TWI650121B - 化合物用於製備Ｔａｕ蛋白病變類疾病之醫藥組成物上之用途 - Google Patents

化合物用於製備Ｔａｕ蛋白病變類疾病之醫藥組成物上之用途 Download PDF

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Abstract

本發明係提供一種化合物用於製備Tau蛋白病變類疾病之醫藥組成物上之用途，尤指一種化合物用於製備阿茲海默症之醫藥組成物上之用途。該化合物具有抑制GSK-3β能力，並可避免神經細胞中之Tau蛋白過度磷酸化或聚集。

Description

化合物用於製備Tau蛋白病變類疾病之醫藥組成物上之用途
本發明係有關於一種化合物用於製備Tau蛋白病變類疾病之醫藥組成物上之用途，尤指一種化合物用於製備阿茲海默症之醫藥組成物上之用途。
阿茲海默症的罹患機率隨者年齡的增長而增加，又因為全球老年人口的數量增加以及飲食習慣的負面變化，因此全球罹患阿茲海默症的人數逐漸增長。罹患阿茲海默症的原因及機制尚未有明確的答案，然有多種假說，包括膽鹼性假說、β類澱粉蛋白質假說、以及Tau蛋白異常沈積等假說。其中最為可信的假說為Tau蛋白異常沈積。在這個假說中，由於激酶以及磷酸酶之間的不平衡(Martin et al.,2013.Lessons learnt from glycogen synthase kinase 3 inhibitors development for Alzheimer’s disease.Curr.Top.Med.Chem.13,1808-1819)，而產生了過度磷酸化的Tau蛋白，過度磷酸化的Tau蛋白開始與其他Tau蛋白配對結合，並於細胞中形成了神經纖維糾結，瓦解了神經細胞內的微管結構，導致神經細 胞內運送系統崩壞，進而導致神經細胞的死亡。
過度磷酸化Tau蛋白質的產生係與肝醣合成酶激酶-3β(GSK-3β)最為相關，GSK-3β係磷酸化Tau蛋白質主要的激酶，因此，抑制GSK-3β可緩解Tau蛋白質的聚集，為治療阿茲海默症的主要目標。
目前已有多種GSK-3β激酶抑制劑被發現，並使用於治療阿茲海默症之細胞或動物模式，例如文獻(Phukan et al.,2010.GSK3β：Role in therapeutic landscape and development of modulators.Br.J.Pharmacol.160,1-19)已揭露了數種GSK-3β抑制劑。然而，目前尚未有具有療效之GSK-3β抑制劑通過人體試驗，應用於臨床病人之治療。
因此，目前急需發展出對於治療阿茲海默症有更佳療效之具有抑制GSK-3β能力之藥劑作為治療藥劑，以避免神經細胞中之Tau蛋白過度磷酸化。
為解決上述之問題，本發明之主要目的係提供一種化合物用於製備Tau蛋白病變類疾病之醫藥組成物之用途，俾能治療如阿茲海默症等由於Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集所致之疾病。
為了達成上述目的，本發明提供了一種化合物用於製備Tau蛋白病變類疾病之醫藥組成物上之用途，該化合物之結構 係如下式(I)所式：
於本發明中，上述式(I)所示之化合物於該醫藥組成物中之濃度並無特別的限制，可依實際使用的狀態而定，例如可依患病的嚴重程度等因素加以調整，使得提供給患者之該醫藥組成物中，包含醫療有效量之式(I)所示之化合物。而於本發明之一實施態樣之醫藥組成物中，式(I)所示之化合物濃度可為1nM至100μM；而於本發明之一較佳實施態樣之醫藥組成物中，式(I)所示之化合物濃度可為10nM至50μM。
於本發明中，該Tau蛋白病變類疾病可指Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集所導致之神經退化性疾病，尤指於神經元、膠質細胞、或路易體中有Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集所致之神經退化性疾病，舉例而言，為阿茲海默症、額顳葉失智症(皮克症；Pick’s disesase)、進行性核上神經麻痺症、拳擊員失智症、萊克-巴迪症(複合型巴金森失智症；Lytico-Bodig disease)、纏結主導型失智症、嗜銀顆粒症、神經結膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、亞急性硬化性白質腦炎、鉛腦部病變、節結性硬化症、哈-斯二氏症(Hallervorden-Spatz disease)、及脂褐質儲積症。其中係 以阿茲海默症及額顳葉失智症為最常見之Tau蛋白病變類疾病。
