TWI681955B - 具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物於人類造血幹細胞之應用 - Google Patents

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一種具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物於人類造血幹細胞之應用，其主要係由一具有細胞相容性溶質、一冷凍保存液以及一冷凍保存添加物所組合而成，該具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物可降低習知冷凍細胞技術中常使用之甲基亞碸(DMSO)的使用劑量，且在細胞解凍後，具有較佳的細胞回收率和抑制細胞凋亡/壞死的能力，進一步可以降低解凍細胞在進行人體治療時可能會對人體產生之副作用。

Description

具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物於人類造血幹細 胞之應用
本發明係有關一種冷凍細胞保存液，尤指可降低甲基亞碸(DMSO)的使用劑量，並以相容性溶質為基礎之細胞冷凍保存液。
在骨髓中各系血液細胞最源頭為造血幹細胞，造血幹細胞具有分化成各種血液細胞的能力，這對於各系血液細胞功能的恢復有很大的幫助，其中，臍帶血來源的造血幹細胞擁有較低的人類白血球抗原配型限制，且造血幹細胞的數量較為豐富；但是，慢性血液疾病患者在患病後進行治療時，通常都已經出生了很長的一段時間，故一般會運用冷凍保存技術將臍帶血進行長時間保存，以供未來進行治療時，還能保有造血幹細胞原來的活性。
細胞冷凍保存技術是將活的細胞，經過階梯式降溫程序，將其長久保存在液態氮中(-195.79℃)，當有需要時，再透過解凍程序，令細胞活化進行使用；因一般細胞含水量約佔總體積的70%，在冷凍過程中容易於其中形成冰晶，而細胞內部的冰晶對細胞而言是具有很強大的殺傷力。
過快的降溫速率會使得細胞內部的水分無法及時經由細胞膜排出胞外，這會使細胞內部產生冰晶以及鹽類濃度瞬間升高導致細胞死亡，反過來說，解凍時的升溫速率太慢，會使得細胞內外的水分反覆結凍和解凍，此時產生 的冰晶亦會對細胞造成傷害，因此在進行冷凍保存技術時會加入一滲透型的冷凍保護劑，使細胞滲透脫水，而冷凍保護劑會取代水佔據細胞內部的空間，這個時候細胞體積會縮小，接著水會隨著冷凍保護劑一同進入細胞內而逐漸達到平衡，進而保護被冷凍之細胞；目前常用的冷凍保護劑包括：二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO)以及胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)等。
胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)，是用尚未出生的胎牛之血液製作而成的血清，由於尚未接觸到環境中的病原體，血液中還沒有產生任何抗體，自1950年代起被廣泛應用，其價格也相對昂貴，但是血清中的成分因來源不同會有所不同，因此可能造成實驗結果的變動、血清中的貼附因子可能導致免疫細胞引起免疫反應以及誘導幹細胞產生分化等，且因成分的不同，使之不適合應用至人體醫療上。
二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO)，是一種常見的兩性分子，通常被當作溶劑使用，具有非常好的抗凍能力，是為現在最廣泛使用的冷凍保護劑；但是二甲基亞碸(DMSO)會誘導幹細胞分化以及引起粒線體相關的細胞凋亡，若解凍後之細胞應用在人體醫療上可能會導致患者產生其他疾病，因此在冷凍細胞時添加濃度不可以太高，並且在冷凍過後的移除程序必須確實。
1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)，是一種有機滲透劑，通常是極性的，具有很高的可溶性，在生理pH下不帶電荷並且具有低分子量，是透過許多微生物積累或合成的，可抵消高鹽度和其它有害的影響，因此細胞可以將這些物質吸收到細胞內而不干擾細胞結構和功能，為一種「相容性溶質」；該化合物長期以來被應用於保護生物分子避免受到諸如高鹽度和瞬間加熱等傷害，可幫助生物體承受極端的滲透壓力。
緣此之故，申請人有鑑於習知技術之缺失，乃發明一種添加1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)且降低二甲基亞碸(DMSO)使用量，對細胞冷凍過後的存活率是有可行性的具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物。
本發明之目的，在於提供一種可降低二甲基亞碸(DMSO)使用量之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物，以降低冷凍細胞解凍後，在進行人體治療時所產生之副作用。
為達上述目的，本發明之技術手段在於：利用下述成分組合成一具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物；其成分包含一具有細胞相容性溶質，例如：1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)、一冷凍保存液，例如：二甲基亞碸(DMSO)以及一冷凍保存添加物。
1‧‧‧僅有5%二甲基亞碸(DMSO)的冷凍保存組合物
2‧‧‧僅有2.5%二甲基亞碸(DMSO)的冷凍保存組合物
3‧‧‧2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及25mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物
4‧‧‧2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及50mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物
5‧‧‧2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及75mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物
6‧‧‧2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及100mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物
7‧‧‧2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及250mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物
