TWI680775B

TWI680775B - 褐藻硫酸多醣／幾丁聚醣複合薄膜

Info

Publication number: TWI680775B
Application number: TW106101495A
Authority: TW
Inventors: 黃意真; 周佑吉
Original assignee: 財團法人農業科技研究院
Priority date: 2017-01-17
Filing date: 2017-01-17
Publication date: 2020-01-01
Also published as: TW201827043A

Abstract

本發明提供一種複合薄膜，其實質上由褐藻硫酸多醣及幾丁聚醣所組成，其中，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為15：85至25：75。本發明之複合薄膜可作為傷口敷料，具有凝血效果、可減緩發炎反應、促進傷口癒合、加速血管新生及膠原蛋白生成。

Description

褐藻硫酸多醣／幾丁聚醣複合薄膜

本發明係關於一種複合薄膜，特別是用於作為傷口敷料的複合薄膜。

皮膚是人體最大的器官，也是人體抵抗外來病源的第一道防線。當皮膚受到大面積或是嚴重的創傷時，會導致皮膚喪失自我修補的能力而使傷口難以復原，此時可利用傷口敷料以幫助傷口癒合。傷口敷料能讓傷口維持在良好封閉及保濕的狀態下，進行表皮化作用，同時，濕潤的環境能使新生的上皮細胞的遷移更加容易。

良好的傷口敷料必須具有良好的吸水性、機械強度以及生物相容性。目前市售之傷口敷料又稱為人工皮，組成大致可區分成主體膠、吸水性物質、防水透氣膜，其中主體膠（例如，橡膠、明膠）可使敷料具有黏性，並提供敷料的機械強度，以便使用者操作；吸水性物質大多為吸水性人工合成高分子聚合物，例如，羧甲基纖維素、聚氨脂。由於人工合成聚合物不易分解，用用後容易造成環境的汙染，近年來也開始研究如何以天然多糖聚合物取代人工合成聚合物。

目前研究用於傷口敷料之天然聚合物例如：幾丁聚醣、褐藻酸鈉及果膠，但其機械強度差，在傷口敷料的應用上有所限制。

褐藻多醣可從大部分的褐藻中分離出來，是一種富含岩藻醣的硫酸多糖，其成分含有L-岩藻醣、半乳糖、木糖、醣醛酸、硫酸基團等，但褐藻硫酸多糖不具成膜的特性。

在本領域中，仍需要具抗發炎等促進傷口癒合之活性，且吸水性佳、機械強度佳的傷口敷料。

本發明提供一種複合薄膜，其實質上由褐藻硫酸多醣及幾丁聚醣所組成，其中，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為15：85至25：75。

根據本發明之一具體實施例，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約15：85。根據本發明之一具體實施例，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約20：80。在另一具體實施例中，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約25：75。

根據本發明之較佳具體實施例，該褐藻硫酸多醣來自於半葉馬尾藻（Sargassum hemiphyllum ）。

根據本發明之較佳具體實施例，所述複合薄膜係以包含以下步驟的方法製備：將幾丁聚醣粉分散於褐藻多醣溶液中，獲得一第一溶液；將醋酸加入至該第一溶液中，獲得一第二溶液；以及將該第二溶液舖置於一容器，乾燥後獲得該複合薄膜。

在本發明之部分具體實施例中，該醋酸為0.05-2%的醋酸溶液。根據本發明之一具體實施例，該醋酸為約1%的醋酸溶液。

在本發明之部分具體實施例中，該方法更包含以下步驟：於乾燥後加入一交聯劑。根據本發明，該交聯劑包括但不限於三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate）、戊二醛（glutaraldehyde）、京尼平（genipin）、乙二醇（ethylene glycol）及氫氧化鈉（sodium hydroxide）。

除非另行定義，所有在本文中所使用的技術及科學術語具有如同本發明所屬技術領域中之技藝人士一般所瞭解的意義。

本文中所使用的「一」乙詞，如未特別指明，係指至少一個（一個或一個以上）之數量。

除非另有說明，在說明書及申請專利範圍中用以表示成分、反應條件的數量等的所有數字，應理解為加上「約」。因此，除非特別指明，說明書及申請專利範圍中所述的數值為近似值。一般而言，本文中所使用的術語「約」，係指一測量值，例如，溫度、時間以及劑量等，涵蓋：相對於所指定的量，在一實例中，±15%或±10%的變動，在另一實例中，±5%的變動，在另一個實例中，±1%的變動，在又一實例中，±0.1%的變動，只要上述之變動對實施所揭露的方法而言是適當的。