根據上文所述，本發明之又一目的係在於提供一種化合物用於製備治療阿茲海默症之醫藥組成物上之用途，該化合物係如式(I)所示：
於本發明中，上述式(I)所示之化合物於該醫藥組成物中之濃度並無特別的限制，可依實際使用的狀態而定，例如可依患病的嚴重程度等因素加以調整，使得提供給患者之該醫藥組成物中，包含醫療有效量之式(I)所示之化合物。而於本發明之一實施態樣之醫藥組成物中，式(I)所示之化合物濃度可為1nM至100μM；而於本發明之一較佳實施態樣之醫藥組成物中，式(I)所示之化合物濃度可為10nM至50μM。
另外，本發明更提供一種化合物用於減少Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集上之用途，該化合物係由下式(I)所示：
於本發明中，式(I)所示之化合物濃度可為1nM至100μM；而於本發明之一較佳實施態樣之醫藥組成物中，式(I)所示之化合物濃度可為10nM至50μM。
於本發明中，於該化合物係透過抑制肝醣合成酶激酶-3β(GSK-3β)之活性，進而降低Tau蛋白過度磷酸化。
再者，於本發明中，式(I)所示之化合物係N-花生四氨基酚(N-arachidonoyl aminophenol)，為一種大麻素受體激動劑AM404，由IUPAC命名法命名為(5Z,8Z,11Z,14Z)-N-(4-羥苯基)-5,8,11,14-二十碳四烯醯胺((5Z,8Z,11Z,14Z)-N-(4-Hydroxyphenyl)icosa-5,8,11,14-tetraenamide)。
於本文中「降低」、「減少」、「減緩」、或「抑制」之用語，係指將包含本發明之式(I)所示化合物之醫藥組成物，投予患有Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集所致之病症之患者，或有朝上述病症發展傾向之患者，以期達到治療、減輕、減緩、改善此病症或病症之傾向。
為了本發明之用途，上述式(I)所示之化合物所製備 之醫藥組成物，可取決待治療的疾病以及疾病的嚴重程度，選擇藉由經口服、非口服(例如經皮下、硬膜下、靜脈內、肌肉、鞘內、腹膜內、顱內、動脈內、或病灶內投藥)、表面、局部、經直腸、經鼻(例如氣霧劑、吸入劑、或粉劑)、舌下、陰道、或經由植入型藥盒等方式投藥，但不限制於此。
因此，本發明所提供之式(I)所示之化合物可透過任何一種習知的製藥程序以製備Tau蛋白病變類疾病之醫藥治療用藥或保健食品。因此，依據使用方式或需求，本發明所製備之醫藥組成物包括式(I)所示之化合物外，更包括一或多個醫藥上可接受之載體、稀釋劑、或賦形劑。
舉例而言，當該醫藥組成物可調配成固體或液體形式。而當醫藥組成物為固態形式時，可使用的固體賦形劑可包括粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、以及栓劑等；固體形式之醫藥組成物可更包括固體調配物，如調味劑、黏合劑、防腐劑、崩解劑、助流劑、以及填料等，但不限於此。另外，液態形式的醫藥組成物中所使用之液態賦形劑可包括水、溶液、懸浮液、以及乳劑等；液態形式之醫藥組成物亦可更包括液態調配物，如著色劑、調味劑、分散劑、抗菌劑、及穩定劑等，但不受限於此。
於本文中「醫療有效量」之用語，係指所投予之醫藥組成物中，式(I)所示化合物之活性成分足以誘發所需醫藥或醫療效力時的含量。決定醫療有效量時，可由本領域之技術人員(如醫師、藥劑師)，考量各種因素，如患者之體型、年齡、性別、身 體健康狀態、所涉及之特定疾病、所涉及之特定疾病之程度或嚴重性、患者的反應、投藥模式、療程、並用之藥物、或其他相關之條件而決定。
於本文中「治療」之用語係指得到所需之醫藥與生理效力。該效力可為預防或部分預防疾病、其症狀或病症之預防方法、部分或完全治癒疾病、或因疾病造成之症狀或不良反應之治療法。本文中「治療」之用語係涵蓋哺乳動物，特別為人類疾病之治療，且包括針對有罹患疾病傾向但尚未診斷出疾病之預防；抑制疾病，亦即壓制或降低疾病或其臨床症狀之發展；或緩解疾病，即緩解疾病及/或其症狀之用途。
圖1係本發明一較佳實施例之抑制GSK-3β之活性評估分析圖。
圖2係本發明一較佳實施例之神經突的量化分析圖。
圖3a係本發明一較佳實施例之HSPB1以及GRP78的表現量分析結果圖。
圖3b係本發明一較佳實施例之HSPB1以及GRP78的表現量量化分析圖。
