膜表面相互連接，所以藉由抗原刺激一黏膜表面不僅可在經直接刺激之表面上而且可在遠處表面上引起黏膜免疫。例如，本發明組合物之經口遞送可防範呼吸及生殖泌尿感染。本發明組合物亦適用於黏膜遞送，諸如遞送至口腔或唇黏膜或呼吸道黏膜，包含鼻黏膜。

可藉由各種途徑投與本發明醫藥組合物，例如，經口、皮下、經皮、皮內、肌肉內、靜脈內或腹膜內。投與該等醫藥組合物之較佳途徑係以約0.01-5000mg，較佳5-500mg之日劑量經口遞送。可以單一日劑量或作為以合適間隔呈現之分劑量(例如，每日兩次、三次、四次或更多次子劑量)投與合適之劑量。

為製備本發明醫藥組合物，使用惰性及醫藥上可接受之載劑。該醫藥載劑可係固體或液體。固體形式製劑包含例如粉劑、錠劑、可分散粒劑、膠囊、扁囊劑及栓劑。固體載劑可係一或多種亦可充當稀釋劑、調味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、黏合劑或錠劑崩解劑之物質；其亦可係囊封材料。

在粉劑中，該載劑通常係微細固體，其係與微細活性組分(例如，具有經囊封之核酸之嵌合病毒狀顆粒)之混合物。在錠劑中，該活性成分(具有經囊封之核酸之嵌合病毒狀顆粒)與具有之必需結合性質之載劑按合適之比例混合並壓縮成所需之形狀及大小。

為製備呈栓劑形式之醫藥組合物，首先熔化低熔蠟(諸如脂肪酸甘油酯及可可脂之混合物)並藉由(例如)攪拌將該活性成分分散於其中。然後將熔融均勻混合物倒入大小適中之模具中並使其冷卻及凝固。

粉劑及錠劑較佳含有約5重量%至約70重量%之該活性成分。合適之載劑包含例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、乳糖、糖、果膠、糊精、澱粉、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔蠟、可可脂及類似物。

該等醫藥組合物可包含該活性化合物及作為提供膠囊之載劑之囊封材料的調配物，其中該活性組分(有或無其他載劑)被該載劑包圍，使得該載劑因此締合該化合物。以類似方式，亦可包含扁囊劑。錠劑、粉劑、扁囊劑及膠囊可用作適合經口投與之固體劑型。

液體醫藥組合物包含例如適合經口或非經腸投與之溶液、懸浮液及適合經口投與之乳化液。該活性組分(例如，具有經囊封之核酸之嵌合病毒狀顆粒)之無菌水溶液或該活性組分在溶劑(包括水、緩衝水、鹽水、PBS、乙醇或丙二醇)中之無菌溶液係適合非經腸投與之液體組合物的實例。該等組合物可含有如適當之生理條件所需之醫藥上可接受之輔助物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、滲透性調節劑、潤濕劑、清潔劑及類似物。

可藉由將該活性組分(例如，具有經囊封之核酸之嵌合病毒狀顆粒)懸浮於所需溶劑系統中及然後使所得溶液通過膜過濾器以將其滅菌，或者，藉由在無菌條件下將該無菌化合物溶解於經預先滅菌之溶劑中來製備無菌溶液。所得水性溶液可經包裝按照現況使用或經凍乾，在投與之前，將該凍乾製劑與無菌水性載劑組合。該等製劑之pH通常將在3與9之間，更佳5至8，及最佳6至7。

可投與本發明醫藥組合物以供預防性及/或治療性治療。在治療性應用中，向已罹患病症之患者投與足以預防、治癒、逆轉或至少部分減緩或阻止該病症及其併發症之病狀之量的組合物。足夠實現此目的之量定義為「治療有效劑量」。對此用途有效之量將取決於該疾病或病症之嚴重性及患者體重與一般狀況，但對70kg之患者而言通常在每日約0.1mg至約2,000mg之該組合物之範圍內變化，對70kg之患者而言更常使用每日約5mg至約500mg之該組合物的劑量。

在預防性應用中，向易於或原本具有發展疾病或病症之風險之患者投與足以延遲或預防症狀顯現之量之本發明醫藥組合物。此類量定義為「預防性有效劑量」。在此用途中，該組合物之精確量再次取決於患者之健康及體重狀態，但對70kg之患者而言通常在每日約0.1mg至約2,000mg之抑制劑之範圍內，對70kg之患者而言更通常每日約5mg至約500mg。

可以主治醫師所選之劑量水平及模式進行該等組合物之單一或多次投與。在任何情況下，該醫藥調配物應提供足以有效刺激患者之免疫反應之一定量(治療性或預防性)之本發明組合物。

出於所有目的，本申請案中所援引之所有專利案、專利申請案及其他公開案(包含基因庫登錄號)係以全文引用之方式併入本文中。

V.實例

以下實例係僅以圖解說明之方式且非以限制之方式提供。熟習此項技術者將易於知曉可改變或修改各種非關鍵性參數以產生大體上相同或相似之結果。

實例1：經官能化以供癌症靶向之可化學活化的病毒蛋白殼體

簡介

已提議將病毒狀顆粒(VLPs)用作奈米載體以展示外源性表位及/或遞送小分子，一種用於防治許多疾病之方法。¹本申請案主要依賴於自組裝性質及基因修飾之簡易性以實現既定VLP之設計應用。相較於基因工程，外源性肽與VLP之化學結合展示顯著優點，因為其容許大量實體(諸如肽或寡醣)以經調節及可撓性而不改變VLP組裝之方式結合至病毒狀顆粒之表面。

E型肝炎病毒(HEV)包含無包膜二十面體蛋白殼體，其包圍7.2千鹼基之單股RNA基因體。該主要蛋白殼體蛋白質係由第二開放閱讀框(ORF2)編碼且其不僅係病毒組裝必要而且係免疫原性及宿主相互作用必要。⁶當自N端缺失111個胺基酸及自C端缺失52個胺基酸後於昆蟲細胞中表現時，該重組蛋白殼體蛋白質(PORF2)可自組裝成VLP。PORF2折疊成三個域：S(殼；胺基酸118-317)、M(中間；胺基酸318-451)及P(突出；胺基酸452-606)。^9-11重組HEV-VLPs由60個PORF2複本組成，其中S域具有典型之八次反平行折疊並穩定二十面體殼及P域突出為極大地助於HEV抗原性之表面尖端。以三域模組 性，可易於操作(例如，改變抗原性)HEV-VLP以自T3二十面體顆粒減小尺寸至T1二十面體顆粒，及/或修改P域處之序列而不妨礙HEV-VLP組裝。

