TWI577380B - Lactic acid bacteria composition for the treatment of gastrointestinal disorders - Google Patents
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Description
本發明係有關於乳酸菌之第二用途，特別係指一種乳酸菌組合物用於抗腸胃疾病之用途。
按，腸炎弧菌，又被稱為副溶血性弧菌，最早於1950年日本大阪之海產食物中毒事件之檢體中篩選出，其係為一種革蘭氏陰性、嗜鹽性、兼性厭氧菌，分佈於世界各出海口與海灣中，會污染貝類、魚類、甲殼類等海產。而當攝食到被腸炎弧菌所污染之未煮熟海產，腸炎弧菌會附著於腸道細胞，分泌溶血素、細胞毒素、腸毒素等，引發如水漾下痢、腹痛、噁心、嘔吐、頭痛、發燒或寒顫等症狀。另外，腸炎弧菌具有組織入侵之能力，倘若傷口沾染到具有腸炎弧菌之海水，會引發敗血症或組織感染之病症。因此，對於如台灣等濱海國家，對於腸炎弧菌所引發之健康風險不得不加以重視。
目前對於腸炎弧菌臨床病症研究者，會以投予抗生素之方式治療，如氯黴素(Chloramphenicol)、頭芽孢菌素(Cephalosporin)或四環黴素。惟，使用抗生素之同時亦會殺死消化道之益菌，例如大腸桿菌、鏈球菌等，而破壞腸胃道正常菌叢，導致身體之抵抗力下降，容易被其他病菌入侵體內、誘發過敏或發炎反應。再者，長期不當使用抗生素，不僅個體會對於抗生素產生高度依賴性，亦會對於身體各部產生不良副作用，例
如腎臟功能受損、脾胃受損、皮膚出現紅疹等，並且，抗生素之濫用會使致病性細菌產生抗藥性。
據此可知，目前臨床上仍欠缺一種能夠有效治療腸炎弧菌所引發之病症，並且同時能夠不破壞個體腸胃道健康之組合物。
本發明之主要目的係在於揭露約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010之用途，由於約氏乳酸桿菌BCRC17010係具有抑制腸炎弧菌生長之能力，因此，能用以製造治療或/及改善腸胃道疾病之醫藥組合物。
為能達成上述目的，於本發明之實施例中係揭露一種將約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010用於製造治療腸胃道疾病之醫藥組合物之用途。而藉由投予含有有效量之約氏乳酸桿菌BCRC17010之醫藥組合物具一個體，能夠有效地治療或/及改善經細菌感染所引發之腸胃道疾病。
較佳地，該腸胃道疾病係由腸炎弧菌所引起者。
較佳地，約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010係能附著於腸胃道細胞中。
較佳地，約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010係經加熱處理。
除非另有定義，於本發明之說明書及申請專利範圍所使用之
技術及科學名詞之意義，其係與本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般理解者相同。若有矛盾之情形，以本發明內容為準。
所謂「有效量」乙詞係指欲產生所求特定效果所需活性成份之量，得以其在組合物中所佔重量百分比表示。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，該有效量會因為欲引起特定效果之投予途徑而有所不同。一般來說，活性成分於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%。
所謂「醫藥組合物」乙詞係包含一有效量之欲產生特定效果之所需活性成份以及至少一載體。而如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，組合物之型態得隨著欲引起特定效果之投予途徑有所不同，如錠劑、粉劑、針劑等，並且，該載體亦隨著組合物之型態而得為固態、半固態或液態。
所謂「投予」乙詞係指將一物遞送至一個體特定部位、特定細胞、特定靶點之方式，或其與個體接觸作用之途徑，一般來說，投予途徑係包含有，但不限於，口服、塗抹、噴灑、吸入、注射等。
以下，為能更進一步說明本發明之功效，將茲舉若干實例作詳細說明，惟，該等實例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。
實例一：菌株培養
