TWI649085B - 增加骨骼密度之醫藥組合物及其使用方法 - Google Patents

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羅玉翔
廖政豪
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許世源
許元愷
周憲民
楊迪山
莊季璇
林文宏
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國璽幹細胞應用技術股份有限公司
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Abstract

本發明係關於一種增加骨骼密度之醫藥組合物，其包括一富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin,PRF)釋放液及一脂肪幹細胞，該脂肪幹細胞為脂肪間葉幹細胞(Adipose tissue stem cells,ADSC)。

Description

增加骨骼密度之醫藥組合物及其使用方法
本發明是關於一種增加骨骼密度之醫藥組合物及其使用方法，尤其關於一種提供含有富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin,PRF)釋放液及脂肪間葉幹細胞(ADSC)的醫藥組合物，可用來增加骨骼密度，達到預防及治療關節炎的功效。
依據國民營養健康狀況變遷調查報告(NAHSIT 2004-2008)，台灣50歲以上股骨頸男性骨鬆盛行率為10.7%、女性為12.1%，若以在腰椎、股骨頸和前臂至少有一部位符合骨質疏鬆症診斷為定義，前述盛行率男性為22.57%、女性為41.17%。若將那些潛藏人口考慮進去，則國民營養健康狀況變遷調查報告所公布的數據尚有低估之可能性，實際罹患骨質疏鬆症之人數將比統計數據中所列的數目更多。
骨質疏鬆症是一種漸進性疾病，其特徵是骨骼組織的質量和數量異常，進而導致骨骼強度受損和易增加骨折的風險。(Matsumoto et al.,2011)雖然詳細的病理機制還需要更進一步去研究探討，但大致上可將骨質 疏鬆症歸咎於雌性激素的分泌降低，使得原本成骨細胞和破骨細胞之間保持的平衡急劇失衡，造成了骨質疏鬆症的發生。
目前骨質疏鬆症的治療主要是著重在降低骨質耗損速率或是促進新骨質的生成，使用的藥物包括了雙磷酸鹽、降鈣素、雌激素和激素替代療法(HRT)...等。雖然這些藥物現在仍然在臨床上使用以預防或治療骨質疏鬆症，但往往有較大的副作用。例如HRT可以預防骨質疏鬆症，但這些藥物卻會刺激子宮內膜增生，增加罹患子宮內膜癌或乳腙癌的風險。因此目前迫切需要開發用於預防和治療骨質疏鬆的替代方法。
有鑒於此，本發明提供一種增加骨骼密度之醫藥組合物，包括一富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin,PRF)釋放液及一脂肪幹細胞。
本發明亦提供一種醫藥組合物用於製備增加骨骼密度之用途，其中該醫藥組合物包括一富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin,PRF)釋放液及一脂肪幹細胞。
較佳地，該脂肪幹細胞為脂肪間葉幹細胞(Adipose tissue stem cells,ADSC)。
較佳地，該富含血小板纖維蛋白釋放液中的生長因子濃度為Platelet-derived growth factor-AB(PDGF-AB)1738.7±582.24pg/mL，Transforming growth factor beta 1(TGF)405.7±82.9pg/mL，Epidermal growth factor(EGF)17.5±7.5pg/mL，Basic fibroblast growth factor(b-FGF)7.6±3.2pg/mL，Nerve growth factor(NGF)4.0±1.1pg/mL，Insulin-like growth factor-1(IGF-1)787.4±119.6pg/mL，Vascular endothelial growth factor(VEGF)92.0±13.9pg/mL。
