TWI626941B - 莫西司他用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥物的用途 - Google Patents

莫西司他用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥物的用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種莫西司他用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥物的用途，其包含將有效劑量之莫西司他施予至所需個體。根據本用途，藉由施予莫西司他可減少Aβ堆積、Tau蛋白磷酸化、神經發炎反應及增加血清素神經元數目及突觸素的表現量以改善因在海馬迴CA1注射Aβ25-35寡聚體所造成的傷害，以及具有作為減緩焦慮及認知功能異常之治療藥物的潛力。

Description

莫西司他用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥 物的用途
本發明係關於一種莫西司他(Mocetinostat,MGCD0103)用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥物的用途。
老年失智症是所有神經退化性疾病中為數最多的一種，其實為各種相似的神經退化性疾病的總稱，其中發生率最高的疾病就是阿茲海默症(Alzheimer’s disease)。目前全球約有2,400萬名阿茲海默症患者，且隨著老化人口增加，每年約增加460萬病例，世界衛生組織(WHO)預估到2040年將增至8,000萬人。阿茲海默症是一種發病進程緩慢、隨著時間不斷惡化的持續性神經功能障礙。最常見的早期症狀，是喪失短期記憶力。之後隨著疾病的發展，症狀可能包含：譫妄、易怒、具攻擊性、無法正常言語、容易迷路、情緒不穩定、喪失生存動力、喪失長期記憶、難以自理和行為異常等。雖然疾病的進程因人而異，很難預測患者的預後，但一般而言，確定診斷後的平均餘命是三到九年。
阿茲海默症的成因至今仍未完全的明瞭，目前已知的阿茲海默症患者的腦部中的神經元細胞會出現類澱粉斑塊(amyloid plaques)和神經纖維糾結(Neurofibrillary Tangles，NFTs)的現象，以及腦部中的Meynert氏基底核(nucleus basalis of Meynert)之退化，且伴隨神經傳導物質乙醯膽鹼(acetylcholine)之減少。所謂神經纖維糾結(NFTs)，是指在腦部病理解剖發現糾結的神經，其細胞型態嚴重變形，並且堆疊成團。目前已知神經纖維糾結的病徵應與Tau蛋白過度磷酸化有關，其造成Tau蛋白的聚集，對細胞產生毒性，因而間接或直接造成神經細胞的損傷。
雖然有各式針對阿茲海默症的藥物發展，然阿茲海默氏症最大之困境在於並無單一有效治療方式。在阿茲海默氏症的患者上，組織蛋白質抑制劑(HDACi)對於調控類澱粉斑塊、GSK3β以及Tau蛋白的活性扮演重要的角色。已有許多組織蛋白去乙醯酶抑制劑(HDACi)藥物用於治療阿茲海默氏症以及其他神經退化性疾病動物模式的報導，例如治療亨丁頓舞蹈症、帕金森氏症等。然而HDACi藥物多數為非選擇性抑制劑，詳細的作用機制尚未明確，因此使用不同種類的HDACi藥物乃是此疾病考量之治療策略。
鑒於上述缺失，本發明的目的在於提供一種HDACi莫西司他(Mocetinostat)(MGCD0103)用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥物的用途，利用其可改善焦慮行為並增進短期與長期記憶的效果，並且可以減少Aβ類澱粉蛋白質堆積、Tau蛋白磷酸化、神經發炎反應及增加血清素神經元數量及突觸素(synaptophysin)的表現量以對抗Aβ25-35寡聚體所造成的傷害，進而有效增進活體的學習及記憶力。
根據本發明的一態樣，提供一種HDACi莫西司他用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥物的用途，其中將有效劑量之莫西司他施予至所需個體。
較佳地，莫西司他的有效劑量可每公斤體重使用0.01~2mg。
較佳地，莫西司他可與生理食鹽水及醫藥上可接受的賦形劑組合使用。
較佳地，生理食鹽水及該醫藥上可接受的賦形劑之比可為3~8：1。
較佳地，醫藥上可接受的賦形劑可為Kolliphor®。
較佳地，施予方式可包含口服、肌內注射、皮下注射或腦部給藥。
較佳地，莫西司他可減少Aβ類澱粉蛋白質堆積、Tau蛋白磷酸化、神經發炎反應及可增加血清素神經元數量以及突觸素(synaptophysin)蛋白質表現量。
根據本發明提出的莫西司他用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥物的用途，可具有下列優點：
(1)根據本發明之用途，施予莫西司他可顯著增加阿茲海默症狀態下的神經細胞存活與神經突長度。
(2)根據本發明之用途，施予莫西司他可改善個體因Aβ25-35寡聚體造成的焦慮行為與空間學習及記憶能力之損傷。
