KR20150132216A

KR20150132216A - 다태 임신에 대한 태아 게놈의 결정

Info

Publication number: KR20150132216A
Application number: KR1020157027071A
Authority: KR
Inventors: 육 밍 데니스 로; 로사 와이 쿤 치우; 콴 치 찬
Original assignee: 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2015-11-25
Also published as: JP2016518811A; EP2971126A1; EA201500939A1; EP2971126B1; WO2014139477A1; MX2015010785A; MX363345B; US20140315200A1; CN105121660B; US10106836B2; CA2901773A1; CN105121660A; EP2971126A4; TWI637058B; AU2014231358A1; TW201441373A; EP3434790A1

Abstract

다태 임신에서 모계 및 부계 단상형(haplotype)의 유전을 결정하기 위한 기술이 제공된다. 모계 유전은, 모친이 이형접합성이고 부계 유전된 대립유전자가 알려져 있는(예를 들어, 부친은 동형접합성인) 좌위에서 결정될 수 있다. 2개의 유형의 좌위를 이용할 수 있고, 여기서 하나의 유형은 제1 모계 단상형에 보이는 부계 대립유전자를 갖고, 다른 유형은 제2 모계 단상형에 보이는 부계 대립유전자를 갖는다. 부계 유전은, 부친이 이형접합성이고 모친이 동형접합성인 좌위로부터 결정될 수 있다. 각각의 좌위에서의 상이한 대립유전자의 양을 측정할 수 있다. (예를 들어, 컷오프 및 각각의 대립유전자의 분획 농도를 이용한) 양들의 비교를 이용하여 단상형 유전을 결정할 수 있다. 단상형은 관심 대상 병증과 관련될 수 있다.

Description

다태 임신에 대한 태아 게놈의 결정{DETERMINING FETAL GENOMES FOR MULTIPLE FETUS PREGNANCIES}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2013년 3월 15일자로 출원된 발명의 명칭이 "Determining Fetal Genomes For Multiple Fetus Pregnancies"인 미국 가출원 제61/789,992호(이의 전체 내용은 본 명세서에서 모든 목적을 위해 참조문헌으로 포함됨)로부터의 우선권을 주장한다.

본원은 로(Lo) 등의 발명의 명칭이 "Fetal Genomic Analysis From A Maternal Biological Sample"인 공동 소유된 미국 특허 공보 제2011/0105353호; 및 로 등의 발명의 명칭이 "Molecular Testing Of Multiple Pregnancies"인 미국 특허 공보 US 제2013/0059733호(이들의 개시내용은 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 관한 것이다.

기술분야

본 발명은 모계 샘플에 기초하여 태아 게놈을 분석하는 것, 더욱 특히 모계 샘플에서의 유전자 단편의 분석에 기초하여 다태 임신의 태아 게놈의 전부 또는 일부를 결정하는 것에 관한 것이다.

1997년에 모계 혈장에서의 무세포 태아 핵산의 발견은 비침습적 산전 진단에 대한 새로운 가능성을 열었다(Lo Y M D et al Lancet 1997; 350: 485-487; 및 미국 특허 제6,258,540호). 이 기술은 태아 유래의, 부계로 유전된 유전자 또는 서열의 검출에 의해, 예를 들어 태아 성 결정, 태아 RhD 상태 결정, 및 태아가 부계로 유전된 돌연변이를 유전 받는지의 결정을 위해 임상 분야로 신속히 옮겨졌다(Amicucci P et al Clin Chem 2000; 46: 301-302; Saito H et al Lancet 2000; 356: 1170; 및 Chiu R W K et al Lancet 2002; 360: 998-1000). 이 분야에서의 최근의 진전은 모계 혈장 핵산 분석으로부터 태아 염색체 이수성, 예컨대 21번 삼염색체의 산전 진단이 가능하게 한다(Lo Y M D et al Nat Med 2007; 13: 218-223; Tong Y K et al Clin Chem 2006; 52: 2194-2202; US 특허 공보 제2006/0252071호; Lo Y M D et al Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 13116-13121; Chiu R W K et al Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 20458-20463; Fan H C et al Proc Natl Acad Sci 2008; 105: 16266-16271; US 특허 공보 제2007/0202525호; 및 US 특허 공보 제2009/0029377호).

상당한 최근의 진전의 다른 분야는 모친 및 부친 둘 다가 동일한 돌연변이를 보유하는 단일 유전자 질환의 비침습적 산전 진단을 위한 단일 분자 계수 방법, 예컨대 디지털 PCR의 이용이다. 이는 모계 혈장에서의 상대 돌연변이 용량(relative mutation dosage: RMD) 분석에 의해 성취된다(US 특허 출원 제2009/0087847호; Lun F M F et al Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 19920-19925; 및 Chiu R W K et al. Trends Genet 2009; 25: 324-331).

그러나, 이 방법은 게놈의 특정 부분을 분석하기 위해 가능한 돌연변이의 선행 지식을 이용하고, 따라서 잠재적 또는 희귀 돌연변이 또는 유전자 질환을 확인할 수 없다. 추가로, 쌍둥이 임신의 접합성(zygosity)에 대한 정보는 종래에 초음파 스캐닝(Chauhan SP et al. Am J Obstet Gynecol 2010; 203: 305-315) 또는 침습적 산전 진단(예를 들어, 양수검사)(Chen CP et al. Hum Reprod 2000; 15: 929-934)에 의해 얻어졌다.

따라서, 비침습적 기술을 이용하여 다태 임신의 태아 게놈의 전부 또는 일부를 확인할 수 있는 새로운 방법, 시스템 및 기기를 제공하는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시형태는 다태를 갖는 임신에서 모계 및 부계 단상형(haplotype)의 유전을 결정하기 위한 방법, 시스템 및 기기를 제공한다. 모계 유전은, 모친이 이형접합성이고 부계로 유전된 대립유전자가 알려진(예를 들어, 부친이 동형접합성임) 좌위에서 결정될 수 있다. 2개의 유형의 좌위를 이용할 수 있으며, 여기서 일 유형은 제1 모계 단상형에 보이는 부계 대립유전자를 갖고, 다른 유형은 제2 모계 단상형에 보이는 부계 대립유전자를 갖는다. 부계 유전은 부친이 이형접합성이고 모친이 동형접합성인 좌위로부터 결정될 수 있다. 각각의 좌위에서의 상이한 대립유전자의 양을 결정할 수 있다. 단상형 유전을 결정하기 위해 (예를 들어, 컷오프 및 각각의 대립유전자의 분획 농도(fractional concentration)를 이용한) 양의 비교를 이용할 수 있다. 단상형은 관심 있는 병증과 관련될 수 있다.

몇몇 실시형태는 본 명세서에 기재된 방법과 관련된 시스템 및 컴퓨터 판독 가능한 매체에 관한 것이다.

본 발명의 실시형태의 성질 및 이점의 더 우수한 이해는 하기 상세한 설명 및 첨부한 도면을 참조하여 얻어질 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시형태에 따라 모친이 동형접합성이고 부친이 이형접합성인 2개의 좌위의 예를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시형태에 따라 다태 임신의 태아에서 부계 단상형의 유전을 결정하는 방법(200)의 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 실시형태에 따라 2개 유형의 좌위의 확인에 의한 가상적인 부친 및 모친의 단상형을 나타낸다.
도 4a는 태아 둘 다가 도 3에 도시된 좌위에 대해 모친로부터 Hap I를 유전 받는 예를 나타낸다. 도 4b는, 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap I를 유전 받을 때, 모계 혈장에서의 부친 및 모친이 공유한 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도의 예시적인 계산을 나타낸다.
도 5a는 태아 둘 다가 도 3에 도시된 좌위에 대해 모친으로부터 Hap II를 유전 받는 예를 나타낸다. 도 5b는, 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap II를 유전 받을 때, 부친 및 모친이 공유한 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도의 예시적인 계산을 나타낸다.
도 6a는 도 3에 도시된 좌위에 대해 모친으로부터 한 명의 태아가 Hap I를 유전 받고 다른 한 명이 Hap II를 유전 받는 예를 나타낸다. 도 6b는, 모친으로부터 한 명의 태아가 Hap I를 유전 받고 다른 태아가 Hap II를 유전 받을 때, 모계 혈장에서의 부친 및 모친이 공유한 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도의 예시적인 계산을 나타낸다.
도 7a는 두 명의 태아에 대한 모계 단상형 유전의 3개의 상이한 시나리오에 대해 모계 특이적 대립유전자(B 대립유전자) 및 부친 및 모친이 공유한 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 나타낸다.
도 7b는 각각의 정보제공 SNP 좌위에서의 개별적인 분획 농도가 어떻게 특정한 유형의 모든 좌위에 대해 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 예측하기 위해 이용될 수 있는지를 예시한다.
도 8은 본 발명의 실시형태에 따라 좌위의 유형 둘 다를 이용한 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법(800)의 흐름도이다.
도 9는 본 발명의 실시형태에 따라 좌위의 일 유형을 이용한 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법(900)의 흐름도이다.
도 10a는, 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap I를 유전 받고 태아가 상이한 태아 DNA 백분율에 기여할 때, α형 및 β형 SNP에 대해 모계 혈장에서의 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 나타낸다.
도 10b는, 태아가 상이한 태아 DNA 백분율에 기여할 때, 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap II를 유전 받을 때, α형 및 β형 SNP에 대해 모계 혈장에서의 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 나타낸다.
도 11a는, 태아가 상이한 태아 DNA 백분율에 기여할 때, 모친으로부터 한 명의 태아가 Hap I를 유전 받고 다른 태아가 Hap II를 유전 받을 때, α형 및 β형 SNP에 대해 모계 혈장에서의 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 나타낸다.
도 11b는 3개의 시나리오에서의 α형 및 β형 SNP를 이용한 A 대립유전자의 분획 농도 및 이 2개의 농도의 비율의 표(1150)를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 실시형태에 따라 좌위의 유형 둘 다로부터의 값의 비율을 이용한 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법(1200)의 흐름도이다.
도 13은 본 발명의 실시형태에 따라, 모친 및 부친이 이형접합성인, 수컷에 의해 수정된 암컷의 두 명의 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법(1300)의 흐름도이다.
도 14a 및 도 14b는 각각 사례 1 및 사례 2에 대한 예상된 α/β 비율의 분포를 나타낸다.
도 15는 사례 1에 대한 4번 염색체의 긴 암(arm)에서 염색체 분절의 RHDO 분석을 나타내는 표(1500)이다.
도 16은 사례 2에 대한 4번 염색체의 긴 암에서 염색체 분절의 RHDO 분석을 나타내는 표(1600)이다.
도 17은 본 발명의 실시형태에 따른 시스템 및 방법과 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터 시스템(10)의 블록 다이어그램을 나타낸다.

정의

본 개시내용에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 대상체(예를 들어, 인간, 예컨대 임신한 여성)로부터 얻어지고 관심 있는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 함유하는 임의의 샘플을 의미한다. 본 발명의 실행 시 유용한 샘플은 혈장, 혈청, 혈액 세포, 백혈구, 망상적혈구 및 전혈을 포함한다. 몇몇 목적을 위해, 타액, 흉수, 땀, 복수, 담즙, 뇨, 이자액, 대변 또는 자궁경관도말(cervical smear) 샘플을 또한 사용할 수 있다.

용어 "좌위" 또는 이의 복수 형태 "좌위들"은 게놈에 걸쳐 변이를 갖는 뉴클레오타이드(또는 염기쌍)의 임의의 길이의 위치 또는 주소이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "좌위" 또는 이의 복수 형태 "좌위들"은 게놈에 걸쳐 변이를 갖는 뉴클레오타이드(또는 염기쌍)의 임의의 길이의 위치 또는 주소이다. 용어 "대립유전자"는, 상이한 표현형 특질을 발생시키거나 발생시키지 않을 수 있는, 동일한 물리적 게놈 좌위에서의 대안적인 DNA 서열을 의미한다. 임의의 특정한 이배체 유기체에서, (수컷 인간 대상체에서 성 염색체를 제외한) 각각의 염색체의 2개의 카피에 의해, 각각의 유전자에 대한 유전자형은 동형접합체에서 동일하고 이형접합체에서 상이한 이 좌위에 존재하는 대립유전자의 쌍을 포함한다. 유기체의 집단 또는 종은 통상적으로 다양한 개체 중에서 각각의 좌위에서 복수의 대립유전자를 포함한다. 하나 초과의 대립유전자가 집단에서 발견되는 게놈 좌위는 다형 부위(polymorphic site)라 칭해진다. 좌위에서의 대립유전자 변이는 존재하는 대립유전자의 수(즉, 다형의 정도) 또는 집단에서의 이형접합체의 비율(즉, 이형접합률(heterozygosity rate))로서 측정 가능하다. 좌위가 서열을 포함하거나 서열을 포함하지 않을 수 있으므로, 서열(예를 들어, 유전자)의 존재 또는 부재는 또한 대립유전자 변이의 유형인 것으로 생각된다. 예를 들어, 결실된 서열 전에 및 후에 보통 오는 서열의 접합에 의해 서열(예를 들어, RHD 유전자)의 이러한 부재가 확인될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "다형"은 이의 빈도와 무관하게 인간 게놈에서의 임의의 개체간 변이를 의미한다. 이러한 변이의 예는 단일 뉴클레오타이드 다형(single nucleotide polymorphism), 단순 탠덤 반복 다형(simple tandem repeat polymorphism), 삽입-결실 다형, (질환을 야기할 수 있는) 돌연변이 및 카피수 변이를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

용어 "단상형"은 동일한 염색체 또는 염색체 구역에 함께 전달되는 복수의 좌위에서의 대립유전자의 조합을 의미한다. 단상형은 한 쌍의 좌위 또는 염색체 구역, 또는 전체 염색체를 의미할 수 있다.

"염색체 구역"은 특정한 염색체에 대한 복수의 뉴클레오타이드 위치를 의미한다. 염색체 구역은 전체 염색체 또는 더 작은 하위섹션일 수 있다. 보통의 사람에서, 염색체 구역은 2개의 단상형을 가질 것이고, 1개는 그 구역이 내부에 있는 염색체의 각각의 카피에 대한 것이다. 2개의 단상형은 염색체 구역 내에서 동일하거나 상이할 수 있다.

본 개시내용에서 사용되는 용어 "컷오프 값" 또는 양은 생물학적 샘플에 대한 분류의 2개 이상의 상태, 예를 들어 특정한 표현형 병증 또는 질환, 또는 표현형 병증 또는 질환에 대한 감수성과 연관되고 관련된 유전자 서열의 존재 또는 부재 사이를 중재하도록 이용되는 숫자 값 또는 양을 의미한다. 예를 들어, 매개변수가 컷오프 값보다 큰 경우, 정량적 데이터의 제1 분류가 이루어지거나, 매개변수가 컷오프 값보다 작은 경우, 정량적 데이터의 상이한 분류가 이루어진다.

본 발명의 상세한 설명

실시형태는 다태를 갖는 임신에서 모계 및 부계 단상형의 유전의 결정을 결정할 수 있다. 부계 유전은 부친이 이형접합성이고 모친이 동형접합성인 좌위로부터 결정될 수 있다. 부계 특이적 대립유전자의 양(예를 들어, 이 대립유전자의 분획 농도)은 많은 태아가 부계 특이적 대립유전자를 갖는 단상형을 어떻게 유전 받는지를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 태아에서의 부계로 유전된 단상형의 지식은 태아가 유전 받은 모계 단상형을 결정하기 위해 이용될 수 있다.

