TWI637058B - 測定多胞胎妊娠之胎兒基因組 - Google Patents

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陳君賜
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Abstract

本發明提供用於在多胞胎妊娠中測定母本及父本單倍型之遺傳的技術。母本遺傳可在其中母體為異型接合且父本遺傳之對偶基因已知(例如父體為同型接合)的基因座處測定。可使用兩種類型之基因座，其中一種類型在第一母本單倍型上出現父本對偶基因，而另一種類型在第二母本單倍型上出現父本對偶基因。父本遺傳可自其中父體為異型接合而母體為同型接合之基因座測定。可量測不同對偶基因在各基因座處之量。該等量之比較(例如使用各對偶基因之分數濃度及截止值)可用於測定單倍型遺傳。單倍型可能與所關注之病狀有關。

Description

測定多胞胎妊娠之胎兒基因組 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2013年3月15日申請，標題為「Determining Fetal Genomes For Multiple Fetus Pregnancies」之美國臨時申請案第61/789,992號的優先權，其全部內容出於所有目的以引用之方式併入本文中。
本申請案與Lo等人標題為「Fetal Genomic Analysis From A Maternal Biological Sample」之共同擁有美國專利公開案第2011/0105353號；及Lo等人標題為「Molecular Testing Of Multiple Pregnancies」之美國專利公開案第US 2013/0059733號相關，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明大體上係關於基於母本樣本來分析胎兒基因組，且更特定言之係關於基於分析母本樣本中之遺傳片段來測定多胞胎妊娠之所有或部分胎兒基因組。
1997年在母本血漿中發現無細胞胎兒核酸為非侵入性產前診斷提供新的可能性(Lo Y M D等人Lancet 1997；350：485-487；及美國專利第6,258,540號)。此技術已快速轉化為其中偵測來源於胎兒之父本遺傳基因或序列的臨床應用，例如用於胎兒性別測定、胎兒RhD狀況 測定、及測定胎兒是否已遺傳有父本遺傳之突變(Amicucci P等人Clin Chem 2000；46：301-302；Saito H et al Lancet 2000；356：1170；及Chiu R W K等人Lancet 2002；360：998-1000)。該領域中之最近進展已使得可能自母本血漿核酸分析來進行胎兒染色體非整倍體(諸如第21對染色體三體症)之產前診斷(Lo Y M D等人Nat Med 2007；13：218-223；Tong Y K等人Clin Chem 2006；52：2194-2202；美國專利公開案2006/0252071；Lo Y M D等人Proc Natl Acad Sci USA 2007；104：13116-13121；Chiu R W K等人Proc Natl Acad Sci USA 2008；105：20458-20463；Fan H C等人Proc Natl Acad Sci 2008；105：16266-16271；美國專利公開案2007/0202525；及美國專利公開案2009/0029377)。
最近顯著進展之另一個區域為使用單分子計數方法(諸如數位PCR)以用於其中母體及父體兩者均攜有相同突變的單基因疾病非侵入性產前診斷。此已藉由母本血漿中之相對突變劑量(RMD)分析來達成(美國專利申請案2009/0087847；Lun F M F等人Proc Natl Acad Sci USA 2008；105：19920-19925；及Chiu R W K等人Trends Genet 2009；25：324-331)。
然而，該等方法使用可能突變之先驗知識來分析基因組之特定部分，且因此可能不識別潛在或不常見突變或遺傳疾病。此外，關於雙胞胎妊娠之接合子型式的資訊已習知地藉由超音波掃描(Chauhan SP等人Am J Obstet Gynecol 2010；203：305-315)或侵入性產前診斷(例如羊水穿刺術)(Chen CP等人Hum Reprod 2000；15：929-934)獲得。
因此，需要提供可使用非侵入性技術識別多胞胎妊娠之所有或部分胎兒基因組的新方法、系統及裝置。
本發明之實施例提供用於在多胞胎妊娠中測定母本及父本單倍 型之遺傳的方法、系統及裝置。母本遺傳可在其中母體為異型接合且父本遺傳之對偶基因已知(例如父體為同型接合)的基因座處測定。可使用兩種類型之基因座，其中一種類型在第一母本單倍型上出現父本對偶基因，而另一種類型在第二母本單倍型上出現父本對偶基因。父本遺傳可自其中父體為異型接合而母體為同型接合之基因座測定。可量測不同對偶基因在各基因座處之量。該等量之比較(例如使用各對偶基因之分數濃度及截止值)可用於測定單倍型遺傳。單倍型可能與所關注之病狀有關。
一些實施例係針對與本文所描述之方法相關的系統及電腦可讀媒體。
可參考以下實施方式及附圖來獲得對本發明實施例之性質及優點的較好理解。
定義
如本發明所用之術語「生物樣本」係指自個體(例如人類，諸如懷孕婦女)取得且含有所關注之一或多種核酸分子的任何樣本。適用於本發明之實踐的樣本包括血漿、血清、血細胞、白血球、網狀紅血球及全血。對一些目的，亦可使用唾液、胸膜液、汗液、腹水、膽液、尿液、胰液、糞便或子宮頸塗片樣本。
術語「基因座(locus)」或其複數形式「基因座(loci)」為在基因組之間具有變異的任何長度之核苷酸(或鹼基對)的位置或位址。
如本文所用，術語「基因座(locus)」或其複數形式「基因座(loci)」為在基因組之間具有變異的任何長度之核苷酸(或鹼基對)的位置或位址。術語「對偶基因」係指在同一實體基因組基因座處之替代性DNA序列，其可或可不導致不同表現型性狀。在具有各染色體之兩個複本(除男性人類個體中之性別染色體之外)的任何特定二倍體生物 中，各基因之基因型包含在該基因座處存在之對偶基因對，其在同型接合子中相同而在異型接合子中不同。生物之群體或物種通常在各個個體中之各基因座處包括多個對偶基因。其中在群體中發現一種以上對偶基因的基因組基因座稱為多形位點。在基因座處之對偶基因變異可量測為在群體中所存在之對偶基因之數量(亦即多形現象之程度)或異型接合子之比例(亦即異型接合性比率)。存在或不存在序列(例如基因)亦視為一種類型之對偶基因變異，因為基因座可包括該序列或不包括該序列。序列(例如RHD基因)之該不存在可例如藉由通常在缺失序列前後出現的序列之連結來識別。如本文所用，術語「多形現象」係指人類基因組中之任何個體間變異，而不管其頻率如何。該等變異之實例包括(但不限於)單核苷酸多形現象、簡單串接重複多形現象、插入-缺失多形現象、突變(可為疾病所致)及複本數量變化。
術語「單倍型」係指在同一染色體或染色體區域上一起傳遞之多個基因座處之對偶基因的組合。單倍型可指少至一對基因座，或指染色體區域，或指整個染色體。
「染色體區域」係指特定染色體之複數個核苷酸位置。染色體區域可為整個染色體或較小子部分。在正常人中，染色體區域將具有兩個單倍型，一個單倍型各自針對該區域所處之染色體的一個複本。染色體區域中之兩個單倍型可相同或不同。
如本發明所用之術語「截止值」或量意謂用於在生物樣本之兩種或兩種以上分類狀態之間判斷例如存在或不存在與特定表現型病狀或疾病、或對表現型病狀或疾病之易感性相關或有關的遺傳序列的數值或量。舉例而言，若參數大於截止值，則將定量資料分入第一分類，或若參數小於截止值，則將定量資料分入不同分類。
10‧‧‧電腦裝置
71‧‧‧I/O控制器
72‧‧‧系統記憶體
73‧‧‧中央處理器
74‧‧‧印表機
75‧‧‧系統匯流排
76‧‧‧監測器
77‧‧‧輸入/輸出端口
78‧‧‧鍵盤
79‧‧‧儲存器件
81‧‧‧外部介面
82‧‧‧顯示配接器
圖1顯示根據本發明之實施例，其中母體為同型接合且父體為異型接合之兩個基因座的一個實例。
圖2為一種用於根據本發明之實施例在多胞胎妊娠之胎兒中測定父本單倍型遺傳的方法200的流程圖。
圖3顯示具有根據本發明之實施例識別之兩種類型基因座的假想父體及母體之單倍型。
圖4A顯示其中兩個胎兒在顯示於圖3中之基因座處均自母體遺傳有單倍型I的一個實例。圖4B顯示當兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型I時，由父體及母體共用之對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中之分數濃度的一個實例計算。
圖5A顯示其中兩個胎兒在顯示於圖3中之基因座處均已自母體遺傳有單倍型II的一個實例。圖5B顯示當兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型II時，由父體及母體共用之對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中之 分數濃度的一個實例計算。
圖6A顯示其中一個胎兒在顯示於圖3中之基因座處已自母體遺傳有單倍型I而一個已遺傳有單倍型II的一個實例。圖6B顯示當一個胎兒已自母體遺傳有單倍型I而另一個胎兒已遺傳有單倍型II時，由父體及母體共用之對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中之分數濃度的一個實例計算。
圖7A顯示在兩個胎兒的母本單倍型遺傳之三種不同情境下，母本特異性對偶基因(B對偶基因)與由父體及母體共用之對偶基因(A對偶基因)的分數濃度。
圖7B展示可如何使用在各資訊性SNP基因座處之個別分數濃度來估計所有特定類型之基因座處的共用對偶基因(A對偶基因)之分數濃度。
圖8為一種用於根據本發明之實施例使用兩種類型之基因座來測定母本單倍型之遺傳的方法800的流程圖。
圖9為一種用於根據本發明之實施例使用一種類型之基因座來測定母本單倍型之遺傳的方法900的流程圖。
圖10A顯示當兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型I且胎兒貢獻不同胎兒DNA百分比時，α型及β型SNP之共用對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中的分數濃度。
圖10B顯示當兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型II時，當胎兒貢獻不同胎兒DNA百分比時，α型及β型SNP之共用對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中的分數濃度。