(3)根據本發明之用途，施予莫西司他可藉由減少Aβ類澱粉蛋白質堆積、Tau蛋白磷酸化、神經發炎反應及增加血清素神經元數量以及突觸素 (synaptophysin)蛋白質表現量，進而成為治療焦慮行為與記憶障礙的潛力藥物。
第1A圖至第1B圖係為體外培養小鼠海馬迴初級神經細胞分別以低劑量與高劑量MGCD0103處理之結果。第1A圖係為細胞培養及以MGCD0103處理之時序圖；第1B圖(I)係為免疫螢光染色圖；第1B圖(II)為相對Neu N蛋白表現細胞之數量的圖表；第1B圖(III)顯示相對神經突長度結果的圖表。*表示與控制組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組比較。
第2圖係為處理MGCD0103影響初級海馬迴神經細胞存活率之結果的圖表。
第3圖係呈現體內實驗流程，其中MGCD0103係以0.01mg/kg(低劑量)與0.5mg/kg(高劑量)，腹腔內(i.p.)方式施予給個體。
第4圖係為小鼠曠野實驗(open field)、高架十字迷宮(EPM)與Y字迷宮(Y-maze)之分析結果。第4圖(I)顯示小鼠曠野實驗中自主運動能力結果的圖表；第4圖(II)顯示小鼠曠野實驗中焦慮行為結果的圖表；第4圖(III)顯示小鼠於高架十字迷宮試驗中對開放臂造訪的累計時間的圖表；第4圖(IV)顯示小鼠於Y字迷宮試驗中自發性換位率結果的圖表。*表示與生理食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組比較。
第5圖係為莫瑞氏水迷宮(MWM)之分析結果。第5圖(I)係為小鼠游泳速度分析之圖表；第5圖(II)顯示為期4天訓練期的學習曲線之圖表，其中各符號分別代表：正常小鼠(●)、海馬迴CA1注射寡聚體Aβ25-35的小鼠(○)、施予低劑量MGCD0103於海馬迴CA1注射寡聚體Aβ25-35的小鼠(■)、施予高劑量 MGCD0103於海馬迴CA1注射寡聚體Aβ25-35的小鼠(□)、施予低劑量MGCD0103於海馬迴CA1注射生理食鹽水的小鼠(▼)或施予高劑量MGCD0103於海馬迴CA1注射生理食鹽水的小鼠(△)；第5圖(III)顯示第5天之學習試驗分析結果之圖表；第5圖(IV)係為第6天移除平台後，小鼠於原平台象限駐留時間分析結果之圖表。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組理比較。
第6圖係為組織蛋白H3及α-微管蛋白(α-tubulin)的乙醯化程度之分析結果。第6圖(I)顯示組織蛋白H3及α-微管蛋白的乙醯化蛋白質的西方墨點轉漬圖；第6圖(II)顯示組織蛋白H3蛋白質乙醯化量化結果之圖表；第6圖(III)顯示α-微管蛋白的乙醯化蛋白質量化結果之圖表。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組比較。
第7圖係為神經元突觸相關蛋白質的表現量分析之結果。第7圖(I)顯示突觸素及PSD95蛋白質的西方墨點轉漬圖；第7圖(II)顯示突觸素蛋白質量化結果之圖表；第7圖(III)顯示PSD95蛋白質量化結果之圖表。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組比較。
第8A圖至第8B圖係為Tau蛋白質磷酸化相關蛋白質分析結果。第8A圖為Tau蛋白質磷酸化相關蛋白質之西方墨點轉漬結果；第8B圖(I)至(II)為Tau蛋白質磷酸化相關蛋白質之量化結果之圖表。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組比較。
第9A圖至第9B圖係為Tau蛋白質磷酸化相關酵素之分析結果。第9A圖為pCDK、pERK蛋白質磷酸化相關蛋白質之西方墨點轉漬結果；第9B圖(I)及(II)為蛋白質之量化結果。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組比較。
第10圖係為海馬迴CA1及杏仁核基底外側神經核Tau蛋白質磷酸化位點於S202之免疫組織切片分析結果。第10圖(I)係Tau蛋白質磷酸化位點於S202之免疫組織切片染色圖；第10圖(II)係為海馬迴CA1定量結果之圖表；第10圖(III)係為活化杏仁核基底外側神經核之定量結果之圖表。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組比較。
第11A圖及第11B圖係為海馬迴CA1 Aβ堆積之免疫組織切片分析結果。第11A圖係為6E10之免疫組織切片染色圖；第11B圖係為定量結果之圖表。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組比較。
第12A圖及第12B圖係為清除與形成Aβ堆積有關的蛋白質分析結果。第12A圖係為BACE1、IDE與NEP蛋白質之西方墨點轉漬結果；第12B圖(I)係為BACE1蛋白質之量化結果之圖表；第12B圖(II)係為IDE蛋白質之量化結果之圖表；第12B圖(III)為NEP蛋白質之量化結果之圖表。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組理比較。