根據本發明之一具體實施例，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約15：85。

根據本發明之一具體實施例，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約20：80。

根據本發明之一具體實施例，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約25：75。

根據本發明之較佳具體實施例，該褐藻硫酸多醣來自於半葉馬尾藻（Sargassum hemiphyllum ）。在本發明之一具體實施例中，該褐藻硫酸多醣為半葉馬尾藻的多醣萃取物。該多醣萃取物可藉由本領域中的常規方法製備。

在本發明之一具體實施例中，藉由烘乾以使該容器中的第二溶液乾燥。

現參照下列特別的非限定性實例更詳細地說明本發明。

材料及方法

1. 半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜的製備

將幾丁聚醣粉末分散於褐藻萃取物溶液中，加入1% (v/v) 醋酸溶液，舖盤並抽風乾燥 3 天，可得到半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜，並以 5% NaOH：CH₃ OH = 1：1 之混合溶液進行中和，浸泡 10 分鐘，再用去離子水浸泡 10 分鐘清洗至中性接著自然乾燥 1 天。以不同重量比之幾丁聚醣/半葉馬尾藻硫酸多醣製備薄膜，重量比分別為 2/0、1.9/0.1、1.8/0.2、1.7/0.3、1.6/0.4及0.5/1.5 (wt %) 等比例混合，命名為C100、C95S5、C90S10、C85S15、C80S20及C75S25。

2. 組成成分分析及表面型態觀察

以ATR-FTIR分析材料之組成成分。樣品製備步驟如下：將 0.002 g 半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜與 0.2 g KBr 均勻混合乾燥後，用瑪瑙研缽磨碎後打錠 (真空加壓：400 kg/cm² )。以掃描式電子顯微鏡觀察複合薄膜表面結構。樣品製備步驟如下：首先將半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜黏附在載台上，放置乾燥箱使樣品乾燥，接著用鍍金機鍍金到樣品表面上，再利用掃描式電子顯微鏡觀察。

3. 膨潤性(swelling ratio)測試

將半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜裁剪成 2 cm × 2 cm，將薄膜浸泡於磷酸緩衝液 (phosphate buffer solution, PBS) 中 24 小時後取出，取出後以拭紙擦拭秤重，經由以下公式計算膨潤率：(W_t – W₀ )/W₀ x 100%；W_t ：含水薄膜之重量 (g)，W₀ ：薄膜起始乾重 (g)。

4. 水氣透濕性(Water vapor transmission rates, WVTR)測試

將半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜裁剪成 2 cm × 2 cm，待其完全膨潤後，放置於試管上方以鋁箔紙固定樣品，試管內裝有去離子水，於 37^o C 條件下，放置 24 小時候取出進行水氣透過測試，測量裝置的重量變化，經由以下公式計算水氣透濕性：(W₂ – W₁ ) / A x 10⁶ gm^-2 天^-1 ；W₁ , W₂ ：分別為實驗前、後試管重量，A：試管口之面積。

5. 機械強度測試

將半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜裁切成長、寬為 6 cm × 1 cm 之細長條狀，以物性儀進行薄膜的拉張試驗，測試時夾具距離設定為 3 cm，移動速度為 3.0 mm/sec。薄膜之拉張強度 (Tensile strength, TS) 與延展度 (Elongation, E)之計算公式如下：TS = F/S，E = (L_i – L₀ ) / L₀ x 100%；F_(N) ：樣品拉長時的最大應力，S_(mm ² ₎ ：樣品的起始截面積，L₀ ，L_i ：分別為樣品起始及斷裂時之長度。

6. 體外降解測試

藉由測量半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜在類生理狀況下不同時間點所殘餘的重量來判定其降解情形。實驗步驟主要是將複合薄膜先行測量過乾重後，浸泡於 37^o C 之 PBS 中，依設定時間固定取樣，時間依序為第 1、7、14、21、28 及 35天，再將複合薄膜取出以二次水清洗，烘乾後再測量複合薄膜重量，經由以下公式計算降解率：(W_t – W₀ )/W₀ x 100%；W_t ：各取樣時間點之複合薄膜乾重(g)，W₀ ：複合薄膜起始乾重(g)。