모계 유전은 모친이 이형접합성인 좌위에서 결정될 수 있고, 부계로 유전된 대립유전자는 알고 있다(예를 들어, 부친은 동형접합성이거나, 부계로 유전된 단상형이 결정된다). 2개의 유형의 좌위를 이용할 수 있다. 일 유형은 제1 모계 단상형에 보이는 부계 대립유전자를 갖고, 다른 유형은 제2 모계 단상형에 보이는 부계 대립유전자를 갖는다. 각각의 좌위에서의 상이한 대립유전자의 양을 측정할 수 있다. (예를 들어, 컷오프 및 각각의 대립유전자의 분획 농도를 이용한) 양의 비교는 단상형 유전을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 그리고, 단상형은 관심 있는 병증과 관련될 수 있고, 이것은 부계 및/또는 모계 단상형이 유전되는지의 결정에 기초하여 유전되거나 유전되지 않는지 결정될 수 있다.

I. 접합성

다태 임신은 임신한 여성이 한 명보다 많은 태아를 수태한 임신을 의미한다. 쌍둥이 임신은 다태 임신의 가장 흔한 형태이다. 쌍둥이 임신은 일란성(동일) 및 이란성(비동일)으로 분류될 수 있다. 주로 쌍둥이에 기초하여 토의가 이루어지지만, 더 많은 수의 태아에 양상들이 또한 적용 가능하다.

모계 혈장에 존재하는 DNA 단편의 분석은 쌍둥이 임신에서, 특히 쌍둥이가 이란성(비동일)인 경우 더 복잡해진다. 특정한 단상형 또는 특정한 질환 관련 다형이 기원 상 태아로서 모계 혈장에서 확인되더라도, 분석가는 다른 문제(태아 둘 다 또는 오직 한 명에게 이환되는지를 어떻게 결정하는지)와 직면한다.

A. 일란성 쌍둥이

임신한 여성이 한 쌍의 일란성 쌍둥이를 수태할 때, 태아에 대한 유전자 분석은 단태 임신을 분석하기 위해 이용되는 것과 유사할 수 있다. 그러나, 이란성 쌍둥이의 가능성은 분석이 더 어렵게 한다. 부계 유전의 분석을 위해, 모계 게놈에서 부재한 부계 대립유전자는 부계 대립유전자가 태아에 의해 유전되는지를 결정하기 위한 마커로서 이용될 수 있다. 부계 대립유전자가 부친의 특정한 단상형에 있는 것으로 알고 있을 때, 태아 중 적어도 한 명에 의한 특정한 단상형의 유전은 (일란성일 때 둘 다에 의해) 결정될 수 있다.

모계 대립유전자의 유전의 분석을 위해, 복잡한 정량적 접근법이 필요한데, 왜냐하면 모계 대립유전자가 태아에 의해 유전되는지와 무관하게 2개의 모계 대립유전자가 모계 혈장에서 검출 가능할 것이기 때문이다. 모계 혈장에서의 2개의 모계 대립유전자의 상대 양을 비교할 수 있고, 태아에 의해 유전된 대립유전자는 더 높은 농도로 존재하는 것으로 예상된다. 다른 실시형태에서, 모계 혈장에서의 2개의 모계 단상형의 상대 양을 비교한다. 혈장 샘플에서의 DNA의 양이 제한될 때 이 상대 단상형 용량 접근법은 더 정확한 결과를 제공할 수 있다. 상대 단상형 용량 접근법에 대한 상세내용은 미국 특허 제8,467,976호(참조문헌으로 포함됨)에서 확인될 수 있다.

B. 이란성 쌍둥이

한 쌍의 쌍둥이가 이란성인 경우, 두 명의 태아는 각각의 부모로부터 동일한 또는 상이한 대립유전자를 유전 받을 수 있다. 이 시나리오에서, 부계 및 모계 대립유전자가 각각의 태아에 의해 유전되는지를 결정하기 위해 더 복잡한 유전자 분석이 필요하다. 이 정보는 일유전자(monogenic) 질환 및 다른 병증의 분석에 유용하다.

실시형태는 다태 임신에서 태아에 의한 부모 단상형의 유전을 분석하기 위한 기술을 기술한다. 분석은 부계 유전의 분석 및 모계 유전의 분석으로 나눠진다.

II. 부계 유전에 대한 분석

부계 단상형(들)이 태아에 의해 유전되는지의 결정은 부친에 대한 유전자형 및/또는 단상형 정보를 알고 있을 때 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태는 부모 특이적 단상형을 확인하고 측정함으로써 부모 유전을 결정하는 방법을 제공한다.

A. 부계 특이적 단상형의 확인

부계 유전의 결정은 모친이 동형접합성이고 부친이 이형접합성인 좌위를 분석함으로써 수행될 수 있다. 이러한 경우에, 태아 특이적 대립유전자는 태아 중 한 명 또는 둘 다에서 부친으로부터 유전될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시형태에 따라 모친이 동형접합성이고 부친이 이형접합성인 2개의 좌위의 예를 나타낸다. 이 2개의 좌위(110, 120)는 서로 가까워서, 단일 감수분열 동안 이 2개의 좌위 사이의 재조합이 있지 않을 것이다. 이 예에서, 좌위(110)에서, 부계 A 대립유전자는 모계 대립유전자와 동일하고, 부계 B 대립유전자는 모친에서 부재하고, 그러므로 부계 특이적이다. 유사하게, 좌위(120)에서의 C 대립유전자가 또한 부계 특이적이다.

일 실시형태에서, 2개의 상이한 좌위에서의 부계 특이적 대립유전자의 상을 결정할 수 있다. 대립유전자의 상은 이들이 동일한 염색체 또는 상이한 상동성 염색체 상에 있는지와 관련하여 이 대립유전자의 관계를 의미한다. 동일한 염색체에 위치하는 상이한 좌위에서의 대립유전자는 단상형을 형성한다. 더 많은 부계 특이적 대립유전자가 검출될 수 있으므로, 각각의 부계 단상형에서 분석된 특이적 좌위의 수를 증가시키는 것은 모계 혈장에서의 부계 특이적 대립유전자를 검출하는 것의 감수성을 증가시킬 수 있다. 검출된 부계 특이적 대립유전자의 수의 증가는 태아의 부계 유전을 추론하는 것의 정확성을 증가시킨다.

이후, 이 2개의 좌위의 부계 특이적 대립유전자에 대해 모계 혈장 DNA를 분석한다. 상이한 기술이 모계 혈장에서 이 부계 특이적 대립유전자를 검출하기 위해 이용될 수 있고, 이 방법은 당업자에게 공지될 것이다. 이 방법의 예는 중합효소 사슬 반응(polymerase chain reaction: PCR), 디지털 PCR, 대립유전자 특이적 PCR, DNA 서열분석, 프라이머 연장 반응, 질량 분광법 기반 방법 및 차세대 서열분석을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

두 명의 태아가 동일한 부계 단상형을 유전 받는지를 결정하기 위해, 2개의 부계 단상형의 각각에 대해 적어도 1개의 부계 특이적 대립유전자를 분석할 수 있다. 도 1은 2개의 부계 단상형 Hap II 및 Hap IV를 나타낸다. 예에서, B 대립유전자가 좌위(110)에 대해 모계 혈장에서 검출되는 경우, 이는 부계 단상형 Hap IV가 태아 중 적어도 한 명에 의해 유전된다는 것을 의미한다. 유사하게, C 대립유전자가 좌위(120)에 대해 모계 혈장에서 검출되는 경우, 부계 Hap III은 태아 중 적어도 한 명에 의해 유전된다. 쌍둥이 임신에서, 모계 혈장에서 2개의 부계 단상형의 각각에 위치한 부계 특이적 대립유전자의 존재는 두 명의 태아가 상이한 부계 단상형을 유전 받는다는 것을 나타낸다. 좌위(110)에서 부계 특이적 대립유전자(B 대립유전자)만이 모계 혈장에서 존재하지만 좌위(120)에서 부계 특이적 대립유전자(C 대립유전자)가 부재한 경우, 태아 둘 다는 부계 Hap IV를 유전 받는다. 유사하게, 좌위(120)에서 부계 특이적 대립유전자(C 대립유전자)만이 모계 혈장에서 존재하지만 좌위(110)에서 부계 특이적 대립유전자(B 대립유전자)가 부재한 경우, 태아 둘 다는 부계 Hap III을 유전 받는다.

모계 혈장에서의 부계 단상형에서 부계 특이적 대립유전자의 검출가능성은 각각의 태아가 기여한 DNA의 분획 농도 및 각각의 부계 특이적 대립유전자를 검출하는 것의 감수성에 의해 영향을 받을 수 있다. 낮은 태아 DNA 분획 농도의 존재에서, 태아가 부계 특이적 대립유전자를 유전 받더라고, 대립유전자는 모계 혈장에서 검출되지 않을 수 있다. 부계 단상형이 태아에 의해 유전되지 않는다는 것을 잘못 결론짓는 것의 기회를 감소시키기 위해, 부계 단상형에서 다수의 부계 특이적 대립유전자를 분석할 수 있다.

B. 부계 유전을 결정하는 방법

도 2는 본 발명의 실시형태에 따라 다태 임신의 태아에서 부계 단상형의 유전을 결정하는 방법(200)의 흐름도이다. 실시형태는 이란성 쌍둥이 태아에서 부계 유전을 분석할 수 있다. 방법(200)은 한 명보다 많은 태아를 임신한 암컷으로부터 얻어진 생물학적 샘플을 이용할 수 있다. 생물학적 샘플은 암컷 및 두 명의 태아의 무세포 DNA를 포함한다. 혈액 관련 샘플, 예컨대 혈장, 혈청, 혈액 세포, 백혈구, 망상적혈구 또는 전혈이 대게 사용된다. 다른 샘플 유형은 뇨, 타액, 질 분비물(vaginal fluid), 암컷 생식관으로부터의 세척액, 눈물 및 땀을 포함한다.

생물학적 샘플을 다양한 방식으로, 예를 들어 디지털 PCR, 서열분석 또는 다른 적합한 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 분석은 게놈에서 소정의 좌위에서의 다수의 대립유전자의 수를 제공할 수 있다. 예를 들어, 서열 리드(read)는 기준 게놈에 정렬될 수 있고, 서열 리드에서의 대립유전자는 기억에 저장될 수 있다. 다른 실시형태에서, PCR 신호는 특정한 좌위 및 대립유전자에 대한 표지된 프로브에 상응하는 DNA 단편을 포함하는 다수의 웰(또는 RT-PCR에 의한 특정한 웰에서의 양)을 나타낼 수 있다. 방법(200)은 컴퓨터 시스템에 의해 수행될 수 있다.

블록(210)에서, 제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인한다. 각각의 좌위에서, 부친은 제1 대립유전자 및 제2 대립유전자에 대해 이형접합성이고, 모친은 제1 대립유전자에 대해 동형접합성이다. 제1 대립유전자는 제1 염색체 구역의 제1 단상형에 있다(예를 들어, 전체 염색체 또는 단지 일부). 제2 부계 단상형은 제2 대립유전자를 갖는다.

모친은 당업자에게 공지된 것처럼 다양한 방식으로 유전자형 분석될 수 있다. 예를 들어, 모계 세포로부터의 DNA를 분석할 수 있고, 오직 1개의 대립유전자가 검출된 좌위는 동형접합성으로서 확인될 수 있다.

부친의 제1 단상형은 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 부친은 유전자형 분석될 수 있고, 단상형은 기준 단상형에 기초하여 결정될 수 있으며, 이 기준 단상형은 부친이 상응하는 특정한 집단(예를 들어, 특정한 민족 그룹에 대해 결정된 기준)으로부터 결정될 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 단상형을 결정하기 위해 부친의 생물학적 샘플을 분석할 수 있다.

블록(220)에서, 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제1 좌위에 존재하는 각자의 제1 대립유전자의 제1 양을 측정한다. 상기 언급된 바대로, 서열 리드 또는 PCR 리드(예를 들어, 다수의 웰에 대한 색상 신호)를 수신하는 컴퓨터에 의해 제2 양을 결정할 수 있다. 컴퓨터는 특정한 제1 좌위에 상응하는 다수의 DNA 단편을 결정하고 제2 대립유전자를 갖는 다수의 이러한 DNA 단편을 계수할 수 있다(예를 들어, 특정한 색상을 갖는 웰의 수 또는 제2 대립유전자를 갖는 다수의 정렬된 서열 리드).

몇몇 실시형태에서, 이미 얻어진 서열 데이터를 이용하여 산술적으로 분석을 수행한다. 적합한 기술의 선택은 US 2011/0105353 A1 및 US 2013/0059733 A1에 제공된 것을 포함한다. 각각의 좌위를 통한 서열분석에 대한 대안으로서, 특이적 프로브 또는 PCR 프라이머를 이용하여 사용자는 특정한 대립유전자에 대해 시험할 수 있다. 관심 있는 단상형 및/또는 그 단상형이 관련된 대립유전자에 있거나 그 주위에 있는 리드를 얻도록 실제 물리적 서열분석 단계 및/또는 이로부터 얻어진 서열 데이터가 마스킹되거나, 여과되거나, 그렇지 않으면 선택된다는 의미에서 측정은 "선택적"일 수 있다.

블록(230)에서, 제1 양을 임의로 정규화한다. 다른 실시형태에서, 제1 양을 정규화하지 않는다. 일 실시형태에서, 제1 좌위에서 제2 대립유전자의 제2 양을 나누어서 제1 양을 정규화한다. 다른 실시형태에서, 제1 좌위에서 DNA 단편의 전체 양으로 제1 양을 나누어 정규화를 수행할 수 있다. 결과는 제1 대립유전자의 분획 농도를 제공할 수 있다.

각각의 좌위에서의 대립유전자의 분획 농도는 이후 함께 모든 대립유전자의 수로 분리하여 나눈 각각의 대립유전자의 수로 계산된다. 생물학적 (모계) 샘플의 리드의 수를 증가시키는 것은 평가의 정확성을 증가시킨다. 각각의 좌위를 분리하여 분석할 수 있고 합의를 위해 결과를 조합할 수 있다. 대안적으로, 모든 좌위에서의 대립유전자의 수를 제1 단상형과 관련되는지에 따라 함께 합한다.

블록(240)에서, 정규화된 제1 양을 제1 컷오프 값과 비교한다. 제1 양에 원시(raw) 값이 사용되는 일 실시형태에서, 제1 컷오프는 0(또는 다른 비교적 작은 정규화되지 않은 값)일 수 있어서, 제1 대립유전자의 임의의 검출은 모계 샘플에서 제1 단상형의 존재를 나타낼 수 있다. 제1 단상형의 존재만이 제1 대립유전자에 대한 백분율 또는 다른 정규화된 값을 알지 못하면서 몇몇 제1 대립유전자의 존재에 기초하여 추정되므로, 이 분석은 성질상 더 정량적일 수 있다. 그리고, 태아 둘 다가 제1 대립유전자를 유전 받는지를 알고 있지 않다.

다른 실시형태에서, 예를 들어, 이용된 생물화학 과정(예를 들어, 서열분석 또는 PCR)에서의 오류로 인해 하나 이상의 제1 대립유전자의 검출이 부정확할 수 있을 때 거짓 긍정을 발생시킬 수 있는 비논리적인 데이터를 피하도록 더 높은 컷오프를 설정할 수 있다.

블록(250)에서, 제1 단상형의 유전은 비교에 기초하여 결정된다. 상기 언급된 바대로, 결정은 제1 양 또는 정규화된 제1 양이 제1 컷오프를 초과할 때 태아 중 적어도 한 명이 제1 단상형을 유전 받는다는 것일 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 하나 초과의 컷오프를 이용할 수 있다. 이러한 예는 제1 대립유전자의 분획 농도가 결정된 때일 수 있다. 생물학적 샘플에서 전체 태아 DNA 백분율을 알고 있고/있거나, 개별적인 백분율을 알고 있다. 이 정량적 측정은 한 명의 태아 또는 태아 둘 다가 관심 있는 단상형을 갖는지의 결정을 허용한다.

