TWI621396B

TWI621396B - 冷凍處理中保護生物組織的防凍劑及其製備方法

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Publication number: TWI621396B
Application number: TW105131801A
Authority: TW
Inventors: 吳博貴; 陳威明; 陳正豐; 王致又; 吳文海
Original assignee: 臺北榮民總醫院
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-04-21
Also published as: TW201813506A

Abstract

本發明關於一種保護生物組織在冷凍處理過程中不受破壞的防凍劑及其製備方法。本發明製備抗凍劑之方法包含將乙二醇、水及二甲基亞碸三者均勻混合製成基質；再緩慢加入聚丙烯酸鈉而得。所製得的抗凍劑在冷凍處理過程中塗覆於該生物組織，可有效減少生物組織之破壞，尤其可用於回收自體骨移植物之製備。

Description

冷凍處理中保護生物組織的防凍劑及其製備方法

本發明關於一種防凍劑及其製備方法，特別是用於人體或動物組織冷凍處理過程中保護組織之用。

性骨瘤(malignant bone sarcoma)如惡性骨肉瘤(Osteosarcoma)，是青少年與兒童好發的骨頭惡性腫瘤。在惡性骨瘤手術治療的過程中，係先將腫瘤完整切除，並將肢體進行重建(During the surgery,we have to perform wide tumor resection and following limb reconstruction)。而重建(limb reconstruction)的方式包括腫瘤型人工關節(tumor prosthesis)或是生物性重建(Biological reconstruction)。相對於腫瘤型人工關節，生物性重建可達到較佳且恆久(longevity)的肢體功能(limb function)，因此儘管手術困難度較高、較為耗時，仍是較常被使用的方式。其中冷凍自體骨滅活(frozen autograft)，是使用「真正的骨頭」來填補骨缺損(reconstruct bone defect)，但因民眾願意捐贈骨頭之意願不高，異體骨來源有限，加上每個人的骨頭大小形狀不盡相同，因此使用上有其缺陷。

惡性骨瘤雖是由骨頭裡面或是表面所長出的腫瘤，但是一般而言，長出腫瘤的骨頭，腫瘤的破壞並不一定是相當嚴重，甚至在部分成骨型(osteoblastic)的骨肉瘤當中，反而會因為腫瘤而長出更多的骨頭。對於這些病患，其骨頭並沒有完全被破壞，因此可以將這些長滿腫瘤但質地仍不錯的骨頭取出，經特殊處理將腫瘤細胞殺死，而得到一塊乾淨的骨頭，就像資源回收一樣，稱之為「回收自體移植物(recycled autograft)」。這種方式最大的優點，在於取自病患本身的骨頭，不用擔心骨頭的大小形狀不同，也不用擔心會有疾病的傳染(disease transmission)。而所謂的液態氮冷凍自體骨滅活，即是將帶著腫瘤的骨頭迅速的浸泡在例如-196 oC的液態氮(liquid nitrogen)一段時間，足以確保腫瘤的中心溫度可以達到最低溫，再放在室溫下緩慢解凍。在此急速冷凍與緩慢解凍的過程中，可將腫瘤細胞完全殺死。這項冷凍處理的原理，簡單的說就是藉由將帶有腫瘤細胞的骨頭溫度降到相當低溫，使得骨細胞內外的水分子形成冰晶結構（crystallization），而這些冰晶會摧毀細胞膜而使得腫瘤細胞死亡。然而，冷凍處理過程中，周遭有部分正常的組織（innocent normal tissues）包括軟骨（cartilage）、骨頭（bone）與肌腱（tendon）也會同時被破壞掉。因此如何保護正常組織避免因冷凍處理過程而遭破壞，為迄今尚待解決的問題。

本發明即在提供一種解決生物組織在冷凍處理過程中避免遭破壞的方法。

本發明一方面提供一種製備抗凍劑之方法，其中該抗凍劑係用於生物組織冷凍處理過程中保護生物組織不受破壞，其製備方法包含下列步驟： (1)取重量比約1~3:1之乙二醇 (ethylene glycol)及水，再取二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide），以與上述乙二醇水溶液重量比約1~2:10之比例，將三者均勻混合製成基質； (2)將上述步驟製得的基質緩慢加熱，並加入聚丙烯酸鈉(sodium polyacrylate)，其中該基質與聚丙烯酸鈉之重量比為4~10:1，攪拌均勻冷卻至室溫而得。