圖11A顯示當一個胎兒自母體遺傳有單倍型I且另一個胎兒遺傳有單倍型II時，當胎兒貢獻不同胎兒DNA百分比時，α型及β型SNP之共用對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中的分數濃度。
圖11B顯示在三種情境中，使用α及β型SNP之A對偶基因的分數 濃度及此等兩種濃度之比率的表1150。
圖12為一種用於根據本發明之實施例使用兩種類型基因座之值的比率來測定母本單倍型之遺傳的方法1200的流程圖。
圖13為一種根據本發明之實施例在由男性授精之女性(其中母體及父體為異型接合)的兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳的方法1300的流程圖。
圖14A及14B分別顯示對情況1及情況2之預期α/β比率分佈。
圖15為顯示對情況1之染色體4長臂上之染色體片段的RHDO分析的表1500。
圖16為顯示對情況2之染色體4長臂上之染色體片段的RHDO分析的表1600。
圖17顯示可與根據本發明之實施例的系統及方法一起使用的一個實例電腦系統10的方塊圖。
實施例可在多胞胎妊娠中測定母本及父本單倍型之遺傳。父本遺傳可自其中父體為異型接合而母體為同型接合之基因座測定。父本特異性對偶基因之量(例如彼等對偶基因之分數濃度)可用於測定多少胎兒已遺傳有具有父本特異性對偶基因之單倍型。胎兒中父本遺傳之單倍型的知識可用於測定由胎兒遺傳之母本單倍型。
母本遺傳可在其中母體為異型接合而父本遺傳之對偶基因已知(例如父體為同型接合或確定父本遺傳之單倍型)的基因座處測定。可使用兩種類型之基因座。一種類型在第一母本單倍型上出現父本對偶基因，而另一種類型在第二母本單倍型上出現父本對偶基因。可量測不同對偶基因在各基因座處之量。該等量之比較(例如使用各對偶基因之分數濃度及截止值)可用於測定單倍型遺傳。並且，單倍型可能與所關注之病狀有關，其可基於測定所遺傳的為何種父本及/或母本單倍型來確定遺傳或不遺傳。
I. 接合子型式
多重妊娠係指其中懷孕婦女懷有一個以上胎兒之妊娠。雙胞胎妊娠為多重妊娠之最常見形式。雙胞胎妊娠可表徵為單接合子性(一致)及雙接合子性(不一致)。儘管論述主要集中於雙胞胎，但態樣亦可適用於較高胎兒數量。
對存在於母本血漿中之DNA片段的分析在雙胞胎妊娠中更複雜，若該等雙胞胎為雙接合子性(不一致)，則尤其複雜。即使在母本血漿中將特定單倍型或特定疾病有關之多形現象識別為來源於胎兒，但分析者仍面對另一個問題：如何確定是該等胎兒中之兩者均受影響，還是僅一個胎兒受影響。
A. 單接合子性雙胞胎
當懷孕婦女懷有一對單接合子性雙胞胎時，對該等胎兒之遺傳分析可類似於用於分析單胞胎妊娠之遺傳分析。但雙接合子性雙胞胎 之可能性使分析更困難。對分析父本遺傳而言，不存在於母本基因組中之父本對偶基因可用作測定由胎兒遺傳的為何種父本對偶基因的標記。當已知父本對偶基因在父體之特定單倍型上時，可測定胎兒中之至少一者(當單接合子性時兩者)對特定單倍型之遺傳。
對分析母本對偶基因之遺傳而言，需要複雜定量方法，因為不管由胎兒遺傳的為何種母本對偶基因，兩種母本對偶基因將均可在母本血漿中偵測。可比較兩種母本對偶基因在母本血漿中之相對量，且預期由胎兒遺傳之對偶基因以較高濃度存在。在另一個實施例中，比較兩種母本單倍型在母本血漿中之相對量。當DNA在血漿樣本中之量受限時，此相對單倍型劑量方法可提供更精確結果。關於相對單倍型劑量方法之細節可見於美國專利第8,467,976號，其以引用之方式併入。
B. 雙接合子性雙胞胎
若該對雙胞胎為雙接合子性，則兩個胎兒可自父母中之每一者遺傳有相同或不同之對偶基因。在此情境下，需要更複雜遺傳分析來測定由各胎兒遺傳的為何種父本及母本對偶基因。此資訊適用於分析單基因性疾病及其他病狀。
實施例描述用於在多胞胎妊娠中分析胎兒之親本單倍型遺傳的技術。該分析分成父本遺傳之分析及母本遺傳之分析。
II. 對父本遺傳之分析
當已知關於父體之基因型及/或單倍型資訊時，可測定由胎兒遺傳的為何種父本單倍型的。一些實施例提供一種用於藉由識別及量測親本特異性單倍型來測定親本遺傳之方法。
A. 識別父本特異性單倍型
可藉由分析其中母體為同型接合且父體為異型接合之基因座來進行父本遺傳之測定。在該等情況中，在胎兒中之一者或兩者中可自 父體遺傳有胎兒特異性對偶基因。
圖1顯示根據本發明之實施例，其中母體為同型接合且父體為異型接合之兩個基因座的一個實例。此等兩個基因座110、120彼此接近，以使得在單一減數分裂期間此等兩個基因座之間的再結合不太可能。在此實例中，在基因座110處，父本A對偶基因與母本對偶基因相同，而父本B對偶基因不存在於母體中且因此為父本特異性的。類似地，在基因座120處之C對偶基因亦為父本特異性的。
在一個實施例中，可測定父本特異性對偶基因在兩個不同基因座處之狀態。對偶基因之狀態係指關於此等對偶基因是處於同一染色體上還是處於不同同源染色體上的此等對偶基因之關係。在位於同一染色體上之不同基因座處的對偶基因形成單倍型。增加對各父本單倍型分析之特異性基因座的數量可增加在母本血漿中偵測該等父本特異性對偶基因之敏感性，因為可偵測更多父本特異性對偶基因。增加所偵測之父本特異性對偶基因的數量增加推論胎兒之父本遺傳的精確性。
隨後分析母本血漿DNA的此等兩個基因座之父本特異性對偶基因。不同技術可用於在母本血漿中偵測此等父本特異性對偶基因，且此等方法將為熟習此項技術者已知的。此等方法之實例包括(但不限於)聚合酶鏈反應(PCR)、數位PCR、對偶基因特異性DNA定序、引子延長反應、基於質譜之方法及下一代定序。
為測定兩個胎兒是否遺傳有相同父本單倍型，可分析兩種父本單倍型中之每一者的至少一個父本特異性對偶基因。圖1顯示兩種父本單倍型單倍型II及單倍型III。在該實例中，若在母本血漿中偵測到基因座110處之B對偶基因，則意味著胎兒中之至少一者遺傳有父本單倍型單倍型IV。類似地，若在母本血漿中偵測到基因座120處之C對偶基因，則胎兒中之至少一者遺傳有父本單倍型III。在雙胞胎妊娠 中，在母本血漿中存在位於兩種父本單倍型中之每一者上的父本特異性對偶基因指示兩個胎兒已遺傳有不同父本單倍型。若在母本血漿中僅存在基因座110處之父本特異性對偶基因(B對偶基因)但不存在基因座120處之父本特異性對偶基因(C對偶基因)，則兩個胎兒均已遺傳有父本單倍型IV。類似地，若在母本血漿中僅存在基因座120處之父本特異性對偶基因(C對偶基因)但不存在基因座110處之父本特異性對偶基因(B對偶基因)，則兩個胎兒均已遺傳有父本單倍型III。
父本單倍型上之父本特異性對偶基因在母本血漿中的可偵測性可受各胎兒貢獻之DNA分數濃度及偵測各父本特異性對偶基因之敏感性影響。在較低胎兒DNA分數濃度存在下，即使在胎兒已遺傳有父本特異性對偶基因時，在母本血漿中仍可能不偵測到對偶基因。為降低得出胎兒未遺傳有父本單倍型之錯誤結論的機率，可在父本單倍型上分析更大數量之父本的特異性對偶基因。
B. 用於測定父本遺傳之方法
圖2為一種用於根據本發明之實施例在多胞胎妊娠之胎兒中測定父本單倍型遺傳的方法200的流程圖。實施例可在雙接合子性雙胞胎中分析父本遺傳。方法200可使用自懷有一個以上胎兒之女性獲得的生物樣本。生物樣本包括女性及兩個胎兒之無細胞DNA。常常使用的為血液相關之樣本，諸如血漿、血清血細胞、白血球、網狀紅血球或全血。其他樣本類型包括尿液、唾液、陰道分泌物、來自女性生殖道之洗滌液、眼淚及汗液。
生物樣本可以各種方式分析，例如使用數位PCR、定序或其他適合之技術。分析可在基因組中之某些基因座處提供多個對偶基因之計數。舉例而言，可將序列讀數與參考基因組進行比對，且可將該序列中之對偶基因保存在記憶體中。在另一個實施例中，PCR信號可指示包括對應於用於特定基因座及對偶基因之標記探針的DNA片段的多個 孔(或在具有RT-PCR之特定孔中的量)。方法200可藉由電腦系統來進行。
在區塊210處，在第一染色體上識別第一組之一或多個第一基因座。在各基因座處，且父體之第一對偶基因及第二對偶基因為異型接合，且母體之第一對偶基因為同型接合。第一對偶基因處於第一染色體區域(例如整個染色體或僅部分)之第一單倍型上。第二父本單倍型具有第二對偶基因。
如熟習此項技術者應已知的，母體可以多種方式進行基因分型。舉例而言，可分析來自母本細胞之DNA，且可將其中僅偵測到一個對偶基因之基因座識別為同型接合。
父體之第一單倍型可以多種方式測定。在一個實施例中，父體可經基因分型，且單倍型可基於參考單倍型來測定，該參考單倍型可自該父體所對應之特定群體來確定(例如對特定族群確定之參考)。在另一個實施例中，可分析父體之生物樣本以測定第一單倍型。
在區塊220處，在該生物樣本之DNA片段中量測在第一基因座處存在的各別第一對偶基因之第一量。如上所述，第二量可藉由接收序列讀數或PCR讀數(例如對多個孔之顏色信號)的電腦來測定。電腦可測定對應於特定第一基因座之多個DNA片段，且計數具有第二對偶基因之多個該等DNA片段(例如具有特定顏色之孔的數量或具有第二對偶基因之多個比對序列讀數)。
在一些實施例中，分析在計算上使用已獲得之序列資料來進行。適合之技術的選擇包括在US 2011/0105353 A1及US 2013/0059733 A1中提供之技術。作為經由各自基因座定序之替代，使用者可使用特異性探針或PCR引子來測試特定對偶基因。量測可為「選擇性」的，意為實際實體定序步驟及/或自其獲得之序列資料經掩蔽、過濾或以其他方式選擇，以獲得在所關注之單倍型處或周圍及/或在該單 倍型所連接之對偶基因處或周圍的讀數。
在區塊230處，第一量視情況經正規化。在其他實施例中，第一量未經正規化。在一個實施例中，藉由將第一量除以第一基因座處的第二對偶基因之第二量來使該第一量正規化。在另一個實施例中，正規化可藉由將第一量除以第一基因座處DNA片段之總量來進行。該結果可提供第一對偶基因之分數濃度。
隨後將對偶基因在各基因座處之分數濃度計算為對偶基因中之每一者的單獨計數除以所有對偶基因一起之計數。增加生物學(母本)樣本讀數之數量增加評估之精確性。可單獨分析各基因座，且組合結果以達成一致。或者，根據所有基因座處之對偶基因是否與第一單倍型有關而將其計數在一起求和。
在區塊240處，將經正規化之第一量與第一截止值相比較。在其中使用第一量之原始值的一個實施例中，第一截止值可為零(或其他相對較小之非正規化值)，以使得第一對偶基因之任何偵測可指示第一單倍型在母本樣本中之存在。此分析實際上可為更加定性的，因為第一單倍型之存在僅基於一些第一對偶基因之存在而假定，而不知道該第一對偶基因之百分比或其他正規化值。並且，兩個胎兒是否均已遺傳有第一對偶基因為未知的。