較佳地，該組織幹細胞的細胞數為4.8-5.0x105 live cell/mL。
發明內容旨在提供本發明內容的簡化摘要，以使閱讀者對本發明內容具備基本的理解。本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
圖式第1圖~第7圖「富含血小板纖維蛋白釋放液」以「PRFr」做為代號表示。
第1圖為本發明實施例各組別小鼠在注射後體溫變化之觀察結果；第2圖為本發明實施例各組骨質密度結果；第3圖為本發明實施例各組脛骨骨體積百分比；第4圖為本發明實施例各組骨小樑間距；第5圖為本發明實施例各組骨小樑數量； 第6圖為本發明實施例各組血清中鈣濃度；第7圖為本發明實施例各組H&E切片染色圖。
為了使本發明內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
在本說明書中，「富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin,PRF)釋放液」中的生長因子濃度為Platelet-derived growth factor-AB(PDGF-AB)1738.7±582.24pg/mL，Transforming growth factor beta 1(TGF)405.7±82.9pg/mL，Epidermal growth factor(EGF)17.5±7.5pg/mL，Basic fibroblast growth factor(b-FGF)7.6±3.2pg/mL，Nerve growth factor(NGF)4.0±1.1pg/mL，Insulin-like growth factor-1(IGF-1)787.4±119.6pg/mL，Vascular endothelial growth factor(VEGF) 92.0±13.9pg/mL。在本說明書中，「富含血小板纖維蛋白釋放液」為將管中富含血小板纖維蛋白及底部的凝膠分離後移至無菌的離心管中，放置於室溫環境下5小時，過程中釋放出來不含纖維蛋白的液體。
在本說明書中，「脂肪幹細胞」為脂肪間葉幹細胞(Adipose tissue stem cells,ADSC)。細胞數為4.8-5.0x105live cell/mL。
「溶液」(solution)一詞在本說明書係採其廣義定義，包含溶解於液體中的成份及懸浮於液體之成份。
「治療」(treating)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及/或處理骨關節炎之相關病徵(symptom)、次要病徵(secondary disorder)或症狀(condition)，其中是藉由促進軟骨及/或硬骨組織的再生來使罹患或疑似患有相關病徵、疾病或症狀之個體獲得效益。「治療」(treating)一詞於本說明書中亦指應用或投予本發明內容之支架系統至一個體，其係患有骨關節炎之相關病徵、次要病徵或症狀，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及/或降低一或多個骨關節炎之相關病徵、症狀、或次要病徵的發生。骨關節炎之相關病徵、次要病徵及/或症狀包含，但不侷限於，疼痛、腫脹、 活動範圍減小及無法自行活動。在此「治療」(treating)亦可以是施用至患有早期該些病徵或症狀之個體，以降低該個體發展成為骨關節炎之相關病徵、次要病徵及/或症狀的風險。在此「治療」(treating)為可以有效地減少一個或多個病徵或臨床標記。換句話說，在此治療亦可以是降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其係依據本發明內容之方法，能接受本發明內容之支架系統的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性，且可以是任何年齡，例如兒童或成人。
