TWI663980B - 蟬花活性物質用於抑制及/或降低過敏反應之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種蟬花活性物質之用途，其係用於製造降低過敏反應之組合物。此蟬花活性物質係經下列步驟製備：(a) 取蟬花菌絲體(
Cordyceps cicadae)於平板培養基上，於20-30℃之溫度下培養14-21天；(b) 將步驟(a)培養後之蟬花菌絲體接種至一燒瓶內，於20-30℃、pH 4-6的條件培養3-14天；及(c) 將步驟(b)培養後之蟬花菌絲體接種至一發酵槽內，於15-30℃、pH 4-6的條件培養3-5天，形成含有蟬花活性物質之蟬花菌絲體發酵液。
Description
本發明關於蟬花活性物質之用途，特別是指以特定方式製成的蟬花活性物質，其在抑制及/或降低過敏反應上的應用。
過敏是21世紀的一種流行病。根據調查，近30年間過敏性疾病的發病率增加了至少3倍，涉及22%的世界人口，已成為世界第六疾病。預計20年後，已開發國家50%以上的人口皆會有過敏性疾病。目前世界衛生組織(WHO)已將過敏列為21世紀重點防治的三大疾病之一。
過敏是因人體接觸無害物質卻產生過強的免疫反應所致。當過敏原(Allergen)首次進入身體時，免疫系統會為了嘗試保護身體而開始產生免疫球蛋白E (IgE)。當下次過敏原進入身體，鑲嵌在肥大細胞(Mast cell)上的IgE會與過敏原結合，刺激肥大細胞釋放組織胺等發炎物質，引發流鼻涕，搔癢，紅腫，腹瀉甚至嘔吐等過敏反應。
當過敏體質的 人過敏時，通常會用抗組織胺等藥物來舒緩過敏症狀，但過敏藥物一般均具有一定的副作用，因 此利用天然植物或由植物中萃取出具有抑制過敏功能的成分來抑制過敏活性，也是大眾關 心的議題。
蟬花(
Cordyceps cicadae)，又稱為胡蟬、蟬菌、蟬蛹草、金蟬花、蟲花、是一種菌蟲複合體，屬於蟲生真菌。蟬花是珍貴的中藥材，具有散風熱、鎮驚、明目等功效。目前尚未有蟬花對過敏免疫反應調節之研究。
研究過敏反應體外方法主要是直接刺激肥大細胞脫顆粒試驗(mast cell degranulation test , MCDT)。組織胺是經典的過敏介質，以往主要用來標記肥大脫顆粒的程度，但有研究顯示組織胺在肥大細胞體外的釋放不穩定，重複性較差，而β-己醣胺酶(β-hexosaminidase)的釋放試驗方式成熟、簡便經濟、應用廣泛。目前研究顯示，RBL-2H3肥大細胞株在IgE與Fc受器單株抗體或是鈣離子載體A23187等刺激下，可以釋放β-己醣胺酶，故可做為篩選減緩過敏反應的研究方法。
本發明提供一種蟬花活性物質之用途，其可用於製造抑制及/或降低過敏反應之組合物。
根據本發明之一實施例，所述蟬花活性物質係經下列步驟製備：(a) 取一蟬花菌絲體(
Cordyceps cicadae)於平板培養基上，於20-30℃之溫度下培養14-21天；(b) 將步驟(a)培養後之蟬花菌絲體接種至一燒瓶內，於20-30℃、pH 4-6的條件培養3-14天；以及(c) 將步驟(b)培養後之蟬花菌絲體接種至一發酵槽內，於15-30℃、pH 4-6的條件培養3-5天，形成含有蟬花活性物質之蟬花菌絲體發酵液。
一實施例中，製備蟬花活性物質的步驟更包括步驟(d)：將蟬花菌絲體發酵液冷凍乾燥後磨粉，形成含有蟬花活性物質之一蟬花菌絲體凍乾粉。
一實施例中，製備蟬花活性物質的步驟更包括步驟(e)：將蟬花菌絲體凍乾粉以至少一溶劑萃取，形成含有蟬花活性物質之蟬花菌絲體萃取液。
一實施例中，製備蟬花活性物質的步驟更包括步驟(f)：將蟬花菌絲體萃取液乾燥，以獲得蟬花活性物質。
一實施例中，步驟(e)之萃取溶劑包括水或醇類。
一實施例中，步驟(a)中之培養係為震盪培養，其轉速為110-130 rpm。
一實施例中，步驟(c)之發酵槽進一步通入一氣體，此氣體包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合，發酵槽的槽壓為0.5-1.0 kg/cm
2且通氣速率為0.01-1.5VVM。
一實施例中，所製備之組合物為醫藥組合物，此醫藥組合物進一步包含藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
一實施例中，此組合物係用於降低皮膚過敏的反應。
一實施例中，此組合物係以乳液、化妝水、精華液、防曬乳、隔離霜或面膜的方式施用。
一實施例中，當步驟(e)之萃取溶劑為水時，此蟬花活性物質的有效濃度介於0.625-5 mg/ml。