예를 들어, 분획 농도가 제1 컷오프 값을 초과하는 경우, 태아 둘 다는 단상형을 유전 받는 것으로서 확인될 수 있다. 분획 농도가 0보다 상당히 크지 않은 경우(예를 들어, 제2 컷오프보다 작은 경우), 태아 둘 다는 단상형을 유전 받지 않는 것으로서 확인된다. 분획 농도가 제1 컷오프를 초과하지 않지만 제2 컷오프를 초과하는 경우, 태아 중 한 명은 제1 단상형을 유전 받는 것으로서 확인될 수 있고, 다른 태아는 그렇지 않다.

예시적인 일 예에서, 전체 태아 DNA 백분율이 10%인 것을 추정하고, 각각의 태아는 5%를 기여한다. 제1 컷오프는 측정의 통계 정확성을 고려하면 7% 내지 9%, 또는 임의의 적합한 백분율(5% 내지 10%를 구별할 수 있음)일 수 있다. 제2 컷오프는 측정의 통계 정확성을 고려하면 2% 내지 4%, 또는 임의의 적합한 백분율(0% 내지 5%를 구별할 수 있음)일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 태아가 기여하는 개별적인 DNA 백분율을 알고 있지 않을 수 있지만, 다른 샘플의 측정에 기초하여 통상적인 범위가 추정될 수 있다. 따라서, 컷오프는 이러한 경우에 여전히 결정될 수 있다.

이 분석에 이용된 컷오프는 모계 샘플에서의 각각의 태아로부터의 상대 양 또는 백분율로부터 결정될 수 있다. 컷오프는 태아 중 어느 하나로부터의 대립유전자의 기여의 부재, 한 명의 태아로부터의 기여, 또는 태아 둘 다로부터의 기여를 구별할 수 있다. 추가의 상세내용은 각각의 환자에 대한 또는 전체로서의 집단에 대한 컷오프 값을 설정하는 것에 대한 더 많은 정보에 대해 US 2011/0105353 A1 및 US 2013/0059733 A1에 제공된다.

블록(260)에서, 블록(210-250)은 제1 염색체 구역의 제2 단상형에 대해 반복될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 제2 좌위, 예컨대 제2 단상형에서 부계 특이적 대립유전자를 갖는 좌위(120)(도 1에서의 Hap III)가 확인될 수 있다. 태아 중 적어도 한 명이 제2 단상형을 유전 받는지에 대해 결정할 수 있다. 따라서, 이 결정은 제1 단상형에 대한 유전의 결정과 조합될 수 있다. 단상형 둘 다가 유전된 것으로 결정된 경우, 한 명의 태아는 단상형 중 1개를 유전 받는다. 오직 1개의 단상형이 유전된 것으로서 결정된 경우, 태아 둘 다는 동일한 단상형을 유전 받는 것으로 결정될 수 있다. 따라서, 태아 둘 다에 대해 유전에 대해 결정할 수 있다.

분획 농도가 결정되고 제1 단상형에 대해 이용되는 경우, 제1 좌위에 대한 분획 농도 및 역치(threshold)로부터 결정된 유전을 확신하기 위해 제2 단상형의 분획 농도가 이용될 수 있다.

유전된 부계 단상형(들)이 결정되면서, 모친이 이형접합성인 좌위에서의 유전된 대립유전자를 결정할 수 있다. 부계로 유전된 대립유전자에 대한 이 정보는 태아에 대한 모계 단상형의 유전을 결정하는 데 있어서 이용될 수

C. 좌위의 확인

모계 및 태아 DNA의 혼합물을 함유하는 생물학적 샘플의 분석 전에, 동안에 또는 후에 부모 게놈에 대한 데이터를 얻을 수 있다. 수컷 부모로부터의 생물학적 샘플을 서열분석함으로써 부계 게놈 서열을 얻을 수 있다. 태아 DNA를 필수적으로 함유하지 않는 생물학적 샘플, 예컨대 방혈된 조직 또는 모낭으로부터, 또는 임신 전에 채취한 또 다른 생물학적 샘플을 서열분석함으로써 모계 게놈 서열을 얻을 수 있다. 대안적으로, 임신 동안 채취한 샘플 또는 모계 혈장의 정량적 평가에 의해 수컷 부모 및/또는 암컷 부모의 게놈의 관련 부분은 추론될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 부모 중 어느 하나에 대한 유전자형 정보는 이후 다른 가족 구성원, 예를 들어 동시 임신의 태아의 형제자매로부터의 유전자형 정보, 또는 조부모의 유전자형 등과의 비교에 의해 부모의 단상형 정보로 연장될 수 있다. 부모의 단상형은 또한 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 다른 방법에 의해 해석될 수 있다. 이러한 방법의 예는 단일 분자 분석, 예컨대 디지털 PCR(Ding C and Cantor CR. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 7449-7453; Ruano G et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6296-6300), 정자 단상형 분석(Lien S et al. Curr Protoc Hum Genet 2002; Chapter 1:Unit 1.6) 및 영상화 기술(Xiao M et al. Hum Mutat 2007; 28: 913-921)에 기초한 방법을 포함한다. 다른 방법은 대립유전자 특이적 PCR(Michalatos-Beloin S et al. Nucleic Acids Res 1996; 24: 4841-4843; Lo YMD et al. Nucleic Acids Res 1991; Nucleic Acids Res 19: 3561-3567), 클로닝 및 제한 효소 분해(Smirnova AS et al. Immunogenetics 2007; 59: 93-8) 등에 기초한 것을 포함한다. 또 다른 방법은 집단에서의 단상형 블록의 분포 및 계통 불균형 구조에 기초하고, 이것은 모계 단상형이 통계 평가로부터 추론되게 한다(Clark AG. Mol Biol Evol 1990; 7:111-22; 10:13-9; Salem RM et al. Hum Genomics 2005; 2:39-66).

분석을 위한 좌위는 또한 특정한 구역, 예를 들어 단상형이 알고 있는 구역 또는 관심 있는 유전자 특징이 존재하는 구역에 대한 이의 근접성에 기초하여 선택될 수 있다. 따라서, 단상형이 알려진 구역 내의 좌위를 선택할 수 있다. 서로 가까운 좌위는 동일한 단상형과 관련될 수 있고, 이들 사이에 있어서 염색체 교차가 없는 한 단상형과 구분할 것이다. 사용자는 분석되는 염색체의 구역을 확대하거나 감소시키는 선택을 갖는다. 구역의 확대는 분석의 정확성을 증가시키는데, 왜냐하면 모계 샘플에서의 더 많은 DNA가 관련될 것이기 때문이다. 그러나, 구역의 확대는 또한 이들 사이에 있어서 교차 사건의 발생을 위협하고, 이런 경우 대립유전자의 유전은 단상형의 유전을 정확하게 예측할 수 없다.

일 실시형태에서, 분석하고자 하는 좌위는 질환 야기 유전자이다. 이 시나리오에서, 관심 있는 2개의 부계 대립유전자는 질환 야기 돌연변이 및 비 질환 야기 대립유전자일 수 있다. 다른 실시형태에서, 분석하고자 하는 좌위는 유전자 질환에 관여된 유전자와 관련된 다형이다. 이런 경우, 관심 있는 2개의 부계 대립유전자는 돌연변이체 유전자와 관련된 대립유전자 및 정상(즉, 비돌연변이체) 유전자와 관련된 또 다른 대립유전자일 것이다.

D. 임상 평가

부계 단상형이 유전적으로 유전 가능한 병증과 관련된 것을 위치시킴으로써 부계로 유전된 상염색체 우성 병증을 평가할 수 있다. 예를 들어, 디지털 PCR, 염색체 분류, 가족 연구 및 집단 단상형 정보로부터의 추론을 이용하여 이를 수행할 수 있다. 특정한 단상형과 관련된 부계 특이적 질환은 이후 모계 혈장에서 확인될 수 있다. 관심 있는 단상형에 존재하는 부계 특이적 대립유전자의 모계 샘플(예를 들어, 모계 혈장)에서의 존재는 태아 중 한 명 또는 둘 다가 병증을 유전 받는다는 것을 나타낼 수 있다.

모계 혈장에서 동일한 부계 단상형에 위치한 대립유전자를 확인함으로써 태아 중 한 명이 부계 단상형을 유전 받는지의 결정에 의해 상염색체 열성 병증을 평가할 수 있다. 질환 관련 대립유전자의 검출은 적어도 한 명의 태아가 질환 관련 부계 단상형을 유전 받는다는 것을 나타낼 수 있다. 따라서, 하나 이상의 제1 대립유전자 및/또는 하나 이상의 제2 대립유전자는 관심 있는 표현형과 관련된다. 그리고, 관심 있는 표현형은 질환 또는 질환 감수성일 수 있다.

III. 모계 유전에 대한 분석

임신에서 다태에 대한 모계 유전의 분석은 복잡한데, 왜냐하면 모계 기원의 DNA가 모친의 혈장에서 대부분의 DNA를 구성하기 때문이다. 태아 기원의 DNA는 (예를 들어, 10%의 차수의) 적은 분율을 나타내고, 이것은 쌍둥이 임신에서 태아 둘 다로부터의 DNA의 조합이다. 따라서, 정량적 접근법은 하기 기재된 바대로 태아 DNA를 구별하고 규명하기 위해 이용된다.

A. 상대 단상형 용량(RHDO) 분석

RHDO 분석을 위해, 본 발명의 일 실시형태는 모친이 이형접합성이고 부친이 동형접합성인 좌위의 카테고리에 집중한다. 이것은 모계 및 부계 대립유전자 둘 다를 동시에 분석할 필요성을 제거한다. 동형접합성인 SNP는 따라서 RHDO 분석에 대해 정보제공으로 정의된다.

도 3은 본 발명의 실시형태에 따라 2개의 유형의 좌위의 확인에 의한 가상적인 부친 및 모친의 단상형을 나타낸다. 모친이 이형접합성이고 부친이 동형접합성인 좌위만이 나타난다. 이 예시에서, 2개의 대립유전자(예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형(SNP))가 이 정보제공 좌위에 대해 확인된다. 다른 유형의 다형, 예를 들어 미세위성(microsatellite) 다형을 또한 사용할 수 있다. 토의의 일부가 SNP에 관한 것일 수 있지만, 다른 유형의 다형(변이)이 사용될 수 있다.

RHDO 분석의 일부로서, SNP는 α형 및 β형의 2개의 유형으로 분할될 수 있다. α형 SNP는 부계 대립유전자가 Hap I에 위치한 모계 대립유전자에 동일한 SNP 좌위이고, β형 SNP는 부계 대립유전자가 Hap II에 위치한 모계 대립유전자와 동일한 SNP 좌위이다. Hap I 및 Hap II의 정렬이 임의이므로, Hap I 및 Hap II는 분석 전에 상호교환되어 정의될 수 있다.

이 예에서, 부친이 좌위에서 동형접합성이므로, Hap III 및 Hap IV는 동일하다. 그러나, 다른 실시형태에서, 부친은 동형접합성이 아니지만, 예를 들어 유전된 부계 단상형을 결정함으로써 부계로 유전된 대립유전자를 알고 있다.

이란성 쌍둥이 임신에서, 모계 단상형의 유전에 대한 3가지 가능성이 존재한다:

ㆍ 태아 둘 다는 모친으로부터 Hap I를 유전 받는다(도 4a);

ㆍ 태아 둘 다는 모친으로부터 Hap II를 유전 받는다(도 5a);

ㆍ 모친으로부터 한 명의 태아는 Hap I를 유전 받고, 다른 한 명은 Hap II를 유전 받는다(도 6a).

도 4a는 모친 및 부친의 단상형을 나타내고, 이것은 도 3에서와 동일하다. 태아 둘 다는 모친으로부터 Hap I를 유전 받은 것으로 나타났다. Hap III 또는 Hap IV가 도시된 좌위에서 동등하면서, 각각의 태아의 다른 단상형은 둘 다에 상응한다.

도 4b는 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap I를 유전 받을 때 모계 혈장에서의 부친 및 모친이 공유한 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도의 예시적인 계산을 나타낸다. 각각의 태아가 모계 혈장에서의 전체 DNA의 10%에 기여하고, 모친이 전체 혈장 DNA의 80%에 기여한다고 추정한다. α형 SNP의 경우, B 대립유전자는 모계 게놈에만 존재한다. 따라서, 모계 혈장에서의 B 대립유전자의 분획 농도는 40%이고, A 대립유전자(모친과 부친 사이의 공유된 대립유전자)의 분획 농도는 60%이다. β형 SNP의 경우, 태아 둘 다 및 모친은 A 및 B 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 따라서, 모계 혈장에서의 A 대립유전자의 분획 농도는 50%이다.

도 5b는 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap II를 유전 받을 때 모계 혈장에서의 부친 및 모친이 공유한 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도의 예시적인 계산을 나타낸다. 각각의 태아는 모계 혈장에서 전체 DNA의 10%에 기여하는 것으로 추정되고, 모친은 80%에 기여한다. α형 SNP의 경우, 태아 둘 다 및 모친은 A 및 B 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 따라서, 모계 혈장에서의 A 대립유전자 및 B 대립유전자 둘 다의 분획 농도는 50%이다. β형 SNP의 경우, B 대립유전자는 모계 게놈에만 존재하지만, 태아에 존재하지 않는다. 따라서, 모계 혈장에서의 B 대립유전자의 분획 농도는 40%이고, A 대립유전자의 분획 농도는 60%이다.

도 6b는 모친으로부터 한 명의 태아가 Hap I를 유전 받고 다른 태아가 Hap II를 유전 받을 때 모계 혈장에서의 부친 및 모친이 공유한 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도의 예시적인 계산을 나타낸다. 각각의 태아가 모계 혈장에서 전체 DNA의 10%에 기여하고 모친이 전체 혈장 DNA의 80%에 기여한다고 추정하면, A 대립유전자의 분획 농도는 α형 및 β형 SNP 둘 다에 대해 55%일 것이다.

B. 예측된 값과 실제 분획 농도의 비교

상기 예는 태아 DNA의 특정한 분획 농도를 추정한다. 태아 특이적 후성적 마커 및 다른 좌위에서의 모친과 부친 사이의 다형 마커의 분석을 포함하는 여러 방법에 의해 태아 DNA의 분획 농도를 결정할 수 있다. 모계 혈장에서의 쌍둥이 둘 다의 분획 농도 및 각각의 태아의 기여도를 측정하는 방법은 US 2013/0059733 A1에 기재되어 있다.

3개의 시나리오를 구별하기 위해 A 대립유전자 또는 B 대립유전자(또는 둘 다)의 분획 농도에서 통계 분석을 수행할 수 있다. 샘플에서의 DNA 단편의 전체 양의 10%에 기여하는 각각의 태아의 예가 하기 토의를 위해 여전히 추정된다. 태아가 상이한 태아 DNA 백분율에 기여하는 실시형태는 하기 부문에 다뤄진다.

도 7a는 두 명의 태아에 대한 모계 단상형 유전의 3개의 상이한 시나리오에 대해 모계 특이적 대립유전자(B 대립유전자) 및 부친 및 모친이 공유한 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 나타낸다. 도 7a에서, 두 명의 태아의 각각은 전체 모계 혈장 DNA의 10%와, α형 SNP 및 β형 SNP에 대해 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 예측된 분획 농도에 기여한다고 추정된다. SNP 좌위에 대한 A 대립유전자의 분획 농도는 실험적으로 측정될 수 있고, 이후 어떤 유전 패턴이 최고로 가장 그럴싸한지를 결정하기 위해 예측된 값과 비교될 수 있다.

