TWI590831B - 包覆酪氨酸激酶抑制劑之奈米粒子在用於製備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於奈米粒子在用於製備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途，尤其是包覆酪氨酸激酶抑制劑之奈米粒子在製備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途。
肝纖維化(Liver fibrosis)是一種肇因於慢性肝臟損傷(liver injury)的傷痕形成過程，並且會導致肝硬化(cirrhosis)、肝衰竭(liver failure)，最終形成肝癌，該些慢性肝臟損傷包括：酒精中毒(alcoholism)、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、持續性的病毒或蠕蟲感染(persistent viral or helminthic infections)，特別是B型與C型肝炎病毒感染(hepatitis B and C virus infection)、以及遺傳性金屬過載(hereditary metal overload)等。肝臟纖維化的發病與病程發展一般均較緩慢，可潛伏三至五年或十數年之久。肝纖維化的發展過程包括肝臟中微血管的血管新生(angiogenesis)及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)之生成及堆積。肝星狀細胞(Hepatic stellate cells，HSCs)係主導調節纖維化發展過程的細胞。慢性的肝臟損傷會產生細胞激素(cytokines)及有絲分裂原(mitogens)如：血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)與轉化生長因子
β(transforming growth factor-β，TGF-β)，該些生長因子會誘導肝星狀細胞的分化及活化。活化的星狀細胞進一步促進纖維化肝細胞中細胞外基質的合成與沉積作用，進而促使細胞激素的分泌而造成發炎反應、微血管新生及擴散，包括血小板衍生生長因子及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。因此，肝星狀細胞係為肝臟纖維化或肝硬化之主要治療標靶。
酪氨酸激酶是一種催化ATP上γ-磷酸轉移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，在細胞生長、增殖、分化中具有重要作用。正常細胞中，酪氨酸激酶活性受到嚴密生理的調控，然而，不正常細胞(例如：纖維化細胞、癌細胞等)內的酪氨酸激酶受體往往過度表現或產生突變，造成強烈的酪氨酸激酶活性，使得細胞不斷的進行分化、增殖、抗凋亡、血管新生以及轉移等，故，抑制酪氨酸激酶之活性，可使酪氨酸激酶受體不再過度表現，有助於該些細胞的控制。索拉非尼(Sorafenib)是一種雙功能的酪氨酸激酶抑制劑，其可阻礙Raf/MEK/ERK路徑以及血管內皮生長因子受器/血小管衍生生長因子受器，可用於作為一針對弱化血管新生及抑制癌細胞擴散的抗癌藥物。近期，研究顯示索拉非尼可透過下行調節(down-regulation)週期素D1(cyclin D1)及週期素依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，Cdk-4)、過度表現Fas與Fas-L、以及活化凋亡蛋白酶-3(caspase-3)來抑制肝星狀細胞之細胞增殖並引發細胞凋亡。再者，索拉非尼亦可標靶Raf/MEK/ERK路徑以降低肝星狀細胞的活化與分化。以纖維化肝臟模型進行的實驗證實，索拉非尼可弱化膠原蛋白的沉澱、降低肝星狀細胞的活化、並抑制血管新生，改善肝臟的纖維化。
然而，雖然索拉非尼是肝臟纖維化及肝癌之一具有潛力的治療劑，但其亦會造成若干副作用，例如：手足症候群(hand-foot syndrome)、腹瀉(diarrhea)、及高血壓(hypertension)，該些副作用係肇因於口服索拉非尼(oral route)會與正常組織細胞作非特定結合。此外，索拉非尼於水的溶解度低，使得其在消化道被吸收的效率低，而導致藥物動力學(pharmacokinetics)表現不佳。因此，傳統口服索拉非尼以治療肝纖維化或肝癌，其臨床上再發率仍然高。綜上而言，索拉非尼之高細胞毒性及低生物可用性(bioavailability)，造成其僅有狹窄的治療區間(therapeutic window)。故，目前極需要一種可提升目標組織吸收率，同時可降低副作用的索拉非尼使用策略，以獲得較佳改善肝臟纖維化的治療效果。
緣此，本發明提供一種包覆酪氨酸激酶抑制劑之奈米粒子在用於製備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途，其中該奈米粒子係促進該酪氨酸激酶抑制劑在纖維化肝臟之吸收，該奈米粒子亦降低該酪氨酸激酶抑制劑在血液中之釋放速率，且該醫藥組成物係為一針劑。