本發明所提供之提供含有富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin,PRF)釋放液及脂肪間葉幹細胞(ADSC)的醫藥組合物，可用來增加骨骼密度，達到預防及治療骨質疏鬆症。
以下實施例係作為示例性之說明，並非用於限制本發明之範疇。
實施例1 富含血小板纖維蛋白(Platelet-Rich Fibrin，PRF)釋放液之製備
1.1兔子血液抽取
抽血前需先將兔子以Zoletil®(Zoletil®50，Virbac，France)50mg/ml及Xylazine(Balanzine®，公源 藥品，臺灣)20mg/ml 1：1混合後之混合液，以0.25ml/kg的劑量肌肉注射進行全身性麻醉。接著將頸部附近的毛髮剃除乾淨，並以10%的碘酒和75%酒精，由內向外擦拭頸部皮膚，進行完整的消毒。
消毒完成後即可使用10ml注射筒搭配22G針頭(DVR-3422，Terumo co，Philippines)，於不加抗凝劑的條件之下，從兔子頸部外頸靜脈血管抽取、採集新鮮血液。
1.2 富含血小板纖維蛋白製備
將抽取出的新鮮兔血立即移至含有clot activator的8.5ml BD Vacutainer®採血管(REF 367988，BD Biosciences，USA)，因為沒有添加抗凝血劑，過程中需以手輕輕搖晃、轉動採血管，避免血液凝固。最後將裝有兔血的採血管500g離心10分鐘，位於採血管底部為紅血球等凝集物及頂部缺乏血小板血漿PPP(Platelet Poor Plasma)中間的富含血小板纖維蛋白稱之為PRF(Platelet Rich Fibrin)。
1.3 富含血小板纖維蛋白釋放液收取
製作富含血小板纖維蛋白完成的採血管以酒精消毒，接著在無菌操作台內，將管中富含血小板纖維蛋白及底部的凝膠分離。接著富含血小板纖維蛋白會移至乾淨且無菌的離心管中，放置於室溫環境下5小時，過 程中釋放出來的液體不含纖維蛋白稱之為富含血小板纖維蛋白釋放液，收集後放置於-20℃冷凍庫中保存。
實施例2 脂肪抽取及幹細胞培養
2.1 小鼠脂肪抽取
選取健康、無任何明顯外傷之小鼠，使用Zoletil®(Zoletil®50，Virbac，France)50mg/ml及Xylazine(Balanzine®，公源藥品，臺灣)20mg/ml 1：1混合後之混合液，各以0.25ml/kg的劑量肌肉注射，將小鼠全身麻醉。接著剃除小鼠腹部的毛髮，並利用10%的碘酒與75%酒精，由內向外擦拭皮膚以完整消毒。
消毒完成的小鼠在無菌的環境下進行脂肪抽取。先將小鼠腹部打開，並夾取脂肪組織於預冷過的PBS內，接著把小鼠腹腔中夾取脂肪組織以PBS清洗三次，去除血液等多餘物質。隨後加入第一型膠原蛋白酶，在室溫下震盪作用一小時後，以500xg離心10分鐘。再將沉澱物打散後以100μm尼龍篩過濾以去除殘餘大塊組織塊，並混合PBS且在500g條件下離心10分鐘。最後去除上清液，取底部細胞進行細胞培養。取出的細胞即為初代脂肪幹細胞，利用含有10%胎牛血清及1X三合一抗生素之α-MEM培養液進行細胞培養。而細胞培養至細胞數量超過1x106顆後即可準備染細胞表面標誌抗體，以進行流式細胞儀篩選。
2.2 脂肪幹細胞之純化
將1x106顆細胞以1倍之0.25% Trypsin-0.02% EDTA全數打下後，收集在15ml離心管中，以1000rpm離心5分鐘。離心完後把離心管中上清液移除，再利用1ml預冷過之PBS將細胞團塊打散，以完整清洗細胞。清洗後再利用1000rpm離心5分鐘，以完整移除管內上清液。
確認細胞完整清洗後，需使用酒精固定細胞，固定前先使用1ml PBS將細胞團塊打散，避免酒精固定時細胞聚集成團塊。接著緩慢加入3ml 70%預冷過的EtOH，於-20℃環境下置放1小時或是在4℃環境中放置一天後，1000rpm離心5分鐘。清除上清液後再加入5mlPBS，且重複動作一次將細胞清洗乾淨。