7. 細胞相容性測試

首先將小鼠纖維母細胞 (L929) 及人類角質細胞 (HaCaT)L929分別種入24孔盤中，其細胞數量為1×10⁴ 細胞/孔，放置於37^o C含有5% CO₂ 之培養箱中培養。將不同組別的半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜裁切成1 cm × 2 cm大小，放置於15 ml離心管中分別浸泡DMEM/F12及DMEM (低葡萄糖)一天和七天，之後將培養液取出，移置到含有細胞之24 well中培養一天及三天。接著將每well加入1000 μl含有100 mg/ml MTT之培養液與細胞反應，經過4小時候出現紫色結晶物，加入500 μl DMSO反應，將紫色的結晶物溶解，取至96孔盤中，以ELISA讀數器讀取OD₅₇₀ 及OD₆₃₀ 之吸光值，吸光值越高代表細胞增生的數量越多，另外將控制組之吸光值訂為100%，則可計算出其他組別之存活率百分比。

8. 細胞貼附型態觀察

以掃描式電子顯微鏡觀察細胞於半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜上的生長及貼附情形。將細胞培養於膜上24小時後取出樣品，先以2.5% 戊二酫 (Glutaraldehyde) 中進行固定2小時，依序以PBS以及二次水沖洗10分鐘2次，利用酒精脫水後以凍乾機進行乾燥，用鍍金機鍍金到樣品表面上，再以掃描式電子顯微鏡進行觀察，觀察細胞貼附於半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜上之型態。

9. 抗發炎測試

將RAW 264.7細胞種於96 well中，其細胞數量為2×104 cells/well，於 37oC 培養箱培養至隔日，將半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜加入至培養液中，培養24小時，取出降解液後以0.22 μm膜過濾，並加入1 μg/ml脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS) 混合加入培養基中，與細胞培養24小時，取100 μl上清液加入50 μl 1%磺胺，避光反應10分鐘，再加入50 μl 0.1% N-（1-萘基） - 乙二胺（N-(1-Naphthyl)-ethylene-diamine），避光反應10分鐘，測量OD540 之吸光值，並以硫酸鈉溶液製作標準曲線。

10. 動物實驗

10.1 SD 大鼠傷口製備

SD 大鼠購買自國家實驗動物中心，六週齡雄性大鼠，重量約200克。首先將SD大鼠進行腹腔注射 Zoletil 50 麻醉，在剃除背部毛髮，並以75%酒精擦拭消毒。於背部製作2個直徑1.5 cm圓形大小之全層皮膚切除，以生理食鹽水簡單清洗，覆蓋實驗所需敷料，組別分為4組：開放性傷口做為控制組、市售敷料當做對照組、幾丁聚醣薄膜、半葉馬尾藻硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜，各組貼上透氣貼布Tegaderm^TM 固定傷口後，即完成傷口創傷手術。

10.2傷口癒合觀察及組織切片分析

傷口創傷完成後，依組別貼附敷材，不同時間點更換敷材、清創及消毒傷口，時間分別為:第0天、第3天、第7天、第10 天與第14天，利用透明板描繪傷口，以 Image J 影像軟體定量傷口面積，並經由以下公式計算不同時間點傷口之變化量：(A₀ – A_N ) / A₀ x 100%；A₀ ：原傷口面積，A_N ：任一時間點之傷口面積。

在不同時間點將大鼠麻醉後，於背部傷口取下 2 cm 圓形組織 (包含傷口復原組織及傷口邊緣正常組織)，將皮膚傷口置於含有 10% Formaldehyde 之樣品瓶中，脫水後，利用石蠟包埋以切片機切片，切片厚度為 5 μm，將切好之組織黏附於載玻片，於 45^o C 下烘乾後，再進行組織染色分析。以H＆E (Hematoxylin and eosin)染色和馬修三色(Masson's trichrome)染色觀察早期傷口癒合 (第3天和第5天)，並與控制組比較，將觀察傷口切緣與傷口中央。持續觀察傷口至21天，以檢測肉芽組織生成、血管新生、毛囊組織及膠原蛋白生成量。