於本發明之一具體實施例中，該水為生理食鹽水。

於本發明之一具體實施例中，該聚丙烯酸鈉為具分子量120000之聚丙烯酸鈉。

於本發明之一具體實施例中，該乙二醇及水之重量比為約2:1。

於本發明之一具體實施例中，該二甲基亞碸與乙二醇水溶液之重量比為約1:10。

於本發明之一具體實施例中，該基質與聚丙烯酸鈉之重量比為約10:1。

於本發明之一具體實施例中，其中該步驟(3)中將製得的基質緩慢加熱並維持在約70 oC。

根據本發明之一實施例，本發明製備抗凍劑之方法，包含下列步驟： (1)取重量比約2:1之乙二醇 (ethylene glycol)及水，再取二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide），以與上述乙二醇水溶液重量比約1:10之比例，將三者均勻混合製成基質； (2)將上述步驟製得的基質緩慢加熱並維持在約70 oC，緩慢加入聚丙烯酸鈉(sodium polyacrylate)，該基質與聚丙烯酸鈉之重量比為約10:1，攪拌均勻冷卻至室溫而得。

本發明另一方面提供一種抗凍劑，其係由上述本發明方法製得。

本發明再一方面提供一種在冷凍處理過程中保護人體或動物生物組織之方法，其係使用由上述方法製得的抗凍劑，塗覆在該生物組織上，於冷凍處理過程中用以保護該生物組織減少破壞。

於本發明之一具體實施例中，該人體或動物之生物組織為軟骨、肌腱或韌帶。於本發明之一特定實施例中，其係用於製備回收自體骨移植物。

本發明又一方面提供一種回收自體骨移植物，其係自骨瘤患者取下帶有製備腫瘤細胞的自體骨，以本發明抗凍劑保護該自體骨的軟骨、肌腱或韌帶，予以冷凍處理殺死腫瘤細胞而得。

於本發明之一具體實施例中，該骨瘤為惡性骨瘤。

依本發明方法製得的回收自體骨移植物，因取自病患本身的骨頭，可免骨頭大小及形狀不同之憂，也不會致其他疾病傳染，而冷凍處理殺死腫瘤細胞時，因有本發明抗凍劑保護而正常的生物組織不會同時被破壞掉。

實施例1 本發明抗凍劑之製備

於室溫下取乙二醇 (ethylene glycol) 63克、生理食鹽水27克及二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO）10克三者混合攪拌均勻，作成抗凍劑基質，取上述所得之抗凍劑基質 30-70克於水浴加熱維持到70度，緩慢加入聚丙烯酸鈉(sodium polyacrylate, MW:120000)至5-7克，攪拌均勻冷卻至室溫，而得本發明抗凍劑，其外觀如圖1所示，呈透明黏稠狀。

實施例2 本發明抗凍劑對於大鼠骨組織的保護效果

將大鼠的膝軟骨取出，對照組A不做處理，對照組B在關節軟骨處塗上傳統一般市售抗凍劑（二甲基亞碸）。實驗組在關節軟骨處塗上本發明抗凍劑。分別將其置入液態氮中冷凍處理20分鐘，接著置於室溫下緩慢回溫20分鐘。再以4% 多聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並做病理切片，以乙蘇木素-伊紅染色(HE stain)，對照組A(A)，對照組B(B)，實驗組(C) 以乙蘇木素-伊紅染色之病理切片如圖2所示。在冷凍過後之對照組A，軟骨表面變得脆裂與凹凸不平（箭頭處），對照組B也是凹凸不平（箭頭處），然而在實驗組C中，可以見到完整的軟骨表面（箭頭處），顯示本發明抗凍劑可保護軟骨組織，避免因抗凍劑處理的碎裂。

實施例3 本發明抗凍劑對於大鼠軟骨組織細胞凋亡的影響

將上述對照組A、對照組B、實驗組C，分別進行細胞凋亡分析（TUNEL assay），驗證是否可藉由本發明抗凍劑避免因冷凍而造成軟骨細胞之脫氧核醣核酸(DNA)之脆裂（fragmentation），實驗結果如圖3。可發現實驗組C中TUNEL陽性之細胞（代表種腫瘤細胞凋亡）之比例，相較對照組A與對照組B明顯較低，顯示本發明抗凍劑可減少細胞凋亡。

實施例4 本發明抗凍劑對於人體軟骨組織的保護作用

將手術中從人體取下不需要的正常軟骨組織（殘餘標本），分成三組，分別予以不做處理(對照組A)，在關節軟骨處塗上傳統市售抗凍劑（對照組B）及在關節軟骨處塗上本發明抗凍劑(實驗組C)。分別將其置入液態氮中冷凍20分鐘，接著置於室溫下緩慢回溫20分鐘。再以4%多聚甲醛固定，並做病理切片與蘇木素-伊紅染色。結果如圖4所示，在冷凍過後之對照組A，軟骨底部與硬骨相交接觸面（星狀處）發生分離（separation），對照組B也發生分離（星狀處），然而在實驗組C中，可以見到軟骨底部與硬骨相交接觸面是正常連結在一起。而此分離的大小，在對照組A為2.16mm, 在對照組B為1.2mm，在實驗組為0.45mm。顯示本發明抗凍劑可保護軟骨組織減少因冷凍造成軟骨與硬骨之分離。