圖4a係本發明一較佳實施例之總GSK-3β及磷酸化GSK-3β表現量分析結果圖。
圖4b係本發明一較佳實施例之總GSK-3β及磷酸化GSK-3β表現 量量化分析圖。
圖5a係本發明一較佳實施例之總Tau蛋白以及磷酸化Tau蛋白表現量分析結果圖。
圖5b係本發明一較佳實施例之總Tau蛋白以及磷酸化Tau蛋白表現量量化分析結果圖。
圖6a係本發明一較佳實施例之果蠅背部剛毛型態圖。
圖6b係本發明一較佳實施例之果蠅背部剛毛數量分析圖。
圖7係本發明一較佳實施例之神經元細胞數量以及神經突生長量的量化分析圖。
圖8係本發明一較佳實施例中，小鼠體重變化以及血糖變化示意圖。
圖9a係本發明一較佳實施例中，小鼠游泳速率分析圖。
圖9b係本發明一較佳實施例中，四個訓練日中小鼠的逃逸潛伏期量化分析圖。
圖9c係本發明一較佳實施例中，測試試驗中小鼠的逃逸潛伏期量化分析圖。
圖9d係本發明一較佳實施例中，小鼠在目標象限中停留的時間量化分析圖。
圖10a係本發明一較佳實施例中，小鼠之海馬迴組織中，總GSK-3β、磷酸化GSK-3β、總Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白之表現量分析圖。
圖10b係本發明一較佳實施例中，小鼠之海馬迴組織中，總 GSK-3β及磷酸化GSK-3β相對表現量之量化分析圖。
圖10c係本發明一較佳實施例中，小鼠之海馬迴組織中，總Tau蛋白及磷酸化Tau蛋白相對表現量之量化分析圖。
圖11係本發明一較佳實施例中，小鼠血漿中IL-6以及TNF-α之濃度量化分析圖。
[統計分析]
以下數據皆以平均值±標準差(SD)來表示，各實驗皆分別執行3次獨立實驗，並利用學生t試驗(Student’s t-test)分析比較未分類之變異量，所有P值皆為雙尾(two-tailed)且P<0.05表示具有顯著差異。
[抑制GSK-3β之活性評估]
以下進行式(I)所示之化合物(下文中以化合物(I)表示)以及SB216763如下式(II)所示之化合物(下文中以化合物(II)表示)對於抑制GSK-3β之活性評估，其中化合物(II)為已知之GSK-3β抑制劑(購自Sigma，產品號：S3442)。GSK-3β激酶活性測定係使用ADP-GloTM激酶檢測系統進行檢測。本檢測係使用重組人類GSK-3β(產品號V1991；購自Promega)作為酶，該GSK-3β的受質係來自第一型肝醣合成酶之胜肽(YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQ(pS)EDEEE)，其對應肝醣合成酶的區域係藉由GSK-3β而磷酸化。包含25μM之ATP、0.2mg/ml之GSK-3β 受質、1ng之GSK-3β、以及連續稀釋之化合物(I)或化合物(II)之混合物(25μl)係於30℃下進行反應30分鐘。激酶的活性數據以相對光單元(RLU)以進行測定，相對光單元係直接與ADP的產生量相關。而測定的結果係如圖1所示。
化合物(I)以及化合物(II)對於GSK-3β之半抑制濃度IC50係透過使用SIGMAPLOT軟體來計算。
化合物(II)為已知之GSK-3β抑制劑，其激酶檢測結果顯示其半抑制濃度IC50有效劑量為0.018μM，而化合物(I)之半抑制濃度IC50為5.353μM。另外，當化合物(I)的濃度為0.018μM時，GSK-3β之殘餘活性為69.6±2.0%。因此，經上述評估結果，本發明之化合物(I)具有抑制GSK-3β活性的功效。
[SH-SY5Y tauRD-DsRed細胞培養]
使用經紅螢光標記之Tau蛋白C端重複區域(最長的異構體Tau441之TauRD-Gln244-Glu372)之聚集突變型(△K280)誘導表現之人類神經細胞(SH-SY5Y)。TauRD-DsRed係以四環素(tetracycline)調控，及可藉由添加多西環素(doxycycline)誘導的混合人類巨細胞病毒(CMV)/TetO2啟動子。該些細胞係培養於含有滅 瘟素(blasticidin)(5μg/ml)以及潮黴素(hygromycin)(100μg/ml)之培養液中以篩選細胞。
[神經保護功效之評估]