實例1：硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜物化性質分析

FTIR-ATR 圖譜 (圖 1) 顯示，幾丁聚醣膜在 1560 cm^-1 的位置上有 NH₂ 的波峰、3400 cm^-1 的位置上有 O-H 的波峰及 2923 cm^-1 的位置上有 CH₂ 的波峰 (Boonkong, Petsom & Thongchul, 2013)；硫酸多醣在 848 cm^-1 的位置上為 C-O-S 的波峰、1240-1270 cm^-1 之位置上為 S=O 的波峰 (Suresh et al., 2013)，與幾丁聚醣形成複合薄膜後，同時存在幾丁聚醣及硫酸多醣之官能基吸收峰，並且觀察到複合薄膜會隨著硫酸多醣含量增加，在 1066 cm^-1 、1076 cm^-1 位置發現吸收峰，在 2923 cm^-1 的 O-H 吸收峰強度減弱，且在 848 cm^-1 和 1240-1270 cm^-1 的 C-O-S、S=O 吸收峰減弱，推測幾丁聚醣與硫酸多醣間因胺基的正電與硫酸根的負電而有相互作用，成功形成複合薄膜。

XRD 分析 (圖 2) 顯示，幾丁聚醣粉末在2θ 為10^o 及 20^o 有吸收波峰，硫酸多醣粉末在2θ 為 27^o 和 40^o 有吸收波峰。在硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜中，硫酸多醣的結晶性消失，幾丁聚醣的波峰隨著其含量降低而減弱，顯示幾丁聚醣的結晶型態受到破壞。SEM 圖像顯示 (圖 3) 薄膜之表面為平整光滑，截面則呈現片狀結構。

膨潤率測試結果顯示：浸泡磷酸緩衝溶液後 30 分鐘，幾丁聚醣膜之膨潤率為 110%，硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜之膨潤性隨著硫酸多醣含量增加而提高，以 C75S25 組別有最高的膨潤性，膨潤率為145%，與幾丁聚醣膜有顯著差異 (p ＜0.001) (圖 4)。硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜之水氣透濕性介於 1900-2100 g/m² /day 之間，所有組別之間無顯著差異 (圖 5)。傷口敷料的水氣透濕性能夠防止傷口脫水及分泌物堆積，正常皮膚的水氣透濕性為 204 g/m² /天，當皮膚產生傷口時，會因傷口種類、嚴重度而有不同的水氣蒸散情形，水氣透濕性的範圍可高達 5138 g/m² /天。當傷口敷料的水氣透濕性過高，會造成傷口乾燥快速、容易產生疤痕；水氣透濕性過低則會使傷口累積分泌物，造成傷口延緩癒合、細菌孳生等問題。因此建議傷口敷料的水氣透濕性應在 2000-2500 g/m² /天，即可避免傷口乾燥、保持傷口濕潤。本試驗中製備的硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜有適當的水氣透濕性，可降低傷口的水分蒸散及可保持傷口濕潤環境。

拉伸強度 (Tensile Strength) 及延展性 (Elongation) 測試 (圖 6) 顯示：拉伸強度、延展性會隨著硫酸多醣的含量增加而上升，以 C75S25 組別有佳的拉伸強度、延展性，其數值分別為 34.4 MPa 和 76.6%，推測為硫酸多醣與幾丁聚醣之間的離子交互作用，增強機械強度。硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜降解至第 21 天重量損失約 5%，降解程度隨著硫酸多醣含量增加而減少重量損失 (圖 7)。

實例2：硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜之細胞相容性測試

細胞相容性試驗 (圖 8) 顯示，隨著硫酸多醣濃度增加，細胞存活率高於 100%，小鼠纖維母細胞與人類角質細胞皆有顯著增生，細胞存活率高於 100%，表示硫酸多醣無細胞毒性，具有良好的生物相容性。以硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜浸泡在培養液中降解 1 天及 7 天，進行培養細胞 1 天及 3 天，分別觀察 L929 與 HaCaT 之細胞存活率 (圖 9、圖 10)。結果顯示，在硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜降解一天後，培養 L929 與 HaCaT 一天，所有複合薄膜組別的細胞皆有良好的生長情況，L929 與 HaCaT 之細胞存活率分別為 140% 及 100%，並持續生長至第三天，存活率達到 200% 及 130%，表示硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜對 L929 與 HaCaT 不具有細胞毒性，且複合薄膜對不同種類的細胞有不同程度的影響。