在其他實施例中，可設定上限截止值以在一或多個第一對偶基因之偵測可因例如所用生物化學過程(例如定序或PCR)中之錯誤而不正確時避免可造成錯誤陽性的虛假資料。
在區塊250處，基於該比較來測定第一單倍型之遺傳。如上所述，當第一量或經正規化之第一量超過第一截止值時，可確定胎兒中之至少一者已遺傳有第一單倍型。
在一些實施例中，可使用一個以上截止值。該等實例可為在測定第一對偶基因之分數濃度時。若生物樣本中總胎兒DNA百分比及/ 或個別胎兒DNA百分比為已知的，此定量量測允許測定一個胎兒或兩個胎兒是否具有所關注之單倍型。
舉例而言，若分數濃度大於第一截止值，則可將兩個胎兒均識別為已遺傳有單倍型。若分數濃度不顯著大於零(例如小於第二截止值)，則不將兩個胎兒均識別為已遺傳有單倍型。若分數濃度不大於第一截止值但大於第二截止值，則可將胎兒之一確定為已遺傳有第一單倍型而另一個沒有。
在一個具體實例中，假定總胎兒DNA百分比為10%，其中各胎兒貢獻5%。在給出量測之統計學精確性的情況下，第一截止值可介於7%-9%之間，或可為可在5%與10%之間進行判別的任何適合之百分比。在給出量測之統計學精確性的情況下，第二截止值可介於2%-4%之間，或可為可在0%與5%之間進行判別的任何適合之百分比。在一些實施例中，由各胎兒貢獻之個別DNA百分比可不為已知的，但可基於其他樣本之量測值來假定典型範圍。因此，仍可在該等情況下確定截止值。
用於此分析中之截止值可自母本樣本中來自各胎兒之DNA的相對量或百分比來確定。截止值可在不自任一胎兒貢獻對偶基因、自一個胎兒貢獻對偶基因、或自兩個胎兒貢獻對偶基因之間進行判別。在US 2011/0105353 A1及US 2013/0059733 A1中提供其他細節，以提供為各患者或為作為整體之群體設定截止值的更多資訊。
在區塊260處，可為第一染色體區域之第二單倍型重複區塊210-250。舉例而言，可識別一或多個第二基因座，諸如在第二單倍型(圖1中之單倍型III)上具有父本特異性對偶基因的基因座120。可確定胎兒中之至少一者是否已遺傳有第二單倍型。因此，此測定可與測定第一單倍型之遺傳組合。若測定兩個單倍型均遺傳，則一個胎兒遺傳有該等單倍型之一。若測定僅一個單倍型遺傳，則可確定兩個胎兒均遺 傳有相同單倍型。因此，可對兩個胎兒進行關於遺傳之測定。
若測定及使用第一單倍型之分數濃度，則第二單倍型之分數濃度可用於確認自分數濃度及臨界值而測定的第一基因座之遺傳。
因為所遺傳之父本的單倍型得到測定，所以可測定在其中母體為異型接合之基因座處的遺傳對偶基因。關於父本遺傳之對偶基因的此資訊可用於確定胎兒母本單倍型之遺傳。
C. 識別基因座
親本基因組之資料可在分析含有母本及胎兒DNA混合物之生物樣本之前、期間或之後獲得。父本基因組序列可藉由對來自父親之生物樣本進行定序來獲得。母本基因組序列可藉由對妊娠之前取得之另一個生物樣本或基本上不含胎兒DNA之生物樣本(諸如無血組織或毛囊)進行定序來獲得。或者，父親及/或母親基因組之相關部分可藉由對在妊娠期間取得之母本血漿或樣本進行定量評估來推論。
在一些實施例中，任一親代之基因型資訊可隨後藉由與來自其他家族成員(例如目前妊娠同胞胎兒)或來自祖父母之基因型等的基因型資訊比較來擴展為父母單倍型資訊。父母之單倍型亦可藉由熟習此項技術者熟知之其他方法來構造。該等方法之實例包括基於單一分子分析之方法，諸如數位PCR(Ding C及Cantor CR.Proc Natl Acad Sci USA 2003；100：7449-7453；Ruano G等人Proc Natl Acad Sci USA 1990；87：6296-6300)、精子單倍型分析(Lien S等人Curr Protoc Hum Genet 2002；第1章：第1.6單元)及顯像技術(Xiao M等人Hum Mutat 2007；28：913-921)。其他方法包括基於對偶基因特異性PCR之彼等方法(Michalatos-Beloin S等人Nucleic Acids Res 1996；24：4841-4843；Lo YMD等人Nucleic Acids Res 1991；Nucleic Acids Res 19：3561-3567)、選殖及限制酶消化(Smirnova AS等人Immunogenetics 2007；59：93-8)等。又其他方法係基於單倍型域在群體中之分佈及連鎖不平 衡結構(其允許自統計學評估推斷母本單倍型(Clark AG.Mol Biol Evol 1990；7：111-22；10：13-9；Salem RM等人Hum Genomics 2005；2：39-66)。)
用於分析之基因座亦可基於其與特定區域(例如其中單倍型已知或其中存在所關注之遺傳特徵的區域)之接近性而加以選擇。因此，處於其中單倍型已知之區域內的基因座可經選擇。彼此接近之基因座可能與相同單倍型有關，且只要其間不存在染色體交叉即可與單倍型分離。使用者具有增大或減少所分析之染色體區域的選擇權。增大區域增加分析之精確度，因為母本樣本中更多DNA將相關。然而，增大區域亦產生在兩者之間出現交叉事件的風險，在此情況下對偶基因之遺傳無法精確預測單倍型之遺傳。
在一個實施例中，待分析之基因座為導致疾病之基因。在此情境下，所關注之兩個父本對偶基因可為導致疾病之突變及不導致疾病之對偶基因。在另一個實施例中，待分析之基因座為與涉及遺傳疾病之基因有關的多形現象。在此情況下，所關注之兩個父本對偶基因為與突變體基因有關之對偶基因及與正常(亦即非突變體)基因有關之另一個對偶基因。
D. 臨床評估
父本遺傳之體染色體顯性病狀可藉由定位與基因可遺傳病狀相關的為何種父本單倍型來進行評估。此可例如使用數位PCR、染色體分類、家族研究及自群體單倍型資訊推論來進行。隨後可由母本血漿識別與特定單倍型有關之父本特異性疾病。位於在所關注之單倍型上的父本特異性對偶基因在母本樣本(例如母本血漿)中之存在可指示胎兒中之一者或兩者已遺傳有該病狀。
體染色體隱性病狀可根據藉由在母本血漿中識別位於相同父本單倍型上之對偶基因來確定胎兒之一是否已遺傳有該父本單倍型而進 行評估。與疾病有關之對偶基因的偵測可指示至少一個胎兒已遺傳有疾病相關之父本單倍型。因此，第一對偶基因中之一或多者及/或第二對偶基因中之一或多者與所關注之表現型有關。並且，所關注之表現型可為疾病或疾病易感性。
III. 對母本遺傳之分析
因為母本來源之DNA構成母體血漿中DNA之大部分，所以對妊娠中之多胞胎進行的母本遺傳分析較複雜。胎兒來源之DNA代表較小分數(例如約10%)，該分數為雙胞胎妊娠中來自兩個胎兒之DNA的組合。相應地，如下所述使用定量方法來區分及表徵胎兒DNA。
A. 相對單倍型劑量(RHDO)分析
對RHDO分析而言，本發明之一個實施例為集中於母體為異型接合且父體為同型接合的基因座之類別。此消除必須同時分析母本及父本對偶基因兩者之必要性。因此將同型接合之SNP定義為用於RHDO分析之資訊性。
圖3顯示具有根據本發明之實施例識別之兩種類型基因座的假想父體及母體之單倍型。僅顯示其中母體為異型接合且父體為同型接合之基因座。在此圖示中，識別此等資訊性基因座之兩個對偶基因(例如單核苷酸多形現象(SNP))。亦可使用其他類型之多形現象，例如微衛星多形現象。儘管部分論述可能係指SNP，但可使用其他類型之多形現象(變異)。
作為RHDO分析之一部分，SNP可分成兩種類型，α型及β型。α型SNP為其中父本對偶基因與位於單倍型I上之母本對偶基因一致的SNP基因座，而β型SNP為其中父本對偶基因與位於單倍型II上之母本對偶基因一致的SNP基因座。因為單倍型I及單倍型II之指定為任意的，所以單倍型I及單倍型II之界定在分析之前可互換。
在此實例中，因為父體在基因座處為同型接合，所以單倍型III 及單倍型IV一致。然而，在其他實施例中，父體不為同型接合，但父本遺傳之對偶基因例如藉由測定所遺傳之父本單倍型而已知。
在雙接合子性雙胞胎妊娠中，母本單倍型之遺傳存在三種可能性：‧兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型I(圖4A)；‧兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型II(圖5A)；‧一個胎兒已自母體遺傳有單倍型I且一個已遺傳有單倍型II(圖6A)。
圖4A顯示與圖3中相同的母體及父體之單倍型。兩個胎兒均顯示已自母體遺傳有單倍型I。各胎兒之另一個單倍型對應於單倍型III或單倍型IV之一，因為兩者在所顯示之基因座處等效。
圖4B顯示當兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型I時，由父體及母體共用之對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中之分數濃度的一個實例計算。假定各胎兒貢獻母本血漿中總DNA之10%，且母體貢獻總血漿DNA之80%。對α型SNP，B對偶基因僅存在於母本基因組中。因此，B對偶基因在母本血漿中之分數濃度為40%，而A對偶基因(在母體與父體之間共用之對偶基因)的分數濃度為60%。對β型SNP，兩個胎兒及母體之A及B對偶基因均為異型接合。因此，A對偶基因在母本血漿中之分數濃度為50%。
圖5B顯示當兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型II時，由父體及母體共用之對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中之分數濃度的一個實例計算。假定各胎兒貢獻母本血漿中總DNA之10%，且母體貢獻80%。對α型SNP，兩個胎兒及母體之A及B對偶基因均為異型接合。因此，A對偶基因及B對偶基因兩者在母本血漿中之分數濃度均為50%。對β型SNP，B對偶基因僅存在於母本基因組中而不存在於胎兒中。因此，B對偶基因在母本血漿中之分數濃度40%，而A對偶基因之分數 濃度為60%。
圖6B顯示當一個胎兒已自母體遺傳有單倍型I而另一個胎兒已遺傳有單倍型II時，由父體及母體共用之對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中之分數濃度的一個實例計算。假定各胎兒貢獻母本血漿中總DNA之10%且母體貢獻總血漿DNA之80%，α型及β型SNP兩者之A對偶基因的分數濃度均為55%。
B. 預測值與實際分數濃度之比較
以上實例假定胎兒DNA之特定分數濃度。胎兒DNA之分數濃度可藉由若干方法來測定，包括分析胎兒特異性之後生標記及其他基因座處母體與父體之間的多形標記。用於量測兩個雙胞胎在母本血漿中之分數濃度及各胎兒之貢獻的方法描述於US 2013/0059733 A1中。
