TWI660742B - 增強免疫反應之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種醫藥組合物，係包含一抗原融合蛋白，該抗原融合蛋白包含一抗原及一Fcγ受體拮抗分子。本發明亦提供一種增強抗原的免疫原性的方法，係包含將該抗原與一Fcγ受體拮抗分子相連接以形成一抗原融合蛋白。本發明亦提供一種增強個體對一抗原的免疫反應的方法，係包含施予該個體有效量之一包含抗原及Fcγ受體拮抗分子的抗原融合蛋白。本發明可應用於開發強效疫苗，此係基於透過與Fcγ受體結合而將疫苗抗原靶向至抗原呈獻細胞。

Description

增強免疫反應之組合物及方法
本發明係關於一種調節免疫反應的組合物及方法。具體而言，本發明係關於利用含有抗原和Fcγ受體拮抗分子的抗原融合蛋白來增強免疫反應的一種醫藥組合物及方法。
疫苗抗原的免疫原性(immunogenicity)是疫苗開發的主要關注點，因為疫苗預防或治療疾病的潛力高度依賴疫苗抗原有效誘發免疫反應的能力。增加疫苗免疫原性的一種常用策略是將佐劑(adjuvant)加入疫苗製劑。佐劑是種類多樣的免疫增強物質，其作用係經由多種機制，包含延長抗原由注射部位釋放的時間，為抗原穿越淋巴系統的運輸提供載體，及作為免疫刺激物。儘管佐劑能有效增強免疫反應，許多佐劑可能造成不欲意的過敏反應(hypersensitivity)。
有效誘發免疫反應的替代方案是直接刺激抗原呈獻細胞(antigen -presenting cells)。周邊組織中的專職抗原呈獻細胞會捕獲及處理抗原、表現淋巴細胞的共刺激分子(co-stimulatory molecules)、遷移至淋巴器官、並分泌細胞激素以啟動免疫反應。樹突細胞(dendritic cells)是最有效的抗原呈獻細胞，其在後天性免疫反應(adaptive immune response)的起始過程中發揮關鍵作用，導致初生(naïve)T細胞(CD4+ 或CD8+ T細胞)分化為作用(effector)細胞(輔助性或細胞毒殺性T細胞)，且進一步調節體液性免疫反應(humoral immune response)。這些特徵使得樹突細胞成為免疫調節策略的主要目標。
抗原呈獻細胞表現多種Fcγ受體(FcγR)，其調節抗原-抗體複合物(也稱為免疫複合物)的內化並且調控免疫反應。FcγR依據其功能分為如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIII、FcγRIV之活化性受體，以及如FcγRIIB之抑制性受體。先前報導顯示免疫複合物藉由與樹突細胞的FcγR接合而有效誘發免疫反應。然而，在疫苗開發過程中使用免疫複合物花費甚鉅，因為抗體及相關免疫複合物的製備既昂貴又複雜。
因此，開發一種不使用免疫複合物而將抗原靶向抗原呈獻細胞以增強抗原專一性免疫反應的新策略，實有其必要。
緣此，本發明提供一種醫藥組合物，係包含一抗原融合蛋白，該抗原融合蛋白包含一抗原及一Fcγ受體(Fc gamma receptor，FcγR)的拮抗分子。
本發明之另一目的在提供一種增強一抗原的免疫原性的方法，係包含將該抗原與一Fcγ受體的拮抗分子相連接以形成一抗原融合蛋白。
本發明之又一目的在提供一種增強一個體對一抗原的免疫反應的方法，係包含施予該個體有效量之一抗原融合蛋白，其中該抗原融合蛋白包含該抗原及一Fcγ受體的拮抗分子。
在本發明之一實施例中，該Fcγ受體的拮抗分子係為一類甲醯化胜肽受體1抑制蛋白(formyl peptide receptor-like 1 inhibitory protein，FLIPr)或一類FLIPr蛋白(FLIPr-like protein)。
在本發明之另一實施例中，該抗原係為一源自癌細胞或病毒的多胜肽。該抗原可選自於由生存素(survivin)、間皮素(mesothelin)、及茲卡病毒套膜蛋白第三結構域(Zika virus envelope protein domain III)所組成的群組。
在本發明之又一實施例中，所謂被增強的免疫反應包含CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、或其組合之增加，一選自於由干擾素-γ(interferon gamma，IFN-γ)、介白素-2 (interleukin-2，IL-2)、介白素-5 (interleukin-5，IL-5)、介白素-17A (interleukin-17A，IL-17A)、及其組合所組成群組之細胞激素之分泌，以及抗原專一性免疫球蛋白G(IgG)抗體之生成。
本發明之醫藥組合物利用透過與FcγR結合而將抗原靶向至抗原呈獻細胞的抗原融合蛋白來增強個體的抗原專一性免疫反應，因此導致抗原專一性CD4+ 或CD8+ T細胞的數目增加，以及促發炎細胞激素與抗原專一性抗體的含量升高。本文所提供增強抗原的免疫原性和增強個體對抗原的免疫反應的方法是簡單，並且可以在不使用額外的佐劑或免疫複合物的情況下用於開發強效疫苗，例如抗腫瘤及抗病毒疫苗。本發明提高了疫苗抗原的效力，因此提供了在如老年患者之免疫力低下個體中引發有效免疫反應的策略。
本發明將以下方圖式及實施例進一步解說。可以理解的是，以下舉出的實施例並非限制本發明的範圍，並且在不脫離所附申請專利範圍之範疇的情況下，本技術領域熟習技藝者當可進行修飾。
定義
本文中所使用數值為近似的、實驗性數值，其值可在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內變化。因此，用語「約」和「近似於」係指在一給定值或範圍的20%以內，較佳為在10%以內，最佳為在5%以內。
本文中所謂「免疫原性」之用語係指一抗原引起或誘發免疫反應的能力。造成較強免疫反應的抗原具有較高的免疫原性。
用語「有效量」係指一活性物質賦予受治療個體治療效果所需要的量。如本技術領域熟習技藝者所認知，有效劑量將依給藥途徑、賦形劑之使用、以及與其它治療方法共用之可能而變化。
本發明係關於一種醫藥組合物，其含有一包含一抗原及一Fcγ受體拮抗分子的抗原融合蛋白，以及關於一種增強個體對一抗原的免疫反應的方法，其包含對該個體施予有效量的該抗原融合蛋白以供免疫。在以下實施例中，以卵清蛋白(OVA)、生存素(Sur)、間皮素、及茲卡病毒套膜蛋白第三結構域(ZE3)作為例示性抗原以研究本發明之抗原融合蛋白的免疫增強作用。類甲醯化胜肽受體1抑制蛋白(FLIPr；SEQ ID NO:1)及其同源物之類FLIPr蛋白(SEQ ID NO:2)是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )為躲避Fcγ受體調節之宿主免疫力而分泌的強效Fcγ受體拮抗分子，其係作為例示性Fcγ受體拮抗分子以製備含有FLIPr或類FLIPr之融合蛋白。材料及方法 抗原融合蛋白之選殖 (cloning) 及表現
抗原融合蛋白之FLIPr或類FLIPr片段較佳為透過由三重複的四個甘氨酸(glycine)殘基與一個絲氨酸(serine)殘基組成的胜肽連接物(linker)連接至如OVA、生存素、及ZE3等抗原的羧基端。重組抗原或抗原融合蛋白可進一步包含一由組氨酸(histidine)殘基構成的短胜肽(His-tag)以便於利用金屬螯合親和層析法(metal-chelating affinity chromatography)進行純化。根據重組OVA (SEQ ID NO:3)、OVA-FLIPr融合蛋白(SEQ ID NO:4)、OVA-類FLIPr融合蛋白(SEQ ID NO:5)、生存素(SEQ ID NO:6)、生存素-FLIPr(Sur-FLIPr)融合蛋白(SEQ ID NO:7)、間皮素(SEQ ID NO:8)、間皮素-FLIPr融合蛋白(SEQ ID NO:9)、ZE3 (SEQ ID NO:10)、及ZE3-FLIPr融合蛋白(SEQ ID NO:11)的胺基酸序列，其相應的核苷酸序列依大腸桿菌(Escherichia coli )密碼子之使用而決定，並且將具有各該核苷酸序列的去氧核醣核酸(DNA)全部合成。其後，該合成的DNA以聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增。該PCR產物選殖至表現載體pET-22b(+) (Novagen)的NdeI和XhoI位點以產生抗原或抗原融合蛋白的表現質體。該些質體係用於生產重組抗原及抗原融合蛋白。
為製備重組蛋白，利用上述各表現質體轉型大腸桿菌BL21 (DE3)。該轉型細胞在37°C隔夜培養，並藉由添加1mM異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside ，IPTG)誘導蛋白質表現，接著在37°C培養3小時。其後，利用高壓破碎機French Press (Constant Systems，Daventry，UK)在27 Kpsi將轉型細胞裂解於均質緩衝液(20 mM Tris (pH8.0)，50 mM蔗糖，500 mM NaCl，10%甘油)。然後，該細胞裂解物以80,000×g離心40分鐘以獲得含有包涵體的細胞沉澱。大部分重組蛋白存在於包涵體且係以萃取緩衝液(50 mM NaH2 PO4 ，5 mM乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，200 mM NaCl，0.5 M尿素，1% Triton X-100，pH 6.0)將其溶解。重組蛋白係透過將萃取分劃載入固定化金屬親和層析管柱(QIagen，Hilden，德國)而純化。FcγR 結合之酵素結合免疫吸附試驗 ( enzyme-linked immunosorbent assay ， ELISA)