接著配製1：100iso ab mouse anti human CD34(BD553731，BD Biosciences，USA)、CD45(AB10558，abcam，USA)、CD44(AB119335，abcam，USA)、CD73(BD550738，BD Biosciences，USA)和CD90(BD554895，BD Biosciences，USA)以及用來測試抗體效力之相對應抗體1：100 iso ab mouse IgG CD34(BD553927，BD Biosciences，USA)、CD45(AB172730，abcam，USA)、CD44(BD553927，BD Biosciences，USA)、CD73(BD553927，BD Biosciences， USA)和CD90(BD555746，BD Biosciences，USA)，再分別加30ul抗體至1ml之細胞液當中後，接著使用1ml PBS將離心管中細胞團塊打散，並放置在4℃環境下作用1.5小時。等待過程中，先於避光環境下配製1：100PE goat anti mouse ab(BD550589，BD Biosciences，USA)，完成後加入30ul至1ml細胞液中，並作用30分鐘。待作用完成後，以3000rpm離心10分鐘且移除上清液，最後利用0.5ml PBS將細胞團塊打散後，即可準備使用流式細胞儀(FACScan，Becton Dickinson，USA)進行篩選。
以CD34、CD45、CD44、CD 90等一級抗體辨識間葉幹細胞上之表面抗原，再利用二級抗體FITC及PI螢光標示所屬一級抗體後，之後以流式細胞儀進行細胞分析及純化。所純化出之細胞的CD44、CD90呈現陽性反應，表現的螢光強度分別為48.6%與99.6%；而CD34、CD45則呈現陰性反應，表現的螢光強度分別為0.5%與2.0%，兩者皆低於5%。
細胞利用流式細胞儀篩選後，以預先準備內裝10mlα-MEM培養液之15ml離心管，將流式細胞儀篩選出含有CD90抗體之細胞取回，利用α-MEM培養液內含10%胎牛血清及1X三合一抗生素進行細胞培養。
2.3 脂肪幹細胞培養及細胞計數
在顯微鏡下確認細胞培養至所需的量，且生 長型態正常後，在無菌操作台內利用真空抽吸器，將完成培養之培養皿內的培養液抽出，改加入5mlPBS溶液，並均勻震盪以清洗整個培養皿，最後再用真空抽吸器抽除PBS廢液。
接著加入1ml之1倍0.25% Trypsin-0.02% EDTA，並均勻搖晃使培養皿內細胞均能接觸1倍0.25% Trypsin-0.02% EDTA後，再將培養皿放回37℃，5% CO2培養箱中。1~2分鐘後於顯微鏡下觀察，細胞自培養皿上分離時會呈現圓粒狀，此時需加入等體積含血清之α-MEM培養液中止1倍0.25% Trypsin-0.02% EDTA反應，避免細胞受損。之後再將含有細胞之培養液收集於離心管中，以電動吸管懸浮均勻後，取100μl細胞液與相等體積之0.5% Trypan blue混合染色後，滴於血球計數盤上，並在顯微鏡下進行計數。大約經過1-2個星期，待細胞滿盤或數量達到1×106cell/ml後，即可將脂肪幹細胞全數收下，並貯存於液態氮中保存。
實施例3動物實驗
3.1 實驗分組
實驗所需使用的小鼠包括治療組及對照組共有為7個組分，每組6隻鼠；治療組分別為富含血小板纖維蛋白釋放液(PRFr-IV)、脂肪幹細胞(ADSC-IV)、脂肪幹細胞+富含血小板纖維蛋白釋放液(ADSC+PRFr-IV)以 及脂肪幹細胞+富含血小板纖維蛋白釋放液+骨內注射(ADSC+PRFr-IV-i)組；對照組分別為非手術組(Pos.Control)、卵巢摘除假手術組(SHAM)以及不接受任何治療(Neg.Control)組。16周齡大的ICR小鼠會隨機分配到非手術組、卵巢摘除假手術組(SHAM)及卵巢摘除手術組，非手術組小鼠作為正常對照組，而卵巢摘除手術組中小鼠則分別接受PRF釋放液(PRFr-IV)、脂肪幹細胞(ADSC-IV)、脂肪幹細胞+PRF釋放液(ADSC+PRFr-IV)、脂肪幹細胞+PRF釋放液+骨內注射(ADSC+PRFr-IV-i)以及不接受任何治療(Neg.Control)，另外為了探討卵巢摘除外科手術過程是否會影響小鼠骨質生長，所以把小鼠的背部肌肉劃開，不進行卵巢摘除手術就將切口縫合，為卵巢摘除假手術組。每組小鼠於治療後8週犧牲，採集全身血液且離心以分離出血清，並取下腿骨部位以10%中性福馬林固定之。