α형 및 β형 SNP에 대한 총 분획 농도를 계산하기 위해 관심 있는 구역 내의 동일한 유형의 모든 SNP(α 또는 β)의 A 및 B 대립유전자에 대한 대립유전자 수가 함께 합쳐진다. 예측된 값으로부터의 총 분획 농도의 편차를 결정할 수 있다. 가장 작은 전체 편차를 발생시키는 패턴은 쌍둥이 태아에서 모계 유전인 것으로 추론될 수 있다.

도 7a에서, 모친으로부터 한 명의 태아가 Hap I를 유전 받고 다른 태아가 Hap II를 유전 받을 때, α형 및 β형 SNP를 이용하여 결정된 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도는 동일할 것이다. 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap I를 유전 받는 경우, A 대립유전자의 분획 농도는 β형 SNP에서 보다는 α형 SNP에 더 높을 것이다. 반대로, 태아 둘 다가 모계 Hap II를 유전 받는 경우, 분획 농도는 α형 SNP에서보다는 β형 SNP에 더 높을 것이다.

α형 및 β형 SNP를 이용한 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도는 이들이 통계학적으로 상이한 경우 비교될 수 있다. 예를 들어, α형 및 β형 SNP에 기초한 공유된 대립유전자의 분획 농도가 통계학적으로 상이하지 않은 경우, 모친으로부터 한 명의 태아는 Hap I를 유전 받고 다른 한 명은 Hap II를 유전 받는다. 대안적으로, α형 SNP에 대한 공유된 대립유전자의 분획 농도가 β형 SNP에서 보다 통계학적으로 더 높은 경우, 태아 둘 다는 모친으로부터 Hap I를 유전 받는다. α형 SNP에 대해 공유된 대립유전자의 분획 농도가 β형 SNP에서 보다 통계학적으로 더 낮은 경우, 이것은 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap II를 유전 받는다는 것을 나타낸다.

다른 실시형태에서, α형 좌위 및 β형 좌위에 대한 분획 농도(또는 다른 양)의 비율을 산출할 수 있다. 이 비율은 칼럼(710)에서의 비율과 비교될 수 있다.

α형 및 β형 SNP에 대해 공유된 대립유전자의 분획 농도가 상당히 상이한 경우, 상이한 통계 시험을 이용할 수 있다. 이 방법의 예는 순차 확률 비율 시험(sequential probability ratio testing: SPRT), 스튜던트 t 시험, 만-휘트니(Mann-Whitney) 순위합 시험, 카이 스퀘어(Chi square) 시험을 포함한다(그러나, 이들로 제한되지는 않음).

도 7b는 특정한 유형의 모든 좌위에 대해 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 예측하기 위해 어떻게 각각의 정보제공 SNP 좌위에서의 개별적인 분획 농도가 이용될 수 있는지를 예시한다. 모든 SNP 좌위에 대한 분획 농도의 분포를 이후 구축할 수 있고, 분포의 피크로부터 측정된 분획 농도를 결정할 수 있다. 모든 A 대립유전자의 수 및 모든 B 대립유전자의 수를 합하는 대신에 이 통계 분석을 수행할 수 있다.

따라서, 각각의 좌위에서의 양의 개별적인 비율(예를 들어, 분획 농도)을 산출할 수 있다. 전체 비율(예를 들어, 전체 분획 농도)을 얻기 위해 이 개별적인 비율을 이후 이용할 수 있다. 따라서, 컷오프와 비교될 수 있는 전체 비율을 결정하기 위해 개별적인 비율의 평균, 중앙치 또는 다른 통계 값(예를 들어, 분포의 피크)을 이용할 수 있다.

C. 좌위의 유형 둘 다를 이용한 모계 유전을 결정하기 위한 계획

일 실시형태에서, 모계 단상형의 유전을 결정하기 위한 정량적 과정에서 좌위의 유형 둘 다를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아 둘 다가 동일한 단상형을 유전 받는지를 결정하기 위해 α형 좌위를 이용할 수 있다. 그리고, 각각의 태아가 상이한 단상형을 유전 받는지를 결정하기 위해 β형 좌위를 이용할 수 있다.

도 8은 본 발명의 실시형태에 따라 좌위의 유형 둘 다를 이용한 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법(800)의 흐름도이다. 방법(800)은 이란성 쌍둥이 태아에서의 모계 유전을 분석할 수 있다. 암컷 부모로부터 얻은 샘플에서 분석을 수행하고, 여기서 샘플은 각각의 태아로부터의 모계 DNA 및 태아 DNA(예를 들어, 무세포 DNA)를 함유한다. 샘플이 태아 DNA를 함유하는 한, (예를 들어, 본 명세서에 정의된 바와 같은) 임의의 생물학적 샘플을 사용할 수 있다. 다른 방법에서처럼, 방법(800)은 컴퓨터 시스템을 이용한다.

블록(810)에서, 제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인한다. 암컷은 각각의 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자 및 각자의 제2 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 제1 모계 단상형은 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형은 제2 대립유전자를 갖는다. 제1 좌위는 특정한 염색체 상의 관심 있는 유전자 특징에 가까울 수 있다. 좌위의 제1 그룹은 본 명세서의 예에 기재된 α형 좌위에 상응할 수 있다.

블록(820)에서, 두 명의 태아가 부친으로부터 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자를 유전 받는지가 결정된다. 일 실시형태에서, 부친은 각자의 제1 대립유전자에 대해 동형접합성인 것으로 결정될 수 있고, 따라서 부계 단상형이 유전되는지와 무관하게 제1 대립유전자가 유전될 것이다. 부계 샘플을 사용하여 부친의 이 유전자형 분석을 수행할 수 있다. 다른 실시형태에서, 유전된 부계 단상형을 결정하기 위해 방법(200)을 이용할 수 있다. 부계 단상형이 결정되므로, 제1 좌위에서 부친이 이형접합성인 경우 제1 좌위에서의 부계로 유전된 대립유전자를 결정할 수 있다.

따라서, 처음에 부계 유전이 결정되면, 부친이 동형접합성이고 모친이 이형접합성인 좌위로 모계 유전의 분석을 제한하는 것이 필요하지 않다. 부모 유전은 부계 대립유전자(들)가 두 명의 태아로 전달된다는 것을 기술하므로, 부모 둘 다가 이형접합성인 좌위를 또한 사용할 수 있다. 이 정보에 기초하여, 좌위는 제1 그룹 또는 제2 그룹에 해당하는 것으로 분류될 수 있다.

블록(830)에서, 제1 염색체 상의 하나 이상의 제2 좌위의 제2 그룹을 확인한다. 제2 그룹의 각각의 제2 좌위에서 제1 모계 단상형은 각자의 제3 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형은 각자의 제4 대립유전자를 갖는다. 좌위의 제1 그룹은 본 명세서의 예에 기재된 β형 좌위에 상응할 수 있다.

블록(840)에서, 두 명의 태아가 부친으로부터 제2 좌위에서 각자의 제4 대립유전자를 유전 받는 것으로 결정된다. 부친으로부터의 제4 대립유전자의 유전의 결정은 블록(820)에 대해 상기 기재된 바대로 결정될 수 있다. 예를 들어, 부친은 제2 좌위의 각각의 좌위에서 각자의 제4 대립유전자에 대해 동형접합성일 수 있다. 다른 실시형태에서, 부친은 제2 좌위에서 이형접합성일 수 있지만, 상이한 일련의 좌위(예를 들어, 모친이 동형접합성인 것)를 이용할 수 있는 방법(200)을 이용하여 각자의 제4 대립유전자가 특정한 부계 단상형으로부터 유전된다는 것을 결정하기 위해 다른 좌위를 이용할 수 있다.

블록(850)에서, 컴퓨터 시스템은 암컷으로부터의 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제1 좌위에 존재하는 각자의 제1 대립유전자의 제1 양 및 각자의 제2 대립유전자의 제2 양을 측정한다. 예를 들어, DNA 단편은 서열 리드를 얻기 위해 서열분석될 수 있고, 리드는 기준 게놈에 정렬되어 제1 좌위에 정렬되는 리드를 확인할 수 있다. 각각 제1 양 및 제2 양을 결정하기 위해 제1 대립유전자 및 제2 대립유전자를 갖는 리드의 수를 계수할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 언급되거나 문헌에 포함된 바대로 다른 기술을 이용한다.

블록(860)에서, 컴퓨터 시스템은 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제2 좌위에 존재하는 각자의 제3 대립유전자의 제3 양 및 각자의 제4 대립유전자의 제4 양을 측정한다. 제1 양 및 제2 양과 유사한 방식으로 제3 양 및 제4 양을 산출할 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 예를 들어, 특정한 대립유전자의 분획 농도를 결정하기 위해 양을 정규화할 수 있다. 따라서, 제1 양은 모든 제1 좌위에서 DNA 단편의 전체 수로 나눈 제1 대립유전자를 갖는 DNA 단편의 수에 상응할 수 있다. 유사한 방식으로 제2 양의 정규화를 결정할 수 있다. 제2 좌위에서 DNA 단편의 전체 수를 사용하여 제3 양 및 제4 양의 정규화를 결정할 수 있다.

블록(870)에서, 4개의 양을 이용하여 두 명의 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정한다. 일 실시형태에서, 4개의 결정된 양으로부터 하기와 같이 모계 유전을 이후 결정한다:

(ⅰ) 제1 양이 제2 양보다 통계학적으로 더 높고 제3 양이 제4 양과 통계학적으로 동일할 때, 태아 둘 다는 제1 모계 단상형을 유전 받는다;

(ⅱ) 제1 양이 제2 양과 통계학적으로 동일하고 제4 양이 제3 양보다 통계학적으로 더 높을 때, 태아 둘 다는 제2 모계 단상형을 유전 받는다; 또는

(ⅲ) 제1 양이 제2 양보다 통계학적으로 더 높을 때 및 제4 양이 제3 양보다 통계학적으로 더 높을 때, 태아 중 한 명은는 제1 모계 단상형을 유전 받고 다른 한 명은 제2 모계 단상형을 유전 받는다.

예를 들어, 특정한 수의 표준 편차를 요하는 컷오프 값을 이용하여 양이 통계학적으로 더 높은지를 결정할 수 있다. 컷오프는 태아 DNA 분획 농도에 따라 달라질 수 있고, 이것은 모든 태아 및/또는 개별적인 태아에 대해 단지 계산될 수 있다.

일 실시형태에서, 제1 양을 제2 양과 컷오프 값과 직접 비교할 수 있다. 이러한 방식으로, 2개의 양 사이의 차이는 제1 양이 제2 양과 컷오프 값보다 클 때 통계학적으로 더 높은 것으로 간주될 수 있다.

다른 실시형태에서, 제1 양 및 제2 양(예를 들어, 차이 또는 비율)으로부터 매개변수를 결정하고, 매개변수를 컷오프와 비교하여 제1 양이 제2 양보다 통계학적으로 더 높은지를 확인한다. 통계 차이 또는 통계 동일의 다른 결정에 동일사항을 수행할 수 있다. 일 실행에서, 상이한 결정에 대한 컷오프 값은 변할 수 있고, 예를 들어, (ⅲ)에 대한 컷오프는 (ⅰ) 및 (ⅱ)에서보다 더 적은 통계 편차를 요할 수 있다.

상기 기재된 바대로, 태아 DNA의 백분율이 20%(각각의 태아가 10%에 기여)인 경우, (ⅰ) 및 (ⅱ)에 대해 통계학적으로 더 높은 것에 대한 통계 동일의 결정은 50%(동일) 내지 60%(더 높은 것)를 구별할 수 있다. 따라서, 매개변수(예를 들어, 분획 농도)가 50% 내지 60%의 반인 55%보다 큰 경우, 통계를 결정하기 위한 컷오프가 참일 것이다. 제1 양 대 제2 양의 비율을 또한 이용할 수 있고, 이것은 α형 좌위에서 A 대립유전자인 60%의 경우에 대해 1.5를 제공할 것이다.

(ⅲ)의 경우, 통계학적으로 더 높은 것의 결정은 50% 내지 55%를 구별할 수 있다. 따라서, 컷오프는 원하는 감수성 및 특이성에 따라 51% 내지 54%일 수 있다. 제1 양 대 제2 양의 비율을 또한 이용할 수 있고, 이것은 α형 좌위에서 A 대립유전자인 55%의 경우에 대해 1.22를 제공할 것이다.

D. 일 유형의 좌위를 이용한 모계 유전을 결정하는 방법

몇몇 실시형태에서, 오직 일 유형의 좌위를 이용한다. 예를 들어, 도 7a는 α형 좌위에 대한 50%, 55% 및 60%의 3개의 차이 비율을 나타낸다. 이 상이한 분류 사이를 구별하기 위해 비율을 다양한 컷오프와 비교할 수 있다.

도 9는 본 발명의 실시형태에 따라 일 유형의 좌위를 이용한 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법(900)의 흐름도이다. 방법(900)은 모친 및 태아로부터 DNA(예를 들어, 무세포 DNA)를 포함하는 모계 생물학적 샘플로부터의 데이터를 이용한다.

블록(910)에서, 제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인한다. 각각의 제1 좌위에서 모친은 각자의 제1 대립유전자 및 각자의 제2 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 제1 모계 단상형은 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형은 제2 대립유전자를 갖는다. 블록(810)과 유사한 방식으로 블록(910)을 수행할 수 있다.

블록(920)에서, 두 명의 태아가 부친으로부터 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자를 유전 받는다는 것이 결정된다. 블록(820)과 유사한 방식으로 블록(920)을 수행할 수 있다. 상기 기재된 바대로, 다양한 순서로 다양한 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 부모 게놈에 대한 데이터는 모계 샘플의 분석 전에, 동안에 또는 후에 얻어질 수 있고, 임의의 적합한 DNA 기술(예를 들어, 서열분석 또는 PCR)을 이용할 수 있다.

블록(930)에서, 컴퓨터 시스템은 모계 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제1 좌위에 존재하는 각자의 제1 대립유전자의 제1 양 및 각자의 제2 대립유전자의 제2 양을 측정한다. 블록(850)과 유사한 방식으로 블록(920)을 수행할 수 있다.

블록(940)에서, 제1 양 및 제2 양의 비율을 계산한다. 비율은 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 제2 양으로 나눈 제1 양; 제1 양으로 나눈 제2 양; 제1 양과 제2 양의 합으로 나눈 제1 양; 또는 제1 양과 제2 양의 합으로 나눈 제2 양.

블록(950)에서, 비율을 이용하여 두 명의 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정한다. 일 실시형태에서, 이후 하기한 바대로 4개의 측정된 양으로부터 모계 유전을 결정한다:

(ⅰ) 비율이 제1 컷오프보다 클 때, 태아 둘 다가 제1 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 것;

(ⅱ) 비율이 제2 컷오프보다 작을 때, 태아 둘 다가 제2 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 것; 또는

(ⅲ) 비율이 제3 컷오프보다 작고 제4 컷오프보다 클 때(제3 컷오프는 제1 컷오프보다 작거나 이와 같고, 제4 컷오프는 제2 컷오프보다 크거나 이와 같고 제3 컷오프보다 작음), 태아 중 한 명이 제1 모계 단상형을 유전 받고 다른 태아가 제2 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 것.

이 분석에서 이용된 컷오프 값은 모계 샘플에서 각각의 태아로부터의 DNA의 상대 양 또는 백분율로부터 결정될 수 있다. 컷오프는 다양한 분류 사이를 구별할 수 있다. 도 7a의 예에서, 제1 컷오프는 60% 내지 55%를 구별할 수 있고, 구체적으로 샘플이 Hap I를 유전 받은 태아 둘 다로서 확인될 수 있는지를 결정한다. 더 높은 특이성을 얻기 위해 일어날 수 있는 것처럼, 부정확한 범위가 있을 때, 제3 컷오프 값은 제1 컷오프보다 작을 수 있다. 제2 컷오프는 50% 내지 55%를 구별할 수 있고, 구체적으로 샘플이 Hap II를 유전 받은 태아 둘 다로서 확인될 수 있는지를 결정한다. 더 높은 특이성을 얻기 위해 일어날 수 있는 것처럼, 부정확한 범위가 있을 때, 제4 컷오프는 제2 컷오프보다 클 수 있다.