可對A對偶基因或B對偶基因之一(或兩者)的分數濃度進行統計學分析以區分三種情境。以下論述仍假定為各胎兒貢獻樣品中DNA片段總量之10%的實例。在後一部分中處理其中胎兒貢獻不同胎兒DNA百分比之實施例。
圖7A顯示在兩個胎兒的母本單倍型遺傳之三種不同情境下，母本特異性對偶基因(B對偶基因)與由父體及母體共用之對偶基因(A對偶基因)的分數濃度。在圖7A中，假定兩個胎兒中之每一者貢獻總母本血漿DNA之10%，且假定α型SNP及β型SNP之共用對偶基因(A對偶基因)的預測分數濃度。SNP基因座之A對偶基因的分數濃度可以實驗方式量測，且隨後與預測值相比較以確定何種遺傳模式最可能。
可將所關注之區域內所有相同類型SNP(α或β)之A及B對偶基因的對偶基因計數聚集在一起以計算α型及β型SNP之聚集分數濃度。可自預測值確定聚集分數濃度之偏差。所給出之總偏差最小的模式可推論為雙胞胎中之母本遺傳。
在圖7A中，當一個胎兒已自母體遺傳有單倍型I且另一個已遺傳 有單倍型II時，使用α型及β型SNP測定的共用對偶基因(A對偶基因)之分數濃度將相同。若兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型I，則α型SNP的A對偶基因之分數濃度將高於β型SNP。相反，若兩個胎兒均已遺傳有母本單倍型II，則β型SNP之分數濃度將高於α型SNP。
可比較使用α型及β型SNP的共用對偶基因(A對偶基因)之分數濃度以確定其是否在統計學上不同。舉例而言，若基於α型及β型SNP的共用對偶基因之分數濃度在統計學上並非不同，則一個胎兒已自母體遺傳有單倍型I且一個已遺傳有單倍型II。或者，若α型SNP的共用對偶基因之分數濃度在統計學上顯著高於β型SNP之分數濃度，則兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型I。若α型SNP的共用對偶基因之分數濃度在統計學上顯著低於β型SNP之分數濃度，則其指示兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型II。
在另一個實施例中，可計算α型基因座與β型基因座的分數濃度(或其他量)之比率。此比率可與行710中之比率相比較。
可使用不同統計學檢定來測定α型及β型SNP的共用對偶基因之分數濃度是否顯著不同。此等方法之實例包括(但不限於)順序機率比檢定(SPRT)、學生t檢定、曼-惠特尼秩和檢定(Mann-Whitney rank-sum test)、卡方檢定(Chi square test)。
圖7B展示可如何使用在各資訊性SNP基因座處之個別分數濃度來估計所有特定類型之基因座處的共用對偶基因(A對偶基因)之分數濃度。所有SNP基因座的分數濃度之分佈可隨後經構造，且所量測之分數濃度可自分佈峰值來測定。可進行此統計學分析，而非對所有A對偶基因之計數及所有B對偶基因之計數求和。
相應地，可計算各基因座處之量的個別比率(例如分數濃度)。此等個別比率可隨後用於獲得總體比率(例如總體分數濃度)。因此，個別比率之平均值、中值或其他統計學值(例如分佈峰值)可用於測定可 與截止值相比較之總體比率。
C. 用於使用兩種類型之基因座來測定母本遺傳的流程
在一個實施例中，可在定量過程中使用兩種類型之基因座來測定母本單倍型之遺傳。舉例而言，α型基因座可測定測定兩個胎兒石油已遺傳有相同單倍型。並且，β型基因座可用於測定各胎兒是否遺傳有不同單倍型。
圖8為一種用於根據本發明之實施例使用兩種類型之基因座來測定母本單倍型之遺傳的方法800的流程圖。方法800可在雙接合子性雙胞胎中分析母本遺傳。該分析對自母親獲得之樣本進行，其中該樣本含有母本DNA及來自胎兒中之每一者的胎兒DNA(例如無細胞DNA)。可使用任何生物樣本(例如如本文所定義之生物樣本)，其限制條件為該樣本含有胎兒DNA。如同其他方法，方法800使用電腦系統。
在區塊810處，在第一染色體上識別第一組之一或多個第一基因座。女性在各第一基因座處之各別第一對偶基因及各別第二對偶基因為異型接合。第一母本單倍型具有第一對偶基因，且第二母本單倍型具有第二對偶基因。第一基因座可接近在特定染色體上所關注之遺傳特徵。第一組基因座可對應於描述於本文實例中之α型基因座。
在區塊820處，確定兩個胎兒在第一基因座處自父體遺傳有各別第一對偶基因。在一個實施例中，父體之各別第一對偶基因可測定為同型接合，且因此不管所遺傳的為何種父本單倍型，該等第一對偶基因均將遺傳。父體之此基因分型可使用父本樣本進行。在另一個實施例中，方法200可用於測定所遺傳之父本單倍型。因為父本單倍型確定，所以可確定在第一基因座處的父本遺傳之對偶基因，即使父體在第一基因座處為異型接合亦可。
相應地，若首先測定父本遺傳，則不必需將母本遺傳之分析限 制為其中父體為同型接合且母體為異型接合之基因座。亦可使用其中父母兩者均為異型接合之基因座，因為親本遺傳指示何種父本對偶基因已傳遞至兩個胎兒。基於該資訊，基因座可分類為處於第一組或第二組。
在區塊830處，在第一染色體上識別第二組之一或多個第二基因座。第一母本單倍型在第二組之各第二基因座處具有各別第三對偶基因，且第二母本單倍型具有各別第四對偶基因。第一組基因座可對應於描述於本文實例中之β型基因座。
在區塊840處，確定兩個胎兒在第二基因座處自父體遺傳有各別第四對偶基因。對自父體遺傳第四對偶基因之測定可如上文區塊820所述進行測定。舉例而言，父體在第二基因座之各基因座處之各別第四對偶基因可為同型接合。在另一個實施例中，父體在第二基因座處可為異型接合，但其他基因座可用於使用方法200確定各別第四對偶基因係遺傳自特定父本單倍型，該過程可使用不同組之基因座(例如其中母體為同型接合之基因座)。
在區塊850處，電腦系統在來自女性之生物樣本的DNA片段中量測在第一基因座處存在的各別第一對偶基因之第一量及各別第二對偶基因之第二量。舉例而言，可對DNA片段進行定序以獲得序列讀數，且該等讀數可與參考基因組比對以識別與第一基因座匹配之讀數。具有第一及第二對偶基因之讀數的數量可經計數以分別測定第一及第二量。在其他實施例中，使用如本文所提及或在所併入之文獻中的其他技術。
在區塊860處，電腦系統在生物樣本之DNA片段中量測在第二基因座處存在的各別第三對偶基因之第三量及各別第四對偶基因之第四量。第三及第四量可以與第一及第二量相似之方式計算。
在一些實施例中，該等量可經正規化以例如測定特定對偶基因 之分數濃度。因此，第一量可具有第一對偶基因之DNA片段的計數除以在所有第一基因座處之DNA片段的總數。可以相似方式測定第二量之正規化。可使用在第二基因座處DNA片段之總數來測定第三及第四量之正規化。
在區塊870處，使用四個量來測定母本單倍型在兩個胎兒中之遺傳。在一個實施例中，隨後如下自四個所量測之量來測定母本遺傳：(i)當第一量在統計學上高於第二量且第三量在統計學上等於第四量時，兩個胎兒均已遺傳有第一母本單倍型；(ii)當第一量在統計學上等於第二量且第三量在統計學上高於第四量時，兩個胎兒均已遺傳有第二母本單倍型；或(iii)當第一量在統計學上高於第二量時且當第四量在統計學上高於第三量時，胎兒之一已遺傳有第一母本單倍型且另一個已遺傳有第二母本單倍型。
一個量是否在統計學上較高可藉由使用截止值(例如需要標準差之具體數值)來測定。截止值可視胎兒DNA分數濃度而定，該濃度可僅針對所有胎兒及/或針對個別胎兒計算。
在一個實施例中，第一量可直接與第二量加截止值進行比較。以此方式，當第一量大於第二量加截止值時，可認為兩個量之間的差異在統計學上較高。
在另一個實施例中，自第一量及第二量測定參數(例如差異或比率)，且將該參數與截止值相比較以預見該第一量是否在統計學上高於該第二量。可對統計學差異或統計學等同性之其他測定進行相同過程。在一個實施中，不同測定之截止值可變化，例如(iii)之截止值所需要的統計學偏差可比(i)及(ii)之截止值少。
如上文所述，若胎兒DNA之百分比為20%(其中各胎兒貢獻10%)，則對(i)及(ii)之統計學等同性與統計學上更大的測定可在50% (等同性)及60%(更大)之間進行區分。因此，若參數(例如分數濃度)大於55%(其在50%與60%之間的一半)，則用於測定統計學更大之截止值可為真。亦可使用第一量與第二量之比率，該比率對α型基因座處60%為A對偶基因之情況為1.5。
對(iii)，統計學上更大之測定可在50%與55%之間進行區分。因此，視所需敏感性及特異性而定，截止值可在51%-54%之間。亦可使用第一量與第二量之比率，該比率對α型基因座處55%為A對偶基因之情況為1.22。
D. 用於使用一種類型之基因座來測定母本遺傳的方法
在一些實施例中，僅使用一種類型之基因座。舉例而言，圖7A顯示α型基因座之三種差異比率50%、55%及60%。比率可與各種截止值相比較以在此等不同分類之間進行判別。
圖9為一種用於根據本發明之實施例使用一種類型之基因座來測定母本單倍型之遺傳的方法900的流程圖。方法900使用來自母本生物樣本之資料，該資料包括來自母體及胎兒之DNA(例如無細胞DNA)。
在區塊910處，在第一染色體上識別第一組之一或多個第一基因座。母體在各第一基因座處之各別第一對偶基因及各別第二對偶基因為異型接合。第一母本單倍型具有第一對偶基因，且第二母本單倍型具有第二對偶基因。區塊910可以與區塊810相似之方式進行。
在區塊920處，確定兩個胎兒在第一基因座處自父體遺傳有各別第一對偶基因。區塊920可以與區塊820相似之方式進行。如上文所述，可以各種次序進行各種步驟。舉例而言，親本基因組之資料可在分析母本樣本之前、期間或之後獲得，且可使用任何適合之DNA技術(例如定序或PCR)。
在區塊930處，電腦系統在母本生物樣本之DNA片段中量測在第一基因座處存在的各別第一對偶基因之第一量及各別第二對偶基因之 第二量。區塊930可以與區塊850相似之方式進行。
在區塊940處，計算第一量與第二量之比率。比率可為各種形式。舉例而言，第一量除以第二量；第二量除以第一量；第一除以第一量與第二量之總和；或第二量除以第一量與第二量之總和。
在區塊950處，使用該比率測定母本單倍型在兩個胎兒中之遺傳。在一個實施例中，隨後如下自四個所量測之量來測定母本遺傳：(i)當該比率大於第一截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有第一母本單倍型；(ii)當該比率小於第二截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有第二母本單倍型；或(iii)當該比率小於第三截止值且大於第四截止值時，將胎兒之一識別為遺傳有第一母本單倍型而將另一個胎兒識別為遺傳有第二母本單倍型，其中該第三截止值小於或等於第一截止值，且該第四截止值大於或等於第二截止值且小於該第三截止值。