3.2 小鼠卵巢摘除手術
先將禁食約8~12小時後的16週齡小鼠從鼠籠中抓出，觀察有無異狀或明顯外傷，接著放置磅秤上測量體重已決定麻醉藥劑量。其後以Zoletil®(Zoletil®50，Virbac，France)50mg/ml及Xylazine(Balanzine®，公源藥品，臺灣)20mg/ml 1：1混合後以肌肉注射進行麻醉，以進行卵巢摘除手術。
將小鼠以尾巴朝向手術者的方向放置在手術台上，並蓋上無菌洞巾。手術刀於小鼠正中間的背上皮膚開一道長約3公分的傷口，挪至左側腎上方肌肉層，劃開並以無齒鑷子夾出卵巢和輸卵管，將手術刀燒紅之後從卵巢後輸卵管交接處將卵巢切下，檢查無持續出血後，把剩餘部分輸卵管歸位，且使用3-0縫線以連續縫法將肌肉層切口縫合。
完成左邊卵巢摘除即可將背部皮膚缺口挪至右側腎上方肌肉層，一樣劃開並以無齒鑷子夾出卵巢和輸卵管，再以燒紅手術刀由卵巢後輸卵管交接處將卵巢切下，檢查無持續出血後，把剩餘部分輸卵管歸位，且使用3-0縫線以連續縫法將肌肉層切口縫合，最後將背部皮膚缺口以間斷縫法將背部皮膚缺口閉合，並擦上碘酒及包紮傷口，即完成小鼠卵巢摘除手術。
3.3 小鼠卵巢摘除假手術
約16週齡小鼠禁食約8~12小時後，依麻醉劑量表以肌肉注射進行麻醉，約8~12小時後的16週齡小鼠從鼠籠中抓出，觀察有無異狀或明顯外傷，接著放置磅秤上測量體重已決定麻醉藥劑量。其後依美國實驗動物學會推薦之Zoletil®(Zoletil®50，Virbac，France)50mg/ml及Xylazine(Balanzine®，公源藥品，臺灣)20mg/ml 1：1混合後以肌肉注射進行麻醉。
將小鼠以尾巴朝向手術者的方向放置在手術台上，並蓋上無菌洞巾。以手術刀在小鼠正中間的背上皮膚開一道長約3公分的傷口，挪至左側腎上方肌肉層，看見卵巢和輸卵管，並檢查過程中有無受損出血後，即使用3-0縫線以連續縫法將肌肉層切口縫合。
完成左邊肌肉層切口縫合，繼續將背部皮膚缺口挪至右側腎上方肌肉層，一樣見卵巢和輸卵管，並檢查過程中有無受損出血後，即使用3-0縫線以連續縫法將肌肉層切口縫合。最後將背部皮膚缺口以間斷縫法將背部皮膚缺口閉合，並擦 上碘酒及包紮傷口，即完成小鼠卵巢摘除假手術。
3.3 幹細胞及富含血小板纖維蛋白釋放液注射
治療前先把培養好的脂肪幹細胞由37℃，5% CO2培養箱中取出，在顯微鏡下確認細胞生長型態正常後，使用1倍0.25% Trypsin-0.02% EDTA將細胞從培養皿上分離下，接著利用PBS清洗細胞，移除多餘的胰蛋白酵素，並以3000rpm離心10分鐘清除廢液。離心後取100μl細胞液與相等體積之0.5% Trypan blue混合染色後，滴於血球計數盤上，並在顯微鏡下計數以確認注射的細胞量。
完成卵巢摘除的小鼠經觀察兩周，確定沒有 因卵巢摘除手術而造成的不良反應，或是任何生理上的疼痛及不適，即可進行治療。
注射時先利用酒精棉花將小鼠的尾部完整消毒，避免細菌感染，接著使用1c.c注射筒搭配26G針頭，抽取離心管中預注射物質，對準小鼠尾根部薦尾靜脈，以每秒10毫升的速度將幹細胞混合液推入，避免瞬間推入幹細胞混和液，使小鼠產生瞬間性凝血現象，造成死亡。注射後的小鼠以酒精棉加壓止血，避免靜脈回血，等確認無任何出血後即可鬆開酒精棉。
3.4 體溫量測
注射後的小鼠以電子體溫計(IB MT200，Microlife，Swiss)量測肛門的溫度，以觀察小鼠有無發燒或劇烈體溫變動現象，以評估注射物質對小鼠是否有強烈的過敏反應。量測時間點為注射後一小時、注射後兩小時及注射後一天、二天、三天、四天共六次。