一實施例中，當步驟(e)之萃取溶劑為醇類時，此蟬花活性物質的有效濃度介於0.0625-0.5 mg/ml。
為使本發明之上述及其他方式更為清楚易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式進行說明。
實施例一 蟬花菌絲體液態培養
本實施例之蟬花菌種來源係由台灣新北市山區採集之野生子實體分離純化而得，但不限於此區所採集之蟬花菌株。
(1)平板培養：將蟬花蟲體子座切開後分離其菌絲體，接種於一平板培養基上，並以20-30℃之溫度培養2-3週(本實施例中，係於25℃下培養2週)。平板培養基的配方可包括馬鈴薯糊精培養基(Potato Dextrose Agar, PDA)、碳源及氮源。上述培養基配方僅為一範例，使用時成份可依需求調整，或搭配市售培養基使用，並無特別限制。
採集平板培養基上之菌絲，進行基因庫資料比對鑑定，確認為蟬花菌株。此菌株與寄存於台灣食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center)，編號BCRC MU30106(寄存日期：102年11月25日)的菌株相同。
(2)燒瓶培養：將(1)中培養之蟬花菌絲體接種於燒瓶內，並以20-30℃、pH4-6及轉速110-130 rpm的條件震盪培養3-14天(本實施例中，以25℃、pH5.5、轉速120 rpm之條件震盪培養10天)；其中該震盪培養係以下表1所示之培養基進行培養。
表1 培養基配方
成分 含量範圍 (重量%) 本實施例使用之重量% 穀類或豆類 1-3 1 醣類 1-4 2.5 酵母抽出物 0.5-1.0 1 無機鹽類 0.1-0.5 0.3
表1之培養基配方中，綜合性碳氮源可為穀類(如麥粉類)或豆類(如黃豆粉、綠豆粉、大豆粉等)；醣類可為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等；無機鹽類可為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鐵等。特別說明的是，上述培養基配方僅為一範例，使用時成份可依需求調整，或搭配市售培養基使用，並無特別限制。
(3)發酵槽培養：將(2)中燒瓶培養之蟬花菌絲體接種於發酵槽內，並於發酵槽內以15-30 ℃、槽壓0.5-1.0 kg/cm
2、pH 4-6及攪拌速度50-150 rpm條件下，以0.1-1.5 VVM的通氣速率培養3-21天，形成一蟬花菌絲體發酵液(本實施例中，係以25 ℃、槽壓0.5 kg/cm
2、pH 5.5、攪拌速度60 rpm及1.0 VVM的條件培養14天)。通入之氣體可包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合。發酵槽內之培養基與步驟(c)中燒瓶內所使用之培養基相同。
此發酵液內即含本發明之蟬花菌絲體活性物質，且此蟬花菌絲體發酵液可進一步藉由乾燥步驟製備為蟬花菌絲體凍乾粉。
(4)萃取：將蟬花菌絲體凍乾粉分成獨立兩份，分別加入20倍體積蒸餾水及乙醇溶解。以水為溶劑的萃取液以溫度100℃加熱30分鐘，待冷卻後離心取上清液經冷凍乾燥法進行乾燥，得到蟬花水萃物。以乙醇為溶劑的萃取液，以溫度40℃轉速60 rpm攪拌24小時，待冷卻後離心取上清液，經減壓濃縮得到蟬花醇萃物。蟬花水萃物或醇萃物兩者皆含有本發明之蟬花菌絲體活性物質。
經由萃取步驟可取得較高濃度之蟬花活性物質。蟬花活性物質的態樣包含蟬花菌絲體發酵液(菌絲體與澄清液)、凍乾粉、水萃物、醇萃物、混合物或其他劑型。以下實施例二中，係分別以水萃物及醇萃物作為蟬花活性物質使用。
實施例二 蟬花活性物質與過敏反應之分析
(1) 收集RBL-2H3肥大細胞株，調整細胞懸浮液濃度，以50,000-100,000/mL 密度種植於96孔盤內。
(2) 將(1)之肥大細胞株置於37 ˚C、5% CO
2培養箱培養16-24小時後，400 g離心10 min並去除上清液。
(3) 在用藥組添加不同濃度(mg/mL)之蟬花活性物質50 μL及去顆粒化促進劑A23187(1 μM) 50 μL至(2)之肥大細胞株中；對照組不添加去顆粒化促進劑A23187；空白組只處理PBS 100 μL，每個濃度進行三重複。
(4) 將(3)之肥大細胞株在37°C下共同培養30分鐘後，於4℃、400 g 離心10 min，將上清液100 μL收集至1 mL微量離心管(eppendorf)，孔內剩下的細胞加入100 μL MTT 溶液，於37 ˚C反應 2小時。