第13圖係為海馬迴神經膠細胞免疫組織切片分析結果。第13圖(I)係為星狀膠細胞與微膠細胞組織切片染色圖；第13圖(II)係為活化星狀膠細胞定量結果之圖表；第13圖(III)係為活化微膠細胞之定量結果之圖表。*表示與食鹽水組比較；#表示與單獨處理Aβ25-35組理比較。
第14圖係為膽鹼性神經元、血清素神經元與腎上腺素神經元免疫組織切片染色結果。
本發明將藉由下列較佳實施例及其配合之圖式，作進一步之詳細說明。需注意的是，以下各實施例所揭示之實驗數據，係為便於解釋本案技術特徵，並非用以限制其可實施之態樣。
定義
術語「大約」或「大概」，當結合可測量的數值變數使用時，係指變數的指示值以及在指示值的實驗誤差內(例如，平均值的95%信賴區間(confidence interval))或在指示值之10%內的變數的所有值，從中取最大值。
「給藥」指物質對一個體的引入，如MGCD0103藉由至少包含經口、非經口(例如：皮下、肌內、經皮、皮內、腹膜內、眼內及靜脈內注射)的給藥方式施予以一個體。
「個體」指需要或被認為潛在需要本發明的組合物的任何哺乳動物，其包含靈長類、齧齒類、寵物、實驗室試驗動物、眷養野生動物。舉例來說，此可包含，但不限於：猴子、人類、豬隻、牛、綿羊、山羊、馬科動物、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔子、貓(felines)、犬(canines)。較佳地，受試者為小鼠或人類。
在本發明中使用的「莫西司他(Mocetinostat)」(在下文中亦稱為「MGCD0103」)係為一種同種型特異性組蛋白去乙醯化酶抑制劑(isotype-specific histone deacetylase inhibitor，HDACi)，其化學名稱為N-(2-胺基苯基)-4-[[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)胺基]甲基]苯甲醯胺且結構如下列化學式1所示：[化學式1]
在本發明中使用的「前藥」意圖表示以非活性或較低活性形式對有機體(如人類)投藥，且藉例如新陳代謝轉化成為活性形式之任何藥物(或化合物)形式。該前藥變為活性形式之轉化並無特別限制，且包括前藥在投藥後發生的任何化學及/或物理改變，例如前藥在作用位置釋放活性部分(尤其是細胞生長抑制劑)。
在本發明中使用的「溶劑合物」意圖表示由溶質與溶劑形成的化學計量可變之複合物。此種用於本發明目的之溶劑不會干擾溶質之生物活性。合適的溶劑之實例包括但不限於水、甲醇、乙醇、乙酸及DMSO(dimethylsulfoxide)。較佳地使用之溶劑為醫藥可接受溶劑。合適的醫藥可接受溶劑之實例包括但不限於水、乙醇、乙酸及DMSO。
在本發明中使用的「醫藥上可接受的賦形劑」係指非MGCD0103的任何成分，其根據所需醫藥形式及施予方式而選自所屬領域中具有通常知識者已知之常見賦形劑。
在本發明的實施例中，醫藥上可接受的賦形劑可為親脂性賦形劑、填料、潤濕劑、黏合劑、或崩解劑，但醫藥上可接受的賦形劑不限於此。亦可使用例如其他常用的界面活性劑，如Tweens或Spans，或常用於製造醫藥可接受固體、液體、或其他藥劑形式之其他類似的乳化劑或生物可用 性增強劑(bioavailability enhancers)，作為調配目的用之賦形劑。如果需要，可添加某些增甜劑、調味劑、或著色劑。
親脂性賦形劑可為硬脂酸甘油酯、棕櫚酸/硬脂酸甘油酯及山萮酸甘油酯；氫化植物油及其衍生物；植物及動物蠟及其衍生物；氫化蓖麻油及其衍生物；及十六烷基酯以及Kolliphor®，較佳為Kolliphor®(可購得自Sigma，C5135，美國)。
填料為一或多種選自由乳糖(lactose)、蔗糖(sugar)、澱粉(starches)、修飾澱粉(modified starches)、甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)、無機鹽、纖維素衍生物(例如微晶纖維素(microcrystalline cellulose)、纖維素)、硫酸鈣(calcium sulfate)、木糖醇(xylitol)、乳糖醇(lactitol)、及其混合物所組成的群組之物質，但是不限於此。
潤濕劑為一或多種選自由蒸餾水、乙醇、澱粉糊(starch paste)、及其混合物所組成的群組之物質，但是不限於此。
黏合劑為一或多種選自由阿拉伯膠(acacia)、明膠(gelatin)、黃蓍膠(tragacanth)、糊精(dextrin)、聚乙烯基吡咯啶酮(polyvinylpyrrolidone)、澱粉及其衍生物、海藻酸鈉(sodium alginate)、山梨醇、糖漿(syrup)、羥丙甲纖維素(hypromellose)、甲纖維素(methyl cellulose)、羥丙纖維素(hydroxypropylcellulose)、羥乙纖維素(hydroxyethylcellulose)、乙纖維素(ethylcellulose)、羧甲纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose)、羧甲纖維素鈣(calcium carboxymethylcellulose)、葡萄糖(glucose)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)、及其混合物所組成的群組之物質，但是不限於此。