在本發明之一實施例中，該酪氨酸激酶抑制劑係為索拉非尼(Sorafenib)；該奈米粒子係減少纖維化肝臟中細胞外基質的累積，且該細胞外基質係為膠原蛋白，同時，本發明之奈米粒子亦抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cell)之活性。
在本發明之一實施例中，該奈米粒子係降低該纖維化肝臟中之血管新生，並且降低該纖維化肝臟中新生血管之密度及管徑。
本發明提供之一種包覆酪氨酸激酶抑制劑形成之奈米粒子
在製備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途，其中該奈米粒子係由一聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PEG-PLGA)或一聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸/聚乳酸聚乙醇酸複合材料(PEG-PLGA/PLGA)所構成；該聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸/聚乳酸聚乙醇酸(PEG-PLGA/PLGA)複合材料中的PEG-PLGA之含量為重量百分比50至70；較佳為該PEG-PLGA與PLGA之含量比例為重量百分比50：50。
本發明之包覆酪氨酸激酶抑制劑之奈米粒子具有低分散性，在血液循環中穩定且可降低該酪氨酸激酶抑制劑之釋放速率；再者，由本發明PEG-PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆酪氨酸激酶抑制劑(如：索拉非尼)能改善、舒緩肝臟纖維化之現象，例如：減少纖維化肝臟中細胞外基質的累積、抑制肝星狀細胞之活性、降低該纖維化肝臟中新生血管之密度及管徑等，並且不具細胞毒性，同時減少副作用的產生，為更安全、有效之酪氨酸激酶抑制劑之用途，可應用於臨床肝纖維化治療。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1A圖係本發明之奈米粒子在不同溶劑中之奈米粒子大小。
第1B圖係本發明之奈米粒子在不同比例之乙醇：四氫呋喃溶合劑中之奈米粒子大小。
第1C圖係本發明奈米粒子包覆不同比例之索拉非尼之奈米粒子大小
第2A圖係本發明以不同比例之PEG-PLGA：PLGA形成之奈米粒子大小。
第2B圖係本發明以不同比例之PEG-PLGA：PLGA形成之奈米粒子的界達電位(zeta-potential)。
第2C圖係本發明以不同比例之PEG-PLGA：PLGA形成之奈米粒子的藥物包覆率。
第3圖係本發明由PEG-PLGA共聚物包覆索拉非尼所形成之奈米粒子與由PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆索拉非尼所形成之奈米粒子之電子顯微鏡外觀示意圖，其中比例尺係代表100nm。
第4圖係本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子及包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子的藥物釋放速率。
第5A圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子對人類臍帶靜脈內皮細胞株之細胞毒性。
第5B圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子對肝星狀細胞株之細胞毒性。
第6圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子的藥物動力學分析。
第7A圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子在纖維化肝臟之累積倍率。
第7B圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子在正常肝臟之累積倍率。
第7C圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子在纖維化肝臟、正常肝臟之累積效果的螢光顯微鏡圖。
第8圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子抑制肝臟纖維化之效果。
第9A圖係α-SMA與β-actin之表現量的西方墨點(western blotting)圖。
第9B圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子降低細胞外基質之效果。
第9C圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子降低細胞外基質之效果的螢光顯微鏡圖。
第10A圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子降低纖維化肝臟中血管新生之效果。
