TWI678160B - 利用電噴霧法將蛋白質奈米封裝於幾丁聚醣-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物以有效防止其在魚類胃腸道中遭到破壞之製法 - Google Patents

Abstract

本發明係一種利用電噴霧法將蛋白質奈米封裝於幾丁聚醣-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(PLGA)之製法，其作法係將PLGA溶解於丙酮，配製成溶液；將蛋白質均勻混入溶液，形成混合液；在室溫下，將混合液加入聚乙烯醇水溶液，均勻攪拌，製成乳化液；將乳化液注入針筒，在高電壓下進行噴霧，針頭及其鄰近之第一環狀電極係連結至電源正極，針頭下方之第二環狀電極係連結至電源負極，且其中放置有燒杯，燒杯內盛裝幾丁聚醣之醋酸水溶液，以收集經噴霧形成的奈米顆粒(NPs)；嗣，藉離心方式，取得NPs沉澱物，且對其完成清洗、冷凍及乾燥，即製成經奈米封裝之蛋白質。

Description

利用電噴霧法將蛋白質奈米封裝於幾丁聚醣-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物以有效防止其在魚類胃腸道中遭到破壞之製法

本發明係關於一種蛋白質之奈米封裝，尤指一種利用電噴霧法將蛋白質奈米封裝於幾丁聚醣-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物中，以有效防止蛋白質在魚類胃腸道中遭到破壞之製法。

台灣重要經濟養殖魚種石斑魚之幼苗與稚魚在養殖過程中屢遭虹彩病毒(iridovirus)和神經壞死病毒(nervous necrosis virus，以下簡稱NNV)感染，尤其是NNV一旦爆發，其高傳染率和高致死率，常造成魚苗大規模死亡。NNV在台灣對龍膽石斑、青斑、虎斑等高經濟魚類的影響最深，其感染程度以孵化後十幾天之魚花(0.8~1.2公分)最為嚴重，發病時間快速且死亡率高達80~100%，甚至，成魚也會有病毒帶原的現象，倘產卵過程與養殖環境控管不良，尚會分別造成病毒垂直及水平的傳播，近年來，台灣盛行的高密度養殖，在發生病毒性疾病時，往往會造成更嚴重的經濟損失。因此，若能在魚苗階段，有效解決NNV之危害及降低其致死率，必然對石斑魚養殖產業有莫大的幫助。

目前，台灣業界對於NNV的防治均是從多方面下手，因為單一方式往往收不到滿意的結果，其做法諸如種魚篩選與控管，魚卵、用具、水、餌料生物的消毒及養殖管理等方面。雖然，上述做法有利減少 魚苗感染NNV的機率，但是，目前最有效控制病毒性疾病的防治方法仍為施用疫苗，且施疫時機尚須配合魚體免疫系統發育的程度，如：點帶石斑至少要孵化後15~17天，免疫系統才漸趨成熟，也才適合施疫的進行，而疫苗引起的免疫力約在施疫後三至四週後才會達到高峰，在免疫力還沒有完全發揮之前，魚苗仍受病毒感染及病發的威脅，因此，對於NNV有垂直感染及好發於孵化後30天內的幼苗，疫苗的選用及施用實有其限制之處。干擾素(IFN)在魚類運用上，目前還是針對第一型之IFN-α/β為主，因為其具有更直接與快速抗病毒的能力。IFNs在體內實驗的抗病毒效果亦有多方證據，證實大西洋鮭魚在受到SAV(Salmonid alpha virus)病毒感染3天內，其頭腎組織顯著地表現出IFN反應，而被ISAV(infectious salmon anaemia virus)感染的大西洋鮭魚在頭腎及肝臟中亦均誘導出IFN及IFN相關基因，對各該病毒的感染提供了早期保護之效果。

先前學者以餵食、浸泡及腹腔注射三種方法，將選殖之大西洋鮭魚IFNα2蛋白施予虹鱒(rainbow trout)幼苗，結果發現只有腹腔注射能有效對抗infection hematopoietic necrosis virus(IHNV)，而增加存活率，並顯著表現黏病毒抗性蛋白(Myxovirus resistance protein，以下簡稱Mx)基因；然而，以海藻酸鹽(alginate)處理DNA疫苗後，再以飼料餵食方式，投予虹鱒幼苗，卻仍可有效地提升存活率，並顯著提高Mx等免疫基因的表現，因此，透過適當材料包覆功能性物質，並有效地傳輸到目標細胞，避免胃酸之破壞，應是餵食方式是否奏效的關鍵步驟。