請參閱下表一，其所列乳酸菌菌株係分別購自台灣新竹食品工業研究所之生物資源保存及研究中心。各該菌株經活化二次，培養基為
含有0.05%之L-半胱胺酸之乳酸桿菌MRS培養基(DIFCO，Detroit，Michigan，美國)，培養條件為37℃、20小時。並且，各該乳酸菌菌株係保存於含有15%甘油之MRS培養基，於-80℃冷凍。
另自台灣食品工業研究所之新竹生物資源保存及研究中心購入腸炎弧菌BCRC10806及BCRC12865，其所使用之培養基為添加2.5%氯化鈉溶液之TSB(Tryptic Soy Broth)，並且，培養溫度為37℃，隔夜培養。
實例二：抑菌圈試驗
取實例一中經培養20小時各該乳酸菌菌株之菌液1毫升，分別經8000rpm轉速離心10分鐘後，過濾，獲得各該乳酸菌菌株之上清液。
參考先前技術所揭孔洞擴散法抑菌試驗之方法(Varma et al.,2010)，將經隔夜培養，含有腸炎弧菌菌株之TSB及2.5%氯化鈉培養液，稀釋至約107CFU/mL。將菌液塗抹於添加2.5%氯化鈉溶液之TSA(Tryptic Soy Agar)培養基上，待稍微乾燥後，於該TSA培養基打出直徑約9毫米之孔洞。
取各該乳酸菌菌株之上清液100μL，分別注入該TSA培養基上之孔洞內。再將完成注入乳酸菌上清液之各該培養皿置於4℃，使菌液擴散2小時後，移入37℃培養箱中培養12小時。
培養完成後，分別測量各該培養皿中TSA培養基上所產生之抑菌圈直徑大小，結果係如下表二所示。
由於抑制圈直徑越大時，表示乳酸菌對腸炎弧菌之抑制能力越強，而透過自抑菌圈大小能夠判斷乳酸菌之抑菌能力，標準如下：抑制圈直徑≦11毫米為「-」，介於12~16毫米者為具第一級抑制能力「+」之菌株，介於17~22毫米者為具第二級抑制能力「++」之菌株，而直徑≧23毫米以上者為具第三級抑制能力「+++」之菌株。以上述標準分析表二之結果可知，表一所列之乳酸菌中僅有下列乳酸菌對於腸炎弧菌具有抑制能力：BCRC12575、14080、14084、14677、14735、16000、10696、17010。
實例三：分析乳酸菌菌株吸附腸道上皮細胞之能力
自台灣新竹食品工業研究所之生物資源保存及研究中心購入人類直腸癌細胞Caco-2。以一細胞培養基於一培養環境下進行培養人類直
腸癌細胞Caco-2，使人類直腸癌細胞Caco-2貼附生長，以進行後續試驗，其中，該細胞培養基為添加10%胎牛血清(Fetal bovie serum，FBS)、1%非必需胺基酸(Non-essential Amino Acid，NEAA)、0.01mg/ml轉鐵蛋白(Transferrin)及1.5g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)之DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養基，該培養環境為37℃、5%二氧化碳之培養箱。
確認該人類直腸癌細胞Caco-2完全貼附後，去除舊培養基，以磷酸鹽緩衝液清洗後，加入900μl新鮮培養基與100μl以細胞培養基回溶之一待測乳酸菌，於37℃、5%二氧化碳之培養箱培養2小時，使該乳酸菌吸附於該細胞上，其中，該待測乳酸菌係為上表二中抑菌圈≧12毫米之乳酸菌：BCRC12575、14080、14084、14677、14735、16000、10696、17010。
培養完成後，再將培養液去除，並以磷酸鹽緩衝液清洗培養盤上之各孔孔壁，而後分別於每孔加入200μl、濃度為6~10%福馬林作用約30分鐘，以將該菌體及該細胞固定於各孔中。去除福馬林，以磷酸鹽緩衝液清洗各該孔之孔壁，再加入200μl已稀釋之結晶紫作用約5分鐘，以將該細胞及該菌體染色。以倒立式螢光顯微鏡觀察計數於各該細胞上之乳酸菌數量，結果如下表三所示。
由先前技術係揭露每個細胞吸附15個菌體以上，該菌體才被認為有吸附能力(Pedersen and Tannock,1989)，依據該判斷標準分析表三可知，僅有寄存編號為BCRC17010之乳酸菌具有腸道細胞之吸附能力。
實例四：抑菌能力試驗
將腸炎弧菌BCRC10806及BCRC12865分別與乳酸菌以1：100之比例混合，其中，乳酸菌係取表三中之該三株乳酸菌：BCRC 17010、BCRC 14677及BCRC 14735。另將腸炎弧菌BCRC10806及BCRC12865分別與等量之磷酸鹽緩衝液混合，作為控制組。將各該混合菌液及各該控制組於37℃下培養1、2、3、4小時後，經1000xg離心，以磷酸鹽緩衝液清洗，以序列稀釋法稀釋至適當倍率後，以添加2.5%氯化鈉溶液之TSA培養基或以鑑別型培養基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBS agar)藉由傾倒法倒入培養皿上，凝固後倒置於37℃下隔夜培養，其中，倘若使用之培養基為鑑別型培養基，腸炎弧菌之菌落顏色為藍至綠色。培養完成後計算腸炎弧菌菌數，結果如下表四及表五所示。