8‧‧‧2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及500mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物
第1圖為本發明之實施例1細胞存活率結果。
第2圖為本發明之實施例1細胞凋亡分析結果。
第3圖為本發明之實施例2細胞存活率結果。
第4圖為本發明之實施例2細胞凋亡分析結果。
為便於 貴審查委員能對本發明之技術手段及運作過程有更進一步之認識與瞭解，茲舉例配合圖式，詳細說明如下。
實施例1
本實施例係提供一種冷凍細胞保存組合物，該冷凍細胞保存組合物係由一具有細胞相容性溶質以及一冷凍保存液所組合而成，以針對該組合物是否可保護冷凍細胞、解凍後細胞回收率和抑制細胞凋亡/壞死的能力進行實驗。
在本實施例中該具有細胞相容性溶質為一1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)，該冷凍保存液為一二甲基亞碸(DMSO)。
該1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)使用之濃度約為20mM到500mM之間；該二甲基亞碸(DMSO)使用體積百分濃度約為2%至5%之間；本實施例所使用的具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物另包含有一冷凍保存添加物以及一血清之取代物等。
該冷凍保存添加物可為：Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)以及Fetal Bovine Serum(FBS)之一種或任意組合，上述之該冷凍保存添加物於本實施例中所使用之廠牌請參考附件。
冷凍細胞
先將增殖7天的人類造血幹細胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)離心，去除上清液，並將配置好的前述該1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)及該二甲基亞碸(DMSO)之冷凍細胞保存組合物放至冰浴盒中冰浴降溫，以避免與細胞液混合之後放出大量熱量對細胞造成傷害，接著將冰浴完的該1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)及該甲基亞碸(DMSO)之冷凍細胞保存組合物與細胞均勻混合，裝入一冷凍管中，該冷凍管中的冷凍細胞保存組合物之細胞密度要維持在1×106cells/ml，接著先將該冷凍管放入一等速降溫盒中，並將該等速 降溫盒放入-80℃冰箱，使其降溫至隔天，最後將該冷凍管移到一液態氮桶中，進行冷凍保存。
解凍細胞
將該冷凍管從該液態氮中取出，放到37℃恆溫水槽進行快速解凍，接著，取少許細胞出來，計算細胞冷凍過後的存活率以及活細胞總數，之後，再取部分細胞上儀器分析細胞凋亡/壞死比例。
細胞存活率
請參閱第1圖所示，分別為一控制組，該控制組為5%二甲基亞碸(DMSO)以及15%胎牛血清(FBS)的冷凍保存組合物，以及複數實驗組，包括：一僅有5%二甲基亞碸(DMSO)的冷凍保存組合物1、一僅有2.5%二甲基亞碸(DMSO)的冷凍保存組合物2、一具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物3，該冷凍細胞保存組合物3為2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及25mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的冷凍保存組合物、一具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物4，該具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物4為2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及50mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的冷凍保存組合物、一具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物5，該具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物5為2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及75mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的冷凍保存組合物、一具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物6，該具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物6為2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及100mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的冷凍保存組合物；由第1圖所示可知，本發明之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物所解凍的細胞，其細胞存活率(Cell Viabillity(%))遠高於該冷凍保存組合物2。
細胞凋亡分析(Annexin-V Assay)
本實驗利用習知技術PI and Annexin-V assay進行分析，其過程說明如下：首先利用習知之血球計數盤(Neubauer hemocytometer)以及WST-1分析計算細胞密度之後，取1×105cells/vial至離心管中，用PBS將其加滿，離心(2000rpm,10min)並去除上清液體，接著加入147μl Annexin V binding buffer和3μl Annexin V-FITC螢光抗體，均勻混合之後進行避光反應(4℃，10min)，反應完之後，加入250μl Annexin V binding buffer，均勻混合後離心(2000rpm，10min)，將多餘的螢光抗體去除，離心完之後，去除上清液體，加入144μl Annexin V binding buffer以及6μl PI螢光染劑，均勻混合之後進行避光反應(4℃，10min)最後，上Accuri C6流式細胞儀，進行分析。