據此，如何在篩選出能有效抑制NNV基因複製且減少細胞病變的最佳干擾素後，能選用較佳之奈米包覆製法包埋干擾素，以期不僅 能確保干擾素在保存及餵食上之便利性外，尚能在對石斑魚餵食干擾素之過程中，確保干擾素不會在石斑魚胃腸道中遭到破壞，而能有效發揮干擾素在石斑魚體內之抗病毒效果，即成為本發明在此欲解決之一重要課題。

發明人經過長久努力研究與實驗，終於開發設計出本發明之一種「利用電噴霧法將蛋白質奈米封裝於幾丁聚醣-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物以有效防止其在魚類胃腸道中遭到破壞之製法」，期藉由本發明的提出，能在篩選出有效抑制魚類病毒或增強魚類免疫能力的最佳蛋白質後，選用較佳之奈米包覆製法包埋干擾素，以能確保該最佳蛋白質在保存及餵食上之便利性外，尚能在對魚類餵食之過程中，確保該最佳蛋白質不會在魚類胃腸道中遭到破壞，且能有效發揮其在魚體內之前述效果，而對魚類養殖產業有所貢獻。

本發明之一目的，係提供一種利用電噴霧法(electrospraying)將蛋白質奈米封裝於幾丁聚醣(chitosan)-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(Poly Lactic-Glycolic Acid，簡稱PLGA)以有效防止其在魚類胃腸道中遭到破壞之製法，其作法是以電噴霧法包埋蛋白質製成奈米顆粒，其作法是取0.01±0.005g PLGA，溶解於1±0.5mL之丙酮(acetone)中，配製成PLGA濃度為0.33~3%(w/v)之PLGA溶液；取100±50μL之蛋白質溶液，其中，蛋白質含量為2±1mg/mL，與1±0.5mL之PLGA溶液均勻混合成PLGA-蛋白質混合液；嗣，在室溫下，將PLGA-蛋白質混合物全數加入1±0.5mL且濃度為1~3% w/v之聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，簡稱PVA)水溶液中，並均勻攪拌，以製成蛋白質乳化液；將蛋白質乳化液注入噴霧針 筒內，使用注射式幫浦(mechanical syringe pump)以0.1±0.5mL/min之流速在20±5kV高電壓下進行噴霧，注射式幫浦所配置的高壓電源(high-power voltage supply，簡稱YSTC)之正極係連接至噴霧針筒之針頭及其鄰近之第一環狀電極(ring electrode)，YSTC之負極則係連接至針頭下方之第二環狀電極，該第二環狀電極距離針頭5~10cm，且其中放置有一燒杯，該燒杯係用來收集經噴霧所形成的奈米顆粒(Nanoparticles，以下簡稱NPs)沉澱物，其內盛裝有幾丁聚醣濃度為0.015~0.05%(w/v)之醋酸水溶液，其中，幾丁聚醣或殼聚醣(chitosan)之分子量為117±30kDa，去乙醯基化之程度(degree of deacetylation)為75~95%，醋酸濃度為1±0.5%；再以12,000±2000×g離心15~30分鐘，分離上清液，取得NPs沉澱物，並利用二次水沖洗NPs沉澱物數次；最後，對NPs沉澱物進行冷凍乾燥，並將樣品放置於4℃溫度環境下備用，即製成經奈米封裝之蛋白質顆粒。

為便 貴審查委員能對本發明之目的、技術特徵及其功效，做更進一步之認識與瞭解，茲舉實施例配合圖式，詳細說明如下：

〔習知〕

無

〔本發明〕

100~105‧‧‧步驟

20‧‧‧噴霧針筒

201‧‧‧金屬針頭

21‧‧‧注射式幫浦

22‧‧‧高壓電源

221‧‧‧第一環狀電極

222‧‧‧第二環狀電極

23‧‧‧燒杯

231‧‧‧幾丁聚醣醋酸水溶液

30‧‧‧BSA乳化滴液

31‧‧‧帶負電之奈米粒子

32‧‧‧帶正電之奈米顆粒

40‧‧‧BSA

第1圖係本發明之製法流程示意圖；第2圖係本發明電噴霧法之架構示意圖；第3圖係本發明電噴霧法之霧化示意圖；及第4圖係本發明電噴霧法中表面帶負電之奈米粒子轉變成表面帶正電之奈米顆粒之示意圖。