將L929 及HaCaT 與硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜共同培養一天及三天，觀察細胞之增生情形 (圖 11)。結果顯示，在共培養的情況下，L929 培養一天後複合薄膜組別的細胞存活率為 80-90%，培養至三天後細胞存活率增加至 140% 或更高，表示 L929 能在硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜上增生；而 HaCaT 培養一天後複合薄膜組別的細胞存活率為 70-80%，培養至三天後複合薄膜組別的細胞存活率增加，其中以 C75S25 組別有較高的細胞存活率，存活率為 120%。 HaCaT 之細胞存活率偏低，推測是因為 HaCaT 不易貼附於硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜，在傷口敷料中可達到不沾黏之特性。

藉由 SEM 觀察細胞貼附於硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜之型態 (圖 12)，可觀察到 L929 與 HaCaT能伸出偽足貼附於複合薄膜上。

實例3：硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜之凝血測試

硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜的凝血效果顯著高於控制組、對照組 (紗布, Gauze) (p ＜0.001) (圖 13)；當硫酸多醣含量增加時，有降低凝血效果之趨勢。

實例4：硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜之抗發炎測試

硫酸多醣具有抗發炎效果，能降低巨噬細胞分泌 NO 及 TNF-α，且隨硫酸多醣濃度增加，抗發炎效果更好 (圖 14、圖 15)；將硫酸多醣與丁聚醣形成複合薄膜後，亦顯示具有降低 NO 及 TNF-α 分泌量之功效，且隨著硫酸多醣含量增加，抗發炎效果更顯著 (圖 16、圖 17)，顯示硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜能避免傷口持續發炎，降低傷口惡化之風險。

實例5：動物實驗

動物實驗分為四組：開放性傷口做為控制組 (Control)、市售的親水性敷料 (3M Hydrocolloid dressing) 做為對照組，幾丁聚醣薄膜 (C100 組) 與硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜 (C75S25 組) 為實驗組，觀察傷口表面癒合、傷口病理組織分析，並透過 H & E 染色及馬修三色觀察傷口修復情形。

傷口癒合情形顯示於圖18，隨著治療天數增加，傷口面積逐漸減少，且C100 組與 C75S25 組的傷口癒合情形顯著優於控制組與對照組，在第 3、5 天時，C100 組與C75S25 組較控制組與對照組有顯著的傷口收縮，癒合率為 30%；在第 7、10 天時，C75S25 組較控制組與對照組有顯著的傷口收縮，癒合率達到 77%；C75S25 組在第 14 天之後傷口將近 100% 癒合，控制組與對照組則在第 21 天後達到完全癒合 (圖 19)。

以 H & E染色分析第 3、5、7、10、14 及 21 天傷口中央組織修復情形 (圖 20)。第 3 天及第 5 天，各組的傷口中央尚未有表皮層覆蓋；在第 7 天時，控制組仍然未形成表皮層，對照組與 C100 組逐漸形成表皮層，而 C75S25 組有較厚的表皮層覆蓋且緊密貼附於真皮層，形成乳突層，並且有角質層的形成；在第 10 天，控制組與對照組形成較厚的表皮層，C100 組與 C75S25 組長出些許的毛囊與血管；在第 14 天時，控制組與對照組長出少許毛囊與血管，C100 組修復情況與第 10 天相近，而 C75S25 組長出更豐富的毛囊與血管；在第 21 天時，各組的表皮層、角質層完整，皆具有毛囊與血管，傷口達到完全癒合，其中以 C75S25 組有最多的毛囊與血管數量。計數血管數量 (圖 21) 結果顯示，第 3、5、7 天時，C100 組與 C75S25 組有較多的血管數目，顯著高於控制組與對照組 (p＜0.001)，而在第 10、14、21 天時，C75S25 組有豐富的血管數目，顯著高於 C100 組 (p＜0.01)。