為檢測重組抗原或抗原融合蛋白與FcγR次類之結合，在4°C的磷酸緩衝鹽溶液(PBS；137 mM氯化鈉，2.7 mM氯化鉀，10 mM磷酸氫二鈉，1.8 mM磷酸二氫鉀，pH7.4)中以0.1 mL之1 μg/mL重組蛋白塗覆96孔盤隔夜。該盤以添加0.05% v/v吐溫20(Tween 20)之PBS清洗三次，並與連結生物素(biotin)之多種重組FcγR蛋白之連續稀釋液培養。該重組FcγR蛋白包括FcγRI、FcγRIIa-H131、FcγRIIb、FcγRIIIa-V158、FcγRIIIa-F158、及FcγRIIA。在室溫下培養2小時後，該盤經清洗再與連結山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)之鏈黴親合素(streptavidin)培養30分鐘。為檢測與Fcγ受體之結合，將3,3’, 5,5’-四甲基聯苯胺(3, 3’, 5, 5’-tetramethylbenzidine，TMB)加入盤中，並使用ELISA測讀儀測量在450nm的吸光值。動物研究
雌性C57BL/6小鼠係購自國家實驗動物中心。所有小鼠係飼養於國立衛生研究院(台灣)的實驗動物中心。所有動物研究皆獲得許可並依照國家衛生研究院動物委員會的方針進行。為進行免疫接種，將小鼠隨機分組並由皮下(subcutaneously)二次施予重組抗原或抗原融合蛋白，間隔為二週。酵素連結免疫斑點試驗 (Enzyme-linkedimmunospot (ELISPOT) assay)
使用小鼠IFN-γELISPOT試劑組(eBioscience)測定產生IFN-γ的細胞的數目。簡言之，先以捕捉抗體(capture antibody)塗覆附帶聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜的96孔盤，並在4°C培養18小時。該盤經二次清洗以添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI培養基阻斷1小時以防止後續步驟中的非專一性結合。將來自免疫小鼠的脾臟細胞依5x105 個細胞/孔之密度接種，並施加所指示之胜肽刺激。
予以OVA或OVA融合蛋白免疫注射之小鼠之脾臟細胞被施加10 μg/mL之一稱為OT-1(SIINFEKL；SEQ ID NO:12)的OVA胜肽、另一稱為OT-2(ISQAVHAAHAEINEAGR；SEQ ID NO:13)的OVA胜肽、一OT-1胜肽的對照胜肽(RAHYNIVTF；SEQ ID NO:14)、或一OT-2胜肽的對照胜肽(GRLITVNPIVTEKDS；SEQ ID NO:15)之刺激，並且培養2天。
予以生存素或生存素融合蛋白免疫注射之小鼠之脾臟細胞被施加10 μg/mL之一稱為生存素21-29 (TFKNWPFLE；SEQ ID NO:16)的生存素胜肽、另一稱為生存素57-64 (CFFCFKEL；SEQ ID NO:17)的生存素胜肽、或一RAH對照胜肽(SEQ ID NO:14)之刺激，並且培養2天。
經過培養後，該些脾臟細胞以含0.05% (w/v) Tween20之PBS清洗三次而自該盤上移除。將100 μL生物素化檢測抗體的等分試樣加入各孔中，使該盤在37°C培養2小時。如上重複清洗步驟，並在室溫下以親合素(avidin)-HRP複合物試劑培養45分鐘後，該盤以含0.05% (w/v) Tween 20之PBS清洗三次，而後以PBS單獨清洗三次。在各孔中加入100 μL 3-氨基-9-乙基咔唑(3-amine-9-ethyl carbazole；Sigma-Aldrich)染色溶液的等分試樣以顯現斑點。該盤於1小時後置於自來水下以停止反應。使用ELISPOT測讀儀(Cellular Technology Ltd.)計算斑點數。體內 (in vivo) 細胞毒性試驗
來自C57BL/6初生(naive)小鼠的脾臟細胞被分為二群。一群係以10 μM OT-1胜肽在37°C下刺激90分鐘。這些細胞以羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)在最終濃度為10 μM (CFSEhigh )時在37°C下標記15分鐘。同時，另一群係以OT-1的對照胜肽(SEQ ID NO:14)刺激並以1 μM CFSE (CFSElow )標記。將該二群細胞等量混合，並將2×107 個細胞經由靜脈注射至免疫小鼠。 24小時後，分離來自脾臟的單個細胞，並使用FACSCalibur流式細胞儀及CellQuest Pro軟體分析CFSE強度。專一性滅殺百分比計算如下：專一性滅殺% = [1-(% CFSEhigh /注射前之% CFSEhigh )/(% CFSElow /注射前之% CFSElow )]。EG7 腫瘤模型
腫瘤攜帶小鼠之建立係在抗原融合蛋白免疫注射之前或之後透過皮下注射將EG7細胞接種至小鼠。該EG7腫瘤細胞來源於EL4細胞，其係一種小鼠淋巴瘤細胞株。腫瘤有無之評估係以視覺檢查和觸診進行。用量尺每週測量腫瘤大小三次，當腫瘤體積達到3000 mm3 時犧牲小鼠。腫瘤體積估計如下：腫瘤體積=腫瘤寬度×腫瘤長度×(腫瘤寬度+腫瘤長度)/2。實施例 1 OVA 融合蛋白 之製備及 FcγR 結合
編碼OVA、OVA-FLIPr融合蛋白、或OVA-類FLIPr融合蛋白的DNA被合成、藉由PCR擴增、並選殖至基於pET-22b之載體中以產生pOVA、pOVA-FLIPr、或pOVA-類FLIPr表現質體。其後，利用各該質體轉型大腸桿菌以表現蛋白質。經固定化金屬親和層析純化後，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和西方墨點法驗證重組蛋白之成功製備。
如圖1A所示，重組OVA、OVA-FLIPr融合蛋白、及OVA-類FLIPr融合蛋白可見於考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)染色的聚丙烯醯胺膠體。如圖1B所示，使用抗組胺酸標籤抗體(BioRad CatNo:MCA1396P)依西方墨點法檢測到重組OVA、OVA-FLIPr融合蛋白、及OVA-類FLIPr融合蛋白。
為分析重組OVA-FLIPr融合蛋白及OVA-類FLIPr融合蛋白的功能活性，進行捕捉ELISA以驗證該二種OVA融合蛋白皆直接與FcγR之同型異構體交互作用。如圖2A-2E所示，重組OVA-FLIPr融合蛋白及OVA-類FLIPr融合蛋白可與所有受試的FcγR同型異構體結合，包括FcγRI (圖2A)、FcγRIIa-H131 (圖2B)、FcγRIIb (圖2C)、 FcγRIIIa-V158 (圖2D)、及FcγRIIIa-F158 (圖2E)。相對地，重組OVA與該些FcγR同型異構體之間沒有交互作用。此結果係為二重複孔的平均值±標準誤差(SEM)。這些結果說明本發明之抗原融合蛋白可以直接結合不同的FcγR同型異構體。實施例 2 OVA 融合蛋白之免疫注射增強 OVA 專一性 T 細胞反應
為確認本發明之抗原融合蛋白的FcγR結合活性是否與體內的免疫反應相關，將C57BL/6小鼠隨機分組(每組6隻小鼠)，並且由皮下二次施予10μg之OVA、OVA-FLIPr融合蛋白、或OVA-類FLIPr融合蛋白，間隔為二週。單獨施予PBS之小鼠係作為負控制組。第二次免疫注射一週後採集該免疫小鼠的脾臟細胞並以ELISPOT試驗檢視分泌IFN-γ之CD4+ 及CD8+ T細胞的數量。
如圖3A-3B所示，在未受刺激(僅培養基)或以對照胜肽刺激的所有脾臟細胞中檢測到IFN-γ分泌細胞的背景值。當以OT-2胜肽 (一種CD4+ T細胞抗原決定位(epitope)；圖3A)或OT-1胜肽(一種CD8+ T細胞抗原決定位；圖3B)刺激後，在OVA免疫小鼠的脾臟細胞中觀察到低頻率的IFN-γ分泌細胞。相對地，予以OVA-FLIPr融合蛋白或OVA-類FLIPr融合蛋白免疫注射的小鼠被誘發高頻率的IFN-γ分泌細胞。這些結果說明使用本發明之抗原融合蛋白進行免疫注射能有效誘發抗原專一性T細胞反應。實施例 3 OVA 融合蛋白之免疫注射刺激細胞毒殺性免疫力
為探討本發明之抗原融合蛋白是否刺激細胞毒殺性免疫力而進行體內細胞毒性試驗。將C57BL/6小鼠隨機分組(每組7-8隻小鼠)，並且由皮下二次施予30 μg之OVA、OVA-FLIPr融合蛋白、或OVA-類FLIPr融合蛋白，間隔為二週。單獨施予PBS之小鼠係作為負控制組。其後，透過靜脈內途徑將經高濃度CFSE(CFSEhigh )標記且以OT-1胜肽刺激之脾臟細胞及經較低濃度CFSE(CFSElow )標記且以對照胜肽刺激之脾臟細胞的等量混合物注射至該免疫小鼠。24小時後犧牲該免疫小鼠並以流式細胞技術(flow cytometry)分析細胞毒殺性T淋巴細胞對脾臟中受胜肽刺激脾臟細胞之滅殺。