崩解劑為一或多種選自由交聯甲纖維素鈉(crosscarmellose sodium)、交聚維酮(crospovidone)、聚乙烯基吡咯啶酮、澱粉羥乙酸鈉(sodium starch glycollate)、玉米澱粉(corn starch)、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙纖維素、及其混合物所組成的群組之物質，但是不限於此。
具體地，本發明的實施例所使用之用於處理及作為對照組的各種藥品製備方法如下。
在部分實施例中，所使用之Aβ25-35寡聚體之製備係將Aβ25-35(Sigma，SI-A4559，美國)利用水回溶後，靜置於37℃中4天即可使用於細胞平台上。Aβ25-35回溶於生理食鹽水後靜置於37℃中7天則使用於體內實驗。
在部分實施例中，於動物實驗中使用的MGCD0103之製備係將MGCD0103溶解於DMSO(dimethylsulfoxide)(40mg/ml)後，在進行腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)時，再將藥物溶於生理食鹽水與Kolliphor®的混合液中，其中生理食鹽水與Kolliphor®的比例可為約3~8：1之間，較佳為約4~6：1之間，最佳為約4：1。
在本發明的部分實施例中，培養小鼠海馬迴初級神經元之方法以及其螢光染色及細胞毒性測試分析如下文進一步詳細地描述。
培養小鼠海馬迴初級神經元之方法
小鼠海馬迴初級神經元培養的方法係根據前人研究(Seibenhener and Wooten 2012)稍作修正而建立：將C57BL/6J品系之8週大的懷孕母鼠予以斷頸後取出16至18天大的胚胎，將其海馬迴組織取出後於37℃下使用0.05%的胰蛋 白酶(trypsin)消化分解15分鐘。在塗有Poly-L-lysine(100μg/ml)之48孔盤培養皿之每個孔種入3×104個細胞；培養液之成分：Neurobasal培養基®(GibcoTM；ThermoFisher Scientific，美國)，另添加補充2%的B-27®添加劑(GibcoTM，ThermoFisher)、0.5mM的麩醯胺(glutamine)(GibcoTM，ThermoFisher)、25μM的麩胺酸鹽(Sigma-Aldrich，美國)、20單元/ml的青黴素/鏈黴素(GibcoTM，ThermoFisher Scientific，美國)、1mM的HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)(Sigma-Aldrich)、以及1%的熱去活供者馬血清(Donor Horse Serum,heat inactivated,(GibcoTM，ThermoFisher))。初級小鼠海馬迴神經元均培養於37℃、CO2濃度5%的培養箱內。
體外實驗(in vitro)的藥物處理
在部分實施例中，細胞需預處理以成為阿茲海默症狀態。因此，將小鼠海馬迴初級神經細胞利用Aβ25-35寡聚體處理，使得神經元數量減少、神經突長度與分支數量均減少，以模擬阿茲海默症之細胞病理狀態。如第1A圖所示，在細胞培養的第9天時，先給予Aβ25-35寡聚體50μM處理1小時後，再給予高劑量(70nM)及低劑量(35nM)的MGCD0103處理48小時。最後收集細胞以進行免疫螢光染色分析。
免疫螢光染色分析
將上述所收集的細胞進行免疫螢光染色分析。首先，將細胞用4%的三聚甲醛(paraformaldehyde)(Sigma-Aldrich)固定30分鐘，之後用PBST洗滌三次，每次10分鐘以去除殘餘的三聚甲醛。接著使用10%的胎牛血清(FBS)破壞其非專一性反應2小時後，加入NeuN蛋白質(1：1000；Millipore，美國)與MAP2蛋白質(1：1000；Millipore，美 國)之一抗於4℃反應16小時，接著將二抗於37℃反應2小時。最後透過4',6-二胺基-2-苯基吲哚(4',6-diamino-2-phenylindole，DAPI；Sigma-Aldrich)將神經元細胞核染色後，使用高通量顯微影像分析系統與MetaXpress®分析軟體(Molecular Devices，美國)來分析神經元與神經突長度等數值。
細胞存活率分析(MTT assay)
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑嗅鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)(Sigma，美國)的原顏色呈現黃色，可經由活細胞粒腺體內的琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)進行還原反應，因而將其中之四唑鎓環(tetrazolium ring)切斷，以形成藍紫色結晶之甲臢(formazan)分子，並加入DMSO溶劑使藍紫色結晶溶解析出，並利用分光光度計來偵測藍紫色變化(吸光值OD570)，進而反映出活細胞的存活率。本實驗於培養初級海馬迴神經細胞的第九天時處理不同劑量之MGCD0103，並在處理後48小時測定細胞存活率。