接著，在6孔盤中每孔種入1×105個SH-SY5Y tauRD-DsRed細胞時，同時添加10μM之全反式視黃酸(all-trans retinoic acid)誘導細胞分化，培養48小時後，接著使用濃度為10μM的剛果紅，以及10μM之化合物(I)進行預處理8小時後，再添加1μg/ml之多西環素(doxycycline；Dox)誘導tauRD-DsRed表現7天後，使用4%之多聚甲醛固定細胞；0.1%之Triton X-100透化(Permeabilize)細胞；並使用3%之BSA終止透化。接著使用初級抗體anti-TUBB3(抗神經元III類β微管)(1：1000稀釋；購自Convance)染色，並接著加入抗兔子Alexa Fluor® 555第二抗體(1：500；購自Molecular Probe)。細胞核係利用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。經溶劑處理或經剛果紅及化合物(I)處理後之細胞中，總神經突的生長係使用MetaXpress之圖像處理分析軟體進行評估。
上述檢測之結果中，經溶劑處理、經剛果紅處理、以及經化合物(I)處理後之細胞螢光顯微影像中，其神經突的量化結果係如圖2所示。其中，係以剛果紅作為正控制組，經剛果紅處理的細胞相對於經溶劑處理的細胞，其神經突生長量為110% vs.100%(p=0.026)，而經化合物(I)處理之神經細胞相對於經溶劑處理的細胞，其神經突生長量為140% vs.100%(p=0.005)。
再者，伴護子(Chaperones)是幫助蛋白質做適當折疊 的分子，故於蛋白折疊不當之中樞神經系統中扮演重要的角色。例如，熱休克27kDa蛋白質1(heat shock 27kDa protein 1；HSPB1)對於澱粉樣蛋白-β(King et al.,2009.The small heat shock protein Hsp27 protects cortical neurons against the toxic effects of β-amyloid peptide.J.Neurosci.Res.87,3161-3175)、α-突觸核蛋白(α-synuclein)(Zourlidou et al.,2004.HSP27 but not HSP70 has a potent protective effect against alpha-synuclein-induced cell death in mammalian neuronal cells.J.Neurochem.88,1439-1448)、以及聚谷氨醯胺(polyglutamine)(Wyttenbach et al.,2002.Heat shock protein 27 prevents cellular polyglutamine toxicity and suppresses the increase of reactive oxygen species caused by huntingtin.Hum.Mol.Genet.11,1137-1151)所引起的毒性可發揮很強的保護作用。另外，如葡萄糖調節蛋白78kDa(glucose-regulated protein 78kDa；GRP78)具有針對阿茲海默症的細胞保護性反應(Hoshino et al.,2007.Endoplasmic reticulum chaperones inhibit the production of amyloid-β peptides.Biochem.J.402,581-589)。因此，本發明檢測了未經多西環素誘導分化、以及經多西環素誘導分化，並分別以10μM之剛果紅及化合物(I)處理之SH-SY5Y tauRD-DsRed細胞中，HSPB1以及GRP78的表現量。
為了檢測HSPB1以及GRP78的表現量，係利用西方墨點分析法(western blotting analysis)進行分析。其方法如下：使用含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、 0.1%SDS、0.5%去氧膽酸鈉、1% Triton X-100、蛋白質分解酶混合物(購自Calbiochem)之蛋白質萃取緩衝液(RIPA buffer)打破上述細胞，以得到總蛋白。取25μg總蛋白於10%之SDS-聚丙烯醯胺膠體進行電泳，並轉漬至硝化纖維膜。阻隔(blocking)降低非專一性抗體抗原結合後，加入DsRed(1：500稀釋；購自Santa Cruz)、HSPB1(1：500稀釋；購自Santa Cruz)、GRP78(1：200稀釋；購自Santa Cruz)抗體，放置於4℃一晚。接著，使用以1：5000稀釋之結合辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)之山羊抗-鼠、山羊抗-兔子、或驢子抗-山羊之IgG抗體(GeneTex)及化學發光受質(購自Millipore)偵測反應複合物。