圖4A顯示來自各組免疫小鼠之受胜肽刺激脾臟細胞的CFSE圖譜。圖4B顯示來自各組免疫小鼠之受胜肽刺激脾臟細胞的專一性滅殺百分比。如圖4A-4B所示，在OVA免疫小鼠觀察到較少量受胜肽刺激脾臟細胞之專一性滅殺。相對地，予以OVA-FLIPr融合蛋白或OVA-類FLIPr融合蛋白免疫注射的小鼠對於受胜肽刺激之脾臟細胞表現出明顯較多的滅殺作用。這些結果說明使用本發明之抗原融合蛋白進行免疫注射能有效刺激抗原專一性細胞毒殺性免疫力。實施例 4 OVA 融合蛋白之免疫注射誘發抗腫瘤反應
為檢視本發明之抗原融合蛋白是否在體內誘發抗腫瘤反應，將C57BL/6小鼠隨機分組(每組6隻小鼠)，並且二次施予10 μg之OVA、OVA-FLIPr融合蛋白、或OVA-類FLIPr融合蛋白，間隔為二週。單獨施予PBS之小鼠係作為負控制組。第二次免疫注射一週後，在小鼠左腹皮下接種經轉染OVA基因且持續產生OVA的5×105 個EG7腫瘤細胞，隨後測量腫瘤體積。
如圖5所示，在予以OVA-FLIPr融合蛋白或OVA-類FLIPr融合蛋白免疫注射的小鼠中腫瘤生長受到抑制。相對地，以OVA免疫的小鼠相比以PBS免疫的小鼠並未表現出腫瘤體積顯著減少。這些結果說明使用本發明之抗原融合蛋白進行免疫注射能有效誘發腫瘤攜帶個體中的抗原專一性抗腫瘤反應。實施例 5 生存素融合蛋白 之製備
依據類似於實施例1所述步驟製備一細胞凋亡(apoptosis)抑制蛋白之生存素(Sur)以及Sur-FLIPr融合蛋白的重組蛋白，並且以SDS-PAGE及西方墨點法進行分析。
如圖6A-6B所示，重組生存素及Sur-FLIPr融合蛋白可見於考馬斯亮藍染色的聚丙烯醯胺膠體。如圖6C-6D所示，使用抗組胺酸標籤抗體依西方墨點法檢測到重組生存素及Sur-FLIPr融合蛋白。實施例 6 生存素融合蛋白之免疫注射增強生存素專一性 T 細胞反應
將C57BL/6小鼠隨機分組(每組6隻小鼠)，並且由皮下二次施予30 μg之生存素或Sur-FLIPr融合蛋白，間隔為二週。單獨施予PBS之小鼠係作為負控制組。第二次免疫注射一週後採集該免疫小鼠的脾臟細胞並以ELISPOT試驗檢視分泌IFN-γ之CD8+ T細胞的數量。
如圖7A-7D所示，在未受刺激(僅培養基)或以RAH對照胜肽刺激的所有脾臟細胞中檢測到IFN-γ分泌細胞的背景值。當以生存素21-29胜肽或生存素57-64胜肽(皆CD8+ T細胞抗原決定位)刺激後，在生存素免疫小鼠的脾臟細胞中觀察到低頻率的IFN-γ分泌細胞。相對地，生存素-FLIPr融合蛋白免疫小鼠被誘發高頻率的IFN-γ 分泌CD8+ T細胞。這些結果說明使用本發明之抗原融合蛋白進行免疫注射能有效誘發抗原專一性T細胞反應。實施例 7 生存素融合蛋白之免疫注射誘發抗腫瘤反應
將經過皮下接種5×104 個EG7腫瘤細胞之C57BL/6小鼠隨機分組(每組9-11隻小鼠)，並且在腫瘤接種後第3天及第10天二次施予30 μg之生存素或Sur-FLIPr融合蛋白。單獨施予PBS之小鼠係作為負控制組。測量腫瘤體積以評估Sur-FLIPr融合蛋白的抗腫瘤活性。
如圖8所示，在予以Sur-FLIPr融合蛋白免疫注射的小鼠中腫瘤生長受到抑制。相對地，以生存素免疫的小鼠相比以PBS免疫的小鼠並未表現出腫瘤體積顯著減少。這些結果說明使用本發明之抗原融合蛋白進行免疫注射能有效誘發抗原專一性抗腫瘤反應。實施例 8 間皮素 融合蛋白之免疫注射增強間皮素專一性 T 細胞反應
依據類似於實施例1所述步驟製備間皮素以及間皮素-FLIPr融合蛋白的重組蛋白(資料未顯示)，該間皮素據報導是一種在如間皮瘤(mesothelioma)及卵巢與胰臟腺癌(adenocarcinoma)之腫瘤中過度表現的蛋白質。將C57BL/6小鼠隨機分組(每組3隻小鼠)，並且由皮下二次施予10 μg之間皮素或間皮素-FLIPr融合蛋白，間隔為一週。單獨施予PBS之小鼠係作為負控制組。第二次免疫注射一週後分離該免疫小鼠的脾臟細胞並施以10 μg/mL間皮素刺激五天，其後依廠商說明書利用ELISA套組(eBioscience)測量分泌至細胞培養基中的IFN-γ、IL-2、IL-5、及IL-17A的含量。
如圖9所示，在以間皮素-FLIPr融合蛋白免疫的小鼠的受刺激脾臟細胞中，輔助性T細胞分泌高含量的促發炎細胞激素，包括IFN-γ、IL-2、IL-5、及IL-17。相對地，在間皮素或PBS免疫小鼠的脾臟細胞中檢測到少量的該些細胞激素。這些結果說明使用本發明之抗原融合蛋白進行免疫注射能有效誘發抗原專一性輔助性T細胞反應。實施例 9 ZE3 融合蛋白 之製備及 FcγR 結合
依據類似於實施例1所述步驟製備ZE3以及ZE3-FLIPr融合蛋白的重組蛋白，並且以SDS-PAGE及西方墨點法進行分析。
如圖10A-10B所示，重組ZE3及ZE3-FLIPr融合蛋白可見於考馬斯亮藍染色的聚丙烯醯胺膠體。如圖10C-10D所示，使用抗組胺酸標籤抗體依西方墨點法檢測到重組ZE3及ZE3-FLIPr融合蛋白。
為分析重組ZE3-FLIPr融合蛋白的功能活性，進行捕捉ELISA以驗證FcγRIIA與該ZE3-FLIPr融合蛋白間的交互作用。如圖11所示，FcγRIIA與重組ZE3-FLIPr融合蛋白之結合係可檢測。相對地，重組ZE3與FcγRIIA之間有微弱交互作用。此結果證明本發明之抗原融合蛋白能直接與FcγR結合。實施例 10 ZE3 融合蛋白 之 免疫注射增強抗體生成
將C57BL/6小鼠隨機分組(每組4隻小鼠)，並且由皮下二次施予10 μg之該ZE3或ZE3-FLIPr融合蛋白，間隔為二週。第一次免疫注射四週後採集該免疫小鼠的血清以便利用ELISA測定抗ZE3之IgG抗體的效價。簡言之，製備血清樣品的3倍連續稀釋液(始於1：33)。將重組ZE3塗覆於96孔盤。使用連結HRP之山羊抗小鼠IgG Fc抗體(ICN Cappel)檢測被結合的IgG。清洗後，加入TMB以進行呈色。使用ELISA測讀儀測量在450 nm的吸光值。ELISA終點效價(end-point titer)定義為產生OD450值為0.2的血清稀釋倍數。除非開始稀釋時(1：33)的OD值小於0.2，否則所有效價均以內插法由滴定曲線獲得。
如圖12所示，在予以ZE3-FLIPr融合蛋白免疫注射的小鼠中觀察到ZE3專一性IgG抗體的優勢生成。相比之下，ZE3免疫小鼠產生較少量的ZE3專一性IgG。此結果說明使用本發明之抗原融合蛋白進行免疫注射能有效誘導抗原專一性抗體之生成。
綜上所述，本發明之抗原融合蛋白相比抗原本身能在一個體引發更強的抗原專一性免疫反應。因此，含有此種抗原融合蛋白的醫藥組合物可應用於開發強效疫苗，例如例如抗腫瘤及抗病毒疫苗。本發明之實施例亦示範一種簡單而直接的增強抗原免疫原性的方法及一種增強個體對抗原的免疫反應的方法。這些方法可以增加疫苗抗原的效力，並且在免疫力低下個體中引起有效的免疫反應。
無。
本技術領域熟習技藝者依據下方對較佳實施例的詳細說明並參酌所附圖式可明白本發明，圖式中： 圖1A係展示經純化之重組蛋白的聚丙烯醯胺(polyacrylamide)膠體影像，該重組蛋白包括卵清蛋白(ovalbumin，OVA)及二種OVA融合蛋白，其係將OVA分別與類甲醯化胜肽受體1抑制蛋白(OVA-FLIPr)或類FLIPr蛋白(OVA-FLIPr-like)融合。 圖1B顯示使用抗組胺酸標籤抗體(anti-His-tag antibody)依西方墨點法(western blotting)偵測該經純化之重組蛋白，包括該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、及該OVA-類FLIPr融合蛋白。 圖2A顯示重組蛋白與FcγRI之結合，該重組蛋白包括該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、及該OVA-類FLIPr融合蛋白。 圖2B顯示重組蛋白與FcγRIIa-H131之結合，該重組蛋白包括該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、及該OVA-類FLIPr融合蛋白。 圖2C顯示重組蛋白與FcγRIIb之結合，該重組蛋白包括該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、及該OVA-類FLIPr融合蛋白。 圖2D顯示重組蛋白與FcγRIIIa-V158之結合，該重組蛋白包括該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、及該OVA-類FLIPr融合蛋白。 圖2E顯示重組蛋白與FcγRIIIa-F158之結合，該重組蛋白包括該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、及該OVA-類FLIPr融合蛋白。 圖3A顯示予以該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、該OVA-類FLIPr融合蛋白、或磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)二次免疫注射之小鼠之脾臟細胞以胜肽刺激後，其中分泌IFN-γ之CD4+ T細胞的頻率。 