TWI623261B - Method for producing sterile fly eggs - Google Patents

Abstract

一種生產無菌蠅卵的方法，包含：(1)提供蛋白質給予蠅類產卵；(2)將25~100顆卵移入裝有飼料之盒中，溫度為20~40℃，飼養5至10日成蛹；(3)將蛹移至一成蟲飼養箱中待羽化；(4)成蟲羽化首日給予蛋白質提供產卵，羽化後第6-10天收集卵；(5)將卵齡為0.5至10小時的卵，以消毒劑進行滅菌1至10分鐘。其中該消毒劑可為次氯酸鈉，所使用的濃度為2.5~5%處理卵塊3及5分鐘，達成的91.4及100%滅菌功效。

Description

一種生產無菌蠅卵的方法

本發明係關於一種飼養蠅類的方式，以及無菌幼蟲的生產方式。

銅綠蠅成蟲屬中小型，體長約5-9mm。體色金屬青綠色，具青銅色光澤，覆有灰色粉被。雄性複眼較密合，額寬約為1單眼之3/7，側額寬約和間額相等；雌性複眼明顯分離，側額寬約為間額2/3寬，粉被較雄性多。銅綠蠅的生活史共分為卵、一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、蛹及成蟲共6個階段。

蛆療法(maggot therapy)或稱生物外科手術(biosurgery)，為將特定雙翅目蠅類幼蟲(蛆)置於病患傷口上達到治療效果之方法，研究證明其具有清除腐肉、抑菌及幫助傷口癒合的能力，且清創效果媲美甚至超過傳統手術清創療法，此外蛆療法操作簡單、成本低廉並且使用安全，故美國於1930-1940年間廣泛使用，但同時抗生素的發現與使用則為蛆療法帶來衝擊，使其逐漸沒落，然而抗生素大量使用之下使許多細菌產生抗藥性，故被現代醫療體系遺忘的蛆療法再次崛起。

此外挑選做為蠅療蛆之蠅種以不傷害人體為首要點，如不侵入寄主體內器官、不傷害活細胞組織僅取食消化壞死組織，其次如非寄主專一性、可體外繁殖以利大量飼養，此外卵生的特性可利於滅菌，故以卵生蠅種為最佳。目前醫療上最常使用的為絲光綠蠅(Lucilia sericataMeigen)及銅綠蠅(Lucilia cuprina Wiedmann)，此二者具有上述的優勢條件。

蛆療法多施用於糖尿病及慢性傷口患者，然亦可用於各種難癒性傷口、靜脈瘀血、葡萄菌感染之傷口、火燒傷等及其他意外事故造成之創傷。由於醫療蛆直接於傷口上取食壞死組織，因此如新鮮傷口、持續 流血傷口、膿腫、筋膜炎、神經外露或是正在實行抗凝血劑治療等病例不適合使用此療法。此外亦可搭配口服性的抗生素、止痛劑等，提升醫療效果。

因此，以生產醫療蛆為目的飼養銅綠蠅族群，其最重要的即是如何取得數量最多且品質最好的卵，因此在大量飼養銅綠蠅時，其各齡期發育時間、生殖能力及飼養密度等皆須全盤考量，以及如何以最有效的方式進行蟲卵之殺菌，實為有待解決之課題。

本發明目的為了解銅綠蠅之生活史，以期藉此得知最佳飼養方式，掌握各齡期發育情形以利控制族群產卵時間及產量。另外評估五種常用消毒水對銅綠蠅卵之滅菌效果，並觀察滅菌處理後卵之孵化情形，期能找出操作簡單適用、具有高成功率及孵化率，且滅菌效果良好之滅菌程序，此外更利用血液培養基檢測滅菌成功之無菌幼蟲，證明該滅菌流程下所生產出的醫療用蛆確實為無菌且可靠的，以提供未來病患安心使用蛆療法。

本發明之目的即在於提供一種生產無菌蠅卵的方法，包含：步驟(1)提供蛋白質給予蠅類產卵；步驟(2)將25~100顆卵移入裝有飼料之盒中，溫度為20~40℃，飼養5至10日成蛹；步驟(3)將蛹齡為2日齡之蛹至於5℃下1~5週；步驟(4)將蛹移至一成蟲飼養箱中待羽化；步驟(5)成蟲羽化首日給予蛋白質提供產卵，羽化後第6-10天收集卵；步驟(6)將卵齡為6~8小時的卵，以消毒劑進行滅菌3~5分鐘，該消毒劑為次氯酸鈉2.5~5%；步驟(7)將消毒處理後的卵，移入含有BHI+TSA培養基的角瓶中飼養。