注射幹細胞及富含血小板纖維蛋白釋放液後的小鼠以電子體溫計(IB MT200，Microlife，Swiss)紀錄其肛門部位溫度變化，以評估幹細胞或富含血小板纖維蛋白釋放液是否會對小鼠造成不良免疫排斥反應，使體溫產生急劇性變化。測量時間分別為注射後一小時、兩小時、一天、兩天、三天、四天，共六個時間點。體溫量測結果紀錄於第1圖。
第1圖治療組小鼠在進行注射後的體溫沒有過於劇烈的變動，與沒有注射的Pos.Control正對照組相比，皆未達到顯著性差異，所以我們由此推斷，注射幹細胞或是富含血小板纖維蛋白釋放液，對小鼠本身沒有產生嚴重的過敏反應。
3.5 不良反應觀察
觀察小鼠在注射幹細胞及富含血小板纖維蛋白釋放液之後，有無產生不良的反應，如：不正常震顫、尾巴部分變白、眼球失去血色...等不正常反應。觀察時間分別為注射後一小時、兩小時、一天、兩天、三天、四天，共六個時間點。結果顯示治療組小鼠在進行注射後的當下，及注射後六個時間點內，皆沒有出現嚴重的震顫發抖及疼痛等不適狀況，進食與飲水狀況也正常，沒有出現任何異狀。因此，注射脂肪幹細胞與注射富含血小板纖維蛋白釋放液，對小鼠免疫排斥的情形不大，不至於造成死亡或是立即性的危害。
實施例4. 骨骼生長評估
4.1小鼠脛骨微電腦斷層掃描
實驗小鼠於8周後犧牲並將鼠脛骨完整取下，去除多餘的肌肉組織後，以10%中性福馬林固定至少一周以上，固定完成的小鼠脛骨樣本以蒸餾水(滅菌沖洗用蒸餾水，產自永豐化學工業公司)沖洗，去除附著在 骨樣本上的殘餘福馬林溶液，利用微電腦斷層掃描儀(Skyscan 1176，Bruker，BelgiumKontich)進行掃描，掃描區域為小鼠的脛骨生長板下方0.9mm處，掃描條件為：(1)能量強度：40kev(2)電流：600uA(3)解析度：9um(4)掃描視野：180度(5)暴露時間：860ms(6)旋轉比例：0.3度/per pic。掃描部位為小鼠左腿脛骨近端生長板下0.5~1.5mm處，分析的項目則包含骨礦物質密度(BMD)、骨體積百分比(BV/TV)、骨小樑間距(Tb.Sp)以及骨小樑數量(Tb.N)共4項。
B MD數值可用來評估生長出來的骨頭是否健康，且具有一般骨頭的功能，BMD數值太低代表骨頭裡面含有的礦物質比例較低，骨質較疏鬆、容易脆弱、易裂。第2圖顯示提升注射次數到四次的治療成效大幅度提高，注射四次的治療組別：PRFr-IV、ADSC-IV、ADSC+PRFr-IV及ADSC+PRFr-IV-i骨礦物質密度分別為0.0662g/cm3、0.0738g/cm3、0.0766g/cm3及0.1016g/cm3，無論是單純使用PRFr組或單獨使用ADSC組，與不治療組Neg.Control比較，皆達到顯著性差異，而將PRFr搭配ADSC組別骨密度更是顯著高於其他組別，達到極顯著差異。
骨體積百分比(BV/TV)屬於一種百分比數值，檢測樣本的BV/TV數值越高時，表示此樣本中骨頭所 佔的比例較高，在整體觀察之下具有較多的骨頭。未經治療的Neg.Control小鼠BV/TV百分比平均為4.895%，代表卵巢摘除後造成小鼠骨量降低，骨小樑數目減少，因而使骨頭間距較正常小鼠更寬。第3圖顯示注射四次的治療組小鼠脛骨內骨量開始有明顯的增加，PRFr-IV、ADSC-IV，BV/TV百分比依序為6.366%與7.0641%，特別是ADSC+PRFr的兩個組別，不論是薦尾靜脈注射ADSC+PRFr-IV或骨內注射ADSC+PRFr-IV-i，BV/TV百分比12.0767%及10.1365%，均達到了極顯著差異。
骨小樑間距(Tb.Sp)數值越高則代表骨耗損情況增加，導致小鼠脛骨樣本中，骨小樑數量較少，或是骨小樑厚度較薄，因而造成腿骨內的骨小樑間距較大。負對照組Neg.Control小鼠在摘除卵巢10周後，小鼠脛骨的平均骨小樑數目較正對照組Pos.Control小鼠標準值低，導致及骨小樑間距較大，且可觀察到明顯骨質流失現象。第4圖顯示注射一次的治療組別(PRFr-IV、ADSC-IV)比起不治療的負對照組小鼠，骨小樑的間距尚未有明顯下降，所以骨小樑間距數值皆未達到顯著差異。注射四次的組別則開始顯現出治療效果，骨小樑間距開始縮小，跟不治療的負對照組比較，皆達到顯著及極顯著差異。