實施例5 本發明抗凍劑對於冷凍後軟骨顏色指數變化之影響

將手術中從人體取下不需要的正常軟骨組織（殘餘標本），分為三組分別予以不做處理(對照組A)，在關節軟骨處塗上傳統市售抗凍劑（對照組B）及在關節軟骨處塗上本發明抗凍劑(實驗組C)。分別將其置入液態氮中冷凍20分鐘，接著置於室溫下緩慢回溫20分鐘。分析軟骨表面亮度之減低 (decrease of luminance level)觀察其顏色指數變化（color indices change）。結果如圖5所示，對照組A與對照組B冷凍過後，軟骨之表面亮度明顯下降，表示軟骨組織內水分在冷凍過後大量脫出。然而在實驗組C的下降幅度相當小，顯示本發明抗凍劑可減緩因冷凍造成軟骨顏色指數之變化，軟骨組織內水分在冷凍過後不會大量脫出。

綜上，本發明抗凍劑可保護生物組織在冷凍處理過程中因冷凍所造成的傷害。顯然，本發明抗凍劑可在冷凍處理過程中作為保護生物組織之用。

圖1顯示依本發明製成之抗凍劑，呈透明黏稠狀。

圖2顯示本發明抗凍劑對於大鼠骨組織的保護效果，相對於對照組，本發明抗凍劑可保護軟骨組織，避免因冷凍處理造成碎裂。

圖3顯示本發明抗凍劑對於大鼠軟骨組織細胞凋亡的影響，相對於對照組，本發明抗凍劑可減少因冷凍處理造成之細胞凋亡。

圖4顯示本發明抗凍劑對人類組織之保護作用，相對於對照組，本發明抗凍劑可減少因冷凍造成軟骨與硬骨之分離。

圖5顯示本發明抗凍劑對於冷凍後軟骨顏色指數變化之影響，相對於對照組，本發明抗凍劑可減緩因冷凍造成軟骨顏色指數之變化。

Claims

一種製備抗凍劑之方法，其中該抗凍劑係用於生物組織冷凍處理過程中保護生物組織不受破壞，其製備方法包含下列步驟：(1)取重量比約1~3：1之乙二醇(ethylene glycol)及水；(2)再取二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide)，以與上述乙二醇水溶液重量比約1~2：10之比例，將三者均勻混合製成基質；(3)將上述步驟製得的基質緩慢加熱，並加入聚丙烯酸鈉(sodium polyacrylate)，其中該基質與聚丙烯酸鈉之重量比為4~10：1，攪拌均勻冷卻至室溫而得。
根據請求項1之方法，其中該水為生理食鹽水。
根據請求項1之方法，其中該聚丙烯酸鈉為具分子量120000之聚丙烯酸鈉。
根據請求項1之方法，其中該乙二醇及水之重量比為約2：1。
根據請求項1之方法，其中該二甲基亞碸與乙二醇水溶液之重量比為約1：10。
根據請求項1之方法，其中該其中該步驟(3)中將製得的基質緩慢加熱並維持在約70℃。
根據請求項1之方法，其包含下列步驟：(1)取重量比約7：3之乙二醇(ethylene glycol)及水；(2)再取二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide)，以與上述乙二醇水溶液重量比約1：10之比例，將三者均勻混合製成基質； (3)將上述步驟製得的基質緩慢加熱並維持在約70℃，緩慢加入聚丙烯酸鈉(sodium polyacrylate)，該基質與聚丙烯酸鈉之重量比為約10：1，攪拌均勻冷卻至室溫而得。
一種抗凍劑，其包含(1)重量比約1~3：1之乙二醇(ethylene glycol)及水，(2)二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide)，其與上述乙二醇水溶液重量比為約1~2：10，其中以上述(1)及(2)所述之成分製得一基質；(3)聚丙烯酸鈉(sodium polyacrylate)，其與上述基質之重量比為1：4~10；其中該抗凍劑係自上述(1)及(2)所述之成分均勻混合製成一基質後緩慢加熱，並加入上述(3)所述之成分，攪拌均勻冷卻至室溫而得。
根據請求項8之抗凍劑，其可用於在冷凍處理過程中保護人體或動物之生物組織減少破壞。
根據請求項9之抗凍劑，其中該人體或動物之生物組織為軟骨、肌腱或韌帶。