為達成前述發明目的，所述之該蛋白質來源為豬肝。

為達成前述發明目的，所述之該步驟(2)中將25顆卵移入裝有飼料之盒中。

為達成前述發明目的，所述之該步驟(2)中溫度為28℃，飼養7日成蛹。

為達成前述發明目的，所述之該步驟(4)中將每300個蛹移 至一成蟲飼養箱27,000立方公分中待羽化。

為達成前述發明目的，所述之該步驟(5)中羽化後第8天收集卵。

為達成前述發明目的，所述之該步驟(5)更進一步將卵齡為0.5至10小時置於5℃、1至7日。

為達成前述發明目的，所述之該卵齡為6小時置於5℃、3日。

本發明之另一目的係在於提供一種生產無菌蠅卵的方法，係將卵齡為6~8小時的卵，以消毒劑進行滅菌3~5分鐘，該消毒劑係為及次氯酸鈉2.5~5%。

第1圖為銅綠蠅28℃下於三種卵的飼養數量(25、50及100顆卵/30克飼料)下之存活率。

第2圖為銅綠蠅在不同卵齡(0.5~1、2、4、6、8及10小時)儲存於5℃下後之孵化率。

第3圖為老熟三齡幼蟲儲存於5℃下不同天數(1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天)後之化蛹率及羽化率。圖中不同大寫字母表示化蛹率間有顯著差異(LSD)；不同小寫字母表示羽化率間有顯著差異(LSD)。

第4圖為使用次氯酸鈉滅菌後24小時於血液培養基進行微生物檢測之情形，(a)對照組可見菌落形成於血液培養基平板上；(b)試驗組幼蟲經滅菌處理成功後無菌。

第5圖為銅綠蠅幼蟲體表微生物檢測，(a)對照組可見菌落形成於血液培養基平板上；(b)試驗組幼蟲經滅菌處理成功後體表無菌。

第6圖為銅綠蠅幼蟲體內微生物檢測，(a)對照組可見菌落形成於血液培養基平板上；(b)試驗組幼蟲經滅菌處理成功後體內無菌(平板上白色固體為磨碎的蛆體本身)。

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所用之藥物、生物材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

實驗方法

一、供試蟲源室內族群建立及飼養

將取得之銅綠蠅蛹置於成蟲飼養箱中待羽化，羽化後首日即給予新鮮豬肝提供蛋白質來源，確保雌蟲卵巢發育完全；每日餵以奶粉：紅糖：酵母粉=1：1：1之混合飼料並提供乾淨飲水。待羽化6-7日後，每日將30克豬肝置於直徑9公分培養皿供給雌蟲產卵。

由供產卵豬肝上採集卵塊後，移入裝有入工飼料的塑膠碗中，碗口以網襪套牢防止幼蟲逃脫，接著將塑膠碗置於鋪有木屑之塑膠盒中(長33×寬25×高16公分，上蓋具有長12×寬10公分覆蓋紗網之開口)。飼養約5日後，老熟的三齡幼蟲陸續停止取食並開始挑蛹，此時即將網襪移除，以利幼蟲爬至木屑中化蛹。待多數幼蟲皆化蛹後，使用網篩將木屑篩除，將蛹裝於9公分培養皿中並移入成蟲飼養箱等待成蟲羽化。 重複上述飼養步驟建立穩定之室內族群。飼養溫度以冷氣控制維持在24-28℃，採自然光之飼養環境。

幼蟲人工飼料配方，取魚粉：酵母粉：洋菜膠粉：水=150克：60克：6克：900毫升(或等同比例)，混合均勻並煮沸與攪拌，冷卻後放入冰箱內保存備用。

二、銅綠蠅幼蟲飼養數量對幼蟲、成蟲期發育之影響

本發明中卵的採集、幼蟲飼養、生存環境及觀察齡期方式等，與年齡-齡期兩性生命表之研究所述相同，唯有在挑取卵之數量上，更改為每只幼蟲飼養杯(30克飼料)分別接上25、50及100顆不同數量的卵。

當進入蛹期時，須將每一個蛹分別放入蛹杯(直徑3×高4公分)中，以便記錄羽化後雌雄性別；完成性別記錄後，將同一處理之成蟲 移置成蟲飼養桶中，於定溫28℃、光週期L：D=12：12及65-75% RH條件下飼育，並適時更換或添加飼料與飲水。每日將死亡成蟲移出，記錄其性別與數量，直至成蟲全部死亡為止。此外，每日定時提供新鮮豬肝任由雌成蟲產卵6小時，之後將豬肝移出並計算當日產卵量。以上三種卵的數量處理每處理3重覆。

將試驗所得資料以軟體依年齡生命表(Age-specific life table)分析，求其內在增殖率(r)、終極增殖率(λ)、淨繁殖率(R₀)及平均世代時間(T)等族群介量，並以SPSS(Statistical Products and Services Solutions)程式軟體進行變方分析並以LSD test檢定法比較不同處理間的差異。孵化率、化蛹率、羽化率及各齡期轉換存活率均為百分比，故先進行角度轉換，再以LSD test檢定法比較各處理間之差異。

三、銅綠蠅卵、三齡幼蟲及蛹之耐寒性試驗

(一)銅綠蠅不同卵齡之卵於5℃下儲存後對孵化之影響

選擇卵齡(卵產下後時間)0.5-1、2、4、6、8及10小時之卵進行試驗，每個卵齡分別低溫(5℃)儲存處理1、2、3、4、5、6及7天。 操作方法係將於30分鐘內產下之卵置於28℃恆溫箱，待達特定卵齡時利用毛筆將卵移置幼蟲飼養杯中，隨後將飼養杯放入塑膠盒(長33×寬25×高16公分，上蓋具有長12×寬10公分覆蓋紗網之開口)中，並於塑膠盒內放置飽和食鹽水以維持濕度，接著移入5℃恆溫箱儲存。待達測試時間點時，將卵移置28℃恆溫箱中，並於24小時後觀察卵的孵化情形。每處理60顆卵，共3重覆。最後以SPSS程式軟體進行變方分析及LSD test比較冷藏處理時間對不同卵齡之卵孵化的差異。