在本發明的部分實施例中，使用的需求個體、施予藥物之方法、需求個體之行為評估方法以及病理分析方法如下文進一步詳細地描述。
動物實驗
在本發明的實施例中，係以小鼠作為體內實驗之需求個體。
如上所述，本發明所使用的小鼠為C57BL/6J品系，8週大的懷孕母鼠與12週大公鼠(國家實驗動物中心，臺灣)。小鼠房的環境溫 度為20~25℃，相對溼度為60%，日夜週期為12小時。所有實驗均於早上7點到下午7點進行。所有實驗過程均完全依照國立臺灣師範大學實驗動物照護及使用委員小組之規定進行。
體內(in vivo)實驗的藥物處理
MGCD0103可以具有或不具有一或多個按特定時間間隔投予個體之有效劑量，以達成本發明之效益。投予頻率可視多種因素中之任一者而變化，例如症狀嚴重程度、個體所需之保護程度、用於預防或治癒目的等。舉例而言，在一個實施例中，根據本發明之MGCD0103可每一天一次投予。
進一步地，在本發明的部分實施例中，使用C57BL/6J品系公鼠(12週齡)作為需求個體。在小鼠適應環境6天後，利用阿佛丁(Avertin)(0.4g/kg體重，Sigma)將小鼠麻醉。在第7天置在立體定位儀(stereotaxic apparatus)上固定，兩側海馬迴CA1(從前囟(bregma)的AP-0.23mm，從中線(midline)的ML±0.2，從頭骨(skull)的DV-0.15mm)注射Aβ25-35寡聚體(10nM；3μl)。手術後一天採腹腔注射(i.p)施予MGCD0103藥物或相同體積之載體，一天一次連續施予29天。在第24天時先進行曠野測驗(Open field)，第26天時進行高架十字迷宮測驗(EPM)，第28天時進行Y字迷宮測驗，第30天至36天時進行水迷宮測試，第37天犧牲小鼠以進行病理分析。
如上所述，MGCD0103施予個體的有效劑量可為每公斤體重使用約0.01~2mg、較佳為每公斤體重使用約0.5~1.5mg，特佳為每公斤體重使用約0.5~1mg。當施予個體的量大於每公斤體重2mg時，可能 具有造成細胞毒性的問題，當施予個體的量小於每公斤體重0.01mg時，顯示對於改善短期記憶與焦慮行為無效。
曠野實驗(Open field test)測試
發明人將小鼠置放於一白色箱(30cm×30cm×30cm)中心區域，讓小鼠自由行走10分鐘，記錄下小鼠前5分鐘在中心區域(15cm×15cm)所停留時間，出現焦慮症狀的小鼠其在一敞開之空間中，較傾向於停留在此空間的邊緣位置，因此藉由觀察小鼠在中心區域停留的時間長短可以判定小鼠焦慮的程度。此外，紀錄後5分鐘的小鼠移動的總距離，可作為判定小鼠自主運動能力的指標。每一隻小鼠完成試驗後，箱子需用70%和30%的乙醇擦拭以清潔並消除氣味，以避免影響其他小鼠的試驗結果。
高架十字迷宮實驗(Elevated Plus Maze)測試
高架十字迷宮藉由動物對陌生環境的探索特性與高懸敞開臂的恐懼形成矛盾衝突行為而可測試動物焦慮狀況。高架十字迷宮由兩條相對開放臂(30cm×5cm)和兩條相對閉合臂(30cm×5cm×15cm)及中央區(10cm×10cm)連接而成，材質使用壓克力霧面不反光且可使用酒精清洗除味。發明人將老鼠放置中央區域面向開放臂自由探索5分鐘，每個試驗(trial)結束時需使用70%與30%酒精擦拭，避免小鼠氣味殘留。使用影像追蹤系統(video tracking system)(EthoVision-XT,Noldus)記錄小鼠在5分鐘內進入開放臂的時間。
Y迷宮活動力測試
Y迷宮活動力測試係利用白色壓克力製成的三臂(長35公分、寬5公分與高20公分)Y迷宮行為工具模組，利用小鼠生性喜歡探索新環境之特性，測量小鼠之短期空間記憶。將小鼠放在Y迷宮三臂之中間，而後給予小鼠自由探 索時間計時8分鐘，小鼠的四肢要完全踏進入三臂其中一臂才能計算一次。計算方式：小鼠自發性換位率=無重複進入三臂的次數*100/(總共進入各臂的次數-2)。
水迷宮記憶測試
莫瑞式(MWN)水迷宮測試係指在一廣大之水池某處放置一平台，來針對小鼠的空間學習與記憶的能力之測試方法。由於小鼠厭惡處於水中的狀態，同時游泳對於老鼠來說十分消耗體力，因此小鼠會本能地尋找水中可以休息的場所(平台)。尋找平台的行為涉及到大腦複雜的記憶過程，其包括(1)收集與空間定位有關的視覺訊息(如四周方形、圓形與三角形等形狀資訊)，以及(2)對這些訊息進行處理、整理、記憶、穩固以及回憶記憶之功能。發明人將小鼠置於充滿乳白色無毒廣告顏料(為使水不透光而遮掩平台，讓小鼠無法事先知悉平台的位置)的水池，讓其探索位於水面下的平台(固定在某一象限內)。本訓練區分幾種階段：(1)探索階段：其將小鼠置於水中歷時1分鐘，若小鼠無法在時間之內找到平台，則抓取小鼠使其站立於平台上20秒，再將小鼠置於一乾燥處休息以待下次實驗。(2)驗收階段：將小鼠由四個特定的位置分次放入水迷宮，以試驗其是否能順利找到平台。每天訓練四次，持續四天(每隻老鼠均有16次訓練)。四天訓練完後進行測量小鼠獲得之學習能力：與訓練間隔24小時後，將平台移走，此次讓小鼠在游泳池內自由游泳1分鐘測量小鼠是否還記得平台所在之位置(長期空間記憶測試)。游泳路徑透過CCD攝影後再經由影像追蹤系統(EthoVision-XT)進行分析。
免疫組織化學染色