第10B圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子降低纖維化肝臟中血管管徑之效果。
第10C圖係本發明包覆索拉非尼之奈米粒子降低纖維化肝臟中血管密度效果之螢光顯微鏡圖。
本發明提供一種包覆酪氨酸激酶抑制劑之奈米粒子在製備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途。首先，製備用於包覆有酪氨酸激酶，例如：索拉非尼之一奈米粒子，係由一種PEG-PLGA聚合物或一種PEG-PLGA/PLGA複合材料構成，亦分析該形成之奈米粒子之藥物包覆、承載、與生物體內之特性，例如：藥物動力學、細胞毒性等；接著，本發明分析包覆索拉非尼之PEG-PLGA或PEG-PLGA/PLGA奈米粒子對肝臟細胞之影響，特別是其對於改善纖維化肝臟之效果，並且經由實驗顯示，施予本發明PEG-PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆索拉非尼所形成之奈米粒子可減少細胞外基質及抑制星狀細胞活化，亦可使纖維化肝臟中血管的正常化，包括：促進不正常新生的血管縮小、降低纖維化肝臟中微血管的密度。故，本發明之包覆酪氨酸激酶抑制劑形成之奈米粒子在製
備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途，可提升酪氨酸激酶，例如：索拉非尼在特定目標組織，例如：纖維化肝臟組織中之吸收，並且可降低其副作用；因此，可進一步製成不同於傳統使用之劑型施予，例如：針劑用於注射，在預防或治療肝臟纖維化上為具有潛力的臨床應用。
「纖維化」一詞用於本說明書係指稱器官組織內纖維結締組織增多，實質細胞減少之病理改變。
「共聚物」一詞用於本說明書係指稱包括聚合反應之產物，其包括天然或合成(包括無規、交替、嵌段、接枝、分枝、交聯)之均聚物、共聚物、三聚物等、摻合物、摻合物之組合物以及其變體。聚合物可在真溶液中，在有益劑中飽和或作為微粒懸浮或過飽和。
首先，本發明製備用於包覆酪氨酸激酶抑制劑之奈米粒子。可以使用聚乳酸聚乙醇酸(Poly(D,L-lactide-co-glycolide)，PLGA)是一種高分子聚合物材料，其對細胞毒性極低且生物適應性、生物可吸收性良好。PLGA及其共聚物在體內可分解為小分子鏈段，例如：經由水解作用形成乳酸(lactic acid)和乙醇酸(glycolic acid)，並且可由克雷伯氏循環(Kreb’s cycle，或稱：三羧酸循環)代謝形成二氧化碳及水而排出體外。由於PLGA具有親油性(hydrophobic)，而聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)為一種親水性(hydrophilic)的聚合物，故，形成之PEG-PLGA共聚合係為一種兩親分子(amphiphile)，同時具有親油及親水性。使用PEG-PLGA共聚合可降低形
成奈米粒子時的分散性(polydispersity)，並且提升所形成之奈米粒子在血液循環中的穩定性。
本發明所使用之PEG-PLGA共聚物以及PLGA係購自綠平方材料有限公司(臺灣)，將形成之PEG-PLGA共聚物置於不同極性(polarity)之溶劑中，如：二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)、四氫呋喃(Tetrahydrofuran，THF)、二甲基甲醯胺(Dimethylformamide，DMF)，並測量其奈米粒子的大小，結果如第1A圖所示。本發明之PEG-PLGA共聚物在四氫呋喃中之奈米粒子大小約為200nm，而在二氯甲烷中之奈米粒子約為250nm、在二甲基甲醯胺中則約為160nm，顯示PEG-PLGA共聚物可形成約300nm以內之奈米粒子，而該奈米粒子的大小係適合用於體內遞送藥物之奈米粒子大小。接著，將PEG-PLGA共聚物溶於不同乙醇：四氫呋喃比例(v/v)之溶劑中，並測量其奈米粒子的大小，結果如第1B圖所示。結果顯示，較佳為當乙醇：四氫呋喃之比例(v/v)為3：20時，PEG-PLGA共聚物之奈米粒子之大小可維持在約200nm。接下來，使用PEG-PLGA奈米粒子包覆索拉非尼，並測量不同索拉非尼：PEG-PLGA共聚物比例(wt/wt)形成之奈米粒子大小，其結果如第1C圖所示。如第1C圖所示，當索拉非尼：PEG-PLGA共聚物之比例為1：20時，該包覆有索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子之大小約為220nm；而當索拉非尼：PEG-PLGA共聚物之比例為1：10時，該包覆有索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子之大小約為240nm。
接者，本發明提供一種PEG-PLGA與PLGA的複合材料，並評估該複合材料中不同比例之PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)之影響。首先，製備PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)比例為7：3以及5：5之複合材料。接著，將所