(二)銅綠蠅三齡幼蟲於5℃下儲存後對化蛹及羽化之影響

本試驗挑選老熟三齡幼蟲(5日齡)於低溫(5℃)儲存1-60天，觀察低溫儲存對幼蟲化蛹及成蟲羽化的影響。將採集自同一母群所產之卵置於定溫28℃、光週期L：D=12：12及65-75% RH之條件下飼育至三齡，當幼蟲陸續停止取食後即可將網襪移除，待幼蟲爬出準備化蛹時即 可將幼蟲挑入塑膠杯(直徑7.5公分×高5公分)中，隨後移入5℃恆溫箱冷藏1-60天。每隔5天取出待測試之三齡幼蟲，移入28℃恆溫箱觀察其化蛹及成蟲羽化情形。每處理10隻幼蟲，共3重覆。以SPSS程式軟體進行變方分析及LSD test分析低溫儲存幼蟲的天數對化蛹及羽化是否有影響。

(三)銅綠蠅不同蛹齡於5℃下儲存後對羽化之影響

本試驗主要測試各齡(1、2、3、4及5日齡)蛹於低溫(5℃)下儲存1-6週(7-42天)對成蟲羽化之影響，操作方法係將採自同一母群所產之卵置於定溫28℃、光週期L：D=12：12及65-75% RH之條件下飼育至化蛹，再挑取待測蛹齡之蛹至蛹杯中，並移入5℃恆溫箱，依序冷藏1-6週，每週(7天)將待測試之蛹取出並移至28℃恆溫箱中，觀察後續成蟲羽化情形。每處理10顆蛹，共3重覆。羽化率為百分比，故先進行角度轉換，再以SPSS程式軟體進行變方分析及LSD test，分析低溫儲存不同蛹齡的天數間是否有差異。

四、銅綠蠅卵之滅菌試驗

本發明使用之消毒水測試藥劑為次氯酸鈉(Sodium Hypochlorite)。

(一)消毒水對卵的滅菌效果之比較

將新鮮豬肝(約30克)置於墊有乾紙巾之直徑9公分培養皿上，移入成蟲飼養箱中供產卵，待30分鐘後取出，使用鑷子將豬肝上之卵塊小心取下，放入含有濕潤濾紙之培養皿(直徑9公分×高1.5公分)中，封上石蠟膜並移入28℃恆溫箱中備用。

本發明以卵齡6小時之卵進行滅菌測試，首先將卵移入50ml離心管中，隨後以無菌水沖洗3次去除豬肝殘渣及懸浮於水面上的卵，旋緊上蓋即可移入無菌操作台內進行測試。

1.卵塊滅菌測試：使用玻璃滴管將卵分裝於1.5ml離心管中，每管放置約200顆卵，接著加入1ml供試消毒水並開始計時，搖晃離心管使每顆卵粒全面與消毒水接觸。分別處理1-10分鐘後，將消毒水利用微量吸管去除，並以無菌水沖洗3次防止消毒水殘留，完成後使用玻璃滴 管吸取卵粒移入含有BHI+TSA培養基之細胞培養角瓶中，並吸除多餘水分避免卵被淹沒，旋上瓶蓋即可放置於定溫28℃、光週期L：D=12：12之恆溫箱中，6小時內卵即可孵化為一齡幼蟲。處理後24、48及72小時觀察BHI+TSA培養基上是否汙染，一但有菌落形成則該組以滅菌處理失敗(滅菌率為0%)記錄，如培養基上未發現菌落形成，則以滅菌處理成功(滅菌率100%)登錄之。對照組以無菌水進行處理。每處理有3組，共4重覆。 求得各處理3組之平均滅菌率後再求每處理4重覆之平均各重覆之滅菌率。滅菌率為百分比，故先進行角度轉換，再以SPSS程式軟體進行變方分析及LSD test，分析不同滅菌處理組合間是否有差異。

消毒水之測試濃度及處理時間如下： 次氯酸鈉：測試濃度為10%、5%、2.5%及1.25%，卵滅菌處理時間為1、2、3、5及7分鐘。

2.卵塊滅菌測試：本試驗採取卵齡6小時之卵經分離後進行滅菌測試。首先將卵移置於鋪有黑布之培養皿上，以濕潤毛筆輕柔將卵塊分離使每顆卵獨立，分離後移入50ml離心管中，以無菌水沖洗3次去除雜質並且將懸浮於水面之卵去除，旋緊上蓋即可移入無菌操作台內進行測試。滅菌程序與上述”卵塊滅菌測試”之方法相同。本試驗除了次氯酸鈉不進行測試外，其餘各消毒水之濃度及處理卵的時間同前述試驗。