經上述西方墨點分析法分析HSPB1以及GRP78的表現量結果係如圖3a所示，其量化結果係如圖3b所示。由分析結果顯示，經化合物(I)處理之SH-SY5Y tauRD-DsRed細胞相對於經溶劑處理之細胞，其HSPB1表現量為174% vs.100%，GRP78表現量為189% vs.100%，皆有顯著的提升。
綜合以上之檢測結果，化合物(I)可顯著提升SH-SY5Y tauRD-DsRed細胞神經突的生長量，以及伴護子HSPB1及GRP78的表現量，故證實了化合物(I)確實具有神經保護之功效。
[抑制Tau蛋白磷酸化之評估]
本實施例之細胞培養步驟以及西方墨點分析方法皆與上述實施例相似，然不同在於，本實施例係驗證細胞中磷酸化-GSK-3β(不具活性)之含量以及磷酸化Tau蛋白之含量，以分析化 合物(I)抑制Tau蛋白磷酸化的能力。故於西方墨點分析法中係使用總GSK-3β(1：1000稀釋；購自Cell Signaling)、p-GSK-3β(Ser9)(1：1000稀釋；購自Cell Signaling)、總Tau(1：500稀釋；購自Dako)、p-Tau(Ser202)(1：500稀釋；購自AnaSpec)、p-Tau(Thr231及Ser396)(1：1000稀釋；購自Invitrogen)、β-actin(1：5000稀釋；購自Millipore)、或GAPDH(1：2000稀釋；購自MDBio)抗體，以檢測其於細胞內之表現量。
上述之總GSK-3β及磷酸化GSK-3β表現量之檢測結果係如圖4a所示，其量化分析係如圖4b所示，由結果可明顯指出，化合物(I)確實具有降低SH-SY5Y tauRD-DsRed細胞中GSK-3β的表現量。
另外，總Tau蛋白以及磷酸化Tau蛋白(Ser202、Thr231、及Ser396)表現量之檢測結果係如圖5a所示，其量化分析係如圖5b所示，由結果可明顯得知，經化合物(I)處理之細胞中，其三個磷酸化位點之磷酸化Tau蛋白的表現量皆明顯下降，相對於未經化合物(I)處理之細胞，Ser202位點磷酸化Tau蛋白的表現量為32%-42% vs.100%(p=0.047-0.032)；Thr231位點磷酸化Tau蛋白的表現量為37%-49% vs.100%(p=0.033-0.015)；以及Ser396位點磷酸化Tau蛋白的表現量為54%-78% vs.100%(p=0.021-0.002)。
根據上述實驗結果，化合物(I)確實具有降低SH-SY5Y tauRD-DsRed細胞中Tau蛋白的磷酸化之效果。
綜合以上結果，由於GSK-3β係調控Tau蛋白磷酸化 的關鍵(Engmann and Giese,2009.Crosstalk between Cdk5 and GSK3β：Implications for Alzheimer’s Disease.Front.Mol.Neurosci.2,2)，經化合物(I)處理之細胞中，磷酸化-GSK-3β之含量增加，代表GSK-3β失去活性，推斷可降低細胞內磷酸化Tau蛋白的含量。
[Tau蛋白於動物體內之毒性評估]
將DMSO投予10隻Eq-gal4品系的果蠅做為控制組，以及將DMSO以及25μM及50μM之式(I)化合物投予10隻經過度表現Tau蛋白之基因轉殖果蠅(Eq>Tau)，並觀察其背側剛毛數量(notal bristle)。
請參照圖6a果蠅之背部剛毛型態圖以及圖6b所示之背部剛毛數量圖(**：p<0.01)，實驗結果顯示，未投藥之果蠅(Eq-gal4)一般具有約200根背側剛毛，而投以DMSO的果蠅(Eq-gal4)(控制組)之背側剛毛數量並未有顯著的減少。然而，基因轉殖果蠅(Eq>Tau)經投以DMSO後，其背側剛毛數量有顯著的減少，而投以化合物(I)之基因轉殖果蠅(Eq>Tau)，具有減緩剛毛數量減少的功效。
根據上述實驗結果，可證明化合物(I)於動物體內具有減緩Tau蛋白毒性的功效。
[小鼠海馬迴細胞培養]