按，奈米技術在製藥領域之藥物傳輸方面已深受業界青睞，尤其是，當一些藥物經使用奈米載體成功地輸送到目的地，且恢復患者健康後，奈米技術的運用更加受到重視。然而，為了使許多具治療效果的蛋白質，在進入目標細胞前，能克服不易被人體吸收的問題，奈米顆粒本身之配方及其在不同種類患體內的穩定性，即成為不同醫藥領域必需嚴格考量之兩個主要重點。

查，近年來，已有諸多文獻報導有關利用聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(poly lactic-glycolic acid，以下簡稱PLGA)包埋第一型干擾素IFN-α之封裝技術，其中，由於PLGA所構成的奈米粒子具有在生物體內反應較為溫和的特點，因此，非常適合運用於生物製藥工業中。一般言，PLGA是一種疏水性聚合物，易水解而產生乳酸(lactic acid)和甘醇酸(glycolic acid)，因此乃成為目前所開發出最成功的可生物降解聚合物之一，許多研究亦證實PLGA可藉由奈米包覆(nanoencapsulation)成功地運送具有生物功能的物質，如：蛋白質、核酸和藥物等，此外，PLGA奈米粒子尚可藉由塗佈(coating)親水性聚合物(hydrophilic polymers)，如：聚乙二醇(polyethylene glycol，簡稱PEG)或幾丁聚醣(chitosan)等穩定劑，來達到穩定目標蛋白之目的，且能提高疏水性之PLGA奈米顆粒與腸上皮細胞的交互作用，進而改善蛋白之運送效果，另，穩定劑除了使奈米粒子更容易進入細胞外，適當的聚合物塗佈材料和穩定劑，尚能幫助所攜帶的目標蛋白免於變性，且能避免奈米顆粒的再聚集，因為，諸如使用電噴霧法(electrospraying)等製造奈米顆粒之過程，常涉及有機溶劑的使用，蛋白質可能因而變性及再聚集。

此外，許多研究亦顯示，部分PLGA奈米粒子是透過胞飲作用(pinocytosis)和胞吞作用(endocytosis)進入細胞內，大約10分鐘，奈米顆粒便會自內切溶酶體(endolysosomes)中釋出而進入細胞質，然而，PLGA奈米粒子之疏水性且帶負電的天然特性，卻限制了PLGA奈米顆粒進入細胞的能力，進而導致粒子被單核吞噬細胞系統(mononuclear phagocyte system，簡稱MPS)或網狀內皮系統(Reticuloendothelial system，簡稱RES)中的巨噬細胞(macrophage)和吞噬細胞(phagocytic cells)所吞噬。因此，藉由表面電荷的修飾，如：幾丁聚醣的表面處理，奈米顆粒可不被MPS識別，順利進入目標細胞中。此外，亦有實驗指出，帶正電的粒子會從溶酶體(lysosome)釋出後聚集在核週(perinuclear)部位，而帶負電及不帶電中性粒子則位於溶酶體處，因此，PLGA奈米顆粒經表面修飾而賦予正電荷後，不論是在腸上皮細胞的吸收與標的細胞內的交互作用上都極具重要性。