(二)滅菌效果檢測

滅菌處理完成後的卵會被移入無菌細胞培養角瓶中，並放置於定溫28℃恆溫箱中待孵化。對照組為未經滅菌處理之幼蟲。

1. BHI+TSA培養基上微生物之檢測：首先將移植環(transfer loop)燒紅待冷卻，接著直接沾取細胞培養角瓶內部之BHI+TSA培養基表面，並畫至於血液培養基(Blood plate)上，隨後封上石蠟膜移入37℃恆溫箱，24小時後觀察紀錄是否有菌落形成。共檢測84組，分別為以濃度5、2.5%次氯酸鈉處理卵2、3及5分鐘的組合(共計72組)，以及濃度1.25%次氯酸鈉處理卵7分鐘的組合(12組)。

2.幼蟲體表微生物之檢測：隨機挑取6組經雙重平板檢測(BHI+TSA培養基及血液培養基)為無菌之幼蟲進行檢測。首先取出20隻 幼蟲並放入裝有1ml無菌水的離心管(1.5ml)中，震盪後以移植環沾取液體並劃於血液培養基表面，封上石蠟膜移入37℃恆溫箱，24小時後觀察記錄是否有菌落形成。

3.幼蟲體內微生物之檢測：挑取經上述”幼蟲體表微生物之檢測”為無菌之組別的幼蟲進行檢測。將20隻幼蟲放入裝有1ml無菌水的離心管(1.5ml)中，再以塑膠研缽棒將幼蟲壓扁讓體內物質流出，震盪均勻後以移植環沾取液體並劃於血液培養基表面，封上石蠟膜移入37℃恆溫箱，24小時後觀察記錄是否有菌落形成。

五、滅菌處理後銅綠蠅卵孵化率之評估

(一)次氯酸鈉各組合處理卵後對孵化之影響

選用經卵滅菌試驗評估效果最佳的次氯酸鈉進行測試，並使用卵齡8小時之卵進行測試。供試次氯酸鈉濃度依序分別為10、5、2.5及1.25%。每處理取20顆卵置於1.5ml離心管中，加入1ml各待測試濃度之次氯酸鈉後，搖晃離心管使每顆卵粒皆可全面與次氯酸鈉接觸，分別處理1、2、3、5及7分鐘後，將次氯酸鈉去除並使用無菌水沖洗3次避免次氯酸鈉殘留，將卵接至人工飼料上，並移入定溫28℃、光週期L：D=12：12之恆溫箱中，觀察24小時後卵的孵化數。對照組則將次氯酸鈉更換為無菌水。每處理共3重覆。校正孵化率(corrected hatchability)所得數值均為百分比，故先進行角度轉換，再以LSD test檢定比較卵經各次氯酸鈉處理組合處理後其孵化率間的差異。

(二)次氯酸鈉各組合處理對不同卵齡之卵孵化影響

測試卵齡為2、4、6及8小時，首先將達測試卵齡之卵塊挑至黑布上，使用濕潤毛筆輕柔地分離卵塊，隨後取20顆卵放入1.5ml離心管中，加入1ml之2.5或5%次氯酸鈉，接著搖晃離心管使每顆卵粒能全面與次氯酸鈉接觸，待處理2、3或5分鐘後，將次氯酸鈉去除並使用 無菌水沖洗3次，沖洗完成即可將卵移入人工飼料中，置於定溫28℃、光週期L：D=12：12恆溫箱裡，觀察其24小時後孵化數。對照組則是將次氯酸鈉更換為無菌水進行操作。每處理共3重覆。校正孵化率後先進行角度轉換，再以LSD test檢定比較各卵齡經次氯酸鈉處理後孵化率間的差異。

實施例一 蠅類飼養的方法

一、銅綠蠅幼蟲飼養數量對幼蟲、成蟲期發育之影響

在定溫28℃下分別以三種卵的數量(25、50及100顆/30克飼料)飼養銅綠蠅，三種卵的數量飼養下，各齡期出現的時間相仿，卵約於1天內即孵化為一齡幼蟲，約在第1.5天時可發育為二齡幼蟲，三齡幼蟲則在第2天開始出現；約於第5.5天開始化蛹，蛹羽化為成蟲則始於第11.3天，雄成蟲較雌成蟲先羽化。

在三種測試數量下，雌成蟲皆在第19日齡開始產卵，由齡別繁殖率(Mx)曲線可看出卵數25顆飼養下其繁殖率明顯高於卵數50與100顆飼養的二組，且約每3天就會出現一個產卵高峰，出現頻率較為規則故呈現鋸齒狀曲線；而卵數50及100顆飼養者雖也有2-3個高峰，但其分佈較不規則，尤其在卵數100顆飼養下的成蟲後期存活數減少，故繁殖率也相對低且不穩定。

由第1表可得知孵化率最高為卵數50顆飼養下的92.0±4.0%，最低為卵數100顆飼養下的82.0±2.0%，二者差異顯著(p<0.01)，而卵數25顆飼養的82.7±10.0%則與前述二者皆無差異。化蛹率最高者亦為卵數50顆飼養下的82.0±6.0%，最低為卵數100顆飼養下的69.0±1.0%，二者間具顯著差異(p<0.01)，而卵數25顆飼養下的73.3±3.8%則與上述二者皆無差異。卵數25、50及100顆飼養下的羽化率依序為66.7±3.8、66.0±1.0及60.0±4.0%，三者間無差異。