發明人將小鼠予以灌流取腦組織進行後固定與脫水。而後利用冷凍切片機(CMS3050S，Leica)切30μm厚度之組織切片。PBS洗滌三次，每次10 分鐘，以去除包埋膠後利用3%的H2O2去除內生性過氧化物酶。接著，利用阻斷液破壞非專一性之抗原1小時，加入一級抗體(6E10、pS202Tau、ChAT、5-HT、TH、GFAP、Ibal)反應12小時，加入二級抗體(1：200倍於阻斷液稀釋，Vector Laboratories，美國)1小時，進行抗生物素蛋白-生物素複合物(avidin-biotin complex，ABC)測定1小時反應。最後利用DAB-kit(二胺基聯苯胺，Vector Laboratories，美國)呈色。所有組織切片染色完後貼附在玻片上，烘乾、脫水、封片後拍照以定量(Image Pro Plus，Media Cybernetics，美國)。
統計方法
在上述實驗中，兩組之間比較使用獨立性t-test予以檢定。三組以上組間比較則用單因子變異數(One-way ANOVA test)進行組間比較，事後檢定用LSD分析(SPSS version 20，Illinois，美國)。所有實驗結果以Mean±SEM表示，當p<0.05時表示達統計顯著。
以下係詳述根據前述之本發明的實施例實際執行所得之實驗數據，其用於使本案之目的、特徵和優點更明顯易懂，本技術領域具通常知識者應理解其非限制本案之保護範圍，且日後再現時應有合理差異。
體外實驗的結果
如第1B圖的結果所示，根據MGCD0103處理神經細胞的結果發現，高劑量的效果相較於單獨Aβ25-35寡聚體處理可顯著增加神經細胞數量(第1B圖(I)與(II))與神經突長度(第1B圖(I)與(III))，而MGCD0103低劑量(35nM)處理的結果相較於單獨處理Aβ25-35寡聚體亦顯著增加神經細胞數量(第1B圖(I)與(II))與 神經突長度量(第1B圖(I)與(III))。根據上述結果所示，顯示MGCD0103具有神經保護的功效，進而可使細胞緩解因Aβ25-35寡聚體所造成的神經細胞傷害。
然而，考慮到大部份HDACi通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)之效率很低，因此參考了一些文獻(Pajouhesh and Lenz 2005；Boumber,Younes et al.2011)，採用0.01與0.5mg/kg的劑量作為體內實驗的低、高劑量。為確認此劑量(0.5mg/kg)仍在IC50範圍之內，因而將初級海馬迴神經細胞在第九天時處理各種濃度的MGCD0103並進行細胞存活率分析。如第2圖所示，細胞存活率的結果中發現MGCD0103之IC50劑量約為7000nM(相當於體內(in vivo)試驗的2mg/kg)，而本發明所使用的劑量為0.01mg/kg(相當於體外(in vitro)的35nM)與0.5mg/kg(相當於體外(in vitro)的1750nM)，因此本發明所選用之劑量遠小於IC50的劑量。
體內實驗的結果
根據上述體外實驗，已初步得出MGCD0103使用於阿茲海默症細胞培養可有效保護神經元，因而發明人進一步將其施用於小鼠活體中，以測試是否本發明提出之組合物可改善阿茲海默症之認知與非認知之能力。接著，發明人進一步觀察MGCD0103對於受到Aβ25-35寡聚體造成的小鼠焦慮行為與短期記憶所產生的影響。參照第4圖(I)至(IV)，由曠野測驗、高架十字迷宮與Y字迷宮結果顯示，比較各組小鼠在本測驗中移動之總距離，顯示在CA1注射Aβ25-35寡聚體組別中，處理低劑量MGCD0103藥物治療後相較於生理食鹽水組小鼠移動總距離降低，其餘各組間均無顯著差異(第4圖(I))，表示MGCD0103藥物的高劑量處理並不影響小鼠自主運動的能力。海馬迴兩側CA1注射Aβ25-35寡聚體(10nM)之小鼠，相較於注射生理食鹽水之組別其行走於中心區域的時間顯著的下降 (第4圖(II))，表示Aβ25-35寡聚體導致小鼠焦慮的症狀，而連續施予低劑量或高劑量的MGCD0103皆能使小鼠在中心區域的時間顯著提升(第4圖(II))，表示在透過MGCD0103藥物處理後能夠改善動物焦慮的情況。此外，高架十字迷宮為另一項測試小鼠焦慮行為的測驗，其利用小鼠生性懼高的特性，記錄其於實驗中停留於開放臂(open arm)的時間，停留時間越長者表示其焦慮程度越低。如第4圖(III)，CA1注射Aβ25-35寡聚體之組別相較於生理食鹽水組顯著減少停留於開放臂的時間，而施予MGCD0103後小鼠停留於開放臂的時間顯著性的增加。根據上述結果顯示，施予本發明之MGCD0103高劑量可顯著地改善由Aβ25-35寡聚體造成的焦慮行為的症狀。
進一步地，觀察MGCD0103處理對於藉由Aβ25-35寡聚體造成的短期記憶能力損傷所產生的影響。如第4圖(IV)所示，透過計算小鼠在Y字迷宮三臂中行走之自發性轉位率，可評估各組之間小鼠短期記憶能力。根據測試結果發現，於CA1中注射Aβ25-35寡聚體相較於注射生理食鹽水的小鼠其自發性轉位率顯著性下降，表示Aβ25-35寡聚體造成短期記憶能力損傷。然而，在施予MGCD0103高劑量後，發現自發性轉位率顯著地上升，表示MGCD0103高劑量可顯著地改善由Aβ25-35寡聚體所造成短期記憶能力的受損。