製備不同PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)比例之複合材料溶於四氫呋喃中，並測量其形成奈米粒子之大小，其結果如第2A圖所示。如第2A圖所示，當PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)比例為7：3時，所形成之奈米粒子之大小約為280nm；而當PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)比例為5：5時，所形成之奈米粒子之大小約為300nm。接著，評估該些不同比例之PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)複合材料之界達電位(zeta-potential)，如第2B圖所示，當PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)比例為7：3或5：5時，所形成之奈米粒子具有相似程度的移動率。進一步評估該些不同比例之PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)複合材料之藥物包覆率(encapsulation efficiency)，如第2C圖所示，當PEG-PLGA：PLGA(wt/wt)比例為5：5時，所形成之奈米粒子具有最佳的藥物包覆率，約95%。
由上可知，由複合材料為50% PEG-PLGA以及50% PLGA所形成之奈米粒子具有最佳的藥物包覆率，故，本發明選取由含有50% PEG-PLGA、50% PLGA之複合材料，以及100% PEG-PLGA共聚物，用以包覆索拉非尼，形成包覆有索拉非尼之奈米粒子，用於下述本發明之各實施例。此外，亦分析其特徵，如表1所示，由100% PEG-PLGA共聚物包覆索拉非尼所形成之奈米粒子之平均直徑為230.1±15.6nm，其多分散指數(polydispersity index，PDI)為0.352±0.024；由50% PEG-PLGA、50% PLGA之複合材料包覆索拉非尼所形成之奈米粒子之平均直徑為303.3±7.8nm，其多分散指數為0.214±0.014。該些包覆有索拉非尼之奈米粒子在電子顯微鏡下的外觀係如第3圖所示，第3圖中的比例尺係代表100nm。
索拉非尼所形成之奈米粒子(0.1mg)放入微量離心管中並分散在1mL的磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)中。將微量離心管放置在37℃搖擺培養箱。於指定的時間點將沉澱物溶解於二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，並通過光度儀在270nm處進行分析。
請參考第4圖，該圖係由PEG-PLGA共聚物包覆索拉非尼所形成之奈米粒子以及由PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆索拉非尼所形成之奈米粒子在168小時內之藥物釋放速率。結果顯示，由PEG-PLGA共聚物包覆索拉非尼所形成之奈米粒子在72小時之內具有較高的藥物釋放速率，並於72小時達到累積釋放度(cumulative release)約100%；另一方面，由PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆索拉非尼所形成之奈米粒子表現較緩慢且穩定的藥物釋放速率，約於120小時達到累積釋放度100%。
為了評估本發明PEG-PLGA/PLGA複合材料以及PLGA共聚物包覆索拉非尼形成之奈米粒子之細胞毒性，本發明提供一人類臍帶靜脈內皮細胞株(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，代表具有新生血管的目標細胞，以及一肝星狀細胞株(hepatic stellate cell，HSC)，代表纖維化之目標細胞。肝星狀細胞株係購自美國ScienCell Research Laboratories(編號：#5300，聖地牙哥，加州)；人類臍帶靜脈內皮細胞株則是取自新竹食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC編號：H-UV001)。將人類臍帶靜脈內皮細胞株與肝星狀細胞株以每孔2000個細胞之密度接種至96孔盤中，放置隔夜使其附著。添加不同形式之索拉非尼或