雖然，相關文獻資料顯示，以電噴霧化系統來製作奈米粒子具有步驟單一、快速又簡便等優勢，然而，相關條件的參數卻很重要，這些參數的設定將顯著影響蛋白質或藥物是否能達到最佳化包埋的效果？據此，發明人乃思及以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，以下簡稱BSA)做為模擬蛋白質，利用電噴霧(electrospraying)法，簡易且快速地將該模擬蛋白質奈米封裝於幾丁聚醣-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物中，並對其相關參數進行測試，以判斷是否能有效防止該模擬蛋白質在魚類胃腸道中遭破壞？進而據以作為包埋IFN之基礎，請參閱第1圖所示，本發明之製法包括下列步驟，且以BSA做為實施對象： (100)首先，取0.01±0.005g之聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(lactic/glycolic acid，以下簡稱PLGA)，其中，聚乳酸(lactic acid)與聚甘醇酸(glycolic acid)之含量比為50±10/50±10，該共聚物之分子量為38,000~54,000MW，溶解於1±0.5mL之丙酮(acetone)中，配製成PLGA濃度為0.33~3% w/v之PLGA溶液；(101)另，取100±50μL之牛血清白蛋白(BSA)溶液，其中，BSA含量為2±1mg/mL，與1±0.5mL之PLGA溶液均勻混合成PLGA-BSA混合液；(102)嗣，在室溫下，將PLGA-BSA混合液全數加入1±0.5mL且濃度為1~3% w/v之聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，簡稱PVA)水溶液中，並均勻攪拌，以製成BSA乳化液(emulsion solution)；(103)接著，請參閱第2圖所示，將BSA乳化液注入一噴霧針筒20內，使用一注射式幫浦(mechanical syringe pump)21以0.1±0.5mL/min之流速在20±5kV高電壓下進行噴霧，該注射式幫浦21所配置的一高壓電源(high-power voltage supply，簡稱YSTC)22之正極係連接至該噴霧針筒20之金屬針頭201及其鄰近之一第一環狀電極(ring electrode)221，YSTC 22之負極則係連接至金屬針頭201下方之一第二環狀電極222，該第二環狀電極222與該金屬針頭201間之距離為5~10cm，且其中放置有一燒杯23，該燒杯23係用來收集經噴霧所形成的奈米粒子(Nanoparticles，以下簡稱NPs)，其內盛裝有幾丁聚醣濃度為0.015~0.05% w/v之幾丁聚醣醋酸水溶液231，其中，幾丁聚醣或殼聚醣(chitosan)之分子量為117±30kDa，去乙醯基化之程度(degree of deacetylation)為75~95%，醋酸濃度為1±0.5%；如此，請參閱第3圖所示，經由該金屬針頭201向下滴出之BSA乳化滴液30(droplets)，在該第一環狀電極221之高電壓作用下，將攜帶大量負離子(ions)，而變得極不穩定，導致其中分別攜帶負電之奈米粒子31彼此互斥，而相互分開，進而令BSA乳化滴液30中之有機溶劑(solvent)氣化分離(evaporate)，並令該等帶負電之奈米粒子31朝該燒杯23方向，被噴灑至該燒杯23內之幾丁聚醣醋酸水溶液231中，並在該第二環狀電極222之高電場作用下，成為表面包覆有PLGA且攜帶正電之奈米顆粒32，請參閱第4圖所示，其中，BSA40係包埋在該帶正電之奈米顆粒32內；(104)再以12,000±2000×g離心15~30分鐘，分離上清液，取得奈米顆粒(Nanoparticles，以下簡稱NPs)之沉澱物；(105)最後，利用二次水對所得NPs沉澱物清洗數次後，對NPs沉澱物進行冷凍及乾燥，並將樣品放置於4℃溫度環境下備用，即製成經奈米封裝之BSA顆粒，且將其標示為PLGA-BSA NPs，以進行後續檢測。

嗣，本發明特別利用前述電噴霧製程，以幾丁聚醣或殼聚醣(chitosan)作為分散介質(dispersion medium)，且以不同濃度之PVA，包埋BSA，製成不同濃度之PLGA-BSA NPs，並分別對其進行奈米顆粒之粒徑大小(particle size)、多分散指數(polydispersity index，簡稱PDI)及界達電位(zeta potential)等測試及分析，其結果如下表一所示，其中，各數值右上方顯示之a、b、c、d、e及f等符號係用以表示其在統計上的差異性，意即，符號相同者係代表其在95%的信賴區間(p<0.05)統計上不具顯著性差異，符號不同者則代表具有統計之顯著性差異；當PLGA濃度為1% w/v，且PVA 濃度為3% w/v時，其奈米顆粒大小為5組中最小者，其多分散指數及界達電位則介於5組之中間，而為5組中具備最佳性狀之配方者。

嗣，本發明再利用前述電噴霧製程，以二次水(ddH₂O)作為分散介質(dispersion medium)，且以不同濃度之PVA搭配不同濃度之chitosan(CS)，包埋BSA，製成不同濃度之PLGA-BSA NPs，並分別對其進行奈米顆粒之粒徑大小、PDI及界達電位等測試及分析，其結果如下表二所示，經與表一對照比較後，仍以表一所示在PLGA濃度為1% w/v，且PVA濃度為3% w/v時，其性狀為最佳者。

最後，本發明再利用前述電噴霧製程，仍以二次水(ddH₂O)作為分散介質(dispersion medium)，在無PVA之情形下，以不同濃度之CS， 包埋BSA，製成不同濃度之PLGA-BSA NPs，並分別對其進行奈米顆粒之粒徑大小、PDI及界達電位等測試及分析，其結果如下表三所示，經與表一對照比較後，仍以表一所示在PLGA濃度為1% w/v，且PVA濃度為3% w/v時，其性狀為最佳。