일 실시형태에서, 수컷 환자와 암컷 환자 사이에 공유된 대립유전자의 분획 농도로부터 모계 유전을 직접 결정하기 위해, 2개의 컷오프 값을 확립한다. 태아 둘 다 또는 한 명의 태아가 각자의 단상형을 유전 받거나, 어느 태아도 유전 받지 않는 3개의 시나리오가 존재한다. 각각의 시나리오는 각각 도 7b에 도시된 성질의 관련 대립유전자의 분획 농도의 분포(중앙치가 감소)를 형성할 것이다. 예를 들어, 태아 둘 다가 생물학적 샘플에서 DNA의 5%에 기여하는 경우, 3개의 시나리오에 대한 분획 농도는 각각 약 60%, 55% 및 50%의 중앙치를 가질 것이다(도 7a). 시나리오 사이를 분배하도록 컷오프 값을 설정한다. 한 명보다는 두 명의 태아에 의해 유전을 구별하는 제1 또는 더 높은 컷오프가 약 57.5%에서 설정될 것이다. 어느 태아에 의해 구별되지 않는 것보다는 한 명의 태아에 의해 유전을 구별하는 제2 또는 더 낮은 컷오프가 약 52.5%에서 설정될 것이다.

부친으로부터의 생물학적 샘플을 서열분석함으로써 부계 게놈 서열을 얻을 수 있다. 태아 DNA를 필수적으로 함유하지 않는 생물학적 샘플, 예컨대 방혈된 조직 또는 모낭으로부터, 또는 임신 전에 채취한 생물학적 샘플을 서열분석함으로써 모계 게놈 서열을 얻을 수 있다. 대안적으로, 임신 동안 채취한 샘플 또는 모계 혈장의 정량적 평가에 의해 수컷 부모 및/또는 암컷 부모의 게놈의 관련 부분은 추론될 수 있다.

분석을 위한 좌위는 또한 특정한 염색체 구역 또는 관심 있는 유전자 특징에 대한 이의 근접성에 기초하여 선택된다. 제1 좌위는 서로 가까우므로 선택될 수 있고, 이들 사이에 있어서 염색체 교차가 없는 한 부모 단상형과 구분할 것이다. 사용자는 분석되는 염색체의 구역을 확대하거나 감소시킬 수 있다. 구역의 확대는 분석의 정확성을 증가시키는데, 왜냐하면 모계 샘플에서의 더 많은 DNA가 관련될 것이기 때문이다. 그러나, 구역의 확대는 또한 이들 사이에 있어서 교차 사건의 발생을 위협하고, 이런 경우 대립유전자의 유전은 단상형의 유전을 정확하게 예측할 수 없다.

일 실시형태에서, 각각의 좌위에서의 대립유전자의 비율은 이후 함께 모든 대립유전자의 수로 분리하여 나눈 각각의 대립유전자의 수로 계산된다. 모계 샘플의 리드의 수를 증가시키는 것은 평가의 정확성을 증가시킨다. 각각의 좌위를 분리하여 분석할 수 있고 예를 들어, 도 7b에 도시된 바대로, 합의를 위해 결과를 조합할 수 있다. 대안적으로, 모든 좌위에서의 대립유전자의 수를 함께 합한다.

E. 모계 혈장에 대한 상이한 양의 DNA에 기여하는 태아

임신한 여성이 쌍둥이 태아를 수태할 때, 두 명의 태아는 모계 순환으로 상이한 양의 DNA를 방출할 수 있다. 그 결과, 두 명의 태아로부터의 태아 DNA 분획 농도는 다를 수 있다.

도 10a는, 태아가 상이한 태아 DNA 백분율에 기여할 때, 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap I를 유전 받을 때, α형 및 β형 SNP에 대한 모계 혈장에서의 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 나타낸다. 이 예에서, 태아 1은 a%에 기여하고, 태아 2는 b%에 기여한다. β형 좌위의 경우, 대립유전자 둘 다가 동일하므로, 백분율은 50%에 머문다. 그러나, A 대립유전자가 더 풍부하므로, α형 좌위에 대한 백분율은 변한다. 백분율은 F = 50% + (a%+b%)/2의 식을 따른다.

도 10b는, 태아가 상이한 태아 DNA 백분율에 기여할 때, 태아 둘 다가 모친으로부터 Hap II를 유전 받을 때, α형 및 β형 SNP에 대한 모계 혈장에서의 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 나타낸다. 이 예에서, 태아 1은 a%에 기여하고, 태아 2는 b%에 기여한다. α형 좌위의 경우, 대립유전자 둘 다가 동일하므로, 백분율은 50%에 머문다. 그러나, A 대립유전자가 더 풍부하므로, β형 좌위에 대한 백분율은 변한다. 백분율은 F = 50% + (a%+b%)/2의 식을 따른다.

도 11a는, 태아가 상이한 태아 DNA 백분율에 기여할 때, 모친으로부터 한 명의 태아가 Hap I를 유전 받고 다른 태아가 Hap II를 유전 받을 때, α형 및 β형 SNP에 대한 모계 혈장에서의 공유된 대립유전자(A 대립유전자)의 분획 농도를 나타낸다. 이 예에서, 태아 1은 a%에 기여하고, 태아 2는 b%에 기여한다. 좌위 둘 다의 경우, 풍부한 대립유전자의 백분율은 태아 기여도에 따라 변한다. α형 좌위의 경우, 백분율은 F = 50% + a%/2가 된다. 그리고, β형 좌위에 대한 백분율은 F = 50% + b%/2가 된다.

도 11b는 3개의 시나리오, 즉 태아 둘 다가 모계 Hap I를 유전 받는 것, 태아 둘 다가 모계 Hap II를 유전 받는 것 및 두 명의 태아가 상이한 모계 단상형을 유전 받는 것에서의 α형 및 β형 SNP를 이용한 A 대립유전자의 분획 농도 및 이 2개의 농도의 비율의 표(1150)를 나타낸다. 칼럼(1160)은 3개의 시나리오에 상응하는 α형 좌위에 대한 공유된 대립유전자 A에 대한 예상된 비율을 나타낸다. 칼럼(1160)은 3개의 시나리오에 상응하는 β형 좌위에 대한 공유된 대립유전자 A에 대한 예상된 비율을 나타낸다. 칼럼(1180)은 다른 칼럼으로부터의 매개변수의 비율, 즉 β형에 대한 값에 대한 α형에 대한 값의 비율을 나타낸다. 다음 부문에 기재된 바대로, 실시형태는 좌위의 유형 둘 다로부터의 농도의 비율에 대한 컷오프를 결정하기 위해 칼럼(1180)에서의 값을 이용할 수 있다.

F. 비율의 비율을 이용하는 방법

일 실시형태에서, 방법(900)은 (예를 들어, α형 및 β형에 대한 비율의 칼럼(1180)에서처럼) 비율을 이용할 수 있다. 예를 들어, 블록(940)에서 이용된 비율은 칼럼(1180)에서의 비율일 수 있다. 이러한 비율을 이용하기 위해, 좌위의 유형 둘 다를 이용한다. 추가로, 칼럼(1180)에서의 비율을 이용하여 방법(800)을 수행할 수 있다. 이러한 방법은 하기 기재되어 있다.

도 12는 본 발명의 실시형태에 따라 좌위의 유형 둘 다로부터의 값의 비율을 이용하여 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법(1200)의 흐름도이다. 방법(1200)은 모친 및 태아로부터의 DNA(예를 들어, 무세포 DNA)를 포함하는 모계 생물학적 샘플로부터의 데이터를 이용한다.

방법(800)의 블록(810-840)과 동일한 방식으로 블록(1210-1240)을 수행할 수 있다.

블록(1250)에서, 모계 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제1 좌위에 존재하는 각자의 제1 대립유전자의 제1 양 및 각자의 제2 대립유전자의 제2 양의 제1 비율을 계산한다. 일 실시형태에서, 제1 비율은 제2 양으로 나눈 제1 양이다. 다른 실시형태에서, 제1 비율은 제1 대립유전자의 분획 농도를 제공하기 위해 제1 양과 제2 양의 합으로 나눈 제1 양이다.

블록(1260)에서, 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제2 좌위에 존재하는 각자의 제3 대립유전자의 제3 양 및 각자의 제4 대립유전자의 제4 양의 제2 비율을 계산한다. 본 명세서에 기재된 바대로, 생물학적 샘플의 측정으로부터, 예를 들어 서열분석 또는 PCR 데이터를 이용하여 제1 양, 제2 양, 제3 양 및 제4 양을 얻는다.

블록(1270)에서, 제1 비율 및 제2 비율의 제3 비율을 계산한다. 일 실시형태에서, 제3 비율은 도 11b에 도시된 바대로 제4 양으로 나눈 제3 양이다. 다른 실시형태에서, 제3 비율은 제3 양과 제4 양의 합으로 나눈 제3 양이다.

블록(1280)에서, 비율을 이용하여 두 명의 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정한다. 일 실시형태에서, 하기한 바대로 4개의 측정된 양으로부터 모계 유전을 이후 결정한다:

(ⅰ) 제3 비율이 제1 컷오프를 초과할 때, 태아 둘 다가 제1 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 것,

(ⅱ) 제3 비율이 제2 컷오프보다 작을 때(제1 컷오프는 제2 컷오프보다 큼), 태아 둘 다가 제2 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 것, 또는

(ⅲ) 제3 비율이 제3 컷오프보다 작고 제4 컷오프보다 클 때(제3 컷오프는 제1 컷오프보다 작거나 이와 같고, 제4 컷오프는 제2 컷오프보다 크거나 이와 같고 제3 컷오프보다 작음), 태아 중 한 명이 제1 모계 단상형을 유전 받고, 다른 태아가 제2 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 것.

일 실시형태에서, 제1 비율(α형) 또는 제2 비율(β형)이 더 높은지를 처음에 결정함으로써 블록(1280)을 수행할 수 있다. 이는 태아 둘 다가 Hap I 또는 Hap II를 유전 받는지를 구별할 수 있다. 이러한 결정 후, 이 선택사항 중 오직 1개가 남을 것이다. 이후, 제3 비율이 2개의 남은 값과 더 가까운지를 결정할 수 있다. 예를 들어, a > b인 경우, α형 및 β형 좌위에 의한 농도의 비율이 2개의 값 중 1개에 더 가까운지를 결정할 수 있다:

.

임의의 적합한 통계 시험을 이용하여 사용된 특정한 컷오프 또는 역치 값을 결정할 수 있다. 통계 시험, 예를 들어 순차 확률 비율 시험(SPRT), 정상 혼합물 모드 l(McLachlan G and Peel D. Multivariate normal mixtures. Finite mixture models 2004: p81-116. John Wiley & Sons Press), 이항식 혼합물 모델 및 포이즌 혼합물 모델(McLachlan G and Peel D. Mixtures with non-normal components, Finite mixture models 2004: p135-174. John Wiley & Sons Press)(이들로 제한되지는 않음)이 본 명세서에 기재된 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 제3 비율이 상기 2개의 값으로부터 통계학적으로 상이한 경우 컷오프를 결정할 수 있다. 대안적으로, 참인 값이 시험된 사례의 비율 값과 더 필적하는지를 결정하기 위해 컴퓨터 모의를 이용할 수 있다(Qu JZ et al. Clin Chem. 2013;59:427-35).

G. 임상 평가

질환 좌위와 관련된 염색체 구역을 분석함으로써 모계로 유전된 상염색체 질환을 평가할 수 있다. 질환 대립유전자와 관련된 모계 단상형이 태아 둘 다에 의해 유전되는 경우, 태아 둘 다는 그 병증으로 영향을 받을 것이다. 두 명의 태아가 상이한 모계 단상형을 유전 받는 것으로 추론되는 경우, 태아 중 오직 한 명이 영향을 받을 것이다. 태아 둘 다가 정상 대립유전자와 관련된 모계 단상형을 유전 받는 경우, 태아 둘 다가 영향을 받지 않을 것이다.

부계 단상형의 유전을 고려함으로써 상염색체 열성 질환을 평가할 수 있다. 태아 둘 다가 질환 대립유전자와 관련된 부계 단상형을 유전 받는 경우, 모계 단상형의 유전의 분석에 기초하여, 본 발명자들은 태아가 그 병증에 의해 영향을 받거나 보균자일 수 있는지를 결정할 수 있다. 태아 둘 다가 정상 부계 대립유전자를 유전 받는 경우, 모계 단상형의 유전의 분석은 태아가 병증의 보균자인지를 결정할 수 있다. 두 명의 태아가 상이한 부계 단상형 및 상이한 모계 단상형을 유전 받는 경우, 한 명의 태아가 영향받고 다른 태아가 정상인 50% 가능성이 있고, 태아 둘 다가 그 병증의 보균자인 50% 가능성이 있다.

IV. 모친 및 부친은 이형접합성이다

연장에 의해, 상기 기재된 실시형태 뒤의 원칙은 유전의 다른 패턴에 적용될 수 있다. 상기 언급된 바대로, 동일한 부계로 유전된 대립유전자는 태아 둘 다에 의해 유전될 수 있다. 그리고, 부계로 유전된 대립유전자는 부친이 이형접합성인 경우에도 결정될 수 있다. 예를 들어, 부계로 유전된 단상형이 모친이 동형접합성이고 부친이 이형접합성인 좌위로부터 결정될 수 있고, 이후 단상형에서 다른 좌위에서의 부계로 유전된 대립유전자가 결정될 수 있다. 그러나, 부계로 유전된 대립유전자를 알고 있지 않을 때 몇몇 실시형태를 이용할 수 있다.

일 실시형태에서, 모계 및 부계 유전자형 둘 다가 A 대립유전자 및 B 대립유전자 둘 다에 대해 이형접합성인 좌위를 이용하여 모계 유전을 결정할 수 있고, 부계로 유전된 대립유전자는 모든 태아 중에서 동일하지 않거나 알고 있지 않다. 모계 혈장에서의 이 2개의 단상형의 존재의 측정은 5개의 범위로 분할될 것이다. 예를 들어, 두 명의 태아가 각각 모계 혈장에서 DNA의 10%에 기여하는 경우, 측정된 A 대립유전자의 기여도 분율은 (태아 둘 다가 동형접합성 B인 경우) 대략 40%일 것이고; (한 명의 태아가 동형접합성 B이고 다른 태아가 이형접합성인 경우) 45%일 것이고; (태아 둘 다가 이형접합성인 경우 또는 한 명이 동형접합성 A이고 다른 한 명이 동형접합성 B인 경우) 50%일 것이고; (한 명의 태아가 동형접합성 A이고 다른 태아가 이형접합성인 경우) 55%일 것이고; (둘 다가 동형접합성 A인 경우) 60%일 것이다. 4개의 가능한 시나리오를 분리하기 위해, 5개의 컷오프 양을 정의한다. 이 복잡함을 해결하기 위해, 부모 좌위가 동형접합성 A인 경우보다 통상적으로 더 많은 DNA 리드가 혈장 샘플에 필요하다.