以馬修三色染色分析第 3、5、7、10、14 及 21 天傷口中央膠原蛋白 (Collagen) 之生成量 (圖 22)。纖維母細胞從傷口周圍遷移至傷口中央並且開始增生，會產生膠原蛋白，提供結締組織間穩定性、支撐結構。隨著天數增加，傷口中央之膠原蛋白逐漸增厚，顏色從淺藍轉成深藍，在第 3、5、7 天時，各組的膠原蛋白含量少，顏色淺；在第 10 天時，控制組與對照組的膠原蛋白之生成量少，C100 組有大量膠原蛋白生成，顏色漸深，C75S25 組除了大量膠原蛋白生成外，也有血管新生；在第 14 天，控制組與對照組的膠原蛋白生成量增加，C100 組膠原蛋白之生成量增加，且有血管形成，而 C75S25 組膠原蛋白顏色明顯較深，且富含毛囊與血管；在第 21 天，C75S25 組的膠原蛋白生成量最多且緻密，顏色最深，而控制組與對照組之膠原蛋白含量較少，顏色較淺，且對照組之膠原蛋白不緻密。

以 H & E染色觀察第 3、5、7 天傷口切緣之癒合情形 (圖 23)。在第 3 天時，控制組與對照組有較寬的傷口切緣缺口，C100 組與 C75S25 組有纖維母細胞遷移，填補切緣缺口；在第 5 天時，控制組與對照組切緣缺口已填補，但表皮尚未緊密覆蓋真皮層，C100 組與 C75S25 組之表皮層已完全覆蓋真皮層；在第 7 天，控制組表皮層完全覆蓋真皮層，而對照組表皮層仍與真皮層間有空隙，C100 組表皮層層增厚，C75S25 組表皮層緊密覆蓋真皮層，且形成乳突層。以馬修三色染色觀察第 3、5、7 天傷口切緣之膠原蛋白之生成量 (圖 24)，結果顯示，C100 組與 C75S25 組皆有少量的膠原蛋白生成

無

圖 1顯示衰減式全反射-傅氏轉換紅外線光譜（Attenuated Total Reflection-Fourier Transform Infrared Spectroscopy, ATR-FTIR）圖譜，其中（A）為幾丁聚醣粉末（ chitosan (CS) powder ）及硫酸多醣粉末（ sulfated polysaccharide (SP) powder ），（B）為幾丁聚醣膜（ chitosan film ）及硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜（ sulfated polysaccharide/chitosan complex films ）。

圖 2顯示X光繞射（X-ray Diffraction, XRD）圖譜，其中（A）為幾丁聚醣粉末、硫酸多醣粉末，（B）為幾丁聚醣膜、硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜。

圖 3顯示掃描式電子顯微鏡（Scanning Electron Microscopy, SEM）觀察硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜（C75S25）之表面（A）及截面（B）的型態。

圖 4顯示膨脹率（Swelling）數據，其中（A）顯示硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜浸泡磷酸緩衝溶液後膨潤率隨時間變化之趨勢，（B）顯示硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜浸泡磷酸緩衝溶液30 分鐘後的膨潤率；**代表p值（p-value）相對於C100組小於0.01，***代表p值（p-value）相對於C100組小於0.001，數據以平均值±標準差表示，n= 4。

圖 5顯示水氣透濕率（Water Vapour Transmission Rate），數據以平均值±標準差表示，n= 4。

圖 6顯示機械性質測試結果，其中（A）顯示拉伸強度（Tensile Strength），為（B）顯示延展性 (Elongation)，數據以平均值±標準差表示，n= 4。

圖 7顯示降解率測試結果，數據以平均值±標準差表示，n= 4。

圖 8顯示硫酸多醣濃度對L929及HaCaT細胞經24小時培養後之存活率的影響，數據以平均值±標準差表示，n= 4。

圖 9顯示對L929 細胞存活率之影響之測試結果，其中複合薄膜浸泡於培養基的時間於(A)為一天， (B)為七天，控制組（+）係培養基，控制組（-）係培養基中裝有二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide, DMSO），數據以平均值±標準差表示，n= 3。

圖 10顯示對HaCaT細胞存活率之影響之測試結果，其中複合薄膜浸泡於培養基的時間於(A)為一天， (B)為七天，控制組（+）係培養基，控制組（-）係培養基中裝有二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide, DMSO），數據以平均值±標準差表示，n= 3。

圖11顯示對小鼠纖維母細胞（L929）（圖A）及人類角質細胞（HaCaT）（圖B）之細胞增生的影響之測試結果，數據以平均值±標準差表示，n= 3。

圖12顯示以SEM 觀察（A）小鼠纖維母細胞（A）及人類角質細胞貼（B）貼附於硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜 (C75S25) 之型態。