不同卵的數量飼育下各齡期轉換存活率示如第2表，卵轉換為一齡蟲結果同表一之孵化率。卵數50及100顆飼養者一齡蟲轉換為二齡蟲其存活率皆在96.4%以上，卵數25顆則為93.7%，三者間並無差異。 而二齡蟲轉換為三齡蟲時，卵數25及50顆飼養下存活率為分別為98.5±2.1及98.9±3.1%，顯著高於卵數100顆飼養下的92.4±2.6%(p<0.04)，雖然卵數100顆飼養下二齡轉三齡蟲時存活率最低，但三齡蟲轉換為蛹時其存活率為為94.6%，與卵數25及50飼養者的96.8%及93.2%並無顯著性差異。而三種卵的數量飼育下蛹羽化為成蟲的存活率則分別為91.0、80.0及87.1%，三者統計上亦無差異。

不同卵的數量飼養下各齡別存活率以第1圖示之。幼蟲期 (7日齡內)時可看出卵數50顆飼養下其存活率高於卵數25及100顆飼養者，直至7日齡時卵數50顆飼養者仍然有85%存活率，而卵數50及100顆者則只有69%存活率。雖然卵數50顆飼養下的幼蟲存活率較高，但在成蟲初期(13日齡)與卵數25顆飼養下的存活率相近，分別為66及65%；當成蟲達15日齡時，卵數100顆飼養者存活率只有60%較低於卵數25及50顆的66%及65%；到了第23日齡時卵數100顆飼育者存活率快速下降至36.5%，而卵數50顆者則在28日齡時活率開始急速下降(23%)。 卵數25、50及100顆飼養下分別於第38、37及39日齡時成蟲才全數死亡。

根據銅綠蠅在三種卵的數量飼養下的生長率、發育率和繁殖率等估算族群介量結果示如第3表。銅綠蠅內在增殖率(r)以卵數25顆飼養下之0.2918(day^-1)為最高，卵數50顆飼養下的0.2812(day^-1)次之，而卵數100顆飼養下的0.2503(day^-1)顯著低於前二者(p<0.05)。終極增殖率(λ)方面，卵數25顆飼養者為1.3389(day^-1)，與卵數50顆飼養下的1.3249(day^-1)之間無差異，此二者顯著高於卵數100顆飼養下的1.2844(day^-1)(p<0.05)。淨繁殖率(R₀)以卵數25顆飼養下之786.95(offspring/♀)最高，顯著高於卵數50顆飼養下的356.15(offspring/♀)及卵數100顆飼養下的252.278(offspring/♀)，顯然不同卵的數量下飼養對銅綠蠅族群的增殖確實有影響。而各處理平均世代時間(T)之間則無顯著差異，皆在23-24.5天左右。

二、銅綠蠅卵、三齡幼蟲及蛹之耐寒性

(一)銅綠蠅不同卵齡之卵於5℃下儲存後對孵化之影響

六種不同卵齡(0.5-1、2、4、6、8及10小時)儲存於5℃下卵孵化之情形示如第2圖。儲存1天後卵齡0.5-1小時的卵孵化率只有2.2%，顯著低於其他卵齡者(p<0.001)；次低為卵齡2小時的45%(p<0.001)；最高則為卵齡8小時的82.3%，但其與卵齡4、6及10小時之孵化率(約為75-80%)無顯著差異。卵齡6、8及10小時的卵儲存2天後仍然有70-81%的孵化率，明顯高於卵齡4小時的34%(p<0.001)，而最低的為卵齡2小時之卵，其孵化率僅10%(p<0.001)。儲存3天後卵齡6、8及10小時的卵孵化率為60-67%，顯著高於卵齡4小時的11%(p<0.001)；低溫處理第4天各卵齡孵化率快速下降，卵齡4、6及10小時者孵化率分別為14、21及37%；儲存5及6天後僅剩卵齡10小時者具有孵化能力(15-17%)，而低溫儲存7天後所有卵齡的卵均尚失孵化能力。由此圖可得知卵齡確實會影響儲存於5℃後之孵化率，卵齡越高其所能儲存的時間越長，而儲存至第4天後各卵齡的孵化率則降至50%以下。

(二)銅綠蠅三齡幼蟲於5℃下儲存後對化蛹及羽化之影響

三齡幼蟲(5日齡)儲存於5℃下不同時間(1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天)後，其化蛹率及羽化率繪製於第3圖。 結果顯示儲存於5℃下1及5天後化蛹率最高(皆為100%)，其次為儲存10天的90%，此三者間無差異(p<0.05)但明顯高於儲存其他15-45天之化蛹率(化蛹率依序為60、73、63、70、53、60及53%)，化蛹率最低的則為儲存50天後之幼蟲，其化蛹率僅有26%顯著低於其他儲存較短時間者(p<0.02)。由此可知三齡幼蟲低溫處理會隨儲存時間的延長其化蛹率也越低的趨勢。

當三齡幼蟲於5℃下儲存1、5及10天後其成蟲羽化率為100、90及83%，顯著高於幼蟲儲存15至45天的羽化率(p<0.02)，而其中除了儲存35天之羽化率降至40%以下外，其餘羽化率仍然保有43 %以上；而三齡幼蟲儲存50天後則皆無法羽化，顯示幼蟲雖然在儲存50天後仍然存活並可化蛹，但化蛹後即會死亡無法成功羽化。