圖3B顯示予以該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、該OVA-類FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠之脾臟細胞以胜肽刺激後，其中分泌IFN-γ之CD8+ T細胞的頻率。 圖4A顯示予以該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、該OVA-類FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠中經高濃度羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)標記且受OT-1胜肽刺激之脾臟細胞之CFSE圖譜；各圖所示百分比表示一實驗中的專一性殺傷百分比。 圖4B顯示予以該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、該OVA-類FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠中受OT-1胜肽刺激之脾臟細胞之專一性滅殺百分比。 圖5顯示予以該卵清蛋白、該OVA-FLIPr融合蛋白、該OVA-類FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射而後接種EG7腫瘤細胞之小鼠之腫瘤體積估計值。 圖6A係展示經純化之重組生存素的聚丙烯醯胺膠體影像。 圖6B係展示經純化之重組生存素-FLIPr (Sur-FLIPr)融合蛋白的聚丙烯醯胺膠體影像。 圖6C顯示使用抗組胺酸標籤抗體依西方墨點法偵測該經純化之重組生存素。 圖6D顯示使用抗組胺酸標籤抗體依西方墨點法偵測該經純化之重組Sur-FLIPr融合蛋白。 圖7A顯示予以該生存素、該Sur-FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠之脾臟細胞以培養基處理後，其中分泌IFN-γ之CD8+ T細胞的頻率。 圖7B顯示予以該生存素、該Sur-FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠之脾臟細胞以RAH胜肽刺激後，其中分泌IFN-γ之CD8+ T細胞的頻率。 圖7C顯示予以該生存素、該Sur-FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠之脾臟細胞以生存素21-29胜肽刺激後，其中分泌IFN-γ之CD8+ T細胞的頻率。 圖7D顯示予以該生存素、該Sur-FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠之脾臟細胞以生存素57-64胜肽刺激後，其中分泌IFN-γ之CD8+ T細胞的頻率。 圖8顯示接種EG7腫瘤細胞而後以該生存素、該Sur-FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠之腫瘤體積估計值。 圖9顯示予以一重組間皮素、一重組間皮素-FLIPr融合蛋白、或PBS二次免疫注射之小鼠之脾臟細胞以間皮素刺激後，其中輔助性T細胞之促發炎細胞激素分泌量；該細胞激素包括IFN-γ、IL-2、IL-5、及IL-17A。 圖10A係展示茲卡病毒套膜蛋白第三結構域(ZE3)之純化重組蛋白的聚丙烯醯胺膠體影像。 圖10B係展示經純化之重組ZE3-FLIPr融合蛋白的聚丙烯醯胺膠體影像。 圖10C顯示使用抗組胺酸標籤抗體依西方墨點法偵測該經純化之重組ZE3。 圖10D顯示使用抗組胺酸標籤抗體依西方墨點法偵測該經純化之重組ZE3-FLIPr融合蛋白。 圖11顯示重組蛋白與FcγRIIA之結合，該重組蛋白包括該ZE3及該ZE3-FLIPr融合蛋白。 圖12顯示小鼠經過該ZE3或該ZE3-FLIPr融合蛋白二次免疫注射後，其血清中ZE3專一性IgG抗體之效價(titer)。
無。
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<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌
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85 90 95 Gly Glu Ile Asp Ser Ile Tyr Trp Asp 100 105 ＜210＞ 2 ＜211＞ 104 ＜212＞ PRT ＜213＞ 金黃色葡萄球菌 ＜400＞ 2 Phe Phe Ser Tyr Glu Trp Lys Gly Leu Glu Ile Ala Lys Asn Leu Ala 1 5 10 15 Asp Gln Ala Lys Lys Asp Asp Glu Arg Ala Asp Lys Leu Ile Lys Glu 20 25 30 Ala Asp Glu Lys Asn Glu His Tyr Lys Gly Lys Thr Val Glu Asp Leu 35 40 45 Tyr Val Ile Ala Lys Lys Met Gly Lys Gly Asn Thr Ile Ala Val Val 50 55 60 Lys Ile Lys Asp Gly Gly Lys Asn Gly Tyr Tyr Thr Phe Asp Ile Thr 65 70 75 80 Arg Pro Leu Glu Glu His Arg Lys Asn Ile Pro Val Val Lys Asn Gly 85 90 95 Glu Ile Asp Ser Ile Thr Trp Tyr 100 ＜210＞ 3 ＜211＞ 394 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組OVA ＜400＞ 3 Met Gly Ser Ile Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe 1 5 10 15 Lys Glu Leu Lys Val His His Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr Cys Pro 20 25 30 Ile Ala Ile Met Ser Ala Leu Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala Lys Asp 35 40 45 Ser Thr Arg Thr Gln Ile Asn Lys Val Val Arg Phe Asp Lys Leu Pro 50 55 60 Gly Phe Gly Asp Ser Ile Glu Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val Asn Val 65 70 75 80 His Ser Ser Leu Arg Asp Ile Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro Asn Asp 85 90 95 Val Tyr Ser Phe Ser Leu Ala Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr 100 105 110 Pro Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Cys Val Lys Glu Leu Tyr Arg Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Pro Ile Asn Phe Gln Thr Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu 130 135 140 Leu Ile Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn 145 150 155 160 Val Leu Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val 165 170 175 Asn Ala Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Ala Phe Lys Asp Glu 180 185 190 Asp Thr Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro 195 200 205 Val Gln Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala 210 215 220 Ser Glu Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly Thr Met 225 230 235 240 Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu 245 250 255 Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn 260 265 270 Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met 275 280 285 Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr 290 295 300 Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu 305 310 315 320 Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn 325 330 335 Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala 340 345 350 Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys 355 360 365 Ile Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val 370 375 380 Ser Pro Leu Glu His His His His His His 385 390 ＜210＞ 4 ＜211＞ 514 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組OVA-FLIPr融合蛋白 ＜400＞ 4 Met Gly Ser Ile Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe 1 5 10 15 Lys Glu Leu Lys Val His His Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr Cys Pro 20 25 30 Ile Ala Ile Met Ser Ala Leu Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala Lys Asp 35 40 45 Ser Thr Arg Thr Gln Ile Asn Lys Val Val Arg Phe Asp Lys Leu Pro 50 55 60 Gly Phe Gly Asp Ser Ile Glu Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val Asn Val 65 70 75 80 His Ser Ser Leu Arg Asp Ile Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro Asn Asp 85 90 95 Val Tyr Ser Phe Ser Leu Ala Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr 100 105 110 Pro Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Cys Val Lys Glu Leu Tyr Arg Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Pro Ile Asn Phe Gln Thr Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu 130 135 140 Leu Ile Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn 145 150 155 160 Val Leu Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val 165 170 175 Asn Ala Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Ala Phe Lys Asp Glu 180 185 190 Asp Thr Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro 195 200 205 Val Gln Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala 210 215 220 Ser Glu Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly Thr Met 225 230 235 240 Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu 245 250 255 Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn 260 265 270 Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met 275 280 285 Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr 290 295 300 Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu 305 310 315 320 Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn 325 330 335 Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala 340 345 350 Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys 355 360 365 Ile Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val 370 375 380 Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Ser Tyr Glu Trp Lys Gly Leu Glu Ile Ala Lys Asn Leu 405 410 415 Ala Asp Gln Ala Lys Lys Asp Asp Glu Arg Ile Asp Lys Leu Met Lys 420 425 430 Glu Ser Asp Lys Asn Leu Thr Pro Tyr Lys Ala Glu Thr Val Asn Asp 435 440 445 Leu Tyr Leu Ile Val Lys Lys Leu Ser Gln Gly Asp Val Lys Lys Ala 450 455 460 Val Val Arg Ile Lys Asp Gly Gly Pro Arg Asp Tyr Tyr Thr Phe Asp 465 470 475 480 Leu Thr Arg Pro Leu Glu Glu Asn Arg Lys Asn Ile Lys Val Val Lys 485 490 495 Asn Gly Glu Ile Asp Ser Ile Tyr Trp Asp Leu Glu His His His His 500 505 510 His His ＜210＞ 5 ＜211＞ 513 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組OVA-類FLIPr融合蛋白 ＜400＞ 5 Met Gly Ser Ile Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe 1 5 10 15 Lys Glu Leu Lys Val His His Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr Cys Pro 20 25 30 Ile Ala Ile Met Ser Ala Leu Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala Lys Asp 35 40 45 Ser Thr Arg Thr Gln Ile Asn Lys Val Val Arg Phe Asp Lys Leu Pro 50 55 60 Gly Phe Gly Asp Ser Ile Glu Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val Asn Val 65 70 75 80 His Ser Ser Leu Arg Asp Ile Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro Asn