類似於天然病毒，HEV-VLP可在於酸性環境中穩定¹⁵及耐蛋白水解消化，¹³因此其作為經口遞送媒劑具有極大優勢。實際上，HEV-VLP之經口投與引起全身性及黏膜免疫而不引起耐受性，及因此可在非人類之靈長類中提供抵抗HEV攻擊之保護性免疫。¹⁶經口投與後，攜載外源性表位之嵌合VLPs可引起黏膜及全身性抗體抵抗HEV及該外源性表位。¹⁴重要地，HEV-VLP可經口遞送質體DNA至小腸上皮細胞並引發抗體及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應抵抗經質體編碼之抗原。¹⁷所有此等研究已確定以類似於病毒天然傳播途徑利用HEV-VLP以供黏膜遞送的可行性。

癌症診療要求藥物與病理性病灶直接接觸；因此，攜載特異性配位體之膠囊優先靶向遞送抗癌試劑。基於脂質體及/或有機聚合物(諸如聚乙二醇)之當前遞送系統產生可行之仍較低之特異性癌細胞靶向。在本研究中，吾人建立基於HEV-VLP之診療性膠囊，其進入特異性可藉由VLP-結合靶向配位體定義。經修飾之HEV-VLP在與LXY30(對人體惡性乳腺腫瘤細胞具有高親和力之配位體肽¹⁸)結合後在活體外及活體內均對乳腺腫瘤細胞顯示特異性靶向，此指示可操作病毒狀顆粒之遞送途徑以促進化學療劑藥物或siRNA靶向遞送至病理性病灶。

結果

P域之表面環處之半胱胺酸置換

烷基化及醯化係兩種傳統之生物結合方法，其等藉由將配位體分別附接在離胺酸之胺基或半胱胺酸上之硫醇基而用以共價修飾病毒顆粒。HEV ORF2天然具有四個曝露於P域表面上之離胺酸殘基。外 部配位體將與四個離胺酸殘基中之一或多者隨機偶合。為避免此隨機偶合，決定以基因方式對P域表面引入半胱胺酸置換，此容許使用醯化以位點特異性地錨固該外部配位體，同時使用烷基化以使螢光染料結合至表面離胺酸殘基。

基於HEV-VLP之已知結構(圖1A)自P域之表面可變環選擇用於半胱胺酸置換的五個位點。¹⁰此等位點係基於其等位置及序列突變可行性選擇以最小化VLP組裝之任何可能變形。如預期，在Y485、T489、S533、N573或T586處之個別半胱胺酸置換不改變VLP組裝，因為該等嵌合VLPs在電子顯微術下表現為直徑27nm之球形投影。為評估半胱胺酸醯化之有效性，吾人首先檢測HEV-VLP與馬來醯亞胺-生物素之結合效率，此一旦成功結合即可透過馬來醯亞胺與半胱胺酸之硫醇基之間之不可逆反應引起VLP生物素化。在所有五個突變VLPs中，當使用經標記之鏈黴親和素分析時，相較於其他嵌合VLP，攜載於N573處經置換之半胱胺酸之嵌合VLP(N573C-VLP)明顯顯示更高Mal-生物素化效率。然而，相較於其他者之生物素化水平，拆解之N573C-VLP表現並無不同(圖2A)。此等資料表明N573C-VLP提供合適之半胱胺酸配置以適應生物素結合及/或後續偵測。

嵌合N573C VLP不與HEV抗體反應

由於P域攜載HEV之抗原性結構，因此序列突變可改變HEV抗體針對所得嵌合VLPs之免疫反應性。為深刻瞭解嵌合VLPs之抗原性，比較存在或缺乏生物素結合下嵌合N573C VLP與野生型HEV-VLP之抗原性。用未結合之N573C VLP、經馬來醯亞胺生物素結合之N573C VLP或野生型HEV-VLP塗覆ELISA板，及然後用兩種單株抗體HEP230或HEP40-4培養。相較於HEP40-4，HEP230對野生型HEV-VLP展示強結合，但無法展示對N573C VLP之可偵測之結合，與生物素結合無關(圖2B)。針對HEP230及HEP40-4之混合物之ELISA顯示相似趨勢(資料 未顯示)。此資料表明殘基N573對HEP230結合係重要的。

殘基N573涉及FAB230結合

提議之突變位點位於P域之表面可變環中。殘基Y485、T489及T586曝露於P域高地之最外表面上，而殘基S533及N573位於P域之桿區域(圖1B)。為瞭解殘基N573在HEP230結合中之作用，吾人藉由低溫電子顯微術(cryoEM)及影像處理判定與HEP230之Fab複合之HEV VLP的結構。

與HEP230之Fab(Fab230)複合之嵌合VLP似乎類似於低溫電子顯微圖上之HEV-VLP之形態。此等複合物顯示均勻之尺寸分佈。藉由疊加二十面體對稱性計算三維重構，然而每個VLP上之六十個抗體結合位點未被Fab230完全佔據。其顯示HEV-VLP含有30個突出尖端，其中之每個沿二十面體二倍軸向外延伸(圖3A)。相較於天然HEV-VLP，此等尖端似乎圍繞二十面體五倍軸彼此連接。該等尖端間之連接密度遠弱於該蛋白殼體且未足夠大以適應Fab分子。然而，該連接密度之尺寸似乎與Fab分子之接觸表面呈良好之一致性(圖3B)，此指示Fab230可在此位置處接觸VLP。

隨後吾人在影像處理期間，藉由自三維重構釋放五倍及三倍對稱性，即，使用2-2-2對稱性代替5-3-2對稱性驗證此發現。五次精修迭代之後，觀察到自P域之相同位點向內延伸向5倍軸(資料未顯示)之單一細長密度。此助於證實Fab230結合至此區域。與HEV抗體8C11之Fab片段(PDB編碼3RKD)之晶體結構對接之模型顯示額外密度確實覆蓋Fab中之三個接觸環(圖3C)。將HEV ORF2(PDB編碼1ZZQ)之晶體結構對接入密度圖中顯示殘基N573在Fab230之結合足跡中(圖3C、D)，且可與來自Fab230之殘基直接接觸。