取出16至18天大的C57BL/6J小鼠胚胎之海馬迴組織，並分離出初代培養細胞，於體外培養第4及第7天時，加入2μM之阿糖胞苷(cytosine arabinoside)於培養液中，以減少神經膠質細 胞數量。接著，於體外培養第9天，使用10nM之渥曼青黴素(Wortmannin；WT)以及GF109203X(GFX)誘導Tau蛋白過度磷酸化，以模擬阿茲海默症。濃度為0、0.1、0.25、及0.5μM之化合物(I)係於第9天添加至細胞培養液中，培養12小時後收集細胞，並進行NeuN(神經元)以及MAP2(神經突狀態)的免疫染色。
圖7係存活的神經元細胞數量(NeuN相對表現量)以及神經突生長量的量化分析(#：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001)。由實驗結果顯示，WT以及GFX顯著地降低了神經元存活率以及神經突長度，而經化合物(I)處理之細胞則有減緩因WT以及GFX誘導所導致神經元存活率降低以及神經突長度降低的現象，進而表現出顯著的神經保護效果。
[Morris水迷宮實驗]
使用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導之6個月大阿茲海默症基因轉殖鼠3×Tg-AD，使之展現高血糖以加速阿茲海默症的惡化。半數的3×Tg-AD小鼠(n=30)係分別於實驗第1、2、8、及9天以腹腔注射投予STZ(100mg/kg)，此為高血糖小鼠(HBG)，半數的3×Tg-AD小鼠(n=30)則於相同時間以腹腔注射投予溶劑檸檬酸鈉(sodium citrate)(0.1M)，此為正常血糖小鼠(NBG)，再將正常血糖小鼠以及高血糖小鼠分成兩組，分別於實驗第14天至28天係每日以腹腔注射投予0.25mg/kg之化合物(I)以及DMSO溶劑，得到四個組別，分別為NBG-化合物(I)、HBG-化合物(I)、NBG-DMSO、HBG-DMSO，每組n=15，且每一週監控一次小鼠的 體重(BW)及血糖(BG)。
圖8係四組小鼠的體重變化以及血糖變化示意圖，其中*：p<0.05；***：p<0.001，由實驗結果顯示，注射STZ四週後的小鼠其體重有顯著減少，而有無投以化合物(I)對於體重並無特別的影響。另一方面，於注射STZ一週後，順利地提高了HBG-化合物(I)組別小鼠的血糖值。
接著於實驗的第34-42天進行Morris水迷宮實驗，測定上述四組小鼠的學習及記憶能力。首先，於四天的訓練日內每日對小鼠進行4次訓練試驗。將小鼠放置於水中的起點，該起點於不同訓練試驗中會隨機變動，計算小鼠找到隱藏固定平台的時間(逃逸潛伏期；escape latency)，而四個訓練日中的曲線代表了小鼠的學習概況。最後一次訓練試驗後24小時進行三次的測試試驗，並取得小鼠找到隱藏平台的時間，作為空間學習能力獲得結果。於測試試驗48小時後，每一小鼠於無平台泳池內自由游泳60秒，量測小鼠停留在標的象限(原先平台所在之象限)中的時間(duration)當作長期記憶能力的評估。
圖9a係四個訓練日中游泳速率量化分析圖，由圖9a所示之結果，四組小鼠的游泳速率皆無明顯的差異。圖9b係四個訓練日中，四組小鼠的逃逸潛伏期的量化分析圖，該結果顯示具有高血糖小鼠的組別中，投以化合物(I)之HBG-化合物(I)小鼠較投以DMSO之HBG-DMSO小鼠具有較高的學習能力。再者，圖9c係於測試試驗中，各組小鼠的逃逸潛伏期之量化分析圖(**： p<0.05)，圖9d係長期記憶能力的評估(*：p<0.01)，小鼠在目標象限中停留的時間分析圖，由圖中所示的結果可以得知，化合物(I)可減緩高血糖小鼠長期記憶的損害。
[小鼠海馬迴組織之西方墨點分析]
將作完Morris水迷宮實驗之小鼠犧牲，分離其海馬迴組織後，利用西方墨點分析法分析各種蛋白質的表現量。海馬迴組織蛋白質使用BCA assay(Pierce)定量，取25μg的蛋白質以SDS-PAGE分開之後轉印於PVDF膜。轉印完成後，再經過阻斷(blocking)降低非專一性訊號、初級抗體[GSK3β、pS9-GSK3β(未活化型)、pT216-GSK-3β(活化型)、pS202Tau、pS396Tau、pT231Tau、HT7(total Tau)]反應、次級抗體(anti-rabbit、anti-mouse IgG HRP-linked antibody；1：10,000；Amersham Pharmacia Biotech)反應。使用β-actin蛋白質當作內控制組(loading control)。用冷光呈色劑(ECL)偵測抗原-抗體複合物，使用LAS-4000(Fujifilm)予以照相與量化。