另外，數據顯示除了儲存1天的幼蟲化蛹率與羽化率皆為100%外，儲存其他較長天數後即便幼蟲可化蛹，但非全部皆能成功羽化，且隨著低溫儲存天數的增加羽化率有下降的趨勢。

(三)銅綠蠅不同蛹齡於5℃下儲存後對羽化之影響

以五個不同蛹齡(1、2、3、4及5日齡)儲存於5℃下1至6週後之羽化率示如第4表。蛹儲存1週後取出，除1日齡蛹羽化率顯著(p<0.05)較低為50.5±17.3%外，其餘皆高達93.3%以上。蛹齡3、4天之蛹羽化率甚可達100%。低溫儲存2週後2、3及4日齡蛹羽化率(皆90%以上)顯著高於1日齡蛹之56.7%(p<0.05)；儲存3週後1、3、4及5日齡之蛹羽化率皆低於43.3%以下，顯著較2日齡蛹的83.3±15.3%低(p<0.05)。低溫處理4週後所有日齡之蛹羽化率皆低於57%以下，但2日齡之蛹羽化率為56.7±11.5%，仍顯著高於3、4、5日齡蛹者(13.3、23.3、20.0%)(p<0.05)，而1日齡之蛹羽化率(33.3%)與各日齡蛹之羽化率皆無差異。低溫儲存3、4、5日齡之蛹5週後羽化率皆為0%，而2日齡之蛹則仍有一半(50%)羽化，且高於1日齡的26.7%(p<0.05)；低溫儲存6週後各蛹齡的蛹皆無法羽化。

由1-6週低溫儲存結果可得知2日齡之蛹其羽化率為最高。此外觀察亦發現除了1、2日齡之蛹所羽化出的成蟲翅膀皆完整外，其餘蛹齡者在儲存第3週之後，有部分成蟲翅膀無法展開，呈現萎縮變形狀，隨著儲存時間的增長，翅發育不完全的成蟲數量也隨之增加，此顯示低溫不但會造成羽化率的下降，亦可能影響蛹期時的蟲體發育，而導致成蟲羽化後翅不健全的現象。

實施例二 生產無菌蠅卵的方法

一、銅綠蠅卵滅菌試驗

滅菌率評估方式係將卵經各種滅菌組合處理後移入定溫28℃下放置24小時，此期間孵化之幼蟲於BHI+TSA培養基上取食爬行，如滅菌處理不完全，微生物即可藉由幼蟲的爬行而污染培養基，一但有菌落形成則該組以滅菌處理失敗(滅菌率為0%)紀錄，如培養基上未發現菌落形成，則以滅菌處理成功(滅菌率100%)登錄之。

次氯酸鈉各濃度與處理時間組合的處理後，對銅綠蠅卵塊之滅菌效果示如第5表。濃度1.25、2.5、5及10%之次氯酸鈉處理卵塊，於滅菌處理完成72小時內之結果，以濃度1.25%處理卵塊7分鐘的組合，其24小時後的滅菌率可高達100%，顯著高於其他組合(p< 0.05)。以濃度2.5%處理卵塊2、3、5及7分鐘的組合，其72小時後之滅菌率分別為58.3、91.7、83.3及100%，四者間無顯著差異。而濃度5%處理卵塊3及5分鐘的組合，72小時後其滅菌率可達91.4-100%，顯著高於處理2分鐘組合的66.7%(p<0.05)。當以濃度10%處理卵塊1及2分鐘，其72小時之滅菌率分別為83.3±16.7與100%。

此外，唯有濃度2.5及5%次氯酸鈉處理卵塊2分鐘的組合，其滅菌處理後72小時之滅菌率由滅菌處理完成後24小時的83.3與66.7%，降至為66.7%與58.3%，滅菌效果有因處理後放置時間增長而下降趨勢；其他組合在滅菌處理完成後24-72小時之間，其滅菌率皆無改變。

銅綠蠅卵經過濃度5%次氯酸鈉處理卵3分鐘後，移入28℃恆溫箱放置24小時後之情形。經觀察發現，對照組24小時後在BHI+TSA培養基上即佈滿微生物，而經過濃度5%次氯酸鈉處理卵3分鐘之卵其在孵化後，即使幼蟲爬行於BHI+TSA培養基上，培養基仍然呈現無菌狀態，以此可得知此組滅菌處理成功(滅菌率100%)。

除了滅菌效果之外，卵塊浸泡於次氯酸鈉下不需使用機械外力即可將卵塊分離。濃度10%次氯酸鈉在1分鐘內即可將卵塊分離，不需藉由機械外力即可使卵單粒懸浮於液體中，但卵粒一但浸泡處理超過2分鐘時，卵粒即會開始互相黏合或是黏於測試管壁上。而濃度5%次氯酸鈉則需2分鐘以上方可使卵塊分離，當處理超過6分鐘後，卵粒即開始黏合或黏附於管壁。濃度2.5%次氯酸鈉同樣需2分鐘方可使卵塊分離，卵粒互相黏合或黏於管壁上情形則於處理7分鐘以上才會發生。濃度1.25%次氯酸鈉則需要7分鐘才能使卵塊分離，互相黏合的現象在所觀察的15分鐘內尚無發現。考量滅菌效果及卵粒黏合時間，上述次氯酸鈉處理組合中，似以2.5及5%次氯酸鈉處理卵塊3及5分鐘的組合為最佳。