Asp 85 90 95 Val Tyr Ser Phe Ser Leu Ala Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr 100 105 110 Pro Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Cys Val Lys Glu Leu Tyr Arg Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Pro Ile Asn Phe Gln Thr Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu 130 135 140 Leu Ile Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn 145 150 155 160 Val Leu Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val 165 170 175 Asn Ala Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Ala Phe Lys Asp Glu 180 185 190 Asp Thr Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro 195 200 205 Val Gln Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala 210 215 220 Ser Glu Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly Thr Met 225 230 235 240 Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu 245 250 255 Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn 260 265 270 Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met 275 280 285 Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr 290 295 300 Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu 305 310 315 320 Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn 325 330 335 Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala 340 345 350 Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys 355 360 365 Ile Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val 370 375 380 Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Ser Tyr Glu Trp Lys Gly Leu Glu Ile Ala Lys Asn Leu 405 410 415 Ala Asp Gln Ala Lys Lys Asp Asp Glu Arg Ala Asp Lys Leu Ile Lys 420 425 430 Glu Ala Asp Glu Lys Asn Glu His Tyr Lys Gly Lys Thr Val Glu Asp 435 440 445 Leu Tyr Val Ile Ala Lys Lys Met Gly Lys Gly Asn Thr Ile Ala Val 450 455 460 Val Lys Ile Lys Asp Gly Gly Lys Asn Gly Tyr Tyr Thr Phe Asp Ile 465 470 475 480 Thr Arg Pro Leu Glu Glu His Arg Lys Asn Ile Pro Val Val Lys Asn 485 490 495 Gly Glu Ile Asp Ser Ile Thr Trp Tyr Leu Glu His His His His His 500 505 510 His ＜210＞ 6 ＜211＞ 151 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組生存素 ＜400＞ 6 Met Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys 1 5 10 15 Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys 20 25 30 Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro 35 40 45 Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu 50 55 60 Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys 65 70 75 80 His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu 85 90 95 Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 100 105 110 Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr 115 120 125 Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp Leu 130 135 140 Glu His His His His His His 145 150 ＜210＞ 7 ＜211＞ 258 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組生存素-FLIPr融合蛋白 ＜400＞ 7 Met Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys 1 5 10 15 Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys 20 25 30 Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro 35 40 45 Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu 50 55 60 Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys 65 70 75 80 His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu 85 90 95 Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 100 105 110 Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr 115 120 125 Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp Leu 130 135 140 Asp Phe Phe Ser Tyr Glu Trp Lys Gly Leu Glu Ile Ala Lys Asn Leu 145 150 155 160 Ala Asp Gln Ala Lys Lys Asp Asp Glu Arg Ile Asp Lys Leu Met Lys 165 170 175 Glu Ser Asp Lys Asn Leu Thr Pro Tyr Lys Ala Glu Thr Val Asn Asp 180 185 190 Leu Tyr Leu Ile Val Lys Lys Leu Ser Gln Gly Asp Val Lys Lys Ala 195 200 205 Val Val Arg Ile Lys Asp Gly Gly Pro Arg Asp Tyr Tyr Thr Phe Asp 210 215 220 Leu Thr Arg Pro Leu Glu Glu Asn Arg Lys Asn Ile Lys Val Val Lys 225 230 235 240 Asn Gly Glu Ile Asp Ser Ile Tyr Trp Asp Leu Glu His His His His 