모계 유전은 또한 각각의 좌위에서의 2개 초과의 대립유전자 변이가 존재할 때 결정될 수 있다. 따라서, 특정한 좌위에서 모계 유전자형이 AB이고 부계 유전자형이 CD인 경우, 모계 혈장에서 측정된 DNA의 양은 분할되어서 A의 기여도 분율이 (태아 둘 다가 BC 또는 BD인 경우) 40%, (태아가 BC 또는 BD와 조합된 AC 또는 AD인 경우) 45%; 및 (태아 둘 다가 AC 또는 AD인 경우) 50%로 분할될 것이다. 모계 유전자형이 AB이고 부계 유전자형이 AC인 경우, 부모 유전자형이 A 대립유전자의 면에서 AB이지만, B 대립유전자의 면에서 더 낮은 경우에서처럼, 모계 혈장에서 측정된 DNA의 양은 5개의 범위로 분할될 것이다.

도 13은 본 발명의 실시형태에 따라 모친 및 부친이 이형접합성인 수컷에 의해 수정된 암컷의 두 명의 태아에서 모계 단상형의 유전을 분석하는 방법(1300)의 흐름도이다. 방법(1300)은 예를 들어 암컷 및 두 명의 태아의 무세포 DNA를 포함하는 모친으로부터의 생물학적 샘플을 이용한다.

블록(1310)에서, 제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인한다. 각각의 제1 좌위에서 암컷은 각자의 제1 대립유전자 및 각자의 제2 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 제1 모계 단상형은 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형은 제2 대립유전자를 갖는다. 수컷은 또한 제1 좌위에서 이형접합성이다. 제1 그룹은 좌위 중 어느 한 유형일 수 있다.

블록(1320)에서, 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제1 좌위에 존재하는 각자의 제1 대립유전자의 제1 양을 측정한다. 다른 측정 조작과 유사한 방식으로 블록(1320)을 수행할 수 있다.

블록(1330)에서, 제1 좌위 유래의 생물학적 샘플의 DNA 단편의 제2 양을 측정한다. 제2 양은 제1 좌위 중 하나에 위치하는 임의의 DNA 단편에 상응할 수 있다. (임의의 대립유전자를 갖는) DNA 단편이 제1 좌위 중 하나에 유래한다는 것을 나타내는 임의의 신호는 제2 양을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 신호는 제1 좌위 중 하나에 정렬된 서열 리드 또는 제1 좌위 중 하나에 대한 프로브에 상응하는 PCR에서의 웰의 색상일 수 있다.

블록(1340)에서, 제1 양 및 제2 양의 비율을 계산한다. 비율은 예를 들어 본 명세서에 기재된 것과 같은 임의의 비율일 수 있다.

블록(1350)에서, 비율을 이용하여 두 명의 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정한다. 일 실시형태에서, 하기와 같이 이후 모계 유전을 결정한다:

(ⅰ) 비율이 제1 컷오프보다 클 때, 태아 둘 다가 제1 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 것; 및

(ⅱ) 비율이 제2 컷오프보다 클 때, 태아 둘 다가 제2 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 것.

다른 모계 유전을 결정할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 제1 예에서처럼, 제1 부계 단상형은 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형은 제2 대립유전자를 갖는다. 비율이 통계학적으로 50%일 때, 태아 둘 다가 (예를 들어, At 블록에서) 하나 이상의 제1 좌위에서 이형접합성이거나, 한 명의 태아가 제1 대립유전자에 대해 동형접합성(예를 들어, AA)이고 다른 태아가 제2 대립유전자에 대해 동형접합성(예를 들어, BB)인 것으로서 확인될 수 있다. 다른 예는, 비율이 (예를 들어, 상기 예에서 40% 내지 45%를 구별하기 위해) 제2 컷오프보다 크고, (예를 들어, 상기 예에서 45% 내지 50%를 구별하기 위해) 제3 컷오프보다 작을 때, 하나 이상의 제1 좌위에서 한 명의 태아가 제2 대립유전자에 대해 동형접합성(예를 들어, BB)이고 다른 태아가 이형접합성(예를 들어, AB)이라는 것을 확인하는 것을 포함한다. 따라서, 제3 컷오프가 제1 컷오프보다 작다. 다른 예는, 비율이 (예를 들어, 상기 예에서 60% 내지 55%를 구별하기 위해) 제1 컷오프보다 작고, (예를 들어, 상기 예에서 50% 내지 55%를 구별하기 위해) 제4 컷오프보다 클 때, (예를 들어, At 블록에서) 하나 이상의 제1 좌위에서 한 명의 태아가 제1 대립유전자에 대해 동형접합성(예를 들어, AA)이고, 다른 태아가 이형접합성이라는 것을 확인하는 것을 포함한다. 따라서, 제4 컷오프는 제3 컷오프보다 크다.

몇몇 실시형태에서, 제1 부계 단상형은 각자의 제3 대립유전자(예를 들어, C)를 갖고, 제2 부계 단상형은 각자의 제4 대립유전자(예를 들어, D)를 갖는다. 비율이 제1 컷오프보다 작고 제2 컷오프보다 클 때, 한 명의 태아는 제1 대립유전자 및 제3 대립유전자 또는 제4 대립유전자(예를 들어, AC 또는 AD) 중 어느 하나에 대해 이형접합성으로서 확인될 수 있다. 다른 태아는 제2 대립유전자 및 제3 대립유전자 또는 제4 대립유전자(예를 들어, BC 또는 BD) 중 어느 하나에 대해 이형접합성으로서 확인될 수 있다.

V. 삼둥이

모계 유전은 또한 2명보다 많은 태아를 수반한 임신에서 본 발명의 원칙에 따라 분할될 수 있다. 예를 들어, 모친이 이형접합성 AB이고 부친이 동형접합성 AA인 예를 고려하고, 각각 모계 혈장 샘플에서 DNA의 10%에 기여하는 세 명의 태아(삼둥이)가 존재한다. A의 기여도 분율은 (모든 세 명의 태아가 이형접합성인 경우) 50%; (두 명이 이형접합성이고 한 명이 동형접합성 A인 경우) 55%; (한 명이 이형접합성이고 두 명의 동형접합성 A인 경우) 60%; 및 (모두 세 명이 동형접합성 A인 경우) 65%로 분할될 것이다. 둘 보다 많은 다태 임신의 경우, 충분한 분할을 제공하도록 혈장 샘플에 통상적으로 더 많은 DNA 리드가 필요하다.

따라서, 일 실시형태에서, 제1 양이 제2 양과 통계학적으로 동일할 때(예를 들어, 비율에 대해 약 50% 값), 세 명의 태아는 하나 이상의 제1 좌위에서 이형접합성으로서 확인될 수 있다. 비율이 (예를 들어, 60% 내지 55%를 구별하기 위해) 제3 컷오프보다 작고, (예를 들어, 50% 내지 55%를 구별하기 위해) 제4 컷오프보다 클 때, 하나 이상의 제1 좌위에서 제1 대립유전자에 대해 두 명의 태아는 이형접합성으로서 확인되고 한 명의 태아는 동형접합성으로서 확인될 수 있다. 비율이 (예를 들어, 60% 내지 55%를 구별하기 위해) 제1 컷오프보다 크고, (예를 들어, 65% 내지 60%를 구별하기 위해) 제5 컷오프보다 작을 때, 하나 이상의 제1 좌위에서 두 명의 태아는 제1 대립유전자에 대해 동형접합성으로서 확인되고 한 명의 태아는 이형접합성으로서 확인될 수 있다. 비율이 제5 컷오프보다 클 때, 모든 세 명의 태아는 제1 대립유전자에 대해 동형접합성으로서 확인될 수 있다.

VI. 실시예

하기 부문은 본 발명의 몇몇 원칙을 예시하는 비제한적인 작업 예를 제공한다.

A. 이란성 쌍둥이로부터 태아 DNA를 얻고 측정하는 것

각각 쌍둥이 임신을 갖는 2명의 임신한 여성을 홍콩의 프린스 오브 웨일즈 병원(Prince of Wales Hospital)의 산과 및 부인과학 부서(Department of Obstetrics and Gynaecology)에서 동의를 받고 지원받았다. 임신 21주 및 25주에 혈액 샘플을 수집하였다. 분만 후 각각의 태아로부터 별도로 제대혈을 수집하였다. 이 연구는 홍콩의 합동 중국 대학교 - 병원 권한 새 영토 이스트 클러스터 임상 조사 민족 연구회(Joint Chinese University of Hong Kong - Hospital Authority New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee)에 의해 승인받았다.

모계 혈액 샘플을 4℃에서 10분 동안 1,600 g에서 원심분리하였다. 혈장 부분을 4℃에서 10분 동안 16,000 g에서 재원심분리하여 임의의 잔류 혈액 세포를 제거하였다. 혈액 세포 부분을 실온에서 5분 동안 2,500 g에서 재원심분리하여 임의의 잔류 혈장을 제거하였다. 혈장 DNA를 DSP(상표명) DNA 블러드 미니 키트(Blood Mini Kit)(상표명)(퀴아젠(Qiagen))로 추출하였다. 제대혈 DNA를 QIAamp(상표명) DNA 블러드 미니 키트(상표명)(퀴아젠)로 추출하였다. 제대혈 샘플로부터 추출한 게놈 DNA를 아피메트릭스(Affymetrix)(상표명) 게놈-와이드 인간(Genome-Wide Human) SNP 어레이 6.0 시스템(상표명)(아피메트릭스)으로 유전자형 분석하였다. 각각의 대상체에서의 2쌍의 쌍둥이는 유전자형 분석에 의해 이란성인 것으로서 확인되었다.

쌍 지은 말단 샘플 제조 키트(Paired-End Sample Preparation Kit)(상표명)(일루미나(Illumina))로 혈장 DNA 서열분석 라이브러리를 구축하였다. 각각의 라이브러리를 준비하기 위해 대략 30ng의 DNA를 사용하였다. 이후, 고객 설계 슈어설렉트 표적 농후 시스템(SureSelect Target Enrichment System)(상표명)(아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))을 이용하여 이 라이브러리를 표적 농후로 처리하였다. 포획 라이브러리는 하기와 같이 14개의 염색체(chr)에 걸쳐 분포된 5.5Mb의 게놈 구역을 포괄한다: chr1 (0.33 Mb), chr2 (0.30 Mb), chr3 (0.62 Mb), chr4 (0.32 Mb), chr5 (0.33 Mb), chr7 (0.31 Mb), chr8 (0.62 Mb), chr9 (0.31 Mb), chr13 (0.30 Mb), chr15 (0.33 Mb), chr17 (0.66 Mb), chr19 (0.35 Mb), chr20 (0.34 Mb) 및 chr22 (0.30 Mb).

각각의 말단에 대해 50bp의 리드 길이를 갖는 Hi-Seq 2000 서열분석기(일루미나)에서 표준 쌍 지은 말단 프로토콜(일루미나)에 의해 라이브러리를 서열분석하였다. 서열분석 유세포의 2 레인으로 각각의 라이브러리를 서열분석하였다. 모든 서열분석된 리드를 비반복 마스킹된 인간 기준 게놈(Hg18)에 정렬시키도록 SOAP2 알고리즘을 이용하였다.

모계 혈장에서 부계로 유전된 태아 대립유전자의 분획 농도에 의해 태아 DNA의 분획 농도를 결정하였다. 부계로 유전된 태아 대립유전자는 모계 혈장에서 2개의 상이한 대립유전자를 갖는 임의의 SNP 좌위에서 마이너 대립유전자로서의 이의 존재에 기초하여 확인되었다.

모계 혈장에서의 부계로 유전된 태아 대립유전자의 분획 농도의 분포에 기초하여, 모계 혈장에서의 태아 DNA의 전체 분획 농도를 예측하였다. 태아 DNA 분획 농도는 각각 사례 1 및 사례 2에 대해 22.6% 및 30.6%로서 결정되었다. 모계 혈장 DNA에 대한 개별적인 쌍둥이 태아의 기여도를 결정하기 위해 모든 정보제공 좌위에서의 태아 DNA의 분획 농도의 분포를 이용하였다.

B. 분석 및 결론

이 분석의 목적을 위한 정보제공 좌위는 모친이 동형접합성이지만 적어도 한 명의 태아가 이형접합성인 SNP 좌위이고, 부친으로부터 상이한 대립유전자를 유전 받았다. 사례 1의 경우, 두 명의 태아가 기여한 모계 혈장에서의 태아 DNA 분획 농도는 10% 및 11.6%이었다. 사례 2의 경우, 두 명의 태아가 기여한 모계 혈장에서의 태아 DNA 분획 농도는 12.4% 및 18.2%이었다.

각각의 임신한 여성의 경우, 두 명의 태아가 동일한 또는 상이한 모계 단상형을 유전 받는지를 결정하기 위해 RHDO 분석을 수행하였다. 4번 염색체의 긴 암에서 위치한 구역은 이 예에서 RHDO 분석을 예시하기 위해 이용되었다. 태아의 제대혈의 유전자형 분석에 따라, 두 명의 태아는 사례 1의 경우 이 구역에 대해 상이한 모계 단상형을 유전 받았다. 사례 2의 경우, 두 명의 태아는 동일한 모계 단상형을 유전 받았다. 부계 유전자형은 가족 분석을 이용하여 결정되었다. 이 RHDO 분석에서, 모친이 이형접합성이고 부친이 동형접합성인 SNP 좌위만을 이용하였다. 다른 실시형태에서, 부계 단상형의 유전이 결정될 때, 모친 및 부친 둘 다가 이형접합성인 SNP 좌위가 RHDO 분석을 위해 또한 이용될 수 있다.

이 분석에서, α형 및 β형 SNP를 이용하여 결정된 분획 농도(α/β 비율)이 쌍둥이 태아의 어떤 모계 단상형 유전 패턴과 가장 필적하는지를 결정하기 위해 가능성 비율 역치를 이용하였다. 각각의 사례의 경우, 두 명의 태아의 분획 농도에 기초하여 α/β 비율에 대해 모의 분석을 수행하였다. α형 SNP 및 β형 SNP에 대해 공유된 대립유전자의 분획 농도의 분포의 서열 리드를 모의하기 위해 이항식 분포에서 5,000개의 데이터 점을 생성시켰다. (a) 태아 둘 다가 동일한 모계 단상형을 유전 받거나, (b) 두 명의 태아가 상이한 모계 단상형을 유전 받는 시나리오에 대한 α/β 비율의 분포를 결정하였다.

도 14a 및 도 14b는 각각 사례 1 및 사례 2에 대한 예상된 α/β 비율의 분포를 나타낸다. 2개의 가능한 유전 패턴에 대한 α/β 비율의 예상된 분포에 기초하여, 두 명의 태아가 동일한 또는 상이한 모계 단상형을 유전 받는지를 구별하기 위해 컷오프 양을 결정하였다. 이 특정한 예에서, 상부 및 하부 컷오프 값을 계산하기 위해 1200의 승산비를 이용하였다. 상부 컷오프 값보다 큰 α/β 비율은 두 명의 태아가 동일한 모계 단상형을 유전 받는다는 것을 제시하고, 하부 컷오프 값보다 작은 α/β 비율은 두 명의 태아가 2개의 상이한 모계 단상형을 유전 받는다는 것을 제시한다. 사례 1의 경우, 모의 분석으로부터 추론된 상부 및 하부 컷오프 값은 각각 1.113 및 1.098이다. 사례 2의 경우, 모의 분석으로부터 추론된 상부 및 하부 컷오프 값은 각각 1.170 및 1.158이다.

도 15는 사례 1에 대한 4번 염색체의 긴 암에서 염색체 분절의 RHDO 분석을 보여주는 표(1500)이다. 이 분석의 통계 검정력이 분석되는 서열분석된 리드의 수에 따라 달라지므로, 분류 블록에서 서열분석된 리드의 수에 대한 역치 요건으로서 5,000을 이용하였다. 즉, 각각의 RHDO 분류 블록에서의 SNP의 수는 가변적일 수 있고, 분석에서 이 SNP 좌위의 전체 서열분석된 리드는 5,000 초과일 것이다. 제1 RHDO 분류 블록의 경우, α/β 비율은 0.97837로 결정되었고, 이것은 모의 분석으로부터 추론된 1.098인 하부 컷오프 값보다 작았다.