二、滅菌效果檢測

檢測組別分別為5、2.5%次氯酸鈉處理卵2、3及5分鐘的組合及1.25%次氯酸鈉處理卵7分鐘的組合，共計檢測84組，其中11組於血液培養基上有菌落形成。未經滅菌處理之對照組，可於血液培養基平板上發現菌落形成(第4圖a)；而經5%次氯酸鈉處裡卵3分鐘之試驗組，於血液培養基平板上不見任何細菌的發生(第4圖b)。故血液培養基檢測法可做為滅菌效果之依據，一但有細菌發生則該批幼蟲以滅菌處理失敗紀錄。

隨機挑取經雙重平板檢測(BHI+TSA培養基及血液培養基)為無菌之幼蟲進行檢測，檢測的6個組別中僅有1組在體表上檢驗出帶菌情形；對照組可見菌落形成於血液培養基平板上(第5圖a)，而經滅菌處理成功之幼蟲其體表不帶菌(第5圖b)。另外，將體表無菌的幼蟲壓扁後，將其體液劃於血液培養基上亦無菌落形成(第6圖b，第6圖a為帶菌幼蟲的體液之對照組)。由此可知卵經過成功的滅菌處理後，孵化出來的幼蟲不但體表未攜帶細菌，體內也未有細菌的存在。而當檢測結果發現有菌落形成，則整組幼蟲即記綠為滅菌處理失敗。

三、滅菌處理後銅綠蠅卵孵化率之評估

(一)次氯酸鈉各組合處理卵後對孵化之影響

銅綠蠅卵(卵齡8小時)經各種次氯酸鈉不銅濃度與處理時間的組合處理後，其校正孵化率示如第6表。濃度10%次氯酸鈉處理卵5分鐘其孵化率顯著最低僅2.1%(p<0.05)，而卵經處理1、2、3分鐘的孵化率分別為53.8、50.0及42.1%，雖然孵化率隨著處理時間延長而降低，但三者間並無顯著差異。由於濃度10%次氯酸鈉處理卵時容易造成卵的損失(黏附於測試管壁上)，故不採用濃度10%次氯酸鈉進行後續試驗。

濃度5%次氯酸鈉處理卵2分鐘後之孵化率最高為 75.0%，與處理卵1分鐘的68.3%並無差異，但顯著(p<0.05)高於處理卵3及5分鐘的60.5及57.3%。濃度2.5%次氯酸鈉處理卵1分鐘孵化率為88.8%與處理卵2分鐘的76.36%無差異，但明顯(p<0.05)高於處理卵3分鐘的75%與處理卵5分鐘的74.7%。由於2.5%次氯酸鈉處理卵7分鐘孵化率只有16.4%故不予採用。

卵經濃度1.25%次氯酸鈉處理後，孵化率最高的為處理卵1分鐘的88.3%，其次為處理卵3分鐘的82.5%，而處理卵2、5及7分鐘孵化率分別為72.2、78.5及70.7%。雖然孵化率皆可達70%以上，但濃度1.25%的次氯酸鈉在滅菌率方面，僅有處理卵7分鐘具有滅菌效果，其餘滅菌率皆為0%，故不予以採用。此外，與第5表各種次氯酸鈉處裡組合的滅菌率比較之下，濃度5%與2.5%次氯酸鈉處理卵1分鐘滅菌率為0%，因此也不予採用。

另外，數據顯示在五個處理卵的時間下，受測卵的孵化率隨著次氯酸鈉濃度增加而下降，故可得知測試卵不僅會因處理時間增長而導致孵化率下降，次氯酸鈉濃度亦為影響測試卵孵化率的原因。

經與第5表統整後可得知，濃度5%次氯酸鈉處理卵2、3、5分鐘以及濃度2.5%次氯酸鈉處理2、3、5分鐘的六個組合孵化率皆為57%以上(孵化率依序為75.0、60.5、57.3、76.3、75.0與74.7%)，此外，各組處裡均有58%以上的滅菌率(滅菌率依序為66.7±0、91.4±14.4%、100±0、58.3±27.6、91.7±14.4及83.3±16.8%)，故挑選此六組合進行後續試驗。

(二)次氯酸鈉各組合處理對不同卵齡之卵孵化影響

以四個不同卵齡(2、4、6及8小時)之卵經上述六種次氯酸鈉處裡組合處理後，其孵化情形示如第7表。卵齡2小時之卵孵化率最高的為2.5%次氯酸鈉處裡5分鐘組合的78.2%，但與5%次氯酸鈉處理卵2、3分鐘之69.6、67.1%以及2.5%處理卵2、3分鐘之69.2、56.7%的四個組合間無差異，而此卵齡孵化率最低的則為5%次氯酸鈉處理卵5分鐘組合的41.4%(p<0.05)。