上述之檢測結果係如圖10a所示，其分析結果係如圖10b-10c所示，其中*、#：p<0.05；**、##：p<0.01。由圖10b係pT216-GSK-3β/GSK-3β之數據，以及圖10c係pS9-GSK-3β/GSK-3β之數據，可明顯看出，於高血糖小鼠中，pT216-GSK-3β(活化的GSK-3β)表現量上升，而pS9-GSK-3β(未活化的GSK-3β)的表現量下降。接著，圖10c係所示之實驗結果顯示，高血糖小鼠體內的磷酸化Tau蛋白表現量皆有上升的趨勢，而投以化合物(I)之小鼠體內 磷酸化Tau蛋白質表現量皆小於投以DMSO之小鼠的表現量。由此證實，化合物(I)確實具有降低高血糖小鼠中細胞中活化的GSK-3β的表現量，以及降低高血糖小鼠中磷酸化Tau蛋白質的表現量。故有減少Tau蛋白過度磷酸化的效果。
[澱粉樣蛋白-β之免疫組織化學染色分析]
將小鼠予以灌流，取腦組織進行後固定與脫水等程序後，冷凍切片30μm厚度之組織。利用磷酸緩衝液(phosphate buffered saline；PBS)洗三次，每次10分鐘去除包埋膠後，利用3% H2O2去除內生性過氧化物酶。再利用阻隔溶液(blocking solution)作用1小時降低非專一性之抗原反應，加入初級抗體(Aβ40、Aβ42)反應12小時，次級抗體(1：200於阻隔溶液中稀釋，Vector)1小時，進行親和素-生物素化酶復合物(avidin-biotin complex)反應1小時。最後利用DAB-kit(diaminobenzidine；Vector)呈色。所有組織切片染色完後貼附在玻片上，烘乾、脫水、封片後拍照定量(Image Pro Plus)。其量化分析的結果係如表1所示，其中↑、↓：p<0.05；↑↑、↓↓：p<0.01：
由上述結果可得知，將化合物(I)投予高血糖阿茲海默症小鼠，可減少澱粉樣蛋白-β的於小鼠海馬迴中的沉積量。
[GFAP以及Iba1之免疫化學染色分析]
將小鼠予以灌流，取腦組織進行後固定與脫水等程序後，冷凍切片30μm厚度之組織。PBS洗三次，每次10分鐘去除包埋膠後，利用3% H2O2去除內生性過氧化物酶。再利用阻隔溶液(blocking solution)作用1小時降低非專一性之抗原反應，加入初級抗體GFAP(星型膠質細胞)、及Iba1(小膠質細胞)反應12小時，次級抗體(1：200於阻隔溶液中稀釋，Vector)1小時，進行親和素-生物素化酶復合物(avidin-biotin complex)反應1小時。最後利用DAB-kit(diaminobenzidine；Vector)呈色。所有組織切片染色完後貼附在玻片上，烘乾、脫水、封片後拍照定量(Image Pro Plus)。並進行量化分析，以檢測小鼠海馬迴組織中神經炎症。其量化分析的結果係如表2所示，其中↑↑↑、↓↓↓：p<0.001：
由上述結果可得知，將化合物(I)投予高血糖之阿茲海默症小鼠，可減緩小鼠海馬迴組織之神經發炎現象。
[IL-6及TNF-α的含量分析]
另外，更進行了四組小鼠血中周邊炎性細胞因子的含量測試。自小鼠顏面採血，將收集的血漿離心(2,000×g for 20min at 4℃)後，取上清液進行分析。分析採用mouse TNF-α ELISA kit及IL-6 ELISA kit(R&D system)。以ELISA reader偵測OD450nm吸光值，血漿中IL-6及TNF-α濃度以標準曲線內插求得。其測試結果係如圖11所示，其中*：p<0.05，可明顯得知投以化合物(I)之小鼠，不論是正常血糖或高血糖之小鼠，其IL-6及TNF-α的含量皆大幅減少，故可證實化合物(I)具有降低發炎現象之功效。
[小鼠大腦之免疫組織化學染色分析]
本實驗進一步檢測小鼠大腦中有關認知方面的神經元，包括位於中膈膜(medial septum)、布羅卡區的垂直對角帶(vertical diagonal band of Broca)、以及布羅卡區的水平對角帶(horizontal diagonal band of Broca)之膽鹼能神經元(cholinergic neurons)；位於縫合核(Raphe nucleus)之血清素神經元(serotonergic neurons)；以及位於藍斑核(locus coeruleus)之去甲基腎上腺素神經元(noradrenergic neurons)。