接著，觀察MGCD0103處理對於藉由Aβ25-35寡聚體造成的空間學習能力及長期記憶能力損傷所產生的影響。在本發明的實施例中，空間學習能力與長期記憶能力係藉由莫瑞式水迷宮實驗來評估。首先，將經處理之小鼠置於充滿乳白色無毒廣告顏料(為以使水不透光而遮掩平台，讓小鼠無法事先知悉平台的位置)的水池中，讓其探索位於水面下的平台(固定在某一象限內)。第5圖(I)至(IV)顯示莫瑞氏水迷宮(MWM)之分析結果。根據第5圖(I)的結果，顯示不 同組別小鼠在水迷宮的游泳速度相當，無先天體力的差別。第5圖(II)為4天訓練期(training trial)的學習曲線，其顯示正常小鼠注射食鹽水到腦中，不會影響其學習能力，呈現有效的學習曲線(●)；給予MGCD0103低劑量(▼)或高劑量(△)於海馬迴CA1注射生理食鹽水的小鼠隨著訓練天數之增加其抵達平台所需花費時間並未顯著性減少。當注射寡聚體Aβ25-35至小鼠腦內，使其學習能力顯著性下降，無法呈現有效的學習曲線(○)；而給予MGCD0103低劑量(■)或是高劑量於海馬迴CA1注射Aβ25-35寡聚體的小鼠(□)，可以隨著訓練天數增加而減少其抵達平台所需時間。因此小鼠在高或低劑量MGCD0103藥物治療後其學習曲線介於生理食鹽水與Aβ25-35組之間，表示此藥物具有改善學習能力的潛力。經過四天訓練期後，第5天進行驗收測驗(testing)，記錄小鼠抵達平台所需時間，藉由此來判定小鼠的空間學習能力。如第5圖(III)所示，在CA1中注射Aβ25-35寡聚體的組別相較於注射生理食鹽水的組別，小鼠到達平台所花費的時間顯著增加，表示Aβ25-35寡聚體導致小鼠學習能力受損，而不論低劑量或是高劑量MGCD0103組，均使小鼠到達平台所花費的時間有顯著性的下降。然而，在生理食鹽水的處理下，MGCD0103組也顯著性增加小鼠抵達平台所需時間。因此，根據上述結果顯示，MGCD0103可改善小鼠受Aβ25-35寡聚體傷害而造成學習能力受損的情形，但是此藥物對於正常小鼠而言卻會造成學習能力受損。於測試結束的24小時後，將水池中的平台移除，記錄小鼠在60秒之內停留於原本平台象限所在的總時間，若時間越長表示小鼠記得原本平台所在的位置(標的象限)。如第5圖(IV)所示，注射Aβ25-35寡聚體後相較於CA1中注射生理食鹽水之組別，小鼠停留時間顯著降低，表示Aβ25-35寡聚體使小鼠長期空間記憶能力受損，而施予低劑量或高劑量MGCD0103治療之後，發現停留時間相較於無治療的Aβ25-35組別，其停留時間顯 著增加，表示MGCD0103有助於改善空間記憶。然而生理食鹽水處理下，MGCD0103不論低或高劑量均顯著性減少停留於標的象限的時間。根據上述的結果顯示，MGCD0103對於Aβ25-35寡聚體小鼠於空間學習能力與長期記憶有所改善，但是對於正常小鼠而言卻有一定程度之傷害性。
同樣地，MGCD0103可有效地提升組織蛋白H3及α微管蛋白的乙醯化程度。具體而言，本發明係進一步利用免疫墨點法進行分析，如第6圖(I)至(III)所示，細胞處理Aβ25-35寡聚體雖然不會降低H3 Lysine 9及α微管蛋白乙醯化的程度(第6圖(I)至(III))，但MGCD0103則顯著性增加H3(Lysine 9位置)與α微管蛋白乙醯化的程度(第6圖(I)至(III))。這些結果顯示海馬迴中急性注射Aβ25-35寡聚體對於H3 Lysine 9及α微管蛋白乙醯化的程度無顯著影響，但長期處理MGCD0103皆能使H3 Lysine 9及α微管蛋白乙醯化的程度有提升的現象。
此外，MGCD0103亦可有效地提升突觸素蛋白的表現量。具體而言，如第7圖的(I)至(III)所示，CA1注射Aβ25-35寡聚體組相較於生理食鹽水組，其突觸素蛋白質的表現量顯著性下降(第7圖(I)及(II))，而Aβ25-35寡聚體組處理後施予MGCD0103的突觸素表現量有顯著性上升，但在PSD95表現量方面，MGCD0103組則無顯著差異(第7圖(I)及(III))，表示Aβ25-35寡聚體的處理可降低海馬迴中突觸功能蛋白質突觸素的表現量，而施予MGCD0103後則可使突觸素蛋白質表現量提升。
進一步地，MGCD0103可有效減少Aβ25-35寡聚體所造成的神經細胞Tau蛋白質過度磷酸化。具體而言，如第8A圖至第8B圖所示，兩側海馬迴CA1注射Aβ25-35寡聚體的小鼠，神經元細胞中顯著性地減少去活化態GSK3β(pS9)酵素的表現量；而Tau蛋白質在Thr-205位置增加過磷酸化的表現。 然而，當施予MGCD0103時，可大幅增加去活化態GSK3β(pS9)酵素的表現量，且也減少Tau蛋白質在Thr-205上的磷酸化的表現量。除此以外，與Tau蛋白質磷酸化相關的pCDK與pERK的表現量各組之間並無顯著性差異(第9A圖至第9B圖)。根據上述結果發現，MGCD0103減少Tau蛋白質磷酸化主要是經由增加去活性的GSK3β(pS9)酵素的表現量所造成，而非藉由pCDK與pERK之路徑。進一步將小鼠海馬迴做免疫組織切片以分析Tau蛋白質在Ser-202位置磷酸化結果(第10圖(I)至(III))。第10圖(I)係為Tau蛋白質在Ser-202位置磷酸化組織切片染色圖，第10圖(II)及(III)為其定量結果之圖表，從其可發現施予MGCD0103後pS202Tau顯著下降，表示MGCD0103可改善由Aβ25-35寡聚體所造成海馬迴CA1區域Tau蛋白過度磷酸化的現象。