圖13顯示對於凝血之影響之測試結果，控制組無薄膜，**代表p值相對於控制組小於0.01，***代表p值相對於控制組小於0.001，數據以平均值±標準差表示，n= 4。

圖14顯示藉由 LPS 刺激 RAW264.7 評估硫酸多醣對於 NO 分泌量之影響之測試結果，其中***代表p值相對於LPS刺激之培養基小於0.001，數據以平均值±標準差表示，n= 3。

圖15顯示藉由 LPS 刺激 RAW264.7 評估硫酸多醣對於 TNF-α 分泌量之影響之測試結果，其中***代表p值相對於LPS刺激之培養基小於0.001，數據以平均值±標準差表示，n= 3。

圖16顯示藉由 LPS 刺激 RAW264.7 評估硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜對於 NO 分泌量之影響之測試結果，其中*代表p值相對於C100組小於0.05，數據以平均值±標準差表示，n= 3。

圖17顯示藉由 LPS 刺激 RAW264.7 評估硫酸多醣/幾丁聚醣複合薄膜對於 TNF-α 分泌量之影響之測試結果，其中***代表p值相對於C100組小於0.001，數據以平均值±標準差表示，n= 3。

圖18顯示以C75S25複合薄膜貼附全層皮膚切除之SD大鼠後於 3、5、7、10、14 及 21天傷口癒合之觀察結果。

圖19顯示以C75S25複合薄膜貼附全層皮膚切除之SD大鼠後於 3、5、7、10、14 及 21天之傷口癒合面積百分比，其中*代表p值相對於控制組小於0.05，#、##及###分別代表p值相對於市售親水性敷料小於0.05、0.01及0.001，數據以平均值±標準差表示，n= 3。

圖20顯示利用 H&E 染色觀察第 3、5、7、10、14 及 21 天 SD 大鼠術後傷口修復情形，放大倍率為100倍。

圖21為SD 大鼠之全層皮膚傷口於 3、5、7、10、14 天後之血管生成之量化圖，其中**及***分別代表p值相對於控制組小於0.01及0.001，#、##及###分別代表p值相對於市售親水性敷料小於0.05、0.01及0.001，◎◎、◎◎◎分別代表p值相對於C100組小於0.01及0.001，數據以平均值±標準差表示，n= 4。

圖22顯示利用馬修三色（Masson’s trichrome ）染色觀察第 3、5、7、10、14 及 21 天 SD 大鼠術後傷口膠原蛋白之生成之結果，放大倍率為100倍。

圖23顯示利用 H&E 染色觀察第 3、5、7 天 SD 大鼠術後傷口切緣癒合情形，其中E為表皮、B為血管，放大倍率為100 倍。

圖24顯示利用馬修三色染色觀察第 3、5、7 天 SD 大鼠術後傷口切緣膠原蛋白之生成之結果，其中E為表皮、B為血管，放大倍率為100 倍。

無

Claims

一種複合薄膜，其實質上由褐藻硫酸多醣及幾丁聚醣所組成，其中，該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為15：85至25：75，且該複合薄膜以包含以下步驟的方法製備：將幾丁聚醣粉分散於褐藻多醣溶液中，獲得一第一溶液；將醋酸加入至該第一溶液中，獲得一第二溶液；以及將該第二溶液舖置於一容器，乾燥後獲得該複合薄膜。
如請求項1之複合薄膜，其中該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約15：85。
如請求項1之複合薄膜，其中該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約20：80。
如請求項1之複合薄膜，其中該褐藻硫酸多醣與該幾丁聚醣的重量比為約25：75。
如請求項1之複合薄膜，其中該褐藻硫酸多醣來自於半葉馬尾藻(Sargassum hemiphyllum)。
如請求項1之複合薄膜，其中該醋酸為0.05-2%的醋酸溶液。
如請求項6之複合薄膜，中該醋酸為約1%的醋酸溶液。
如請求項1之複合薄膜，其中該方法更包含以下步驟：於乾燥後加入一交聯劑。
如請求項8之複合薄膜，其中該交聯劑選自於由三聚磷酸鈉、戊二醛、京尼平、乙二醇及氫氧化鈉所組成的群組。