結合至N573C VLP之LXY30顯示癌細胞靶向

為評估N573-VLP之靶向及診斷性能力，通過經半胱胺酸錨固之 三聚氰胺-炔類將乳癌細胞靶向配位體LXY30化學添加至表面N573C-VLPs。經LXY30修飾之N573C-VLPs(LXY30-VLPs)在化學結合後保持完整性(圖4)。流動式細胞測量術顯示相較於野生型VLPs(圖5A)，LXY30-VLPs對MDA-MB-231乳癌細胞具有明顯更高附著(>5倍)，此指示LXY30-VLP特異性靶向乳癌細胞。

為判定LXY30-VLPs是否進入MDA-MB-231細胞內，吾人在LXY30-VLPs及MDA-MB-231細胞之培養後藉由共焦顯微術檢測HEV ORF2之分佈。為此成像，用近紅外染料Cy5.5標記LXY30-VLPs並用MDA-MB-231細胞在37℃下培養1小時。如圖5B中所示，大多數經Cy5.5-標記之VLP圍繞MDA-MB-231細胞之細胞核區域分佈，此意指VLP被內化至細胞質中。野生型VLPs具有最低細胞攝取，而LXY30-VLPs在MDA-MB-231細胞中展示明顯更高攝取(圖5B)。此等結果證明與靶向配位體之化學結合能夠引起HEV-VLP特異性攝取至乳癌細胞中。亦藉由神經膠瘤細胞系U-87MG測試LXY30及加擾LXY30(S-LXY30)之攝取，此表明其作為HEV-VLP之結合物以靶向神經膠瘤細胞之用途(圖6)。

結合至N573C VLPs之LXY30活體內靶向至乳腺腫瘤細胞

已顯示非侵入性活體內成像係一種可視化監測治療試劑遞送之強大工具。使用活體內NIR光學成像以研究VLPs在帶MDA-MB-231乳癌異體移植物之裸鼠內之分佈，其作為評估腫瘤靶向之特異性的標準。將經Cy5.5標記之LXY30-VLPs及經Cy5.5標記之野生型VLPs分別經由尾部血管靜脈內注射於帶MDA-MB-231異體移植物之裸鼠中。用螢光成像器以不同間隔掃描小鼠高達72小時。靜脈內注射後，經Cy5.5-標記之野生型VLPs及LXY30-VLPs立即遍佈小鼠全身，並經由增強滲透性及保留(EPR)效應逐漸累積於MDA-MB-231腫瘤中。然而，LXY30-VLPs在腫瘤位點之攝取率快於野生型VLPs在腫瘤位點之 攝取率。在1及6小時注射後，經Cy5.5-標記之LXY30-VLPs在MDAMB-231腫瘤中之螢光強度亦顯著高於經Cy5.5-標記之野生型VLPs在MDAMB-231腫瘤中之螢光強度(圖7)。

HEV為腸傳播病毒，偏好進入肝臟中之肝細胞。經Cy5.5標記之VLPs於一小時內累積在腹部器官(包含肝臟)不足為奇。注射後72小時進行切除器官之離體(ex vivo)成像。Cy5.5之剩餘信號主要發現於肝臟及腎臟，然而該信號在切除之腫瘤中顯示微弱(資料未顯示)。肝臟及腎臟中之高攝取可部分解釋為崩解之VLPs自循環血管滲漏。總而言之，此等結果指示Cy5.5/LXY30連接之HEV-VLPs能夠靶向活體內之MDA-MB-231異種移植物。

討論

已多次嘗試使用VLPs作為藥物遞送系統用於需要遞送細胞毒性藥物或特異性基因修飾物、細胞標記或需囊封之藥物之疾病。VLPs提供組織/細胞特異性方法機會同時對健康細胞之整體傷害最小。相較於因降解早而具有有限半衰期之其他奈米遞送系統，類似E型肝炎病毒之HEV-VLP可通過低pH及蛋白水解性黏膜/胃環境而保持其結構且無需冷溫儲存。此意為HEV-VLPs可具有較高傾向有效遞送及因顆粒降解而減少累積，²⁰兩者皆係治療性奈米載體之重要因素。HEV ORF2在市售昆蟲High Five細胞中基於桿狀病毒表現載體之生產產生容易以高產率及低成本純化之HEV-Cys-VLP蛋白殼體蛋白質。²¹相比之下，許多其他奈米遞送系統因可變表現水平及無生產效率而妥協。

HEV-VLP P域之表面上之半胱胺酸置換經工程化以保留配位體可接近靶細胞。在所有產生之嵌合VLPs中，基於西方墨點分析N573C VLP建構似乎顯示最強鏈黴親和素結合(圖2A)，儘管半胱胺酸硫醇基嵌埋於二十面體五倍軸(fivefold axis)之表面凹陷內。結構分析顯示N573C與其五倍相關(five-fold related)相鄰N573C之間之距離係45Å， 該距離與鏈黴親和素單體之長度十分一致。實際上，鏈黴親和素係溶液中之同源四聚物。該鏈黴親和素同源四聚物可插入表面凹陷處並與N573C錨定之生物素分子形成多價相互作用，此大大地減小分解速率。因此，鏈黴親和素對N573C VLP之結合性(avidity)最高，儘管鏈黴親和素對單一生物素之親和力似乎與其結合至拆解之VLPs所顯示之親和力相同。相比之下，其他嵌合VLPs中之半胱胺酸殘基之四級配置不支持鏈黴親和素之多價結合。

N573殘基係位於Fab之結合足跡中(圖3)，使得N573之突變阻斷PORF2與HEP230之相互作用。然而，五倍凹陷之體積不足以同時適應五個Fab分子，使得經Fab-結合之VLP結構在二十面體平均化後僅可捕獲Fab分子之接觸區域。密度係佔據蛋白殼體之約20%，此表明僅一個Fab分子存在於每個五倍軸處。此與非二十面體對稱性平均化密度圖一致。此結合位點不同於吾人先前報告之抗體HEP224之結合位點，抗體HEP224之結合關鍵取決於HEV ORF2之殘基Y485。⁴經HEP224結合VLP之重構在P域之肩部顯示60個Fabs之密度，Fab自VLP中央向遠處延伸。⁴此表明在HEV-VLP表面上之兩種不同之抗原性域彼此不重疊；與先前為HEV報告之ELISA¹³及突變作用¹⁹結果一致。