由表四及表五之結果可知，雖然各該乳酸菌菌株分別與腸炎弧菌BCRC12865或腸炎弧菌BCRC10806共培養1小時，腸炎弧菌BCRC12865或腸炎弧菌BCRC10806之存活率皆下降，但是，僅由乳酸菌菌株BCRC17010能夠以較短之時間使各該腸炎弧菌之殘存率下降至0，顯示乳菌菌株BCRC17010係具有較佳之抑菌效率。
實例五：耐溫性試驗
取下列各該乳酸菌菌液及上清液：BCRC 17010、BCRC 14677及BCRC 14735，分別以100℃加熱15分鐘。再依據實例二所述方法將各該乳酸菌之菌液、加熱後菌液、加熱後上清液進行抑菌圈試驗，結果如下表六及表七所示。
依據實例二中所述抑菌能力之判斷標準可知，該三株乳酸菌中僅有BCRC 17010經100℃加熱後還具有抑菌能力，其他二株乳酸菌經加熱處理後皆無法抑制腸炎弧菌生長。
實例六：競爭吸附人類直腸癌細胞Caco-2之試驗
首先，分別取二乳酸菌：BCRC14735、BCRC17010之活菌菌液(109cfu/ml)1毫升，以及二腸炎弧菌：BCRC10806、BCRC12865之活菌菌液(107cfu/ml)1毫升。將各該活菌菌液以10000rpm離心10分鐘後，除去上清液，加入1毫升之磷酸鹽緩衝液，震盪回溶，再次離心，去除上清液，清洗後以1毫升細胞培養基回溶，以供後續競爭吸附試驗之用。
將該二腸炎弧菌：BCRC10806、BCRC12865分別與乳酸菌BCRC14735及BCRC17010進行競爭吸附試驗，結果係分別如下表八及表九
所示。
競爭吸附試驗之流程如下：取24孔盤，每孔加入1毫升人類直腸癌細胞Caco-2之細胞懸浮液，細胞濃度為2×105cell/ml，均勻混合後，以實例三中所述細胞培養基於37℃、5%二氧化碳培養箱中培養細胞2天，使該細胞貼附生長。確認該細胞完全貼附後，去除舊培養基後，以磷酸鹽緩衝液清洗後，分別以不同條件處理之，其中，加入800μl之新鮮培養基、100μl之待測乳酸菌菌液(109CFU/ml)及100μl之腸炎弧菌菌液(107CFU/ml)為實驗組；而加入900μl之新鮮培養基及100μl之腸炎弧菌菌液(107CFU/ml)為控制組。將以不同條件處理之各組細胞以1000rpm離心約2分鐘，放入37℃、5%二氧化碳培養箱培養1小時，使該待測乳酸菌、該腸炎弧菌得以吸附至該細胞上。之後，將培養液吸出，以磷酸鹽緩衝液清洗各該孔之孔壁後，於每孔加入1毫升、0.25%之trypsin/EDTA進行消化反應，再將細胞刮下，吸入含9毫升之磷酸鹽緩衝液中，經序列稀釋，以鑑別型培養基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar)傾倒法倒入培養皿上，凝固後倒置於37℃下進行隔夜培養，培養完成後觀察鑑別型培養基上所生長出而呈現藍至綠色之腸炎弧菌菌落，並且計算腸炎弧菌菌數。
由上表九及十之結果可知，相較於乳酸菌BCRC14735，乳酸菌BCRC17010確實具有抑制腸炎弧菌吸附於細胞之能力，並且，綜合上述實例三之結果可知，透過投予本發明所揭醫藥組合物至一感染腸炎弧菌之個體，乳酸菌BCRC17010能夠於腸道內抑制腸炎弧菌吸附於細胞上生長，達到治療腸炎弧菌所引發之疾病的功效。
實例七：檢測乳酸菌抑制腸炎弧菌侵入細胞之能力
如同實例六所述方法，將該二乳酸菌：BCRC14735、BCRC17010之活菌菌液(109cfu/ml)以及該二腸炎弧菌：BCRC10806、BCRC12865之活菌菌液(107cfu/ml)加以處理。而後，將該二腸炎弧菌：BCRC10806、BCRC12865分別與乳酸菌BCRC14735及BCRC17010進行細胞侵入試驗，結果係分別如下表十及十一所示，其中，腸炎弧菌BCRC10806侵入前之菌數為7.9log CFU/ml，腸炎弧菌BCRC 12865侵入前之菌數為7.52log CFU/ml。
細胞侵入試驗之流程係如下：取24孔盤，每孔加入1毫升人