藥物載體，並於48或72小時後，添加溶解在PBS之MTT於每個孔，且在37℃培養3小時。最後加入50μL的DMSO至每個孔中，通過光度儀在570nm處進行分析。其中，分別以包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子處理之細胞作為實驗組1、包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理之細胞作為實驗組2、未包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子處理之細胞作為負控制組1、未包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理之細胞作為負控制組2；另一方面，以未經任何處理之細胞作為空白對照組，並將以游離之索拉非尼處理之細胞作為正控制組。對人類臍帶靜脈內皮細胞株之細胞毒性係如第5A圖所示，當細胞僅以游離之索拉非尼處理時，細胞存活率(cell viability)低於50%，而以本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子與包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理(實驗組1、實驗組2)亦可抑制細胞存活率達約50%，說明本發明以PLGA或PEG-PLGA/PLGA包覆索拉非尼形成之奈米粒子可釋放索拉非尼於目標細胞，同時，由經未包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子與未包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理之細胞(負控制組1、負控制組2)之存活率結果可見，本發明之PEG-PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料不具細胞毒性，不會造成目標細胞死亡。
而就肝星狀細胞株而言，請參考第5B圖，當細胞僅以游離之索拉非尼處理時，細胞存活率約為75%。以本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子處理之細胞(實驗組1)其細胞存活率亦為約75%，而以本發明之包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理之細胞(實驗組2)之存活率則較高，約為88%，說明本發明以PLGA或PEG-PLGA/PLGA包覆索拉非尼形成之奈米粒子可釋放索拉非尼於目標細胞並使細胞存活率下降；
另一方面，由經未包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子與未包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理之細胞(負控制組1、負控制組2)之存活率結果可見，本發明之PLGA或PEG-PLGA/PLGA形成之奈米粒子不具細胞毒性，不會造成目標細胞死亡。
如第6圖所示，注射含有C6之血清予小鼠，經過0.5小時至1小時，本發明PEG-PLGA奈米粒子及PEG-PLGA/PLGA奈米粒子在小鼠血液中之C6濃度約為10%，而未以奈米粒子包覆之C6在小鼠血液中之濃度則為約1%，說明本發明PEG-PLGA奈米粒子及PEG-PLGA/PLGA奈米粒子可有效使藥物在血液中的釋放速率降低，具有較佳的藥物動力學表現；注射1小時至4小時，以本發明PEG-PLGA奈米粒子及PEG-PLGA/PLGA奈米粒子包覆之C6在小鼠血液中之濃度變化趨於平緩，說明就長時間作用而言，本發明PEG-PLGA奈米粒子及PEG-PLGA/PLGA奈米粒子可使藥物在血液中穩定地釋放。
包覆C6的PLGA奈米粒子其製備方式如同索拉非尼加載的PLGA奈米粒子為利用乳化反應方式製成。C3H小鼠以0.1mg/kg的劑量以尾靜脈方式注射不同劑型之C6。在不同時間點，將40μL的血液從尾動脈收集，並與乙二胺四乙酸(EDTA)混合。於螢光強度在激發波長485nm，發射波長538nm下測量螢光量，並利用C6或是包覆C6的PLGA奈米粒子在血液
中的標準曲線計算小鼠血液中C6含量。
在第7A圖中可見，在纖維化小鼠肝臟中，本發明包覆C6之PLGA奈米粒子被吸收之效率約為控制組的2.7倍，而以本發明之PEG-PLGA/PLGA包覆C6形成之奈米粒子可提升C6於纖維化小鼠肝臟的累積倍率約為控制組的3倍；相較於第7B圖，本發明包覆C6之PLGA奈米粒子及包覆C6之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子均不會顯著地提升C6在正常小鼠肝臟的累積倍率。該包覆C6之奈米粒子提升C6在疾病肝臟(如：纖維化肝臟)細胞之累積倍率亦可由第7C圖得知，如第7C圖所示在纖維化小鼠肝臟中，無論是以本發明之PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆C6，該包覆有C6之奈米粒子(白色箭頭)之數量明顯增加，說明以本發明之PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆C6形成奈米粒子可提升C6在目標細胞(即，纖維化肝臟細胞)之累積效果，且不對正常細胞造成影響，說明使用本發明之PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料作為材料包覆物質，可有效且準確地促使該物質於目標細胞(即，纖維化肝臟細胞)累積。