用於此分析中之截止值可自母本樣本中來自各胎兒之DNA的相對量或百分比來確定。截止值可在各種分類之間進行判別。在圖7A之實例中，第一截止值可在60%與55%之間進行判別，且特定言之測定樣本是否可分類為兩個胎兒均遺傳有單倍型I。第三截止值在存在未確定之範圍時可小於第一截止值，如為獲得更大特異性而進行。第二截止值可在50%與55%之間進行判別，且特定言之測定樣本是否可分類為兩個胎兒均遺傳有單倍型II。第四截止值在存在未確定之範圍時可大於第二截止值，如為獲得更大特異性而進行。
在一個實施例中，為直接自在父親與母親之間共用之對偶基因的分數濃度測定母本遺傳，確立兩個截止值。存在其中兩個胎兒、一個胎兒或沒有胎兒已遺傳有各別單倍型的三種情境。各情境各自將形成顯示在圖7B中之性質的相關對偶基因之分數濃度分佈，其中中值 減小。舉例而言，若兩個胎兒均貢獻生物樣本中DNA之5%，則三種情境之分數濃度的中值將分別為約60%、55%及50%(圖7A)。設定截止值以在情境之間進行分隔。區別兩個(而非一個)胎兒遺傳之第一或上限截止值將設定為約57.5%。區別一個胎兒(而非沒有)遺傳之第二或下限截止值將設定為約52.5%。
父本基因組序列可藉由對來自父體之生物樣本進行定序來獲得。母本基因組序列可藉由對妊娠之前取得之生物樣本或基本上不含胎兒DNA之生物樣本(諸如無血組織或毛囊)進行定序來獲得。或者，父親及/或母親基因組之相關部分可藉由對在妊娠期間取得之母本血漿或樣本進行定量評估來推論。
用於分析之基因座亦基於其與所關注之特定染色體區域或遺傳特徵的接近性而進行選擇。第一基因座可選擇為彼此接近且只要其間不存在染色體交叉即可與親本單倍型分離。使用者可增大或減少所分析之染色體區域。增大區域增加分析之精確度，因為母本樣本中更多DNA將相關。然而，增大區域亦產生在兩者之間出現交叉事件的風險，在此情況下對偶基因之遺傳無法精確預測單倍型之遺傳。
在一個實施例中，隨後將對偶基因在各基因座處之比率計算為對偶基因中之每一者的單獨計數除以所有對偶基因一起之計數。增加母本樣本讀數之數量增加評估之精確性。可單獨分析各基因座，且組合結果以達成一致，例如圖7B中所描繪。或者，將所有基因座處對偶基因之計數在一起求和。
E. 向母本血漿貢獻不同量之DNA的胎兒
當懷孕婦女懷有雙胞胎時，兩個胎兒可向母本循環中釋放不同量之DNA。因此，來自兩個胎兒之胎兒DNA分數濃度可不同。
圖10A顯示當兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型I時，當胎兒貢獻不同胎兒DNA百分比時，α型及β型SNP之共用對偶基因(A對偶基 因)在母本血漿中的分數濃度。在此實例中，胎兒1貢獻a%且胎兒2貢獻b%。對β型基因座，因為兩種對偶基因相等，所以百分比維持在50%處。但因為A對偶基因更豐富，所以α型基因座之百分比變化。百分比遵循公式F=50%+(a%+b%)/2。
圖10B顯示當兩個胎兒均已自母體遺傳有單倍型II時，當胎兒貢獻不同胎兒DNA百分比時，α型及β型SNP之共用對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中的分數濃度。在此實例中，胎兒1貢獻a%且胎兒2貢獻b%。對α型基因座，因為兩種對偶基因相等，所以百分比維持在50%處。但因為A對偶基因更豐富，所以β型基因座之百分比變化。百分比遵循公式F=50%+(a%+b%)/2。
圖11A顯示當一個胎兒自母體遺傳有單倍型I且另一個胎兒遺傳有單倍型II時，當胎兒貢獻不同胎兒DNA百分比時，α型及β型SNP之共用對偶基因(A對偶基因)在母本血漿中的分數濃度。在此實例中，胎兒1貢獻a%且胎兒2貢獻b%。用於兩種基因座，豐富對偶基因之百分比隨胎兒貢獻而變化。對α型基因座，百分比變為F=50%+a%/2。並且，對β型基因座之百分比變為F=50%+b%/2。
圖11B顯示在三種情境(即兩個均已遺傳有母本單倍型I，兩個胎兒均已遺傳有母本單倍型II及兩胎兒已遺傳有不同母本單倍型)中，使用α及β型SNP之A對偶基因的分數濃度及此等兩種濃度之比率的表1150。行1160顯示對應於三種情境的α型基因座之共用對偶基因A的預期比率。行1170顯示對應於三種情境的β型基因座之共用對偶基因A的預期比率。行1180顯示來自其他行之參數的比率，即α型之值相對於β型之值的比率。如隨後部分中所描述，實施例可使用行1180中之值來確定來自兩種類型基因座之濃度的比率的截止值。
F. 使用比率之比率的方法
在一個實施例中，方法900可使用比率(例如在行1180中α及β型之 比率)。舉例而言，在區塊940中使用之比率可為行1180中之比率。為使用該比率，使用兩種類型之基因座。另外，方法800可使用行1180中之比率來進行。下文描述該方法。
圖12為一種用於根據本發明之實施例使用兩種類型基因座之值的比率來測定母本單倍型之遺傳的方法1200的流程圖。方法1200使用來自母本生物樣本之資料，該資料包括來自母體及胎兒之DNA(例如無細胞DNA)。
區塊1210-1240可以與方法800之區塊810-840相同的方式進行。
在區塊1250處，第一比率由在母本生物樣本之DNA片段中的在第一基因座處存在的各別第一對偶基因之第一量與各別第二對偶基因之第二量計算。在一個實施例中，第一比率為第一量除以第二量。在另一個實施例中，第一比率為第一量除以第一量與第二量之總和以提供第一對偶基因之分數濃度。
在區塊1260處，第二比率由在生物樣本之DNA片段中的在第二基因座處存在的各別第三對偶基因之第三量與各別第四對偶基因之第四量計算。如本文所描述，第一、第二、第三及第四量例如使用定序或PCR資料而自生物樣本之量測獲得。
在區塊1270處，第三比率由第一及第二比率計算。在一個實施例中，如圖11B中所示，第三比率為第三量除以第四量。在另一個實施例中，第三比率為第三量除以第三量與第四量之總和。
在區塊1280處，使用該比率測定母本單倍型在兩個胎兒中之遺傳。在一個實施例中，隨後如下自四個所量測之量來測定母本遺傳：(i)當第三比率大於第一截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有第一母本單倍型，(ii)當第三比率小於第二截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有第二母本單倍型，其中該第一截止值大於該第二截止值，或 (iii)當第三比率小於第三截止值且大於第四截止值時，將胎兒之一識別為遺傳有第一母本單倍型而將另一個胎兒識別為遺傳有第二母本單倍型，其中該第三截止值小於或等於該第一截止值，且該第四截止值大於或等於該第二截止值且小於該第三截止值。
在一個實施例中，區塊1280可藉由首先測定是第一比率(α型)還是第二比率(β型)更高來進行。此可在兩個胎兒是已遺傳有單倍型I還是單倍型II之間進行判別。在該測定之後，僅保留彼等選項之一。隨後，可測定第三比率與兩個殘餘值中之何者更接近。舉例而言，若a>b，則可測定α型與β型基因座之濃度比率與以下兩個值中之何者更接近：
所用之特異性截止值或臨界值可使用任何適合之統計學檢定來確定。在本文所描述之方法中使用的統計學檢定例如(但不限於)順序機率比檢定(SPRT)、正常混合模式1(McLachlan G及Peel D.Multivariate normal mixtures.Finite mixture models 2004：第81-116頁.John Wiley & Sons Press)、二項混合模型及泊松混合模型(McLachlan G及Peel D.Mixtures with non-normal components,Finite mixture models 2004：第135-174頁.John Wiley & Sons Press)。舉例而言，截止值可測定第三比率在統計學上是否不同於以上兩個值。或者，可使用電腦模擬來測定真值中之何者與檢定情況之比率值更相容(Qu JZ等人Clin Chem.2013；59：427-35)。
G. 臨床評估
母本遺傳之體染色體疾病可藉由分析與疾病基因座有關之染色體區域來進行評估。若由兩個胎兒均遺傳與疾病對偶基因有關之母本 單倍型，則兩個胎兒將受該病狀影響。若推論兩個胎兒已遺傳有不同母本單倍型，則僅胎兒之一將受影響。若兩個胎兒均遺傳有與正常對偶基因有關之母本單倍型，則兩個胎兒將不受影響。
體染色體隱性疾病可藉由考慮父本單倍型之遺傳來進行評估。若兩個胎兒均遺傳有與疾病對偶基因有關之父本單倍型，則基於對母本單倍型遺傳之分析，吾等可測定胎兒是否將受該病狀影響或將為攜帶者。若兩個胎兒均遺傳有正常父本對偶基因，則對母本單倍型遺傳之分析可測定胎兒是否為該病狀之攜帶者。若兩個胎兒遺傳有不同父本單倍型及不同母本單倍型，則存在一個胎兒受影響而另一個正常的50%機率及兩個胎兒均為該病狀之攜帶者的50%機率。
IV. 母體及父體為異型接合
藉由擴展，上述實施例背後之原理可應用於其他遺傳模式中。如上所述，相同的父本遺傳之對偶基因可由兩個胎兒遺傳。並且，父本遺傳之對偶基因可甚至在其中父體為異型接合之情況下測定。舉例而言，父本遺傳之單倍型可自其中母體為同型接合且父體為異型接合之基因座測定，且隨後可測定在單倍型上其他基因座處的父本遺傳之對偶基因。但當父本遺傳之對偶基因未知時可使用一些實施例。
在一個實施例中，母本遺傳可使用其中母本及父本基因型兩者之A對偶基因及B對偶基因兩者均為異型接合的基因座來測定，而父本遺傳之對偶基因在所有胎兒中不相同或未知。量測此等兩種單倍型在母本血漿中之存在將解析為五個範圍。舉例而言，若兩個胎兒各自貢獻母本血漿中DNA之10%，則所量測的A對偶基因之貢獻比例將為約40%(若兩個胎兒均為同型接合B)；45%(若一個胎兒為同型接合B且另一個為異型接合)；50%(若兩個胎兒均為異型接合或若一個為同型接合A且另一個為同型接合B)；55%(若一個胎兒為同型接合A且另一個為異型接合)；及60%(若兩個均為同型接合A)。為分離五種可能情 境，定義四個截止量。為解決此複雜性，血漿樣本通常需要比親本基因座為同型接合A時更多的DNA讀數。
母本遺傳亦可在各基因座處存在超過兩個對偶基因變異體的情況下測定。因此，若在特定基因座處母本基因型為AB且父本基因型為CD，則在母本血漿中所量測的DNA之量將解析以使得A之貢獻比例將解析為40%(若兩個胎兒均為BC或BD)；45%(若胎兒為AC或AD與BC或BD組合)；及50%(若兩個胎兒均為AC或AD)。若母本基因型為AB且父本基因型為AC，則在母本血漿中所量測的DNA之量將解析為五個範圍，對A對偶基因而言如在其中親本基因型為AB的情況下，但對B對偶基因而言較低。
圖13為一種根據本發明之實施例在由男性授精之女性(其中母體及父體為異型接合)的兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳的方法1300的流程圖。方法1300使用來自母體之生物樣本，例如包括女性及兩個胎兒之無細胞DNA的生物樣本。