類直腸癌細胞Caco-2之細胞懸浮液，細胞濃度為2×105cell/ml，均勻混合後，以實例三中所述細胞培養基於37℃、5%二氧化碳培養箱中培養細胞2天，使該細胞貼附生長。確認該細胞完全貼附後，去除舊培養基後，加入200μl之戊二醛(glutaraldehyde)固定10分鐘，而後以磷酸鹽緩衝液清洗後，再分別以不同條件處理之，其中，控制組係加入入900μl之新鮮培養基及100μl之腸炎弧菌菌液(107CFU/ml)，而實驗組係加入800μl之新鮮培養基、100μl之待測乳酸菌菌液(109CFU/ml)及100μl之腸炎弧菌菌液(107CFU/ml)。將該實驗組與該控制組分別以1000rpm離心約2分鐘，放入37℃、5%二氧化碳培養箱培養3小時，培養完成後，去除培養基，以磷酸鹽緩衝液清洗各該孔之孔壁，再於各該孔加入1毫升含有100μg/ml之卡納酶素(kanamycin)/不含胎牛血清之細胞培養基，於37℃、5%二氧化碳培養箱培養1小時，再以磷酸鹽緩衝液清洗，加入1毫升、0.1%之triton-100作用10分鐘後，取出裂解液至9毫升之磷酸延緩沖液中，經序列稀釋，以鑑別型培養基傾倒法倒入培養皿上，凝固後倒置於37℃下進行隔夜培養，培養完成後觀察鑑別型培養基上所生長出而呈現藍至綠色之腸炎弧菌菌落，並且計算腸炎弧菌菌數。
由表十及表十一之結果可知，於細胞侵入試驗中，乳酸菌BCRC17010具有較佳抑制腸炎弧菌侵入細胞之能力。由此可知，本發明所揭含有乳酸菌BCRC17010之醫藥組合物確實能夠治療由腸炎弧菌所引起之疾病。
綜合上述結果可知，本發明所揭含有約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010之醫藥組合物確實具有抑制腸炎弧菌生長、吸附或侵入細胞之能力，並且具有良好之腸道附著力，因此，藉由投予含有有效量之約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010之醫藥組合物至被感染腸炎弧菌之個體時，約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010能夠吸附於腸道細胞上，而能達到持續地於消化道中抑制病原菌生長，治療或/及改善腸胃道疾病之功效。
以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。
參考文獻
Varma、P., Dinesh, K.R., Menon, K.K., and Biswas, R. (2010). Lactobacillus fermentum isolated from human colonic mucosal biopsy inhibits the growth and adhesion of enteric and foodborne pathogens. Journal of food science 75, M546-551.
Pedersen, K., and Tannock, G.W. (1989). Colonization of the porcine gastrointestinal tract by lactobacilli. Applied and environmental microbiology 55, 279-283.
Claims (3)
- 一種將約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010用於製造治療或/及改善腸胃道疾病及/或腸胃健康之醫藥及/或保健組合物之用途，其中，該腸胃道疾病係由腸炎弧菌所引起者。
- 依據申請專利範圍第1項所述將約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010用於製造治療或/及改善腸胃道疾病及/或腸胃健康之醫藥及/或保健組合物組合物之用途，其中，該約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010係經加熱處理。
- 依據申請專利範圍第1項所述將約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010用於製造治療或/及改善腸胃道疾病及/或腸胃健康之醫藥及/或保健組合物組合物之用途，其中，約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)BCRC17010係能附著於腸胃道細胞中。
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