據上所述，由於表一所示具備最佳性狀之配方，係使用PLGA、PVA及幾丁聚醣(chitosan)，作為包埋BSA，製成PLGA-BSA NPs之基本配方，其與發明人另案申請中之「一種利用超音波震盪法將魚類干擾素(IFN)奈米封裝於幾丁聚醣-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物以有效防止其在魚類胃腸道中遭破壞之製法」相較，二者所使用之奈米包埋材料均為PLGA、PVA及幾丁聚醣(chitosan)，且本發明所形成之PLGA-BSA NPs之前述性狀檢測數據，亦近似於前述超音波震盪法包埋gIFN(七帶石斑魚干擾素)後所形成之PLGA-gIFN NPs之性狀檢測數據，據此，由於二者均具有相同之奈米包埋結構，顯然應能據以合理的推論，利用本發明之電噴霧法所形成之PLGA-BSA NPs，應能如同利用前述超音波震盪法所形成之PLGA-gIFN NPs般，可有效防止蛋白質在魚類胃腸道中遭到破壞(根據其動物實驗結果)， 進而在業界篩選出能有效抑制魚類病毒或增強魚類免疫能力的最佳蛋白質後，能利用本發明之電噴霧法，包埋該最佳蛋白質，以確保該最佳蛋白質在保存及餵食上之便利性，且在對魚類餵食該最佳蛋白質之過程中，能確保其不會在魚類胃腸道中遭到破壞，而能有效發揮該最佳蛋白質在魚體內之前述效果。

按，以上所述，僅為本發明最佳之一具體實施例，惟本發明之技術特徵並不侷限於此，任何熟悉該項技藝者在本發明領域內，可輕易思及之變化或修飾，皆可涵蓋在以下本案之專利範圍。

Claims (3)

1. 一種利用電噴霧法將蛋白質奈米封裝於幾丁聚醣-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物以有效防止其在魚類胃腸道中遭到破壞之製法，包括下列步驟：將聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(PLGA)溶解於丙酮中，配製成PLGA溶液，其中，PLGA之重量為0.01±0.005g，且聚乳酸與聚甘醇酸之含量比為50±10/50±10，PLGA之分子量為38,000~54,000MW，丙酮(acetone)之含量為1±0.5mL，以使PLGA溶解於丙酮後，能形成濃度為0.33~3% w/v之PLGA溶液；將蛋白質溶液均勻混入PLGA溶液，形成PLGA-蛋白質混合液，其中，該蛋白質溶液之容量為100±50μL，且其中蛋白質之含量為2±1mg/mL，該蛋白質溶液係與1±0.5mL之PLGA溶液均勻混合成該PLGA-蛋白質混合液；嗣，在室溫下，將PLGA-蛋白質混合液加入聚乙烯醇(PVA)水溶液中，並均勻攪拌，製成蛋白質乳化液，其中，該PVA水溶液之含量為1±0.5mL，且其濃度為1~3% w/v；將蛋白質乳化液注入一噴霧針筒內，使用一注射式幫浦在高電壓下進行噴霧，該注射式幫浦所配置的高壓電源之正極係連接至該噴霧針筒之一針頭及其鄰近之一第一環狀電極，高壓電源之負極則係連接至該針頭下方之一第二環狀電極，該第二環狀電極中放置有一燒杯，該燒杯內盛裝有幾丁聚醣之醋酸水溶液，用來收集經噴霧所形成的奈米顆粒(NPs)沉澱物，其中，該幾丁聚醣醋酸水溶液之濃度為0.015~0.05% w/v，且幾丁聚醣或殼聚醣之分子量為117±30kDa，去乙醯基化之程度為75~95%，醋酸濃度為1±0.5%；以離心方式，分離上清液，取得NPs沉澱物；及最後，對NPs沉澱物進行清洗、冷凍及乾燥，即製成經奈米封裝之蛋白質顆粒。
2. 如請求項1所述之製法，其中，該注射式幫浦係以0.1±0.5mL/min之流速在20±5kV高電壓下進行噴霧，該第二環狀電極距離針頭5~10Cm。
3. 如請求項2所述之製法，其中，以12,000±2000×g離心15~30分鐘，分離上清液，取得NPs之沉澱物。