總而言之，選擇HEV-573C VLPs作為經模組化之診療性膠囊之平臺，因為其具有弱化針對預存在之HEV抗體之免疫抵抗性之可能性及與配位體多價結合之可能性。在吾人之實驗中，吾人利用兩種不同結合方法：馬來醯亞胺與半胱胺酸之硫醇選擇性結合及胺基與NHS-酯之胺基選擇性結合。吾人因藉由半胱胺酸置換提供之空間特異性而選擇硫醇選擇性結合以將癌細胞靶向配位體偶合至VLP。為避免競爭，藉由胺基選擇性結合進行染料之結合，此為吾人產生足夠之NIR信號以活體外及活體內(小鼠中)偵測MDA-MB-231乳癌細胞中之VLP分佈。因此，HEV-Cys VLPs可用作以癌症黏附性配位體及偵測標示物 標記之用於癌症診斷之穩健候選者之雙重官能性的平臺。

除於表面上結合癌細胞靶向配位體外，亦可藉由使用HEV-Cys-VLPs之內部空間擴張經模組化之診療性膠囊之利用率。HEV-Cys-VLP係能夠囊封各種生物活性物質。例如，對於MRI診斷及熱療法而言，HEV-Cys-VLPs可囊封諸如鐵氧體之磁性奈米顆粒。在此類情況下，可使用超音波或射頻電磁輻射選擇性刺激磁性奈米顆粒以加熱囊封於腫瘤靶向之診療性膠囊中之鐵氧體顆粒。²²帶負電荷之微-RNA/siRNA亦可囊封於HEV-Cys-VLPs之內部中。¹⁷藉由結合癌細胞靶向配位體於其表面上，HEV-Cys-VLP可具有潛在癌細胞靶向基因療法應用；因此，此將改善用於癌症患者中之當前治療。

材料及方法

HEV ORF2之P域之定點突變作用

遵循製造商協議及圖8中描繪之引子，藉由定點突變作用使用QuickChange定點突變作用套組(Stratagene)將HEV-ORF2之P域之五個胺基酸殘基(Y485、T489、S533、N573及T586)(圖9)個別地突變成半胱胺酸殘基。使用攜載HEV ORF2基因之桿狀病毒轉移載體(pFastBac1/dORF2-HEV)⁸作為定點突變作用之模板。基於HEV之二聚物模型及關鍵性結合位點資訊選擇此等殘基以供突變作用。²³攜載位點突變Y485、T489、S533、N573及T586之突變pFastBac1/dORF2-HEV質體分別命名為pFastBac1/dORF2-HEV-Y485、-T489、-S533、-N573及-T586。藉由測序兩股證實此等質體中之每個突變的真實性。

HEV-Cys VLPs之產生及純化及活體外拆解

突變HEV ORF2蛋白質使用基於桿狀病毒之表現載體表現於昆蟲High Five細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。使用Bac-to-Bac®桿狀病毒表現系統(Invitrogen)於Sf9細胞(Invitrogen)上產生用以表現突變HEV ORF2蛋白質之重組桿狀病毒及每個上述pFastBac1/HEV ORF2 質體遵循製造商提供之協議。該等Sf9及High Five細胞分別保持於遵照標準協議補充有2.5%熱滅活FBS之ESF921介質(Expression Systems,Davis,CA USA)及Excell 420介質(SAFC Biosciences,Lenexa,KS)上。²⁴如前文描述自各種突變POR2建構進行HEV-Cys-VLPs之產生及純化。⁷為表現突變POR2蛋白質及產生VLPs，以每個桿狀病毒建構以感染倍率為5接種High Five細胞並培養6-7天。通過如前文描述之CsCl均衡密度梯度超速離心法之多重步驟收集並純化VLPs。⁷將經純化之VLPs再懸浮於pH6.2之10mM鉀-MES緩衝劑中並儲存於4℃下。拆解實驗中使用微型滲析裝置(Millipore)。藉由針對於含有EDTA(10mM)及/或DTT(20mM)之緩衝劑之滲析中斷經純化之VLPs。

透射電子顯微術

將經純化之VLPs裝載於輝光放電之經碳塗覆之EM柵上並以2%乙酸氧鈾染色並在JOEL JEM-1230透射電子顯微鏡下以30,000X放大倍數檢測。影像記錄於CCD攝影機(TVIPS Gauting,Germany)上。

生物素與HEV-Cys VLPs之結合

為將經馬來醯亞胺連接之生物素化學結合至HEV-Cys VLPs，使用經馬來醯亞胺連接之生物素(20μM-200μM)以與HEV-Cys VLPs(4μM-40μM)在pH7.2之0.01M PBS中在4℃下反應過夜。然後使用7,000MWCO去鹽柱(ZebaTM旋轉去鹽柱，Thermo Scientific)移除未結合之馬來醯亞胺-生物素

西方墨點

於還原條件下，將總計2μg之結合生物素之HEV-Cys ORF2裝載於每流道之流動之10% SDS-PAGE上。然後將蛋白質轉移至聚二氟亞乙烯(PVDF)膜(Millipore Co.)以供西方墨點。首先以5%脫脂奶阻斷PVDF膜及然後在室溫下以1：10,000之比率以經HRP結合之鏈黴親和素培養1小時。然後藉由增強化學螢光法使用ECL套組(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)偵測生物素-鏈黴親和素反應。

酶聯免疫吸附分析(ELISA)

於10mM鉀-MES(pH 6.2塗覆緩衝劑)中製備重組HEV-WT-VLP顆粒(包含HEV-WT及HEV-Cys突變體)。將該等蛋白質稀釋至1-100ng/ml之最終濃度並在4℃下過夜塗覆於潔淨之底部96-孔板(Nunc,Pleasant Prairie,WI)。用pH 7.2之0.01M PBS培養對照孔。在以含有20mM之pH 7.4之Tris及150mM NaCl之Tris緩衝劑中之0.5%吐溫-20阻斷後，用~50μl之HEV抗體在37℃下培養經塗覆之VLPs兩小時。使用經鹼性磷酸酶標記之抗小鼠FAb偵測相關HEV抗體。使用對硝基苯基磷酸鹽(pNPP)溶液(Sigma Co)發展酵素催化反應。在405nm下使用酶標儀測量硝基苯基之黃色產物及計算每個VLP之平均吸光度值。

LXY30-VLP-Cy5.5之製備

藉由在200μM CuSO4及1mM抗壞血酸之存在下於4℃下混合650μM之馬來醯亞胺-疊氮化合物及650μM之炔類-LXY30過夜製備經馬來醯亞胺結合之LXY30。然後以3：1(配位體對結合位點)之莫耳比率添加經馬來醯亞胺結合之LXY30以通過硫醇反應在4℃下與HEV-Cys突變體上之Cys殘基反應過夜。藉由7,000MWCO去鹽柱(ZebaTM旋轉去鹽柱，Thermo Scientific)移除未結合之分子。