本發明利用四氯化碳(Carbon tetrachloride，化學式：CCl4)誘導小鼠產生肝纖維化，加入100μL之16%(v/v)四氯化碳至橄欖油並混入飼料中餵食四週大之小鼠，持續8週(至小鼠為12週大)。於第5週(即小鼠9週大時)開始以尾靜脈注射方式施予以本發明PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆之10mg/kg索拉非尼奈米粒子，每週兩次，持續4週。在施予索拉非尼之同時，四氯化碳誘導亦持續進行。以僅經由四
氯化碳誘導肝纖維化之小鼠作為空白對照組，並以游離之索拉非尼處理之小鼠作為正控制組；實驗組1、實驗組2則分別為以本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子、包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理之小鼠；負控制組1、負控制組2則分別為僅以本發明PEG-PLGA共聚物、PEG-PLGA/PLGA複合材料形成之奈米粒子但未包覆索拉非尼處理之小鼠。
結果請參考第8圖，如第8圖所示，空白對照組因四氯化碳誘導而產生嚴重纖維化(白色部分)；負控制組1、負控制組2小鼠則因未含有索拉非尼，故，纖維化的情形未顯著改善；就實驗組1以及實驗組2之小鼠而言，與空白對照組相比，可明顯觀察到纖維化(白色部分)之數量及範圍顯著地縮小，說明本發明包覆有索拉非尼之PEG-PLGA或PEG-PLGA/PLGA奈米粒子可有效抑制肝臟纖維化的產生。此外，本發明包覆有索拉非尼之PEG-PLGA或PEG-PLGA/PLGA奈米粒子抑制肝纖維化之效果，相較於僅以游離之索拉非尼處理(正控制組)之效果明顯較佳，說明本發明用以包覆索拉非尼之PEG-PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料可提升索拉非尼之功效，達到更加有效舒緩肝纖維化之效果。
平滑肌α-肌動蛋白(Smooth muscle α-actin，α-SMA)的表現是星狀細胞活化時的指標之一。本實驗例評估本發明包覆有索拉非尼之PEG-PLGA或PEG-PLGA/PLGA奈米粒子對小鼠肝臟中肝星狀細胞活化之影響。
結果如第9A圖所示，由西方墨點圖可見，當施予小鼠游離
的索拉非尼時，α-SMA之表現量會被抑制，說明肝星狀細胞之活化被抑制；當施予小鼠本發明包覆有索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子時，如西方墨點圖所示，完全不見該α-SMA之表現量，說明本發明用以包覆索拉非尼之PEG-PLGA共聚物可使索拉非尼具有絕佳的肝星狀細胞活化抑制效果。
膠原蛋白(Collagen)不僅是人類體內含量最多的蛋白質，亦是存在細胞外間質中最多的蛋白質。本發明利用檢測膠原蛋白I(collagen I)之含量，以評估本發明包覆有索拉非尼之PEG-PLGA或PEG-PLGA/PLGA奈米粒子對細胞外間質之影響。以未經任何處理之小鼠作為空白對照組，並以游離之索拉非尼處理之小鼠作為正控制組；實驗組1、實驗組2則分別為以本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子、包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理之小鼠；負控制組1、負控制組2則分別為僅以本發明PEG-PLGA共聚物、PEG-PLGA/PLGA複合材料形成之奈米粒子處理之小鼠。
請參考第9B圖，其中實驗組1、實驗組2顯著地減少細胞外間質至肝臟面積的5%以下，相較於正控制組以游離之索拉非尼處理之減少細胞外間質之效果明顯優異約3倍左右，說明本發明將索拉非尼以PEG-PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆形成奈米粒子，可有效提升其減少細胞外間質之效果。另參考第9C圖，圖中發光(白色箭頭)處代表細胞外間質，僅以游離之索拉非尼處理之小鼠減少細胞外間質之效果並不顯著；然而，如第9C圖所示，當施予小鼠本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子或包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子，圖中幾乎不見發光處，亦證實本發明將索拉非尼以PEG-PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合
材料包覆形成奈米粒子具有顯著減少細胞外間質之效果。
溫韋伯氏因子(von Willebrand factor，vWF)是血液中的一種醣蛋白，其與止血作用相關，亦用於腫瘤中新生血管之血管內皮細胞標記。本實驗例評估本發明包覆有索拉非尼之PEG-PLGA或PEG-PLGA/PLGA奈米粒子對新生血管之影響。