將作完Morris水迷宮實驗之小鼠予以灌流，取腦組織進行後固定與脫水等程序後，冷凍切片30μm厚度之組織。PBS洗三次，每次10分鐘去除包埋膠後，利用3% H2O2去除內生性過氧化物酶。再利用阻隔溶液(blocking solution)作用1小時降低非專一性之抗原反應，加入初級抗體(ChAT、TH、5HT)反應12小時，次級抗體(1：200於阻隔溶液中稀釋，Vector)1小時，進行親和素-生物素化酶復合物(avidin-biotin complex)反應1小時。最後利用DAB-kit(diaminobenzidine,Vector)呈色。所有組織切片染色完後貼附在玻片上，烘乾、脫水、封片後拍照定量(Image Pro Plus)。
膽鹼能神經元的數量並無顯著的不同(數據未示)，然而，如表3所示，位於縫合核之血清素神經元(5HT)以及位於藍斑核之去甲基腎上腺素神經元(TH)於高血糖組別中皆有顯著的下降，而化合物(I)可有效維持該些神經元的含量，故化合物(I)確實可展現神經保護之功效。表3中，↑：p<0.05；↑↑↑、↓↓↓：p<0.001。
綜合以上實施數據，本發明所提供之化合物(I)具有抑制GSK-3β活性之功效，並於細胞培養模式中，證實了化合物(I)有效降低Tau蛋白聚集、降低磷酸化Tau蛋白的表現等功效。又於果蠅模式中，證明了可有效降低Tau蛋白之毒性，以及於阿茲海默症小鼠模式中，證實了小鼠於高血糖的情況下，可減緩長期記憶的損害；減少Tau蛋白過度磷酸化的效果；減少澱粉樣蛋白於小鼠海馬迴組織中的沉澱量；以及可減緩小鼠海馬迴組織以及周邊的神經炎症。由於化合物(I)減少Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集的功效，因此化合物(I)對於Tau蛋白病變類疾病，如阿茲海默症或額顳葉失智症等神經退化性疾病，具有抑制、降低疾病或臨床症狀之發展、或緩解疾病以及臨床症狀之效果。

Claims (13)

  1. 一種化合物用於製備Tau蛋白病變類疾病之醫藥組成物上之用途，該化合物之結構係由以下式(I)所示：
    Figure TWI650121B_C0001
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該化合物(I)之濃度係1nM至100μM。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該化合物之濃度係10nM至50μM。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該Tau蛋白病變類疾病係Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集所致之神經退化性疾病。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該Tau蛋白病變類疾病係於神經元、膠質細胞、或路易體中有Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集所致之神經退化性疾病。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該Tau蛋白病變類疾病係阿茲海默症或額顳葉失智症。
  7. 一種化合物用於製備治療阿茲海默症之醫藥組成物上之用途，該化合物之結構係由下式(I)所示：
    Figure TWI650121B_C0002
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中，該化合物之濃度係1nM至100μM。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中，該化合物之濃度係10nM至50μM。
  10. 一種化合物用於減少Tau蛋白過度磷酸化或Tau蛋白聚集上之用途，該化合物之結構係由以下式(I)所示：
    Figure TWI650121B_C0003
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中，該化合物之濃度係1nM至100μM。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中，該化合物之濃度係10nM至50μM。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中，該化合物係透過抑制肝醣合成酶激酶-3β(GSK-3β)之活性，進而降低Tau蛋白過度磷酸化。
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