為將Cy5.5 NHS酯(Limiprobe)化學結合至HEV-Cys VLPs，使用Cy5.5 NHS酯(200nm)以與HEV-Cys突變體(20μM)以300：1(染料對VLP)之莫耳比率在含有0.01M PBS之pH 7.2之緩衝劑中在室溫下反應2小時，接著在4℃下培養過夜。然後藉由7,000MWCO去鹽柱(ZebaTM旋轉去鹽柱，Thermo Scientific)移除游離Cy5.5 NHS酯。

流動式細胞測量術

分別用Cy5.5-標記之HEV-573C VLPs(VLP-Cy5.5)或Cy5.5/LXY30結合之HEV-573C VLPs(LXY30-VLP Cy5.5)將MDA-MB- 231乳癌細胞在37℃下培養1小時。然後用PBS清洗該等細胞3次並再懸浮於PBS中以供流動式細胞分析。¹⁸為每個樣品收集總計10,000個事件。使用未經染色之細胞作為對照組。

共焦顯微術

根據先前制定之協議進行樣品製備。²⁵簡而言之，將MDA-MB-231乳癌細胞接種於腔室蓋玻片滑片(VWR LabShop,Batavia,IL)中。到達80%細胞長滿後，分別以Cy5.5-標記之HEV-573C VLPs(VLP-Cy5.5)及經Cy5.5-標記經LXY30-結合之HEV-573C VLPs(LXY30-VLP-Cy5.5)在37℃下培養該等細胞1h。以Hoechst 33342(invitrogen)染色細胞核5min。以PBS清洗該等細胞兩次並在蔡司共焦螢光顯微鏡下觀察前以新鮮媒介物取代。

活體內光學成像

雌性SPF BALB/c小鼠(10-12周齡)購買自Charles River(Davis,CA)並根據AAALAC指南培養在無病原體條件下並在開始任何實驗前容許其等適應至少4天。將MDA-MB-231乳癌細胞皮下注射至裸鼠中以形成皮下結節。所有動物實驗遵從制度指南及根據加州大學戴維斯分校(University of California,Davis)之動物使用及照護管理諮詢委員會(Animal Use and Care Administrative Advisory Committee)批准之協議第06-12262號進行。通過尾部血管向帶MDA-MB-231腫瘤之小鼠分別靜脈內注射4nmol/L之經Cy5.5螢光標記之HEV-573C VLPs(VLP-Cy5.5)及經LXY30結合之HEV-573C VLPs(LXY30-VLP-Cy5.5)。

在不同時間點(注射後1、6、24及48小時)，以柯達成像系統IS2000MM根據前文描述之步驟掃描該等小鼠。²⁶以625nm激發帶通濾波器及700nm發射收集影像，曝露時間係每影像30s。活體內成像後，藉由在注射後72h以過量CO₂使動物安樂死。切除腫瘤、器官及肌肉組織並以柯達成像工作站成像。

用於低溫電子顯微術之VLP-Fab複合物之製備

藉由在4℃下以1：180之莫耳比率培養VLPs及Fabs過夜製備VLP-Fab複合物。為在結構化判定期間確保最佳純度、最大佔用及最終低背景雜訊，藉由使樣品通過短Sephacryl-300凝膠過濾柱獲得純VLP-FAB複合物。使用在280nm波長下之光學密度讀數以選擇含有VLP-Fab複合物之片段。然後藉由SDS-PAGE在還原條件下表徵經純化之VLP片段以證實Fab之結合。

低溫電子顯微術

關於cryo-EM之程序及其樣品製備大體上類似於如彼等前文描述者。²⁷簡而言之，一滴最佳濃度之HEV-VLP等分試樣施用於輝光放電之經多孔碳塗覆之銅柵，經點墨以移除過量液體並立即浸漬於液體乙烷中。然後將冰凍水合之樣本轉移至Gatan 626DH低溫架上並在透射電子顯微鏡(JEM-2100F,JEOL)下在液氮溫度下檢測。在最低劑量系統下於TemCam-F415 CCD攝影機(TVIPS)上在2Å之像素尺寸(pixel size)下於樣本空間處獲取顯微圖。施用之失焦在顯微圖中自1,000至3,000變化。顆粒濃度、最佳冰厚度及最小樣本位移係用於選擇顯微圖之可視化標準。

影像處理

然後手動選擇顆粒並首先經由交叉相關針對影像循環平均數之總和集中各者。藉由疊加單一顯微圖內之所有顆粒之功率譜計算像散性及失焦值。判定對比轉移功能並將相修正應用於結構性判定之資料中。野生型HEV-VLP之最初模型獲得自先前研究。¹³使用極性傅利葉轉換(PFT)演算法²⁸以對每個顆粒迭代進行原始及定向精修。藉由將一組顆粒與在二十面體非對稱性單元中均勻展開之定向組合，同時疊加5-3-2二十面體之對稱性計算三維重構。以經典傅利葉殼相關式(FSC)評估重構之可靠性並使用0.5作為截止值以15Å判定最終解析度。

將晶體結構擬合於低溫-EM密度圖中

藉由使用程式O將包含十個單元的HEV ORF2蛋白質(PDB ID 2ZZQ)之HEV十聚物平移及旋轉移動至cryo-EM密度圖中來進行手動擬合。²⁹該擬合係首先藉由最小化對稱性相關HEV ORF2分子間之碰撞手動精修及然後基於cryo-EM密度與計算自經擬合之HEV ORF2座標之密度間之交叉相關係數(CC值)評估。當CC值達到80%時停止擬合。該等Fab座標係獲自經Fab8C11結合之HEV P域(PDB ID 3RKD)之晶體結構並接入cryoEM圖內同時保持結合介面作為VLP之接觸表面。

參考文獻

1. Ludwig, C.; Wagner, R., Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol 2007, 18, 537-545.

2. Purcell, R. H., Hepatitis E virus. In Fields Virology, 第3版; Fields, B. N.; Knipe, D. M.; Howley, P. M.編. LIppincott - Raven Publishers: Phiadelphia, 1996;第2831-2843頁.

3. Tam, A. W.; Smith, M. M.; Guerra, M. E.; Huang, C. C.; Bradley, D. W.; Fry, K. E.; Reyes, G. R., Hepatitis E virus (HEV): molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome. Virology 1991, 185 (1), 120-31.