(5) 將(4)中的50 μL上清液吸至新的96 孔盤，並加入50 μL/孔的受質溶液2 mM 對硝基苯-N-乙醯-β-D-胺基葡萄醣苷(p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide)。
(6) 在37°C下，將(5)的96孔盤培養1.5 hr後，加入50 μL的0.4 M (pH 10.7) Na
2CO
3-NaHCO
3緩衝液終止其反應，並測定405 nm吸光值(OD 405nm)，可得知代表β-己醣胺酶(β-hexosaminidase)含量。
(7) 按以下公式計算β-己醣胺酶(β-hexosaminidase)含量抑制率：：β-己醣胺酶抑制率(%) =
。
(8)將(4)孔內MTT溶液移除，每孔加入100 μl DMSO，震盪2 min，於570 nm 測定吸光值。
統計分析：實驗結果數據以平均值（Mean）±標準誤差（SD表示。試驗數據以Student's t-test 統計分析其組間差異。若p ＜ 0.05則視為具有統計上的顯著差異。
水萃物
第1A圖顯示本發明實施例一中的蟬花水萃物之405 nm吸光值(OD 405nm)測試結果。在不影響細胞存活率的濃度下，鈣離子載體1μM A23187刺激可誘導肥大細胞RBL-2H3去顆粒化釋出過敏介質β-己醣胺酶(β-hexosaminidase)。圖中顯示的OD 405nm越高，代表β-己醣胺酶濃度越高，過敏反應越嚴重。試驗結果顯示，蟬花水萃物能隨濃度增高來抑制過敏介質β-己醣胺酶釋出的趨勢，具有抑制及/或降低過敏之作用。
OD 405 蟬花水萃物濃度 對照組(-A23187) 用藥組(+A23187) 細胞存活率(%) 0 mg/mL 0.3516±0.0292 0.7269±0.0510 100-103% 0.625 mg/mL 0.4081±0.0065 0.5818±0.0266 96-104% 1.25 mg/mL 0.4316±0.0081 0.5330±0.0646 96-97% 2.5 mg/mL 0.4328±0.0180 0.4295±0.0379 91-93% 5 mg/mL 0.4492±0.0118 0.4159±0.0892 85-94%
第1B圖係將用藥組與對照組(對照組β-己醣胺酶釋放率作為100%，即抑制率為0%)比較，其顯示蟬花水萃物濃度對添加A23187刺激的Rbl-2H3細胞活化去顆粒釋放有明顯抑制作用，並呈現濃度依賴關係。因此，證明蟬花水萃物能夠抑制/降低過敏反應，且有效濃度為0.625-5 mg/ml。
蟬花水萃物濃度 β-己醣胺酶抑制率(%) 0.625 mg/mL 53.71±8.07% * 1.25 mg/mL 72.96±17.57% * 2.5 mg/mL 100.87±14.71% ** 5 mg/mL 108.87±25.73% ** 數值以平均值 ± 標準差表示
(n = 3)對照組β-己醣胺酶釋放率為100%(即抑制率為0%)，各濃度與負對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01
醇萃物
第2A圖顯示本發明實施例一中的蟬花醇萃物之405 nm吸光值(OD 405nm)測試結果。圖中顯示的OD 405nm越高，代表β-己醣胺酶濃度越高，過敏反應越嚴重。試驗結果顯示，蟬花醇萃物能隨濃度增高來抑制過敏介質β-己醣胺酶釋出的趨勢，具有抑制及/或降低過敏之作用。
OD 405 蟬花醇萃物濃度 對照組(-A23187) 用藥組(+A23187) 細胞存活率(%) 0 mg/mL 0.3711±0.0238 1.1826±0.2500 88-100% 0.0625 mg/mL 0.3781±0.0152 0.6039±0.0271 90-92% 0.25 mg/mL 0.3775±0.0141 0.5575±0.0295 81-83% 0.5 mg/mL 0.4008±0.0020 0.3666±0.0086 76-79%
同樣的，第2B圖係將用藥組與對照組(對照組β-己醣胺酶釋放率作為100%，即抑制率為0%)比較，蟬花醇萃物濃度對添加A23187刺激的Rbl-2H3細胞活化去顆粒釋放有明顯抑制作用。因此，證明蟬花醇萃物亦能夠抑制/降低過敏反應，且有效濃度為0.0625-0.5 mg/ml。
蟬花醇萃物濃度 β-己醣胺酶抑制率(%) 0.0625 mg/mL 72.17±2.99% * 0.25 mg/mL 77.82±2.17% * 0.5 mg/mL 104.21±0.86% ** 數值以平均值 ± 標準差表示