在區塊1310處，在第一染色體上識別第一組之一或多個第一基因座。女性在各第一基因座處之各別第一對偶基因及各別第二對偶基因為異型接合。第一母本單倍型具有第一對偶基因，且第二母本單倍型具有第二對偶基因。男性在第一基因座處亦為異型接合。第一組可為任一類型之基因座。
在區塊1320處，在生物樣本之DNA片段中量測在第一基因座處存在的各別第一對偶基因之第一量。區塊1320可以與其他量測操作相似之方式進行。
在區塊1330處，量測來自第一基因座的生物樣本之DNA片段之第二量。第二量可對應於位於第一基因座之一處的任何DNA片段。指示DNA片段(具有任何對偶基因)來自第一基因座之一的任何信號可用於測定第二量。舉例而言，該信號可為與第一基因座之一匹配的序列 讀數或對應於用於第一基因座之一的探針的PCR中之孔的顏色。
在區塊1340處，計算第一量與第二量之比率。該比率可為任何比率，例如本文所描述之比率。
在區塊1350處，使用該比率測定母本單倍型在兩個胎兒中之遺傳。在一個實施例中，隨後如下測定母本遺傳：(i)當該比率大於第一截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有第一母本單倍型；及(ii)當該比率小於第二截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有第二母本單倍型。
可測定其他母本遺傳。在一些實施例中，如在以上第一實例中，第一父本單倍型具有第一對偶基因且第二母本單倍型具有第二對偶基因。當該比率在統計學上等於50%時，可將兩個胎兒識別為均在一或多個第一基因座(例如At區塊)處為異型接合，或一個胎兒之第一對偶基因為同型接合(例如AA)且另一個胎兒之第二對偶基因為同型接合(例如BB)。另一個實例包括當該比率大於第二截止值(例如在以上實例中在40%與45%之間進行判別)且小於第三截止值(例如在以上實例中在45%與50%之間進行判別)時，將一個胎兒在一或多個第一基因座處之第二對偶基因識別為同型接合(例如BB)且另一個胎兒識別為異型接合(例如AB)。因此，第三截止值小於第一截止值。另一個實例包括當該比率小於第一截止值(例如在以上實例中在60%與55%之間進行判別)且大於第四截止值(例如在以上實例中在50%與55%之間進行判別)時，將一個胎兒在一或多個第一基因座處之第一對偶基因識別為同型接合(例如AA)且另一個胎兒識別為異型接合(例如At區塊)。因此，第四截止值大於第三截止值。
在一些實施例中，第一父本單倍型具有各別第三對偶基因(例如C)，且第二父本單倍型具有各別第四對偶基因(例如D)。當該比率小 於第一截止值且大於第二截止值時，可將一個胎兒的第一對偶基因及第三或第四對偶基因中之任一者識別為異型接合(例如AC或AD)。可將另一個胎兒的第二對偶基因及第三或第四對偶基因中之任一者識別為異型接合(例如BC或BD)。
V. 三胞胎
母本遺傳亦可根據本發明中涉及超過兩個胎兒之妊娠的原理來解析。舉例而言，考慮當母體為異型接合AB且父體為同型接合AA，且存在各自貢獻母本血漿樣本中DNA之10%的三個胎兒(三胞胎)時的實例。A之貢獻比例將解析為50%(若所有三個胎兒均為異型接合)；55%(若兩個為異型接合且一個為同型接合A)；60%(若一個異型接合且兩個為同型接合A)；及65%(若所有三個均為同型接合A)。對高於兩個之多重妊娠而言，通常需要血漿樣本之更多DNA讀數以提供充分解析。
相應地，在一個實施例中，當第一量在統計學上等於第二量(例如該比率之值為約50%時)，可將三個胎兒在一或多個第一基因座處識別為異型接合。當該比率小於第三截止值(例如在60%與55%之間判別)且大於第四截止值(例如在50%與55%之間判別)時，可將兩個胎兒在一或多個第一基因座處之第一對偶基因識別為異型接合且一個胎兒為同型接合。當該比率大於第一截止值(例如在60%與55%之間判別)且小於第五截止值(例如在65%與60%之間判別)時，可將兩個胎兒在一或多個第一基因座處之第一對偶基因識別為同型接合且一個胎兒為異型接合。當該比率大於第五截止值時，可將所有三個胎兒之第一對偶基因識別為同型接合。
VI. 實例
以下部分提供展示本發明之一些原理的非限制性實施例。
A. 獲得及量測來自雙接合子性雙胞胎之胎兒DNA
在香港威爾斯親王醫院婦產科中在具有知情同意書的情況下募集各自懷有雙胞胎之兩名懷孕女性。在妊娠21及25週時採集血液樣本。在分娩之後自各胎兒單獨採集臍帶血。此研究經香港中文大學-院方新界東集群臨床研究倫理委員會聯合會批准。
在4℃下將母本血液樣本於1,600g下離心10分鐘。在4℃下將血漿部分於16,000g下再離心10分鐘以移除任何殘餘血細胞。在室溫下將血液細胞部分於2,500g下再離心5分鐘以移除任何殘餘血漿。用DSPTM DNA血液微型套組TM(Qiagen)提取血漿DNA。用QIAampTM DNA血液微型套組TM(Qiagen)提取臍帶血DNA。自臍帶血樣本提取之基因組DNA用AffymetrixTM全基因組人類SNP陣列6.0系統TM(Affymetrix)進行基因分型。藉由基因型分析確認各個體中之兩對雙胞胎為雙接合子性。
血漿DNA定序庫用雙末端樣本製備套組TM(Illumina)來構造。使用約30ng之DNA來製備各庫。隨後使用定製SureSelect目標增濃系統TM(Agilent Technologies)使此等庫經受目標增濃。捕獲庫覆蓋如下14染色體(chr)上5.5Mb之基因組區域分佈：chr1(0.33Mb)、chr2(0.30Mb)、chr3(0.62Mb)、chr4(0.32Mb)、chr5(0.33Mb)、chr7(0.31Mb)、chr8(0.62Mb)、chr9(0.31Mb)、chr13(0.30Mb)、chr15(0.33Mb)、chr17(0.66Mb)、chr19(0.35Mb)、chr20(0.34Mb)及chr22(0.30Mb)。
藉由標準雙末端方案(Illumina)在Hi-Seq 2000定序器(Illumina)上使用各末端50bp讀取長度來對該等庫進行定序。各庫用一個定序流槽之2個通道進行定序。使用SOAP2演算法來將所有定序讀數與非重複掩蔽人類參考基因組(Hg18)進行比對。
胎兒DNA之分數濃度藉由父本遺傳之胎兒對偶基因在母本血漿中的分數濃度來測定。父本遺傳之胎兒對偶基因基於其作為母本血漿 中具有兩個不同對偶基因之任何SNP基因座處之次要對偶基因的存在來進行識別。
基於父本遺傳之胎兒對偶基因在母本血漿中的分數濃度分佈，估計胎兒DNA在母本血漿中之總分數濃度。情況1及2之胎兒DNA分數濃度分別測定為22.6%及30.6%。胎兒DNA在所有資訊性基因座處之分數濃度分佈用於測定個別雙胞胎對母本血漿DNA之貢獻DNA。
B. 分析及結論
用於此分析之目的的資訊性基因座為母體為同型接合但至少一個胎兒為異型接合且已自父體遺傳有不同對偶基因的彼等SNP基因座。對情況1，由兩個胎兒貢獻的母本血漿中之胎兒DNA分數濃度為10%及11.6%。對情況2，由兩個胎兒貢獻的母本血漿中之胎兒DNA分數濃度為12.4%及18.2%。
對各懷孕婦女，進行RHDO分析已測定兩個胎兒是已遺傳有相同還是不同母本單倍型。在此實例中使用位於染色體4之長臂處的區域來說明RHDO分析。根據胎兒臍帶血之基因型分析，對情況1，兩個胎兒之此區域已遺傳有不同母本單倍型。對情況2，兩個胎兒已遺傳有相同母本單倍型。父本基因型使用家族分析來測定。在此RHDO分析中，僅使用母體為異型接合且父體為同型接合之SNP基因座。在其他實施例中，當確定父本單倍型之遺傳時，RHDO分析亦可使用母體及父體兩者均為異型接合之SNP基因座。
在此分析中，使用或然性比率臨界值來測定使用α型及β型SNP測定之分數濃度(α/β比率)與雙胞胎之何種母本單倍型遺傳模式最相容。對各情況，對基於兩個胎兒之分數濃度的α/β比率進行模擬分析。在二項分佈中生成5,000個資料點已模擬α型及β型SNP共用對偶基因之分數濃度分佈的序列讀數。在(a)兩個胎兒均已遺傳有相同母本單倍型或(b)兩胎兒已遺傳有不同母本單倍型的情境中測定α/β比率之分佈。
圖14A及14B分別顯示對情況1及情況2之預期α/β比率分佈。基於兩種可能遺傳模式之α/β比率預期分佈，確定截止量已區分兩個胎兒是已遺傳有相同還是不同母本單倍型。在此特定實例中，使用幾率比1200來計算上限及下限截止值。α/β比率大於上限截止值表明兩胎兒已遺傳有相同母本單倍型，而α/β比率小於下限截止值表明兩個胎兒已遺傳有兩個不同母本單倍型。對情況1，自模擬分析推論之上限及下限截止值分別為1.113及1.098。對情況2，自模擬分析推論之上限及下限截止值分別為1.170及1.158。
圖15為顯示對情況1之染色體4長臂上之染色體片段的RHDO分析的表1500。因為此分析之統計學能力視定序讀數分析之數量而定，所以使用5,000個作為分類區塊中定序讀數之數量的臨界要求。換言之，SNP在各RHDO分類區塊中之數量將為變數，且此等SNP基因座在該分析中之總定序讀數將超過5,000。對第一RHDO分類區塊，α/β比率測定為0.97837，該值小於自模擬分析推論之下限截止值1.098。
此結果為兩胎兒之此區域已遺傳有兩種不同母本單倍型。使用第一分類區塊下行之SNP以用於進一步RHDO分析，且結果表明兩個胎兒遺傳不同母本單倍型。此區域內總共9個RHDO分類區塊顯示相同結論。此等結果由兩個胎兒之基因型結果確認正確。
圖16為顯示對情況2之染色體4長臂上之染色體片段的RHDO分析的表1600。對RHDO分類區塊1，α/β比率測定為1.299，該值大於自模擬分析推論之上限截止值1.170。
此結果指示兩個胎兒之此區域已遺傳有相同母本單倍型。另外，使用α型SNP測定之分數濃度高於使用β型SNP測定之分數濃度。此指示兩個胎兒已遺傳有母本單倍型I(圖10A)。
使用第一分類區塊中區域下行之SNP以用於進一步RHDO分析，且此區域內總共9個RHDO分類區塊顯示相同結論。此等結果由兩個 胎兒之基因型結果確認正確。
VII. 電腦系統
本文所提及之任何電腦系統均可利用任何適合數量之子系統。該等子系統之實例顯示在圖17中之電腦裝置10中。在一些實施例中，電腦系統包括單一電腦裝置，其中子系統可為電腦裝置之組件。在其他實施例中，電腦系統可包括具有內部組件之多個電腦裝置，其各自為一個子系統。