4. Xing, L.; Wang, J. C.; Li, T. C.; Yasutomi, Y.; Lara, J.; Khudyakov, Y.; Schofield, D.; Emerson, S. U.; Purcell, R. H.; Takeda, N.; Miyamura, T.; Cheng, R. H., Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol 2011, 85 (2), 1117-24.

5. Schofield, D. J.; Glamann, J.; Emerson, S. U.; Purcell, R. H., Identification by phage display and characterization of two neutralizing chimpanzee monoclonal antibodies to the hepatitis E virus capsid protein. J Virol 2000, 74 (12), 5548-5555.

6. Yu, H.; Li, S.; Yang, C. Y.; Wei, M.; Song, C.; Zheng, Z.; Gu, Y.; Du, H.; Zhang, J.; Xia, N. S., Homology model and potential virus-capsid binding site of a putative HEV receptor Grp78. J Mol Model 2010 , Epub ahead of print.

7. Li, T.-C.; Takeda, N.; Miyamura, T.; Matsuura, Y.; Wang, J. C. Y.; Engvall, H.; Hammar, L.; Xing, L.; Cheng, R. H., Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J. Virol. 2005, 79 (20), 12999-13006.

8. Li, T. C.; Yamakawa, Y.; Suzuki, K.; Tatsumi, M.; Razak, M. A.; Uchida, T.; Takeda, N.; Miyamura, T., Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol 1997, 71 (10), 7207-7213.

9. Guu, T.; Liu, Z.; Ye, Q.; Mata, D.; Li, K.; Yin, C.; Zhang, J.; Tao, Y., Structure of the hepatitis E virus-like particle suggests mechanisms for virus assembly and receptor binding. Proc Natl Acad Sci U S A 2009, 106, 12992-12997.

10. Xing, L.; Li, T. C.; Miyazaki, N.; Simon, M. N.; Wall, J. S.; Moore, M.; Wang, C. Y.; Takeda, N.; Wakita, T.; Miyamura, T.; Cheng, R. H., Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem 2010, 285, 33175-33183.

11. Yamashita, T.; Mori, Y.; Miyazaki, N.; Cheng, H.; Yoshimura, M.; Unno, H.; Shima, R.; Moriishi, K.; Tsukihara, T.; Li, T. C.; Takeda, N.; Miyamura, T.; Matsuura, Y., Biological and immunological characterics of hepatitis E virus-like particles based on the crystal structure. Proc Natl Acad Sci U S A 2009, 106, 12986-12991.

12. Xing, L.; Kato, K.; Li, T.; Takeda, N.; Miyamura, T.; Hammar, L.; Cheng, R. H., Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology 1999, 265 (1), 35-45.

13. Jariyapong, P.; Xing, L.; van Houten, N. E.; Li, T. C.; Weerachatyanukul, W.; Hsieh, B.; Moscoso, C. G.; Chen, C. C.; Niikura, M.; Cheng, R. H., Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine 2013, 31 (2), 417-24.

14. Niikura, M.; Takamura, S.; Kim, G.; Kawai, S.; Saijo, M.; Morikawa, S.; Kurane, I.; Li, T. C.; Takeda, N.; Yasutomi, Y., Chimeric recombinant hepatitis E virus-like particles as an oral vaccine vehicle presenting foreign epitopes. Virology 2002, 293 (2), 273-280.

15. Zafrullah, M.; Khursheed, Z.; Yadav, S.; Sahgal, D.; Jameel, S.; Ahmad, F., Acidic pH enhances structure and structural stability of the capsid protein of hepatitis E virus. Biochem Biophys Res Commun 2004, 313 (1), 67-73.

16. Li, T.-C.; Suzaki, Y.; Ami, Y.; Dhole, T. N.; Miyamura, T.; Takeda, N., Protection of cynomolgus monkeys against HEV infection by oral administration of recombinant hepatitis E virus-like particles. Vaccine 2004, 22, 370-377.

17. Takamura, S.; Niikura, M.; Li, T. C.; Takeda, N.; Kusagawa, S.; Takebe, Y.; Miyamura, T.; Yasutomi, Y., DNA vaccine-encapsulated virus-like particles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal and systemic immune responses by oral administration. Gene Ther 2004, 11 (7), 628-635.

18. Yao, N.; Xiao, W.; Wang, X.; Marik, J.; Park, S. H.; Takada, Y.; Lam, K. S., Discovery of targeting ligands for breast cancer cells using the one-bead one-compound combinatorial method. J Med Chem 2009, 52 (1), 126-33.

19. Galaway, F. A.; Stockley, P. G., MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Molecular pharmaceutics 2013, 10 (1), 59-68.

20. Ma, Y.; Nolte, R. J.; Cornelissen, J. J., Virus-based nanocarrier s for drug delivery. Advanced drug delivery reviews 2012, 64 (9), 811-25.

21. Kawano, M.; Xing, L.; Lam, K. S.; Handa, H.; Miyamura, T.; Barnett, S.; Sreivastava, I. K.; Cheng, R. H., Design platforms of nanocapsules for human therapeutics or vaccine In Development of Vaccines Singh; Srivastava, I. K.編. Wiley Pub 2011; 第125-140頁.

22. Roemer, R. B., Engineering aspects of hyperthermia therapy. Annu Rev Biomed Eng 1999, 1, 347-76.

23. Nilsson, J.; Miyazaki, N.; Xing, L.; Wu, B.; Hammar, L.; Li, T. C.; Takeda, N.; Miyamura, T.; Cheng, R. H., Structure and Assembly of a T=1 Virus-Like Particle in BK Polyomavirus. J. Virol. 2005, 79 (9), 5337-5345.

24. Merrington, C. L.; King, L. A.; R.D., P., Baculovirus expression systems. In Protein Expression: A practical Approach., Higgins, S. J.; Hames, B. D., Eds. Oxford University Press: 1999; 第101-127頁。

25. Xiao, K.; Li, Y.; Lee, J. S.; Gonik, A. M.; Dong, T.; Fung, G.; Sanchez, E.; Xing, L.; Cheng, H. R.; Luo, J.; Lam, K. S., "OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo. Cancer Res 2012, 72 (8), 2100- 10.

26. Luo, J.; Xiao, K.; Li, Y.; Lee, J. S.; Shi, L.; Tan, Y.; Xing, L.; Cheng, H.; Liu, G.; Lam, K. S., Welldefined, size-tunable, multifunctional micelles for efficient paclitaxel delivery for cancer treatment. Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1216-1224.