其結果如第10A圖所示，本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子、包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子(實驗組1、實驗組2)均較僅以游離之索拉非尼處理之小鼠(正控制組)或未經任何處理之小鼠(空白對照組)顯著地降低肝臟細胞中的新生血管，其降低血管新生之效果約為僅以游離之索拉非尼處理之小鼠的兩倍，證實本發明使用PEG-PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材包覆索拉非尼可提升降低新生血管之能力。
再者，本實驗例亦評估本發明包覆有索拉非尼之PEG-PLGA或PEG-PLGA/PLGA奈米粒子對不正常血管之影響，特別是對血管管徑之影響。其結果如第10B圖所示，未經處理(空白對照組)小鼠之平均血管管徑約為110μm；以本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA奈米粒子、包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理之小鼠其平均血管管徑明顯降低，其中，特別是包覆索拉非尼之PEG-PLGA/PLGA奈米粒子可降低血管管徑至約60μm。此外，如第10C圖所示，肝臟組織中微血管(白色箭頭)的密度，小鼠在經由本發明包覆索拉非尼之PEG-PLGA或PEG-PLGA/PLGA奈米粒子處理後，明顯較未處理或僅以游離索拉非尼處理之小鼠的微血管密度為低，證
實以本發明之PEG-PLGA共聚物或PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆索拉非尼可有效縮小纖維化肝臟組織中微血管之管徑並降低微血管的密度，即有效促進微血管的正常化。
綜上所述，本發明用於包覆索拉非尼之PEG-PLGA共聚物可形成具有良好親油及親水性的奈米粒子，同時具有低分散性及良好的血液循環穩定性；而增加PEG-PLGA/PLGA複合材料中PLGA含量可增加形成奈米粒子之大小及其藥物包覆效率，並且減緩藥物釋放的效率。PEG-PLGA共聚物及PEG-PLGA/PLGA複合材料均可形成奈米粒子包覆用以索拉非尼，並且可成針劑，以注射方式施予，有效的延長索拉非尼在血液循環中的時間，並且均可促進索拉非尼在纖維化肝臟的吸收，亦可降低索拉非尼的細胞毒性及提升其生物可用性。此外，施予由PEG-PLGA共聚物包覆索拉非尼所形成之奈米粒子以及由PEG-PLGA/PLGA複合材料包覆索拉非尼所形成之奈米粒子可有效地改善肝臟的纖維化，同時更可使纖維化肝臟中不正常新生的血管縮小，進而降低纖維化肝臟中微血管的密度，以致血管的正常化。
本發明所提供包覆酪氨酸激酶抑制劑之奈米粒子在用於製備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。
Claims (8)
- 一種包覆索拉非尼(Sorafenib)之奈米粒子在用於製備改善肝臟纖維化之醫藥組成物的用途，其中該奈米粒子係由一聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PEG-PLGA)，或一聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸/聚乳酸聚乙醇酸複合材料(PEG-PLGA/PLGA)所構成，且PEG-PLGA與PLGA的重量比例為50：50至70：30，且該奈米粒子在纖維化肝臟累積而促進索拉非尼在纖維化肝臟之吸收。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該奈米粒子係降低索拉非尼在血液中之釋放速率。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該奈米粒子係減少纖維化肝臟中細胞外基質的累積。
- 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該細胞外基質係為膠原蛋白。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該奈米粒子係抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cell)之活性。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該奈米粒子係降低該纖維化肝臟中之血管新生。
- 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該奈米粒子進一步降低該纖維化肝臟中新生血管之密度及管徑。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物係一針劑。
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