(n = 3)對照組β-己醣胺酶釋放率為100%(即抑制率為0%)，各濃度與負對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01
雖然本發明已用實施例說明如上，然上述實施例僅為示例，並非用以限制本發明。本領域通常知識者在參酌說明書的內容後，當能適當的改用、變化上述實施例。因此，本發明之保護範圍應以後述的申請專利範圍為準。
第1A圖繪示實施例二中蟬花活性物質水萃物對RBL-2H3肥大細胞株抗過敏的測試結果。
第1B圖繪示蟬花活性物質水萃物的β-己醣胺酶抑制率測試結果。
第2A圖繪示實施例二中蟬花活性物質醇萃物對RBL-2H3肥大細胞株抗過敏的測試結果。
第2B圖繪示蟬花活性物質醇萃物的β-己醣胺酶抑制率測試結果。
Claims (10)
- 一種蟬花活性物質用於製造抑制及/或降低過敏反應之醫藥組合物的用途，其中該蟬花活性物質的製備方法包括下列步驟：(a)取一蟬花菌絲體(Cordyceps cicadae)於平板培養基上，於20-30℃之溫度下培養14-21天；(b)將步驟(a)培養後之蟬花菌絲體接種至一燒瓶內，於20-30℃、pH 4-6的條件培養3-14天；以及(c)將步驟(b)培養後之蟬花菌絲體接種至一發酵槽內，於15-30℃、pH 4-6的條件培養3-5天，形成含有該蟬花活性物質之一蟬花菌絲體發酵液。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中製備該蟬花活性物質的步驟更包括步驟(d)：將該蟬花菌絲體發酵液冷凍乾燥後磨粉，形成含有該蟬花活性物質之一蟬花菌絲體凍乾粉。
- 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中製備該蟬花活性物質的步驟更包括步驟(e)：將該蟬花菌絲體凍乾粉以至少一溶劑萃取後乾燥，形成含有該蟬花活性物質之至少一蟬花菌絲體萃取液。
- 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中製備該蟬花活性物質的步驟更包括步驟(f)：將該蟬花菌絲體萃取液乾燥，以獲得該蟬花活性物質。
- 如申請專利範圍第3或4項所述之用途，其中在步驟(e)中，該溶劑係選自水或醇類。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中步驟(a)中之培養係為震盪培養，其轉速為110-130rpm。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中步驟(c)中該發酵槽進一步通入一氣體，該氣體包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合，該發酵槽的槽壓為0.5-1.0kg/cm2且通氣速率為0.01-1.5VVM。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物進一步包含藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。
- 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中當步驟(e)之該溶劑為水時，該蟬花活性物質的有效濃度介於0.625-5mg/ml。
- 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中當步驟(e)之該溶劑為醇類時，該蟬花活性物質的有效濃度介於0.0625-0.5mg/ml。
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- 2018-05-04 TW TW107115253A patent/TWI663980B/zh active
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| T徐瑞霞，"大蟬花菌種分離、鑑定及其液態培養菌絲體之基因毒性評估"， 檢驗及品保雜誌，2015年 * |
| 徐瑞霞，"大蟬花菌種分離、鑑定及其液態培養菌絲體之基因毒性評估"， 檢驗及品保雜誌，2015年 |
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| TW201946640A (zh) | 2019-12-16 |
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