27. Kawano, M. A.; Xing, L.; Tsukamoto, H.; Inoue, T.; Handa, H.; Cheng, R. H., Calcium bridge triggers capsid disassembly in the cell entry process of simian virus 40. J Biol Chem 2009, 284 (50), 34703-12.

28. Baker, T.; Cheng, H., A model based approach for determining orientations of biological macromolecules imaged by cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol. 1996, 116, 120-130.

29. Jones, T. A.; Zou, J. Y.; Cowan, S. W.; Kjeldgaard, M., Improved method for building protein model in electron density maps and the location of errors in these models. Acta crystallogr. Sect. A 1991, 47, 110-119.

實例2：經官能化之奈米載體

簡介

圖10描繪用於修飾HEV ORF2 VLP奈米載體之表面及囊封可偵測之標記、藥物或核酸有效負載之各種途徑。基於HEV ORF2 VLP之奈米載體可活體外自組裝並囊封抗癌療劑或成像劑。利用基因工程化，可將癌症靶向配位體便利地配位至該載劑表面以供癌症特異性靶向遞送。總而言之，嵌合VLP展示極佳之生物相容性、近紅外光之高吸收及結構依賴性螢光淬滅/發射。此奈米醫學平臺容許整合多重成像及治療模態以供優異癌症偵測及治療。

腫瘤內遞送係一項現代醫學研究之挑戰性任務且係包括奈米載體與細胞、細胞外基質及腫瘤內血管分佈之間之許多協商之方法。本 文描述基於HEV-VLP之奈米載體以藉由使VLP在整體動物水平之原位分佈成像引導之靶向腫瘤遞送至腫瘤內部，並最終到達亞細胞胞器。藉由向P域之表面添加黏附性標記提供用於腫瘤靶向之工程化HEV-VLPs。基因插入之螢光標示物亦可插入於VLP中使得其可用作內源性報導子。此等奈米顆粒之用途證明於其在奈米載體之發展中所起之作用之相關顯微研究之力量。

奈米顆粒在被動及靶向藥物遞送中之用途在過去數十年中已顯著增加。已充分研究包含合成聚合物、脂質體及樹狀體之奈米載體，然而，僅有兩種經FDA批准之抗體-結合物及四種經FDA批准之基於奈米顆粒之藥物遞送載劑。病毒狀顆粒(VLP)係天然提供之奈米載體，其具有若干引人關注之特徵。其等可自組裝成具有能夠密集、重複展示腫瘤靶向試劑之既定週期性之單分散性奈米級顆粒。此外，該VLP具有多個使得其作為潛在奈米載體更引人關注之獨特特徵。

可用電子顯微術在存在或缺乏對比增強試劑下表徵HEV VLP奈米顆粒。可常規進行奈米顆粒之顯微表徵以檢測奈米載體之物理性質，使用本文描述之方法，諸如使冷凍水合多官能性顆粒成像，例如使用對比增強之金原子簇(圖11A)。用於將金簇結合至半胱胺酸硫醇鹽之方法及組合物包含直接配位體交換及/或馬來醯亞胺半胱胺酸結合(參見，例如，Ackerson等人，Bioconjug.Chem.,21,214-218(2010)；Ackerson等人，Methods Enzymol.,481：195-230(2010)；及Marjormäki等人，PNAS,111(4)：1277-81(2014))。藉由電子顯微術之直接可視化精確揭示奈米顆粒之尺寸、形狀及域配置及奈米顆粒上之蛋白質/藥物吸收、可影響奈米顆粒之整體生物活性及靶向腫瘤遞送之效率之因素。可藉由對未經染色之冷凍水合樣本進行低溫電子顯微術或藉由對負染色樣本進行傳統電子顯微術來使奈米顆粒成像。cryoEM相當適用於使生物大分子複合物成像(圖11A-D)。

此外，相關顯微技術可基於此等最新描述之結合物以達成在相同腫瘤樣本檢測中利用多重成像模態以遞送上述資訊並超過單獨任一模態之容量。例如，可使用光及電子顯微術以自生物體水平至器官水平、至細胞及甚至亞細胞細節成像。組合近紅外(NIR)整體動物成像及/或微-CT，相關光及電子顯微術(CLEM)允許VLP腫瘤內分佈之活體外及活體內成像。利用例如高壓冷凍及冷凍置換，可保存腫瘤診斷以保持HEV-VLP之充分抗原性以供免疫螢光標記化。

區域識別係腫瘤診斷之關鍵性問題中之一者，其中光及電子顯微術確實使相同物體成像。例如，利用本文描述之HEV VLPs，1)DAB(3,3’-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽)之光轉化；2)雙功能性探針FluoroNanogold；及3)EM取景柵之座標可於腫瘤識別之多重模態中資訊化。第一方法使用一經照射螢光染料即形成之氧自由基以引發DAB原位氧化。雖然在DAB溶液之存在下在螢光顯微鏡下可視化樣本，但經氧化之DAB形成網狀物，其將經呈細微顆粒密集沉澱物之四氧化鋨於前者螢光信號之位點處染色。經FluoroNanogold結合之抗體係市售試劑，其藉由使1.4nm金簇與綠色或紅色螢光團結合提供光及電子顯微鏡對比度。不同於其他尺寸之膠質金，該1.4nm奈米金簇不淬滅螢光。

本文描述之HEV VLPs容許藉由3D電子斷層掃描偵測及可視化以監測藥物遞送。電子斷層掃描提供3D空間資訊以描述藥物遞送媒劑在腫瘤內部的生物分佈。在三維實體中，腫瘤之微環境可比具有經培養之單層細胞之活體外發現之環境更複雜得多。電子斷層掃描可在分析載藥VLP之腫瘤內累積中用作CLEM之補充，以便於闡述VLP外滲並穿過腫瘤內之細胞層之機制。

此外，在拆解-及-重組裝過程中，除金簇外，HEV VLPs可配備額外之成像劑，例如，水溶性CdSe/ZnS量子點或鐵氧體並經其囊封 (圖12)。量子點可提供雙功能性探針以用相關光及電子顯微術追蹤VLP腫瘤攝取。可最佳化包裝效率以具有有效囊封，例如，藉由以HEV蛋白殼體化信號通過經LC-SPDP介導之交聯塗覆量子點。佔用HEV開放閱讀框1之密碼子35-59之RNA元件係較強之蛋白殼體化信號，其容許與HEV蛋白殼體蛋白質(包含如本文描述之HEV ORF2 VLP之經截短及/或經半胱胺酸修飾的版)之活體外特異性相互作用。為使用VLP作為藥物載劑，可在蛋白殼體自組裝前使用類似於前述RNA元件之HEV蛋白殼體化信號標記該藥物(例如，化學療劑)之化學連接子(例如，LC-SPDP或適配體、終樹狀體)。