第7表、

卵齡4小時之卵孵化率最高的為濃度2.5%次氯酸鈉處裡3及5分鐘組合的80.6%與80.7%，其次為5%次氯酸鈉處理卵2分鐘之74.1%，再次為5%次氯酸鈉處理卵3分鐘的71.7%，孵化率最低的為2.5%次氯酸鈉處理卵2分鐘組合的59.7%。然而卵齡4小時之卵在此六種處理組合處理下孵化率並無統計上的差異。

卵齡6小時之卵孵化率由高至低依序為濃度2.5%次氯酸鈉處裡卵3分鐘的88.7%，處理卵2分鐘組合的83.1%、5%次氯酸鈉處理卵3分鐘的82.9%，接著為2.5%次氯酸鈉處理卵5分鐘的80.8%，5%濃度處理卵2分鐘的78.9%，孵化率最低的則為5%次氯酸鈉處理卵5分鐘組合的65.9%，分析顯示卵齡6小時之卵在此六種處理組合處理下各孵化率間亦無差異。

卵齡8小時之卵孵化率最高的為5%次氯酸鈉處裡1分鐘組合的81.5%，顯著(p<0.05)高於5%次氯酸鈉處理卵3分鐘的59.3%。上述二者與5%濃度處理卵5分鐘的79.6%，以及2.5%處理卵2、3及5分鐘組合的74.0、68.5及75.9%皆無差異。

2.5%次氯酸鈉濃度處理各卵齡之卵2分鐘，孵化率最高者為卵齡6小時的83.1%，其顯著(p<0.05)高於卵齡4小時的59.7%，而卵齡2及8小時與上述二者間則無差異。同濃度次氯酸鈉處理卵3分鐘之組合，孵化率最高者亦為卵齡6小時的88.7%，顯著(p<0.05)高 於卵齡2小時的56.7%，卵齡4及8小時者則與上述二者無差異。2.5%次氯酸鈉處理卵5分鐘之組合，卵齡2、4、6及8之間孵化率皆高於75%，四個卵齡之卵的孵化率間雖無差異，但仍以卵齡6小時者最高(88.7%)。

5%次氯酸鈉濃度處理各卵齡之卵2分鐘，孵化率最高者為卵齡8小時的81.5%，其顯著(p<0.05)高於卵齡2小時的69.6%，而卵齡4及6小時與上述二者間則無差異。此濃度次氯酸鈉處理卵3分鐘之組合，孵化率最高者為卵齡6小時的82.9%與卵齡4小時的71.7%，顯著(p<0.05)高於卵齡8小時的59.3%。5%次氯酸鈉處理卵5分鐘之組合，孵化率最高者為卵齡8小時的79.6%，顯著(p<0.05)高於卵齡2小時的41.4%。

由第7表可得知卵齡6小時之卵的孵化率穩定較高，除了5%次氯酸鈉處理5分鐘孵化率為65.5%外，其餘組合孵化率皆可達到78.9%以上。此外卵齡6小時之卵在各次氯酸鈉處理組合之下，孵化率亦相對高於其他卵齡。卵齡2小時的卵除了在2.5%次氯酸鈉處理卵2及5分鐘的組合下孵化率與其他卵齡無差異外，其餘處理組合孵化率皆為最低，顯示卵齡較年輕者(卵齡2小時)最容易受次氯酸鈉處理影響而降低孵化率。

Claims (8)

1. 一種生產無菌蠅卵的方法，包含：步驟(1)：提供蛋白質給予蠅類產卵；步驟(2)：將25~100顆卵移入裝有飼料之盒中，溫度為20~40℃，飼養5至10日成蛹；步驟(3)：將蛹齡為2日齡之蛹置於5℃下1~5週；步驟(4)：將蛹移至一成蟲飼養箱中待羽化；步驟(5)：成蟲羽化首日給予蛋白質提供產卵，羽化後第6-10天收集卵；步驟(6)：將卵齡為6~8小時的卵，以消毒劑進行滅菌3~5分鐘，該消毒劑為次氯酸鈉2.5~5%；步驟(7)：將消毒處理後的卵，移入含有BHI+TSA培養基的角瓶中飼養。
2. 如申請專利範圍第1項所述之生產無菌蠅卵的方法，其中該蛋白質來源為豬肝。
3. 如申請專利範圍第1項所述之生產無菌蠅卵的方法，其中該步驟(2)中將25顆卵移入裝有飼料之盒中。
4. 如申請專利範圍第1項所述之生產無菌蠅卵的方法，其中該步驟(2)中溫度為28℃，飼養7日成蛹。
5. 如申請專利範圍第1項所述之生產無菌蠅卵的方法，其中該步驟(4)中將每300個蛹移至一成蟲飼養箱27,000立方公分中待羽化。
6. 如申請專利範圍第1項所述之生產無菌蠅卵的方法法，其中該步驟(5)中羽化後第8天收集卵。
7. 如申請專利範圍第1項所述之生產無菌蠅卵的方法，其中該步驟(5)更將卵齡為6~8小時置於5℃環境，先儲存1至7日，再進行步驟(6)。
8. 如申請專利範圍第7項所述之生產無菌蠅卵的方法，其中該卵齡進一步為6小時置於5℃環境，儲存3日。