245 250 255 His His ＜210＞ 8 ＜211＞ 312 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組間皮素 ＜400＞ 8 Met Asp Ala Glu Gln Lys Ala Cys Pro Pro Gly Lys Glu Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Asp Glu Asp Leu Ile Phe Tyr Gln Asn Trp Glu Leu Glu Ala Cys 20 25 30 Val Asp Gly Thr Met Leu Ala Arg Gln Met Asp Leu Val Asn Glu Ile 35 40 45 Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Ser Ile Phe Lys His Lys Leu Asp Lys 50 55 60 Thr Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Leu Ile Gln Gln Leu Gly His 65 70 75 80 Phe Phe Arg Tyr Val Ser Pro Glu Asp Ile His Gln Trp Asn Val Thr 85 90 95 Ser Pro Asp Thr Val Lys Thr Leu Leu Lys Val Ser Lys Gly Gln Lys 100 105 110 Met Asn Ala Gln Ala Ile Ala Leu Val Ala Cys Tyr Leu Arg Gly Gly 115 120 125 Gly Gln Leu Asp Glu Asp Met Val Lys Ala Leu Gly Asp Ile Pro Leu 130 135 140 Ser Tyr Leu Cys Asp Phe Ser Pro Gln Asp Leu His Ser Val Pro Ser 145 150 155 160 Ser Val Met Trp Leu Val Gly Pro Gln Asp Leu Asp Lys Cys Ser Gln 165 170 175 Arg His Leu Gly Leu Leu Tyr Gln Lys Ala Cys Ser Ala Phe Gln Asn 180 185 190 Val Ser Gly Leu Glu Tyr Phe Glu Lys Ile Lys Thr Phe Leu Gly Gly 195 200 205 Ala Ser Val Lys Asp Leu Arg Ala Leu Ser Gln His Asn Val Ser Met 210 215 220 Asp Ile Ala Thr Phe Lys Arg Leu Gln Val Asp Ser Leu Val Gly Leu 225 230 235 240 Ser Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro Asn Ile Val Asp Leu 245 250 255 Lys Thr Glu Glu Asp Lys Ser Pro Val Arg Asp Trp Leu Phe Arg Gln 260 265 270 His Gln Lys Asp Leu Asp Arg Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile 275 280 285 Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Phe Asn Val Arg Glu Ala Phe Ser 290 295 300 Leu Glu His His His His His His 305 310 ＜210＞ 9 ＜211＞ 436 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組間皮素-FLIPr融合蛋白 ＜400＞ 9 Met Asp Ala Glu Gln Lys Ala Cys Pro Pro Gly Lys Glu Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Asp Glu Asp Leu Ile Phe Tyr Gln Asn Trp Glu Leu Glu Ala Cys 20 25 30 Val Asp Gly Thr Met Leu Ala Arg Gln Met Asp Leu Val Asn Glu Ile 35 40 45 Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Ser Ile Phe Lys His Lys Leu Asp Lys 50 55 60 Thr Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Leu Ile Gln Gln Leu Gly His 65 70 75 80 Phe Phe Arg Tyr Val Ser Pro Glu Asp Ile His Gln Trp Asn Val Thr 85 90 95 Ser Pro Asp Thr Val Lys Thr Leu Leu Lys Val Ser Lys Gly Gln Lys 100 105 110 Met Asn Ala Gln Ala Ile Ala Leu Val Ala Cys Tyr Leu Arg Gly Gly 115 120 125 Gly Gln Leu Asp Glu Asp Met Val Lys Ala Leu Gly Asp Ile Pro Leu 130 135 140 Ser Tyr Leu Cys Asp Phe Ser Pro Gln Asp Leu His Ser Val Pro Ser 145 150 155 160 Ser Val Met Trp Leu Val Gly Pro Gln Asp Leu Asp Lys Cys Ser Gln 165 170 175 Arg His Leu Gly Leu Leu Tyr Gln Lys Ala Cys Ser Ala Phe Gln Asn 180 185 190 Val Ser Gly Leu Glu Tyr Phe Glu Lys Ile Lys Thr Phe Leu Gly Gly 195 200 205 Ala Ser Val Lys Asp Leu Arg Ala Leu Ser Gln His Asn Val Ser Met 210 215 220 Asp Ile Ala Thr Phe Lys Arg Leu Gln Val Asp Ser Leu Val Gly Leu 225 230 235 240 Ser Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro Asn Ile Val Asp Leu 245 250 255 Lys Thr Glu Glu Asp Lys Ser Pro Val Arg Asp Trp Leu Phe Arg Gln 260 265 270 His Gln Lys Asp Leu Asp Arg Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile 275 280 285 Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Phe Asn Val Arg Glu Ala Phe Ser 290 295 300 Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Ser Glu Phe Phe Phe Ser Tyr Glu Trp Lys Gly Leu Glu Ile Ala Lys 325 330 335 Asn Leu Ala Asp Gln Ala Lys Lys Asp Asp Glu Arg Ile Asp Lys Leu 340 345 350 Met Lys Glu Ser Asp Lys Asn Leu Thr Pro Tyr Lys Ala Glu Thr Val 355 360 365 Asn Asp Leu Tyr Leu Ile Val Lys Lys Leu Ser Gln Gly Asp Val Lys 370 375 380 Lys Ala Val Val Arg Ile Lys Asp Gly Gly Pro Arg Asp Tyr Tyr Thr 385 390 395 400 Phe Asp Leu Thr Arg Pro Leu Glu Glu Asn Arg Lys Asn Ile Lys Val 405 410 415 Val Lys Asn Gly Glu Ile Asp Ser Ile Tyr Trp Asp Leu Glu His His 420 425 430 