顯示在圖17中之子系統藉助於系統匯流排75互連。顯示另外之子系統，諸如印表機74、鍵盤78、儲存器件79、連接至顯示配接器82之監測器76、及其他。耦接至I/O控制器71上之周邊器件及輸入/輸出(I/O)器件可藉由此項技術中已知之多種手段(諸如輸入/輸出(I/O)端口77(例如USB、FireWire®))連接至電腦系統。舉例而言，I/O端口77或外部介面81(例如乙太網、Wi-Fi等)可用於將電腦系統10連接至廣域網路，諸如網際網路、鼠標輸入器件或掃描儀。藉助於系統匯流排75之互連允許中央處理器73與各子系統連通且控制來自系統記憶體72或儲存器件79(例如固定磁碟，諸如硬碟機或光碟)之指令的執行以及子系統之間資訊的交換。系統記憶體72及/或儲存器件79可體現電腦可讀取媒體。本文所提及之任何資料可自一個組件向另一個組件輸出且可向使用者輸出。
電腦系統可包括例如藉由外部介面81或藉由內部介面連接在一起的複數個相同組件或子系統。在一些實施例中，電腦系統、子系統或裝置可經網路連通。在該等情況下，可將一個電腦視為用戶端而另一個電腦視為伺服器，其中每一者可為同一電腦系統之一部分。用戶端及伺服器各自可包括多個系統、子系統或組件。
應理解本發明之任何實施例可以控制邏輯形式以模組或積體方式使用硬體(例如特殊應用積體電路或場可程式化閘極陣列)及/或使用 通用可程式化處理器之電腦軟體來執行。如本文所用，處理器包括同一積體晶片上之多核心處理器，或單一電路板或網絡連接之電路板上的多個處理單元。基於本發明及本文所提供之教示，一般熟習此項技術者將知道及瞭解使用硬體及硬體與軟體之組合來實施本發明之實施例的其他方式及/或方法。
描述於本申請案中之任何軟體組件或功能可作為待由處理器執行的使用任何適合之電腦語言(諸如Java、C、C++、C#)或腳本語言(諸如Perl或Python)的軟體程式碼使用例如習知或目標定向技術來執行。軟體程式碼可儲存為用於儲存及/或傳輸之電腦可讀取媒體上的一系列指令或命令，適合之媒體包括隨機存取記憶體(RAM)、唯讀記憶體(ROM)、磁性媒體(諸如硬碟機或軟性磁碟)或光學媒體(諸如光碟(CD)或DVD(數位化通用光碟))、快閃記憶體、及其類似物。電腦可讀取媒體可為該等儲存或傳輸器件之任何組合。
該等程式亦可使用適合於藉助有線、光學及/或符合多種方案之無線網路(包括網際網路)傳輸的載波信號來編碼及傳輸。因此，根據本發明之一個實施例的電腦可讀媒體可使用以該等程式編碼之資料信號產生。以程式碼編碼之電腦可讀媒體可與相容器件一起封裝或與其他器件分開單獨提供(例如藉助於網際網路下載)。任何該等電腦可讀取媒體可存在於單一電腦產品(例如硬碟機、CD或整個電腦系統)上或其內部，且可存在於系統或網路內之不同電腦產品上或其內部。電腦系統可包括用於向使用者提供本文所提及之任何結果的監測器、印表機、或其他適合之顯示器。
本文所描述之任何方法可完全或部分地使用電腦系統來進行，該電腦系統包括一或多個處理器，該等處理器可經組態以進行該等步驟。因此，實施例可針對於經組態以進行本文所描述之任何方法之步驟的電腦系統，其中潛在地用不同組件進行各別步驟或各別步驟組。 儘管本文中方法之步驟以經編號之步驟呈現，但其可同時或以不同次序進行。另外，此等步驟之部分可與其他方法之其他步驟之部分一起使用。另外，步驟之全部或部分可視情況選用。另外，任何方法之任何步驟皆可用進行此等步驟之模組、迴路或其他構件來進行。
可在不背離本發明之實施例的精神及範疇的情況下以任何適合之方式組合特定實施例之特定細節。然而，本發明之其他實施例可針對於與各個別態樣或此等個別態樣之特定組合相關的特定實施例。
已出於說明及描述之目的呈現本發明之例示性實施例的以上描述。該描述並不意欲為窮舉的或將本發明限制於所描述之精確形式，且鑒於以上教示，許多修改及變化為可能的。選擇並描述該等實施例以最佳地解釋本發明之原理及其實際應用，進而使其他熟習此項技術者能夠根據適合於所涵蓋之特定用途在各種實施例中且在進行各種修改的情況下最佳地利用本發明。
除非特別指示相反，否則「一(a/an)」或「該(the)」之敍述意欲意謂「一或多個(種)」。
此處所提及之所有專利、專利申請案、公開案及描述均出於所有目的以全文引用之方式併入。不容許任一者為先前技術。

Claims (50)

  1. 一種在由男性授精之女性的兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳的方法，該方法包含：在第一染色體上識別第一組之複數個第一基因座，其中該女性在各第一基因座處之各別第一對偶基因及各別第二對偶基因為異型接合，第一母本單倍型具有該等第一對偶基因且第二母本單倍型具有該等第二對偶基因；確定該兩個胎兒在該等第一基因座處自該男性遺傳有該等各別第一對偶基因；在該第一染色體上識別第二組之複數個第二基因座，其中該女性在各第二基因座處之各別第三對偶基因及各別第四對偶基因為異型接合，該第一母本單倍型具有各別第三對偶基因且該第二母本單倍型具有各別第四對偶基因，及確定該兩個胎兒在該等第二基因座處自該男性遺傳有該等各別第四對偶基因；在來自該女性之生物樣本的DNA片段中量測在該等第一基因座處存在的該等各別第一對偶基因之第一量及該等各別第二對偶基因之第二量，該生物樣本包括該女性及該兩個胎兒之無細胞DNA；在該生物樣本之DNA片段中量測在該等第二基因座處存在的該等各別第三對偶基因之第三量及該等各別第四對偶基因之第四量；及藉由以下各者在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳：(i)當該第一量在統計學上高於該第二量且該第三量在統計學上等於該第四量時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有該第一母 本單倍型，(ii)當該第一量在統計學上等於該第二量且該第四量在統計學上高於該第三量時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有該第二母本單倍型，或(iii)當該第一量在統計學上高於該第二量時且當該第四量在統計學上高於該第三量時，將該等胎兒之一識別為遺傳有該第一母本單倍型而將另一個胎兒識別為遺傳有該第二母本單倍型。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含：藉由以下各者來確定該第一量在統計學上高於該第二量且該第三量在統計學上等於該第四量：計算該第一量與該第二量之第一比率；計算該第三量與該第四量之第二比率；計算該第一比率與該第二比率之第三比率；及比較該第三比率與截止值。
  3. 如請求項1之方法，其進一步包含：藉由以下各者來確定該第一量在統計學上高於該第二量且該第四量在統計學上高於該第三量：計算該第一量與該第二量之第一比率；計算該第四量與該第三量之第二比率；計算該第一比率與該第二比率之第三比率；及比較該第三比率與截止值。
  4. 如請求項3之方法，其中該第三比率與該截止值之該比較確定該第三比率在統計學上是否等於1。
  5. 如請求項1之方法，其中在第一染色體上識別該第一組之複數個第一基因座包括在該生物樣本中偵測該等各別第一及第二對偶 基因。
  6. 如請求項1之方法，其中該男性在該第一組之各第一基因座處的該各別第一對偶基因為同型接合，且該男性在該第二組之各第二基因座處的該等各別第四對偶基因為同型接合。
  7. 如請求項1之方法，其中量測該等各別第一對偶基因之該第一量及該等各別第二對偶基因之該第二量包括：在各第一基因座處：確定具有該各別第一對偶基因之DNA片段之第一量與具有該各別第二對偶基因之DNA片段之第二量的比率；及確定該等比率之平均比率。
  8. 如請求項7之方法，其進一步包含：藉由比較該平均比率與截止值來確定該第一量在統計學上高於該第二量。
  9. 如請求項1之方法，其進一步包含：藉由以下各者來確定該第一量在統計學上高於該第二量：藉由確定差異或比率自該第一量及該第二量計算第一參數；及比較該第一參數與截止值。
  10. 如請求項1之方法，其中該等第一對偶基因中之複數者、該等第二對偶基因中之複數者、該等第三對偶基因中之複數者及/或該等第四對偶基因中之複數者與所關注之表現型有關。
  11. 如請求項1之方法，其中該等第二對偶基因中之複數者及/或該等第四對偶基因中之複數者與體染色體顯性疾病或疾病易感性有關。
  12. 如請求項1之方法，其中該等第一對偶基因中之複數者及/或該等第二對偶基因中之複數者與體染色體隱性疾病或疾病易感性有 關。
  13. 如請求項1之方法，其中該等第三對偶基因中之複數者及/或該等第四對偶基因中之複數者與體染色體隱性疾病或疾病易感性有關。
  14. 一種在由男性授精之女性的兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳的方法，該方法包含：在第一染色體上識別第一組之複數個第一基因座，其中該女性在各第一基因座處之各別第一對偶基因及各別第二對偶基因為異型接合，第一母本單倍型具有該等第一對偶基因且第二母本單倍型具有該等第二對偶基因；確定該兩個胎兒在該等第一基因座處自該男性遺傳有該等各別第一對偶基因；在來自該女性之生物樣本的DNA片段中量測在該等第一基因座處存在的該等各別第一對偶基因之第一量及該等各別第二對偶基因之第二量，該生物樣本包括該女性及該兩個胎兒之無細胞DNA；計算該第一量與該第二量之比率；藉由以下各者在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳：(i)當該比率大於第一截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有該第一母本單倍型，(ii)當該比率小於第二截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有該第二母本單倍型，或(iii)當該比率小於第三截止值且大於第四截止值時，將該等胎兒之一識別為遺傳有該第一母本單倍型而將另一個胎兒識別為遺傳有該第二母本單倍型，該第三截止值小於或等於該第一截止值，且該第四截止值大於或等於該第二截止值且小於該第 三截止值。
  15. 如請求項14之方法，其中計算該第一量與該第二量之比率包括：對於各第一基因座，計算該各別第一對偶基因之量與該各別第二對偶基因之量的各別比率；及基於該等各別比率計算該比率。
  16. 如請求項15之方法，其中基於該等各別比率計算該比率包括計算該等各別比率之平均值或中值。
  17. 如請求項14之方法，其中該女性懷有三個胎兒，且其中在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳進一步包括：當該第一量在統計學上等於該第二量時，將該三個胎兒在該複數個第一基因座處識別為異型接合，當該比率小於該第三截止值且大於該第四截止值時，將兩個胎兒在該複數個第一基因座處之該等第一對偶基因識別為異型接合而一個胎兒識別為同型接合，或當該比率大於該第一截止值且小於第五截止值時，將兩個胎兒在該複數個第一基因座處之該等第一對偶基因識別為同型接合而一個胎兒識別為異型接合，或當該比率大於該第五截止值時，將所有三個胎兒之該等第一對偶基因識別為同型接合。