骨小樑數量(Tb.N)是將小鼠腿骨樣本裡設定 一條虛擬線，並計算穿過這條虛擬線中骨小樑的數量，Tb.N數值較低代表了樣本腿骨內的骨小樑平均數目較少，相反的Tb.N數值越高則代表樣本腿骨內的骨小樑平均數目較多。第5圖顯示骨小樑數量平均值有明顯增加，PRFr-IV、ADSC-IV、ADSC+PRFr-IV及ADSC+PRFr-IV-i分別為21.32%、26.66%、120.18%及58.2%。
實施例5. 血清生化檢測
在接受幹細胞及PRFr注射治療後的小鼠，經過8週，體重約25g，予以犧牲，且採集其血液。接著將所抽取到的血液利用3000rpm離心10分鐘，以從血液中採集分離出的血清，最後將各組小鼠之血清送往聯合醫事檢驗所(Union Clinical Laboratory，Taiwan)，利用全自動生化分析儀(ADVIA 1800，SIEMENS，Germany)進行血清中鈣離子及磷離子含量分析。
第6圖顯示Pos.Control正對照組小鼠與SHAM摘除卵巢假手術組小鼠，血清中鈣含量相似，而摘除卵巢的Neg.Control負對照組小鼠，血清中鈣含量則明顯降低許多。因此我們證實，摘除卵巢的小鼠確實出現了骨質疏鬆症的現象，造成血清中鈣離子濃度降低。經過注射四次幹細胞及富含血小板纖維蛋白釋放液的小鼠，血清中鈣離子濃度有顯著性上升，與負對照組比較達到了 顯著性差異。
實施例6. 組織切片染色
完成微電腦斷層掃描分析後的小鼠脛骨以22.5%Formicacid(6274H，MP Biomedicals，Taiwan)和10%Sodium citrate(A0208003001，Acros，USA)1：1混合的脫鈣液進行脫鈣作用。脫鈣後的腿骨樣本從中間對半切開，再以組織修片刀修整後放入包埋盒中，再浸泡於福馬林中保存，並送往農業科技研究院進行後續步驟。包埋盒中固定的組織樣本將脫水，再放入加熱熔解的液狀石蠟中包埋。冷卻後取下凝固的組織石蠟塊，切成大約4μm薄片以製作成組織切片，進行蘇木紫-伊紅染色(H & E stain)，最後在光學顯微鏡下觀察骨骼內部形態。
第7圖指出與沒有治療的組別比較，小鼠骨髓腔內骨小樑數目稀少，特別是生長板下方處，骨髓腔內的骨小樑數目稀疏。而注射四次幹細胞或是富含血小板纖維蛋白釋放液的組別：ADSC-IV、PRFr-IV、ADSC+PRFr-IV及ADSC+PRFr-IV-i四組，骨髓腔內的骨小樑數目與不治療組相比，有明顯較多的現象。其中ADSC+PRFr-IV及ADSC+PRFr-IV-i這兩組的治療成效顯著，在顯微鏡下觀察染色結果，可以發現到骨髓腔內有許多骨小樑分佈。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實 施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

Claims (9)

  1. 一種增加骨骼密度之醫藥組合物，包括一富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin,PRF)釋放液及一脂肪幹細胞；其中該脂肪幹細胞為一脂肪間葉幹細胞(Adipose tissue stem cells,ADSC)；其中該脂肪間葉幹細胞係表現表面抗原CD44+、CD90+、CD34-以及CD45-。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該富含血小板纖維蛋白釋放液中的生長因子濃度為Platelet-derived growth factor-AB(PDGF-AB)1738.7±582.24pg/mL，Transforming growth factor beta 1(TGF)405.7±82.9pg/mL，Epidermal growth factor(EGF)17.5±7.5pg/mL，Basic fibroblast growth factor(b-FGF)7.6±3.2pg/mL，Nerve growth factor(NGF)4.0±1.1pg/mL，Insulin-like growth factor-1(IGF-1)787.4±119.6pg/mL，Vascular endothelial growth factor(VEGF)92.0±13.9pg/mL。