非正式序列表

SEQ ID NO：1>HEV基因型1(NP_056788.1)

SEQ ID NO：2>HEV基因型3(BAH10873.1)

SEQ ID NO：3>HEV基因型4(ABE27148.1)

SEQ ID NO：4>HEV基因型2(M74506.1)

SEQ ID NO：5>HEV基因型5(BAJ77116)

SEQ ID NO：6>HEV基因型6(BAJ61827.1)

SEQ ID NO：7>HEV基因型1(NP_056788.1)，殘基112-608

SEQ ID NO：8>HEV基因型3(BAH10873.1)，殘基112-608

SEQ ID NO：9>HEV基因型4(ABE27148.1)，殘基112-608

SEQ ID NO：10>HEV基因型2(M74506.1)，殘基112-608

SEQ ID NO：11>HEV基因型5(BAJ77116)，殘基112-608

SEQ ID NO：12>HEV基因型6(BAJ61827.1)，殘基112-608

<110> 美國加利福尼亞大學董事會

<120> 經官能化以供癌症靶向之化學活化的奈米蛋白殼體

<140> WO PCT/US2015/031439

<141> 2015-05-18

<150> US 62/000,465

<151> 2014-05-19

<160> 33

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 660

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 660

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 660

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 659

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 4

<210> 5

<211> 610

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<220>

<221> misc_feature

<222> (368)..(368)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 5

<210> 6

<211> 610

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 6

<210> 7

<211> 497

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 7

<210> 8

<211> 497

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 8

<210> 9

<211> 497

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 9

<210> 10

<211> 497

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 10

<210> 11

<211> 497

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<220>

<221> misc_feature

<222> (257)..(257)

<223> Xaa可係任何天然生成胺基酸

<400> 11

<210> 12

<211> 497

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 12

<210> 13

<211> 178

<212> PRT

<213> 肝炎E病毒

<400> 13

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列a-親代

<400> 14

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列a-親代

<400> 15

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列a-半胱胺酸突變

<400> 16

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列a-半胱胺酸突變

<400> 17

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列b-親代

<400> 18

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列b-親代

<400> 19

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列b-半胱胺酸突變

<400> 20

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列b-半胱胺酸突變

<400> 21

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列c-親代

<400> 22

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列c-親代

<400> 23

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列c-半胱胺酸突變

<400> 24

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列c-半胱胺酸突變

<400> 25

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列d-親代

<400> 26

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列d-親代

<400> 27

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列d-半胱胺酸突變

<400> 28

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列d-半胱胺酸突變

<400> 29

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列e-親代

<400> 30

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列e-親代

<400> 31

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之正向引子序列e-半胱胺酸突變

<400> 32

<210> 33

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成之反向引子序列e-半胱胺酸突變

<400> 33

Claims (20)

1. 一種經修飾之蛋白殼體蛋白質，其包括一部分E型肝炎病毒(HEV)開放閱讀框2(ORF2)蛋白質，可形成酸及蛋白水解穩定型HEV病毒狀顆粒(VLP)，其中該部分HEV ORF2包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6之該HEV ORF2蛋白質之452-606區段，其中如SEQ ID NO：1所示之該HEV ORF2蛋白質之殘基Y485、T489、S533、N573或T586或SEQ ID NO：2、3、4、5或6中之對應殘基中之至少一者係經半胱胺酸取代，該半胱胺酸係經化學衍化或未經化學衍化。
2. 如請求項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質，其中該半胱胺酸經化學衍化。
3. 如請求項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質，其中該部分HEV ORF2包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6之HEV ORF 2蛋白質之112-608區段。
4. 如請求項2之經修飾之蛋白殼體蛋白質，其中該半胱胺酸係經烷基化、醯化、芳基化、琥珀醯化、氧化或結合至可偵測之標記。
5. 如請求項4之經修飾之蛋白殼體蛋白質，其中該可偵測之標記包括螢光團、超順磁標記、MRI顯影劑、正電子發射同位素或具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇(cluster)。
6. 一種組合物，其包括如請求項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質及醫藥上可接受之賦形劑。
7. 一種核酸，其包括編碼如請求項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質之聚核苷酸序列。
8. 一種表現卡匣，其包括啟動子，其可操作地連接至編碼如請求 項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質之聚核苷酸序列。
9. 一種細胞，其包括如請求項7之核酸。
10. 一種細胞，其包括如請求項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質。
11. 一種HEV VLP，其包括如請求項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質。
12. 一種製造經修飾之蛋白殼體蛋白質之方法，其包括在適合允許該經修飾之蛋白殼體蛋白質表現之條件下培養如請求項9或10之細胞。
13. 一種將HEV VLP導向靶細胞之活體外方法，其包括使細胞與該HEV-VLP接觸，其中該HEV VLP包括如請求項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質，其中該HEV VLP進一步包括對靶細胞具有親和力之細胞靶向部分，其結合至該半胱胺酸。
14. 如請求項5之經修飾之蛋白殼體蛋白質，其中該具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇係金奈米簇。
15. 如請求項11之HEV VLP，其中該半胱胺酸係結合至可偵測之標記，其中該可偵測之標記包括具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇(cluster)，其中該具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇係金奈米簇。
16. 如請求項13之活體外方法，其中該半胱胺酸係結合至可偵測之標記，其中該可偵測之標記包括具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇(cluster)，其中該具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇係金奈米簇。
17. 如請求項13之活體外方法，其中該HEV VLP進一步包含經囊封之生物活性劑，且該HEV VLP將該生物活性劑遞送至靶細胞。
18. 一種包含如請求項1之經修飾之蛋白殼體蛋白質之HEV VLP之用途，其用於製備將HEV VLP導向患有疾病或病症之個體之靶細胞之藥劑，其中該HEV VLP進一步包括對靶細胞具有親和力之 細胞靶向部分，其結合至該半胱胺酸。
19. 如請求項18之用途，其中該半胱胺酸係結合至可偵測之標記，其中該可偵測之標記包括具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇(cluster)，其中該具有原子序數大於20之第3族至第18族之元素簇係金奈米簇。
20. 如請求項18之用途，其中該HEV VLP進一步包含經囊封之生物活性劑，且該HEV VLP將該生物活性劑遞送至靶細胞。

Images