이 결과는 두 명의 태아가 이 구역에 대한 2개의 상이한 모계 단상형을 유전 받는다는 것이다. 제1 분류 블록의 하류에 있는 SNP는 추가의 RHDO 분석에 이용되고, 결과는 두 명의 태아에 의한 상이한 모계 단상형의 유전을 제시한다. 이 구역 내의 전체 9개의 RHDO 분류 블록은 동일한 결론을 나타낸다. 이 결과는 두 명의 태아의 유전자형 결과에 의해 수정된 것으로서 확인되었다.

도 16은 사례 2에 대한 4번 염색체의 긴 암에서 염색체 분절의 RHDO 분석을 나타내는 표(1600)이다. RHDO 분류 블록 1의 경우, α/β 비율은 1.299로서 확인되었고, 이것은 모의 분석으로부터 추론된 1.170인 상부 컷오프 값보다 크다.

이 결과는 두 명의 태아가 이 구역에 대해 동일한 모계 단상형을 유전 받는다는 것을 나타낸다. 또한, α형 SNP를 이용하여 결정된 분획 농도는 β형 SNP를 이용하여 결정된 분획 농도보다 높았다. 이것은 두 명의 태아가 모계 Hap I를 유전 받는다는 것을 나타낸다(도 10a).

제1 분류 블록에서 구역의 하류에 있는 SNP는 추가의 RHDO 분석을 위해 이용되고, 이 구역 내의 전체 9개의 RHDO 분류 블록은 동일한 결론을 나타낸다. 이 결과는 두 명의 태아의 유전자형 결과에 의해 수정된 것으로서 확인되었다.

VII. 컴퓨터 시스템

본 명세서에 언급된 임의의 컴퓨터 시스템은 임의의 적합한 수의 하위시스템을 이용할 수 있다. 이러한 하위시스템의 예는 도 17에서 컴퓨터 기기(10)에 도시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 단일 컴퓨터 기기를 포함하고, 하위시스템은 컴퓨터 기기의 부품일 수 있다. 다른 실시형태에서, 컴퓨터 시스템 다수의 컴퓨터 기기를 포함할 수 있고, 각각은 내부 부품을 갖는 하위시스템이다.

도 17에 도시된 하위시스템은 시스템 버스(system bus)(75)를 통해 상호연결된다. 추가의 하위시스템, 예컨대 프린터(74), 키보드(78), 저장 장치(들)(79), 모니터(76)(디스플레이 어댑터(82)에 커플링됨), 및 기타가 도시되어 있다. 주변장치 및 입력/출력(I/O) 장치(I/O 컨트롤러(71)에 커플링됨)는 당해 분야에 공지된 임의의 수의 수단, 예컨대 입력/출력(I/O) 포트(977)(예를 들어, USB, 파이어와이어(FireWire)(등록상표))에 의해 컴퓨터 시스템에 연결될 수 있다. 예를 들어, I/O 포트(77) 또는 외부 인터페이스(81)(예를 들어, 이더넷(Ethernet), 와이파이(Wi-Fi) 등)는 컴퓨터 시스템(10)을 광대역 네트워크, 예컨대 인터넷, 마우스 입력 장치 또는 스캐너에 연결하도록 사용될 수 있다. 시스템 버스(75)를 통한 상호연결은 중앙 프로세서(73)가 각각의 하위시스템과 소통하고, 시스템 메모리(72) 또는 저장 장치(들)(79)(예를 들어, 고정 디스크, 예컨대 하드 드라이브 또는 광학 디스크)로부터의 명령의 실행, 및 하위시스템 사이의 정보의 교환을 제어하도록 한다. 시스템 메모리(72) 및/또는 저장 장치(들)(79)는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 구현할 수 있다. 본 명세서에 언급된 임의의 데이터는 하나의 부품으로부터 다른 부품으로 출력될 수 있고, 사용자에게 출력될 수 있다.

컴퓨터 시스템은 예를 들어 외부 인터페이스(81) 또는 내부 인터페이스에 의해 함께 연결된 복수의 동일한 부품 또는 하위시스템을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 컴퓨터 시스템, 하위시스템 또는 기기는 네트워크에 걸쳐 소통할 수 있다. 이런 경우에, 하나의 컴퓨터는 클라이언트(client)로 생각되고, 다른 컴퓨터는 서버(server)로 생각되며, 각각은 동일한 컴퓨터 시스템의 부분일 수 있다. 클라이언트 및 서버는 각각 다수의 시스템, 하위시스템 또는 부품을 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 실시형태가 하드웨어(예를 들어, 응용 주문형 집적 회로(application specific integrated circuit) 또는 필드 프로그래밍 가능한 게이트 어레이)를 사용하여 및/또는 모듈식 또는 집적식 방식으로 컴퓨터 소프트웨어와 함께 일반적으로 프로그래밍 가능한 프로세서를 사용하여 제어 논리의 형태로 실행될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 프로세서는 동일한 집적 칩 상의 멀티 코어 프로세서, 또는 단일 회로판 또는 네트워크 상의 다수의 프로세싱 유닛을 포함한다. 본 명세서에 제공된 개시내용 및 교시내용에 기초하여, 당해 분야의 당업자는 하드웨어 및 하드웨어와 소프트웨어의 조합을 이용하여 본 발명의 실시형태를 실행하기 위한 다른 방식 및/또는 방법을 알고 이해할 것이다.

본원에 기재된 임의의 소프트웨어 부품 또는 기능은 예를 들어 종래의 또는 객체 지향 기법을 이용하여 임의의 적합한 컴퓨터 언어, 예를 들어 자바(Java), C, C++, C# 등 또는 스크립팅 언어, 예컨대 펄(Perl) 또는 파이썬(Python)을 이용하여 프로세서에 의해 실행되는 소프트웨어 코드로서 실행될 수 있다. 소프트웨어 코드는 저장 및/또는 전송을 위한 컴퓨터 판독 가능한 매체 상에 일련의 명령 또는 명령어로서 저장될 수 있고, 적합한 매체는 임의 접근 메모리(RAM), 읽기 전용 메모리(ROM), 자기 매체, 예컨대 하드 드라이브 또는 플로피 디스크 또는 광학 매체, 예컨대 컴팩트 디스크(CD) 또는 DVD(디지털 다기능 디스크), 플래시 메모리 등을 포함한다. 컴퓨터 판독 가능한 매체는 이러한 저장 또는 전송 장치의 임의의 조합일 수 있다.

이러한 프로그램은 인터넷을 포함하여, 다양한 프로토콜에 따르는, 유선, 광학 및/또는 무선 네트워크를 통해 전송에 적합한 반송파 신호를 이용하여 또한 코딩되고 전송될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 실시형태에 따른 컴퓨터 판독 가능한 매체는 이러한 프로그램에 의해 코딩된 데이터 신호를 이용하여 생성될 수 있다. 프로그램 코드에 의해 코딩된 컴퓨터 판독 가능한 매체는 호환 장치와 패키징되거나 (예를 들어, 인터넷 다운로드를 통해) 다른 장치로부터 별도로 제공될 수 있다. 임의의 이러한 컴퓨터 판독 가능한 매체는 단일 컴퓨터 제품(예를 들어, 하드 드라이브, CD 또는 전체 컴퓨터 시스템) 상에 또는 내에 있을 수 있고, 시스템 또는 네트워크 내의 상이한 컴퓨터 제품 상에 또는 내에 있을 수 있다. 컴퓨터 시스템은 사용자에게 본 명세서에 언급된 임의의 결과를 제공하기 위한 모니터, 프린터 또는 다른 적합한 디스플레이를 포함한다.

본 명세서에 기재된 임의의 방법은 단계를 수행하도록 구성될 수 있는 하나 이상의 프로세서를 포함하는 컴퓨터 시스템에 의해 전체로 또는 부분적으로 수행될 수 있다. 따라서, 실시형태는 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 단계를 수행하도록 구성된 컴퓨터 시스템에 관한 것일 수 있고, 가능하게는 상이한 부품은 각각의 단계 또는 단계의 각각의 그룹을 수행한다. 숫자의 단계로 제시되어 있지만, 본 명세서에서 방법의 단계는 동일한 시간에 또는 상이한 순서로 수행될 수 있다. 추가로, 이 단계의 부분은 다른 방법으로부터의 다른 단계의 부분과 함께 사용될 수 있다. 또한, 단계의 전부 또는 일부는 임의일 수 있다. 추가로, 임의의 방법의 임의의 단계는 이 단계를 수행하기 위한 모듈, 회로 또는 다른 수단으로 수행될 수 있다.

특정한 실시형태의 구체적인 상세내용이 본 발명의 실시형태의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 실시형태는 각각의 개별 양상에 대한 구체적인 실시형태 또는 이 개별 양상의 구체적인 조합에 관한 것일 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시형태의 상기 설명은 예시 및 설명의 목적을 위해 제시된다. 이것은 배타적이거나 본 발명을 기재된 정확한 형태로 제한하도록 의도되지 않고, 많은 변형 및 변경이 상기 교시내용의 견지에서 가능하다. 본 발명의 원칙 및 이의 실질적인 적용을 가장 잘 설명하여 당해 분야의 당업자가 다양한 실시형태에서 본 발명을 가장 잘 이용하도록 실시형태가 선택되고 기재되어 있으며, 특정한 사용에 적합한 다양한 변형이 고려된다.

"일", "하나" 또는 "그"의 언급은 구체적으로 반대를 나타내지 않는 한 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다.

본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공보 및 설명은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 어떤 것도 선행 기술로 인정되지 않는다.