  18. 如請求項14之方法，其中該第一組中之該等第一對偶基因中的複數者與病狀或易感性有關，該方法進一步包含：確定該等胎兒之兩者、沒有、或一者已遺傳有基於該等單倍型之遺傳的該病狀或易感性。
  19. 如請求項14之方法，其中該女性具有與體染色體隱性病狀或易感性有關之單倍型，且該等胎兒中之一者或兩者經測定為攜有 該病狀或易感性。
  20. 一種在由男性授精之女性的兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳的方法，該方法包含：在第一染色體上識別第一組之複數個第一基因座，其中該女性在各第一基因座處之各別第一對偶基因及各別第二對偶基因為異型接合，第一母本單倍型具有該等第一對偶基因且第二母本單倍型具有該等第二對偶基因；確定該兩個胎兒在該等第一基因座處自該男性遺傳有該等各別第一對偶基因；在該第一染色體上識別第二組之複數個第二基因座，其中該女性在各第二基因座處之各別第三對偶基因及各別第四對偶基因為異型接合，該第一母本單倍型具有各別第三對偶基因且該第二母本單倍型具有各別第四對偶基因，及確定該兩個胎兒在該等第二基因座處自該男性遺傳有該等各別第四對偶基因；在來自該女性之生物樣本的DNA片段中計算在該等第一基因座處存在的該等各別第一對偶基因之第一量與該等各別第二對偶基因之第二量的第一比率，該生物樣本包括該女性及該兩個胎兒之無細胞DNA；在該生物樣本之DNA片段中計算在該等第二基因座處存在的該等各別第三對偶基因之第三量與該等各別第四對偶基因之第四量的第二比率，其中該等第一、第二、第三及第四量自量測該生物樣本而獲得；計算該第一與第二比率之第三比率；藉由以下各者在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳：(i)當該第三比率大於第一截止值時，將兩個胎兒識別為均 已遺傳有該第一母本單倍型，(ii)當該第三比率小於第二截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有該第二母本單倍型，該第一截止值大於該第二截止值，或(iii)當該第三比率小於第三截止值且大於第四截止值時，將該等胎兒之一識別為遺傳有該第一母本單倍型而將另一個胎兒識別為遺傳有該第二母本單倍型，該第三截止值小於或等於該第一截止值，且該第四截止值大於或等於該第二截止值且小於該第三截止值。
  21. 如請求項20之方法，其中該第三截止值等於該第一截止值，且該第四截止值等於該第二截止值。
  22. 如請求項20之方法，其進一步包含：藉由以下各者來確定該第三比率大於第一截止值：比較該第三比率與1；及當該第三比率大於1時，比較該第三比率與該第一截止值。
  23. 如請求項20之方法，其進一步包含：藉由以下各者來確定該第三比率小於第三截止值且大於第四截止值：確定該第三比率在統計學上等於1。
  24. 如請求項20之方法，其進一步包含：測定由第一胎兒貢獻之第一胎兒DNA分數百分比a%及由第二胎兒貢獻之第二胎兒DNA分數百分比b%，其中該等第一、第二、第三及第四截止值係基於a%及b%來確定。
  25. 如請求項24之方法，其中該第一截止值在(1+a%+b%)/1與(50%+a%/2)/(50%+b%/2)之間進行判別。
  26. 如請求項24之方法，其中該第二截止值在1/(1+a%+b%)與(50%+a%/2)/(50%+b%/2)之間進行判別。
  27. 如請求項20之方法，其中步驟(i)包括確定該第一比率是否在統計學上高於該第二比率，其中步驟(ii)包括確定第二比率是否在統計學上高於該第一比率，且其中步驟(iii)包括確定該第一比率與該第三比率在統計學上相等。
  28. 一種在由男性授精之女性的兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳的方法，該方法包含：在第一染色體上識別第一組之複數個第一基因座，其中該女性在各第一基因座處之各別第一對偶基因及各別第二對偶基因為異型接合，第一母本單倍型具有該等第一對偶基因且第二母本單倍型具有該等第二對偶基因，且其中該男性在該第一基因座處為異型接合；在來自該女性之生物樣本的DNA片段中量測在該等第一基因座處存在的該等各別第一對偶基因之第一量，該生物樣本包括該女性及該兩個胎兒之無細胞DNA；量測來自該等第一基因座的該生物樣本之DNA片段的第二量；計算該第一量與該第二量之比率；藉由以下各者在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳：(i)當該比率大於第一截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有該第一母本單倍型；及(ii)當該比率小於第二截止值時，將兩個胎兒識別為均已遺傳有該第二母本單倍型。
  29. 如請求項28之方法，其中第一父本單倍型具有該等第一對偶基因且第二母本單倍型具有該等第二對偶基因。
  30. 如請求項29之方法，其中：該比率為該第一量除以該第一量與該第二量之總和，或該比率為該第二量除以該第一量與該第二量之總和，且在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳包括：當該比率在統計學上等於50%時，識別以下兩種可能性：兩個胎兒在該複數個第一基因座處均為異型接合，或一個胎兒之該等第一對偶基因為同型接合，而另一個胎兒之該等第二對偶基因為同型接合。
  31. 如請求項29之方法，其中在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳包括：當該比率大於該第二截止值且小於第三截止值時，將一個胎兒在該複數個第一基因座處之該等第二對偶基因識別為同型接合，而另一個胎兒識別為異型接合，該第三截止值小於該第一截止值。
  32. 如請求項31之方法，其中在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳包括：當該比率小於該第一截止值且大於第四截止值時，將一個胎兒在該複數個第一基因座處之該等第一對偶基因識別為同型接合，而另一個胎兒識別為異型接合，該第四截止值大於該第三截止值。
  33. 如請求項28之方法，其中在該第一基因座處第一父本單倍型具有各別第三對偶基因且第二父本單倍型具有各別第四對偶基因。
  34. 如請求項33之方法，其中在該兩個胎兒中測定母本單倍型之遺傳包括：當該比率小於該第一截止值且大於該第二截止值時，識別以 下可能性：一個胎兒之該等第一對偶基因及該等第三或第四對偶基因中之任一者為異型接合，及另一個胎兒之該等第二對偶基因及該等第三或第四對偶基因中之任一者為異型接合。
  35. 一種在由男性授精之女性的兩個胎兒中測定父本單倍型之遺傳的方法，該方法包含：在第一染色體上識別第一組之複數個第一基因座，其中該男性在各第一基因座處之各別第一對偶基因及各別第二對偶基因為異型接合，第一父本單倍型具有該等第一對偶基因且第二父本單倍型具有該等第二對偶基因，且其中該女性之該等第二對偶基因為同型接合；在來自該女性之生物樣本的DNA片段中量測在該等第一基因座處存在的該等各別第一對偶基因之第一量，該生物樣本包括該女性及該兩個胎兒之無細胞DNA；使該第一量正規化以獲得經正規化之第一量；比較該經正規化之第一量與一或多個截止值；基於該比較確定是否一個胎兒、兩個胎兒或沒有胎兒遺傳有該第一父本單倍型。
  36. 如請求項35之方法，其進一步包含：在來自該兩個胎兒中之一者或兩者的該生物樣本中測定胎兒DNA百分比；及基於該胎兒DNA百分比確定該一或多個截止值。
  37. 如請求項35之方法，其中將該經正規化之第一量與第一截止值及第二截止值相比較，其中當該經正規化之第一量小於該第二截止值時確定該等胎兒沒有已遺傳有該第一父本單倍型，其中 當經正規化之第一量大於該第二截止值且小於該第一截止值時確定該等胎兒之一已遺傳有該第一父本單倍型，且其中當該經正規化之第一量大於該第一截止值時，確定該等胎兒中之兩者均已遺傳有該第一父本單倍型。
  38. 如請求項35之方法，其中使該第一量正規化以獲得經正規化之第一量包括：在該生物樣本之DNA片段中量測在該等第一基因座處存在的該等各別第二對偶基因之第二量；及計算該第一量與該第二量之比率以獲得該經正規化之第一量。
  39. 如請求項38之方法，其中該比率為該第一量除以該第一量與該第二量之總和。
  40. 如請求項35之方法，其中基於該比較確定是否一個胎兒、兩個胎兒或沒有胎兒遺傳有該第一父本單倍型包括：若該經正規化之第一量在統計學上大於零但小於第一截止值，則僅將該等胎兒之一者識別為已遺傳有該單倍型；或若該經正規化之第一量大於第二截止值，則將兩個胎兒識別為均已遺傳有該單倍型。
  41. 如請求項35之方法，其進一步包含：在該第一染色體上識別第二組之複數個第二基因座，其中該男性在各第二基因座處之各別第三對偶基因及各別第四對偶基因為異型接合，該第一父本單倍型具有該等第三對偶基因且該第二父本單倍型具有該等第四對偶基因，且其中該女性對該等第三對偶基因為同型接合；在該生物樣本之DNA片段中量測在該等第二基因座處存在的該等各別第四對偶基因之第二量； 使該第二量正規化以獲得經正規化之第二量；比較該經正規化之第二量與一或多個截止值；基於該比較來確定是否一個胎兒、兩個胎兒或沒有胎兒遺傳有該第二父本單倍型。
  42. 如請求項41之方法，其進一步包含：使用對該等第一及第二父本單倍型之遺傳之測定來確定是否一個胎兒、兩個胎兒或沒有胎兒遺傳有該等第一及第二父本單倍型。
  43. 如請求項35之方法，其中該等第一對偶基因中之複數者及/或該等第二對偶基因中之複數者與所關注之表現型有關。
  44. 如請求項35之方法，其中該所關注之表現型為疾病或疾病易感性。
  45. 如請求項35之方法，其中該第一父本單倍型與體染色體隱性病狀或易感性有關，且確定該等胎兒中之一者或兩者攜有該病狀或易感性。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法，其中該生物樣本為血漿。
  47. 如請求項1至45中任一項之方法，其中量測步驟包含對存在於該生物樣本中之DNA進行定序。
  48. 一種電腦程式產品，其包含電腦可讀取媒體，該電腦可讀取媒體儲存用於控制電腦系統進行操作之複數個指令，該等指令包含如請求項1至47中任一項之方法。
  49. 一種系統，其包含電腦系統，該電腦系統包含一或多個經組態以進行如請求項1至47中任一項之方法的處理器。
  50. 如請求項49之系統，其進一步包含經組態以對生物樣本中之DNA進行定序的裝置。
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