His His His His 435 ＜210＞ 10 ＜211＞ 115 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組ZE3 ＜400＞ 10 Met Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr 1 5 10 15 Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln 20 25 30 Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val 35 40 45 Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro 50 55 60 Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp 65 70 75 80 Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys 85 90 95 Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Leu Glu His His His 100 105 110 His His His 115 ＜210＞ 11 ＜211＞ 239 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 重組ZE3-FLIPr融合蛋白 ＜400＞ 11 Met Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr 1 5 10 15 Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln 20 25 30 Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val 35 40 45 Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro 50 55 60 Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp 65 70 75 80 Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys 85 90 95 Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Lys Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Phe Phe 115 120 125 Ser Tyr Glu Trp Lys Gly Leu Glu Ile Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gln 130 135 140 Ala Lys Lys Asp Asp Glu Arg Ile Asp Lys Leu Met Lys Glu Ser Asp 145 150 155 160 Lys Asn Leu Thr Pro Tyr Lys Ala Glu Thr Val Asn Asp Leu Tyr Leu 165 170 175 Ile Val Lys Lys Leu Ser Gln Gly Asp Val Lys Lys Ala Val Val Arg 180 185 190 Ile Lys Asp Gly Gly Pro Arg Asp Tyr Tyr Thr Phe Asp Leu Thr Arg 195 200 205 Pro Leu Glu Glu Asn Arg Lys Asn Ile Lys Val Val Lys Asn Gly Glu 210 215 220 Ile Asp Ser Ile Tyr Trp Asp Leu Glu His His His His His His 225 230 235 ＜210＞ 12 ＜211＞ 8 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ OT-1胜肽 ＜400＞ 12 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 ＜210＞ 13 ＜211＞ 17 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ OT-2胜肽 ＜400＞ 13 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg ＜210＞ 14 ＜211＞ 9 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ RAH胜肽 ＜400＞ 14 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 ＜210＞ 15 ＜211＞ 15 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ OT-2胜肽的對照胜肽 ＜400＞ 15 Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser 1 5 10 15 ＜210＞ 16 ＜211＞ 9 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 生存素21-29 ＜400＞ 16 Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu 1 5 ＜210＞ 17 ＜211＞ 8 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 生存素57-64 ＜400＞ 17 Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu 1 5

Claims (12)

  1. 一種醫藥組合物，係包含一抗原融合蛋白，其中該抗原融合蛋白包含一抗原及一選自於由一類甲醯化胜肽受體1抑制蛋白(formyl peptide receptor-like 1 inhibitory protein，FLIPr)及一類FLIPr蛋白所組成群組之Fcγ受體拮抗分子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該抗原係為一源自癌細胞或病毒的多胜肽。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之醫藥組合物，其中該多胜肽係選自於由生存素、間皮素、及茲卡病毒套膜蛋白第三結構域所組成的群組。
  4. 一種增強一抗原的免疫原性的方法，係包含將該抗原與一選自於由一類甲醯化胜肽受體1抑制蛋白(formyl peptide receptor-like 1 inhibitory protein，FLIPr)及一類FLIPr蛋白所組成群組之Fcγ受體拮抗分子相連接以形成一抗原融合蛋白。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該抗原係為一源自癌細胞或病毒的多胜肽。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該多胜肽係選自於由生存素、間皮素、及茲卡病毒套膜蛋白第三結構域所組成的群組。
  7. 一種抗原融合蛋白用於製備增強個體對一抗原的免疫反應的醫藥組合物的用途，其中該抗原融合蛋白包含該抗原及一選自於由一類甲醯化胜肽受體1抑制蛋白(formyl peptide receptor-like 1 inhibitory protein，FLIPr)及一類FLIPr蛋白所組成群組之Fcγ受體拮抗分子。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該抗原係為一源自癌細胞或病毒的多胜肽。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該多胜肽係選自於由生存素、間皮素、及茲卡病毒套膜蛋白第三結構域所組成的群組。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該免疫反應包含CD4+T細胞、CD8+ T細胞、或其組合之增加。
  11. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該免疫反應包含一選自於由干擾素-γ、介白素-2、介白素-5、介白素-17A、及其組合所組成群組之細胞激素之分泌。
  12. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該免疫反應包含一抗原專一性免疫球蛋白G抗體之生成。
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