當細胞初期凋亡(apoptosis)時細胞膜中的PS(phosphatidyserine)會由細胞膜內側外翻至細胞膜外側，而Annexin V蛋白對PS具有高度親合性，因此利用在annexin V上面接上螢光物質就可以偵測細胞是否有細胞凋亡現象。
請參閱第2圖所示，PI以及Annexin-V分析其結果會出現4個象限，於本實驗左上為PI有訊號，而Annexin V沒有訊號，這象限為因為外在環境因素導致細胞死亡(Necrosis)、右上為PI跟Annexin V都有訊號，代表細胞凋亡(Apoptosis)末期、左下為PI與Annexin V皆沒有訊號，代表正常細胞，而右下為PI沒有訊號，但Annexin V有訊號，代表細胞開始進行細胞凋亡(Apoptosis)；由第2圖所示可知，添加了該1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物3、4、5、6其細胞開始凋亡(Apoptotic)率皆低於該控制組(細胞開使凋亡率為22.0%)以及該冷凍保存組合物2(細胞開使凋亡率為18.5%)，而正常細胞率 亦高於僅使用相同濃度二甲基亞碸(DMSO)之該冷凍保存組合物3(正常細胞率為21.3%)，因此證實該1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)及該二甲基亞碸(DMSO)之冷凍細胞保存組合物可做為冷凍細胞之保存液，且解凍後細胞狀況良好。
實施例2
於本實施例中添加不同該1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的濃度，以取得最佳實施濃度，而控制組、細胞冷凍、解凍、細胞存活率計算以及細胞凋亡分析的步驟皆與實施例1相同，故不再此贅述，其差異在於本實施例細將解凍完成的細胞至於細胞培養基中進行培養，培養三天後再分析細胞的存活比率，培養人類造血幹細胞的方法為習知技術，在此不贅述；然，該等實驗組有進行調整，除前述實施例1之該冷凍保存組合物1、該冷凍保存組合物2、該具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物4以及具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物6外，另增加一具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物7，該具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物7為2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及250mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的冷凍保存組合物，以及一具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物8，該具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物8為2.5%二甲基亞碸(DMSO)以及500mM的1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的冷凍保存組合物。
細胞存活率
請參閱第3圖所示，增加該1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的量，其細胞存活的比率約在70%以上。
細胞凋亡分析
請參閱第4圖所示，其中增加該1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)的量，其細胞凋亡率亦低於該控制組(細胞開使凋亡率為3.4%)以及該冷凍保存組合物2(細胞開使凋亡率為5.1%)，而正常細胞率亦高於僅使用相同濃度二甲基亞碸(DMSO)之該冷凍保存組合物3(正常細胞率為95.7%)
請再參閱第3、4圖所示，該具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物8之細胞存活率低於該冷凍保存組合物2，而細胞凋亡率(5.6%)亦高於該冷凍保存組合物2(3.1%)，因此本發明之具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物其最佳比例為2.5%該二甲基亞碸(DMSO)，並添加50mM至100mM之1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)，在此濃度之下具有較佳的細胞回收率和抑制細胞凋亡/壞死的能力，如此亦可達到降低該二甲基亞碸(DMSO)的使用量，減少解凍之細胞在進行人體治療時可能會產生之副作用。
上述實施例中，除可應用在人類造血幹細胞(HSCs)之冷凍保存外，亦可應用在間葉幹細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)、內皮前驅細胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)、內皮細胞(Endothelial Cells,ECs)、人類臍帶靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)、胚胎幹細胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)、誘導性多功能幹細胞(Induced Pluripotent Stem Cell,iPS cells)、小腸幹細胞(Intestinal Stem Cells,ISCs)、輪部幹細胞(Limbal Stem Cells,LSCs)、各種血液細胞，包含紅血球、嗜中性白血球、自然殺手細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞、巨核細胞、單核球、巨噬細胞等以及神經幹細胞、植物細胞或微生物之冷凍保存。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

Claims (1)

  1. 一種具有相容性溶質之冷凍細胞保存組合物於人類造血幹細胞之應用，其中該冷凍細胞保存組合物係由一濃度為25mM至100mM具有細胞相容性溶質之1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)、一體積百分濃度2.5%之二甲基亞碸(DMSO)為作冷凍保存液以及一Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)組合而成。
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