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該 脂肪細胞的細胞數為4.8-5.0x105cell/mL。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該富含血小板纖維蛋白釋放液與脂肪幹細胞之比例為1：1-1：2。
  5. 一種醫藥組合物用於製備治療骨質疏鬆之藥物之用途，其中該醫藥組合物包括一富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin,PRF)釋放液及一脂肪幹細胞；其中該脂肪幹細胞為一脂肪間葉幹細胞(Adipose tissue stem cells,ADSC)；其中該脂肪間葉幹細胞係表現表面抗原CD44+、CD90+、CD34-以及CD45-。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該富含血小板纖維蛋白釋放液中的生長因子濃度為Platelet-derived growth factor-AB(PDGF-AB)1738.7±582.24pg/mL，Transforming growth factor beta 1(TGF)405.7±82.9pg/mL，Epidermal growth factor(EGF)17.5±7.5pg/mL，Basic fibroblast growth factor(b-FGF)7.6±3.2pg/mL，Nerve growth factor(NGF)4.0±1.1pg/mL，Insulin-like growth factor-1(IGF-1)787.4±119.6pg/mL，Vascular endothelial growth factor(VEGF)92.0±13.9pg/mL。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該脂肪幹細胞的細胞數為4.8-5.0x105call/mL。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該富含血小板纖維蛋白釋放液與脂肪幹細胞之比例為1：1-1：2。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該用途包含透過靜脈注射及/或骨內注射給予一個體該醫藥組合物連續及/或不連續4天以上。
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CN103272258A (zh) * 2013-05-15 2013-09-04 中国人民解放军第四军医大学 一种新的冻干富血小板纤维蛋白及其制备和应用

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劉元媛等人，Choukroun’s PRF對體外培養人脂肪幹細胞增殖及成骨分化的影響，中國美容醫學，2013年，第22卷第1期，第40-43頁 *
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林思緯等人，幹細胞併合血小板纖維蛋白應用於骨折之修補與再生(II)，社團法人高雄市獸醫師公會會刊，104年，會刊102期 *
林思緯等人，幹細胞併合血小板纖維蛋白應用於骨折之修補與再生(II)，社團法人高雄市獸醫師公會會刊，104年，會刊102期。

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