Claims

수컷에 의해 수정된 암컷의 두 태아에서의 모계 단상형(haplotype)의 유전을 결정하는 방법으로서,
제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인하는 단계로서, 상기 암컷은 각각의 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자 및 각자의 제2 대립유전자에 대해 이형접합성(heterozygous)이고, 제1 모계 단상형이 상기 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형이 상기 제2 대립유전자를 갖는 단계;
상기 두 태아가 상기 수컷으로부터 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자를 유전 받는다고 결정하는 단계;
상기 제1 염색체 상의 하나 이상의 제2 좌위의 제2 그룹을 확인하는 단계로서, 상기 제2 그룹의 각각의 제2 좌위에서 상기 제1 모계 단상형은 각자의 제3 대립유전자를 갖고, 상기 제2 모계 단상형은 각자의 제4 대립유전자를 갖는 단계, 및
상기 두 태아가 상기 수컷으로부터 제2 좌위에서 각자의 제3 대립유전자를 유전 받는다고 결정하는 단계;
상기 암컷으로부터의 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제1 좌위에 존재하는 상기 각자의 제1 대립유전자의 제1 양 및 상기 각자의 제2 대립유전자의 제2 양을 측정하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 상기 암컷 및 상기 두 태아의 무세포 DNA를 함유하는 단계;
상기 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제2 좌위에 존재하는 상기 각자의 제3 대립유전자의 제3 양 및 상기 각자의 제4 대립유전자의 제4 양을 측정하는 단계; 및
(ⅰ) 상기 제1 양이 상기 제2 양보다 통계학적으로 더 높고, 상기 제3 양이 상기 제4 양과 통계학적으로 동일할 때, 태아 둘 다를 상기 제1 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 단계,
(ⅱ) 상기 제1 양이 상기 제2 양과 통계학적으로 동일하고, 상기 제4 양이 상기 제3 양보다 통계학적으로 더 높을 때, 태아 둘 다를 상기 제2 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 단계, 또는
(ⅲ) 상기 제1 양이 상기 제2 양보다 통계학적으로 더 높고, 상기 제4 양이 상기 제3 양보다 통계학적으로 더 높을 때, 태아 중 하나를 상기 제1 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하고, 다른 태아를 상기 제2 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 단계
에 의해 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계를 포함하는, 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 양 및 상기 제2 양의 제1 비율을 산출하는 것;
상기 제3 양 및 상기 제4 양의 제2 비율을 산출하는 것;
상기 제1 비율 및 상기 제2 비율의 제3 비율을 산출하는 것; 및
상기 제3 비율을 컷오프(cutoff) 값과 비교하는 것
에 의해, 상기 제1 양이 상기 제2 양보다 통계학적으로 더 높고, 상기 제3 양이 상기 제4 양과 통계학적으로 동일하다는 것을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 양 및 상기 제2 양의 제1 비율을 산출하는 것;
상기 제4 양 및 상기 제3 양의 제2 비율을 산출하는 것;
상기 제1 비율 및 상기 제2 비율의 제3 비율을 산출하는 것; 및
상기 제3 비율을 컷오프 값과 비교하는 것
에 의해, 상기 제1 양이 상기 제2 양보다 통계학적으로 더 높고, 상기 제4 양이 상기 제3 양보다 통계학적으로 더 높다는 것을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제3 비율을 컷오프 값과 비교하는 것은 상기 제3 비율이 통계학적으로 1인지를 결정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인하는 단계는 상기 생물학적 샘플에서 각자의 제1 대립유전자 및 제2 대립유전자를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 수컷은 상기 제1 그룹의 각각의 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자에 대해 동형접합성이고, 상기 수컷은 상기 제2 그룹의 각각의 제2 좌위에서 각자의 제4 대립유전자에 대해 동형접합성인 방법.
제1항에 있어서, 상기 각자의 제1 대립유전자의 제1 양 및 각자의 제2 대립유전자의 제2 양을 측정하는 단계는,
각각의 제1 좌위에서, 상기 각자의 제1 대립유전자를 갖는 DNA 단편의 제1 수 및 상기 각자의 제2 대립유전자를 갖는 DNA 단편의 제2 수의 비율을 결정하는 단계; 및
상기 비율의 평균 비율을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 평균 비율을 컷오프 값과 비교함으로써 상기 제1 양이 상기 제2 양보다 통계학적으로 더 높은지를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 양 및 상기 제2 양으로부터의 제1 매개변수를 계산하는 것; 및
상기 제1 매개변수를 컷오프와 비교하는 것
에 의해, 상기 제1 양이 상기 제2 양보다 통계학적으로 더 높은지를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 제1 대립유전자, 하나 이상의 상기 제2 대립유전자, 하나 이상의 상기 제3 대립유전자 및/또는 하나 이상의 상기 제4 대립유전자가 관심 있는 표현형과 관련된 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 제2 대립유전자 및/또는 하나 이상의 상기 제4 대립유전자가 상염색체 우성 질환 또는 질환 감수성과 관련된 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 제1 대립유전자 및/또는 하나 이상의 상기 제2 대립유전자가 상염색체 열성 질환 또는 질환 감수성과 관련된 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 제3 대립유전자 및/또는 하나 이상의 상기 제4 대립유전자가 상염색체 열성 질환 또는 질환 감수성과 관련된 방법.
수컷에 의해 수정된 암컷의 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법으로서,
제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인하는 단계로서, 상기 암컷은 각각의 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자 및 각자의 제2 대립유전자에 대해 이형접합성이고, 제1 모계 단상형이 상기 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형이 상기 제2 대립유전자를 갖는 단계;
상기 두 태아가 상기 수컷으로부터 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자를 유전 받는다고 결정하는 단계;
상기 암컷으로부터의 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제1 좌위에 존재하는 상기 각자의 제1 대립유전자의 제1 양 및 상기 각자의 제2 대립유전자의 제2 양을 측정하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 상기 암컷 및 상기 두 태아의 무세포 DNA를 함유하는 단계;
상기 제1 양 및 상기 제2 양의 비율을 계산하는 단계;
(ⅰ) 상기 비율이 제1 컷오프보다 클 때, 태아 둘 다를 상기 제1 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 단계,
(ⅱ) 상기 비율이 제2 컷오프보다 작을 때, 태아 둘 다를 상기 제2 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 단계, 또는
(ⅲ) 상기 비율이 제3 컷오프보다 작고 제4 컷오프보다 클 때, 태아 중 하나를 상기 제1 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하고, 다른 태아를 상기 제2 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 단계로서, 상기 제3 컷오프는 상기 제1 컷오프보다 작거나 같고, 상기 제4 컷오프는 상기 제2 컷오프보다 크거나 같고 상기 제3 컷오프보다 작은 단계
에 의해 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계를 포함하는, 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 제1 양 및 제2 양의 비율을 계산하는 단계는,
각각의 제1 좌위에 대해, 상기 각자의 제1 대립유전자의 양 및 상기 각자의 제2 대립유전자의 양의 각자의 비율을 계산하는 단계; 및
상기 각자의 비율에 기초한 비율을 산출하는 단계를 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 각자의 비율에 기초한 비율은 상기 각자의 비율의 평균 또는 중앙치를 산출하는 것을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 암컷이 세 태아를 임신하고, 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계는,
상기 제1 양이 상기 제2 양과 통계학적으로 동일할 때, 상기 세 태아가 상기 하나 이상의 제1 좌위에서 이형접합성인 것으로서 확인하는 단계,
상기 비율이 상기 제3 컷오프보다 작고 상기 제4 컷오프보다 클 때, 상기 하나 이상의 제1 좌위에서 두 태아가 이형접합성이고, 하나의 태아가 상기 제1 대립유전자에 대해 동형접합성이라는 것을 확인하는 단계, 또는
상기 비율이 상기 제1 컷오프보다 크고 제5 컷오프보다 작을 때, 상기 하나 이상의 제1 좌위에서 두 태아가 상기 제1 대립유전자에 대해 동형접합성이고, 하나의 태아가 이형접합성이라는 것을 확인하는 단계, 또는
상기 비율이 상기 제5 컷오프보다 클 때, 모든 세 태아가 상기 제1 대립유전자에 대해 동형접합성이라는 것을 확인하는 단계를 더 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 제1 그룹에서의 하나 이상의 상기 제1 대립유전자가 병증 또는 감수성과 관련되고, 상기 방법은,
상기 단상형의 유전에 기초하여, 태아 중 둘 다 또는 하나가 병증 또는 감수성을 유전 받거나, 어느 태아도 유전 받지 않는지를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 암컷은 상염색체 열성 병증 또는 감수성과 관련된 단상형을 갖고, 상기 태아 중 하나 또는 둘 다는 상기 병증 또는 감수성의 보유자인 것으로 결정되는 방법.
수컷에 의해 수정된 암컷의 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법으로서,
제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인하는 단계로서, 상기 암컷은 각각의 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자 및 각자의 제2 대립유전자에 대해 이형접합성이고, 제1 모계 단상형이 상기 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형이 상기 제2 대립유전자를 갖는 단계;
상기 두 태아가 상기 수컷으로부터 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자를 유전 받는다고 결정하는 단계;
상기 제1 염색체 상의 하나 이상의 제2 좌위의 제2 그룹을 확인하는 단계로서, 상기 제2 그룹의 각각의 제2 좌위에서 상기 제1 모계 단상형은 각자의 제3 대립유전자를 갖고, 상기 제2 모계 단상형은 각자의 제4 대립유전자를 갖는 단계, 및
상기 두 태아가 상기 수컷으로부터 제2 좌위에서 각자의 제4 대립유전자를 유전 받는다고 결정하는 단계;
상기 암컷으로부터의 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제1 좌위에 존재하는 상기 각자의 제1 대립유전자의 제1 양 및 상기 각자의 제2 대립유전자의 제2 양의 제1 비율을 계산하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 상기 암컷 및 상기 두 태아의 무세포 DNA를 함유하는 단계;
상기 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 제2 좌위에 존재하는 상기 각자의 제3 대립유전자의 제3 양 및 상기 각자의 제4 대립유전자의 제4 양의 제2 비율을 계산하는 단계로서, 상기 제1 양, 제2 양, 제3 양 및 제4 양은 상기 생물학적 샘플의 측정으로부터 얻어지는 단계;
상기 제1 비율 및 상기 제2 비율의 제3 비율을 계산하는 단계;
(ⅰ) 상기 제3 비율이 제1 컷오프보다 클 때, 태아 둘 다를 상기 제1 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 단계,
(ⅱ) 상기 제3 비율이 제2 컷오프보다 작을 때, 태아 둘 다를 상기 제2 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 단계로서, 상기 제1 컷오프는 상기 제2 컷오프보다 더 큰 단계, 또는
(ⅲ) 상기 제3 비율이 제3 컷오프보다 작고 제4 컷오프보다 클 때, 태아 중 하나를 상기 제1 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하고, 다른 태아를 제2 모계 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 단계로서, 상기 제3 컷오프는 상기 제1 컷오프보다 작거나 같고, 상기 제4 컷오프는 상기 제2 컷오프보다 크거나 같고 상기 제3 컷오프보다 작은 단계
에 의해 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계를 포함하는, 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법
제20항에 있어서, 상기 제3 컷오프는 상기 제1 컷오프와 같고, 상기 제4 컷오프는 제2 컷오프와 같은 방법.
제20항에 있어서,
상기 제3 비율을 1과 비교하는 것; 및
상기 제3 비율이 1보다 클 때, 상기 제3 비율을 상기 제1 컷오프와 비교하는 것
에 의해, 상기 제3 비율이 제1 컷오프보다 크다고 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제20항에 있어서,
상기 제3 비율이 통계학적으로 1이라고 결정하는 것에 의해, 상기 제3 비율이 제3 컷오프보다 작고 제4 컷오프보다 크다고 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제20항에 있어서,
제1 태아가 기여하는 제1 분획 태아 DNA의 백분율(a%) 및 제2 태아가 기여하는 제2 분획 태아 DNA의 백분율(b%)을 결정하는 단계를 더 포함하고,
상기 제1 컷오프, 제2 컷오프, 제3 컷오프 및 제4 컷오프는 a% 및 b%에 기초하여 결정되는 방법.
제24항에 있어서, 상기 제1 컷오프는 (1+a%+b%)/1과 (50%+a%/2)/(50%+b%/2) 를 구별하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 제2 컷오프는 1/(1+a%+b%)와 (50%+a%/2)/(50%+b%/2) 를 구별하는 방법.
제20항에 있어서, 단계 (ⅰ)은 상기 제1 비율이 상기 제2 비율보다 통계학적으로 더 높은지를 결정하는 단계를 포함하고, 단계 (ⅱ)는 상기 제2 비율이 상기 제1 비율보다 통계학적으로 더 높은지를 결정하는 단계를 포함하며, 단계 (ⅲ)은 상기 제1 비율 및 상기 제3 비율이 통계학적으로 같다고 결정하는 단계를 포함하는 방법.
수컷에 의해 수정된 암컷의 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법으로서,
제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인하는 단계로서, 상기 암컷은 각각의 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자 및 각자의 제2 대립유전자에 대해 이형접합성이고, 제1 모계 단상형이 상기 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형이 상기 제2 대립유전자를 갖고, 상기 수컷은 상기 제1 좌위에서 이형접합성인 단계;
상기 암컷으로부터의 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 상기 제1 좌위에 존재하는 각자의 제1 대립유전자의 제1 양을 측정하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 상기 암컷 및 상기 두 태아의 무세포 DNA를 함유하는 단계;
상기 제1 좌위로부터의 생물학적 샘플의 DNA 단편의 제2 양을 측정하는 단계;
상기 제1 양 및 상기 제2 양의 비율을 계산하는 단계; 및
(ⅰ) 상기 비율이 제1 컷오프보다 클 때, 태아 둘 다를 상기 제1 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 비율이 제2 컷오프보다 작을 때, 태아 둘 다를 상기 제2 모계 단상형을 유전 받은 것으로서 확인하는 단계
에 의해 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계를 포함하는, 모계 단상형의 유전을 결정하는 방법.
제28항에 있어서, 제1 부계 단상형이 상기 제1 대립유전자를 갖고, 제2 모계 단상형이 상기 제2 대립유전자를 갖는 방법.
제29항에 있어서, 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계는,
상기 비율이 통계학적으로 50%일 때,
태아 둘 다가 상기 하나 이상의 제1 좌위에서 이형접합성인 가능성, 또는
하나의 태아가 상기 제1 대립유전자에 대해 동형접합성이고, 다른 태아가 상기 제2 대립유전자에 대해 동형접합성인 가능성
의 2개의 가능성을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계는,
상기 비율이 상기 제2 컷오프보다 크고 제3 컷오프보다 작을 때, 상기 하나 이상의 제1 좌위에서 하나의 태아가 상기 제2 대립유전자에 대해 동형접합성이고, 다른 태아가 이형접합성이라는 것을 확인하는 단계로서, 상기 제3 컷오프는 상기 제1 컷오프보다 작은 단계를 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계는,
상기 비율이 상기 제1 컷오프보다 작고 제4 컷오프보다 클 때, 상기 하나 이상의 제1 좌위에서 하나의 태아가 상기 제1 대립유전자에 대해 동형접합성이고, 다른 태아가 이형접합성이라는 것을 확인하는 단계로서, 상기 제4 컷오프는 상기 제3 컷오프보다 큰 단계를 포함하는 방법.
제28항에 있어서, 제1 부계 단상형이 각자의 제3 대립유전자를 갖고, 제2 부계 단상형이 각자의 제4 대립유전자를 갖는 방법.
제33항에 있어서, 상기 두 태아에서의 모계 단상형의 유전을 결정하는 단계는,
상기 비율이 상기 제1 컷오프보다 작고 상기 제2 컷오프보다 클 때,
하나의 태아가 상기 제1 대립유전자와 상기 제3 대립유전자 또는 제4 대립유전자에 대해 이형접합성인 가능성, 및
다른 태아가 상기 제2 대립유전자와 상기 제3 대립유전자 또는 제4 대립유전자에 대해 이형접합성인 가능성
을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
수컷에 의해 수정된 암컷의 두 태아에서의 부계 단상형의 유전을 결정하는 방법으로서,
제1 염색체 상의 하나 이상의 제1 좌위의 제1 그룹을 확인하는 단계로서, 상기 수컷은 각각의 제1 좌위에서 각자의 제1 대립유전자 및 각자의 제2 대립유전자에 대해 이형접합성이고, 제1 부계 단상형이 상기 제1 대립유전자를 갖고, 제2 부계 단상형이 상기 제2 대립유전자를 갖고, 상기 암컷은 상기 제2 대립유전자에 대해 동형접합성인 단계;
상기 암컷으로부터의 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 상기 제1 좌위에 존재하는 각자의 제1 대립유전자의 제1 양을 측정하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 상기 암컷 및 상기 두 태아의 무세포 DNA를 함유하는 단계;
상기 제1 양을 정규화하여 정규화된 제1 양을 얻는 단계;
상기 정규화된 제1 양을 하나 이상의 컷오프와 비교하는 단계;
상기 비교에 기초하여, 하나의 태아 또는 태아 둘 다가 상기 제1 부계 단상형을 유전 받거나, 어느 태아도 유전 받지 않는지를 결정하는 단계를 포함하는, 부계 단상형의 유전을 결정하는 방법.
제35항에 있어서,
상기 두 태아 중 하나 또는 둘 다로부터의 생물학적 샘플에서 태아 DNA 백분율을 결정하는 단계; 및
상기 태아 DNA 백분율에 기초하여 상기 하나 이상의 컷오프를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 정규화된 제1 양은 제1 컷오프 및 제2 컷오프와 비교하고, 상기 정규화된 제1 양이 상기 제2 컷오프 값보다 작을 때, 태아 중 어느 것도 상기 제1 부계 단상형을 유전 받지 않는 것으로 결정되며, 상기 정규화된 제1 양이 상기 제2 컷오프보다 크고 상기 제1 컷오프보다 작을 때, 상기 태아 중 하나는 상기 제1 부계 단상형을 유전 받는 것으로 결정되고, 상기 정규화된 제1 양이 상기 제1 컷오프보다 클 때, 상기 태아 둘 다는 상기 제1 부계 단상형을 유전 받는 것으로 결정되는 방법.
제35항에 있어서, 상기 제1 양을 정규화하여 정규화된 제1 양을 얻는 단계는,
상기 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 상기 제1 좌위에 존재하는 각자의 제2 대립유전자의 제2 양을 결정하는 단계; 및
상기 제2 양에 대한 상기 제1 양의 비율을 계산하여 상기 정규화된 제1 양을 얻는 단계를 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 비율은 상기 제1 양과 상기 제2 양의 합으로 나눠진 제1 양의 비율인 방법.
제35항에 있어서, 상기 비교에 기초하여, 하나의 태아 또는 태아 둘 다가 상기 제1 부계 단상형을 유전 받거나, 어느 태아도 유전 받지 않는지를 결정하는 단계는,
상기 정규화된 제1 양이 통계학적으로 0 초과이지만 제1 컷오프보다 작을 때, 상기 태아 중 하나만이 상기 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 단계; 또는
상기 정규화된 제1 양이 제2 컷오프 값보다 클 때, 태아 둘 다가 상기 단상형을 유전 받는 것으로서 확인하는 단계를 포함하는 방법.
제35항에 있어서,
상기 제1 염색체 상의 하나 이상의 제2 좌위의 제2 그룹을 확인하는 단계로서, 상기 수컷은 각각의 제2 좌위에서 각자의 제3 대립유전자 및 각자의 제4 대립유전자에 대해 이형접합성이고, 상기 제1 부계 단상형이 상기 제3 대립유전자를 갖고, 상기 제2 부계 단상형이 상기 제4 대립유전자를 갖고, 상기 암컷은 상기 제3 대립유전자에 대해 동형접합성인 단계;
상기 생물학적 샘플의 DNA 단편에서 상기 제2 좌위에 존재하는 각자의 제4 대립유전자의 제2 양을 측정하는 단계;
상기 제2 양을 정규화하여 정규화된 제2 양을 얻는 단계;
상기 정규화된 제2 양을 하나 이상의 컷오프와 비교하는 단계;
상기 비교에 기초하여, 하나의 태아 또는 태아 둘 다가 상기 제2 부계 단상형을 유전 받거나, 어느 태아도 유전 받지 않는지를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제41항에 있어서,
하나의 태아 또는 태아 둘 다가 상기 제1 부계 단상형 및 제2 부계 단상형을 유전 받거나, 어느 태아도 유전 받지 않는지의 결정을 하기 위해 상기 제1 부계 단상형 및 제2 부계 단상형에 대한 유전의 결정을 이용하는 단계를 더 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 하나 이상의 상기 제1 대립유전자 및/또는 하나 이상의 상기 제2 대립유전자는 관심 있는 표현형과 관련된 방법.
제35항에 있어서, 상기 관심 있는 표현형은 질환 또는 질환 감수성인 방법.
제35항에 있어서, 상기 제1 부계 단상형은 상염색체 열성 병증 또는 감수성과 관련되고, 상기 태아 중 하나 또는 둘 다는 상기 병증 또는 감수성의 보유자인 것으로 결정되는 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장인 방법.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 측정하는 단계는 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 서열분석하는 단계를 포함하는 방법.
컴퓨터 시스템을 제어하여 작동시키기 위한 복수의 명령어를 저장하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품으로서, 상기 명령어는 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 방법을 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하도록 구성된 하나 이상의 프로세서를 포함하는 시스템.
제49항에 있어서, 생물학적 샘플에서 DNA를 서열분석하도록 구성된 기기를 더 포함하는 시스템.