同樣地，MGCD0103可經由增加IDE蛋白質(Aβ降解酵素)的表現量而有效地降低β類澱粉蛋白質堆積。如第11A圖及第11B圖所示，觀察小鼠海馬迴的免疫組織切片並分析海馬迴CA1中Aβ堆積的數量，發現注射Aβ25-35寡聚體組相較於生理食鹽水組的海馬迴CA1中Aβ堆積的數量顯著增加，而不論施予MGCD0103處理其Aβ堆積的數量均顯著降低，表示MGCD0103組皆可改善由Aβ25-35寡聚體所導致的Aβ堆積。因此，如第12A圖至第12B圖所示，本發明進一步利用西方墨點法分析海馬迴中BACE1(Aβ形成酵素)、IDE(Aβ降解酵素)及NEP(Aβ降解酵素)蛋白質的表現量，發現CA1注射Aβ25-35寡聚體組相較於生理食鹽水組BACE1的表現量顯著上升(第12A圖與第12B圖(I))，但施予MGCD0103後BACE1的表現量皆無顯著差異；CA1注射Aβ25-35寡聚體組相較於生理食鹽水組IDE的表現量達顯著性下降(第12A圖與第12B圖(II))，但Aβ25-35組施予MGCD0103後，IDE蛋白質表現量皆顯著上升(第12A圖與第12B圖(II))。CA1注射Aβ25-35寡聚 體組相較於生理食鹽水組NEP表現量無顯著差異，而處理MGCD0103後也無顯著差異(第12A圖與第12B圖(III))，表示Aβ25-35寡聚體可透過增加BACE1與減少IDE蛋白質表現量增加Aβ堆積，而MGCD0103藥物則是透過提升IDE蛋白質的表現量減少Aβ之堆積。
更進一步地，MGCD0103可減緩Aβ25-35寡聚體所導致的神經發炎反應。如第13圖(I)至(III)所示，CA1注射Aβ25-35寡聚體會顯著性增加小鼠的星形膠細胞量，然而施予MGCD0103則顯著地減少星狀膠細胞量(第13圖(I)及(II))。再者，CA1注射Aβ25-35寡聚體處理會顯著性地增加微膠細胞量，然而施予MGCD0103會顯著性地減少微小膠細胞量(第13圖(I)及(III))。
接著，發明人進一步觀察MGCD0103對於血清素神經元、膽鹼神經元及正腎上腺性神經元數量的影響。如第14圖所示，本發明係利用免疫組織化學染色觀察血清素神經元、膽鹼神經元及正腎上腺性神經元數量，並將其進行量化的結果如下列表1所示： a表示與生理食鹽水組比較；b表示與與單獨處理Aβ25-35組比較；↑為增加(p<0.05)；↓↓↓為降低(p<0.001)
參照第14圖及表1，表示CA1注射Aβ25-35寡聚體組相較於生理食鹽水組血清素神經元及正腎上腺性神經元數量顯著下降，而Aβ25-35寡聚體組施予MGCD0103後，血清素神經元數量顯著上升，表示MGCD0103組皆能改善由Aβ25-35寡聚體所導致血清素神經元數量下降的現象，然而不影響膽鹼神經元及正腎上腺性神經元數量。
根據上述的結果，本發明所使用的MGCD0103不論在體外或體內實驗皆顯示可有效地達到神經保護之效果，並根據體內實驗顯示，施予MGCD0103可減少Aβ類澱粉蛋白質堆積、Tau蛋白磷酸化、神經發炎反應及可增加血清素神經元數量以及突觸素蛋白質表現量，進而可改善由Aβ25-35寡聚體所造成的焦慮、學習能力以及短期與長期記憶力的損害，因而可在治療記憶障礙的藥物、增進活體的學習及記憶力之用途作為一有效的解決方法。
綜上所述，雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。因此，本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (7)

  1. 一種莫西司他(MGCD0103)用於製備增進阿茲海默症患者學習能力與記憶之藥物的用途，其中將一有效劑量之該莫西司他或其溶劑合物施予至一所需個體，其中該有效劑量為每公斤體重使用0.01~0.5mg。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該莫西司他係與一醫藥上可接受的賦形劑組合使用。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該莫西司他係與生理食鹽水及該醫藥上可接受的賦形劑組合使用，其中生理食鹽水及該醫藥上可接受的賦形劑之比為3~8：1。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該醫藥上可接受的賦形劑係為親脂性賦形劑、填料、潤濕劑、黏合劑、或崩解劑。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該親脂性賦形劑係為Kolliphor®。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中施予方式包含口服、肌內注射、皮下注射或腦部給藥。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該莫西司他係減少Aβ類澱粉蛋白質堆積、Tau蛋白磷酸化、神經發炎反應及增加血清素神經元數量以及突觸素蛋白質表現量。
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