TWI569796B - 赤芝酮之用途 - Google Patents

Description

赤芝酮之用途

本發明係關於一種赤芝酮之用途，特別關於一種赤芝酮用以製備抗登革熱病毒及日本腦炎病毒之藥物、保健食品或營養補充品的用途。

黃病毒屬(flavivirus)為一群單股正鏈RNA病毒，其係藉由感染之節肢動物(例如，蚊子或壁蝨等)的叮咬而傳遞，其中包含西尼羅河病毒(West Nile virus)、登革熱病毒(dengue virus)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、黃熱病毒(yellow fever virus)等。

黃病毒屬病毒由於其染色體為容易發生變異之RNA，習用抗黃病毒屬病毒之藥物多係藉由抑制病毒之蛋白質活性以達成其療效，惟卻容易產生抗藥性，故確實仍有改善之空間。

本發明係提供一種赤芝酮之用途，係將赤芝酮用以製備抗登革熱病毒及日本腦炎病毒之藥物、保健食品或營養補充品者。

本發明所述之赤芝酮之用途，係用以製備抗登革熱病毒及日本腦炎病毒之藥物、保健食品或營養補充品，其中，赤芝酮係投予一所需個體，以抑制一登革熱病毒及日本腦炎病毒感染該所需個體。

其中，赤芝酮係以靜脈注射之方式投予該所需個體。

其中，赤芝酮係以每天每公斤體重之該所需個體投予2~5毫克之劑量投予該所需個體。

其中，赤芝酮係以每天每公斤體重之該所需個體投予4.8毫 克之劑量投予該所需個體。

本發明之赤芝酮係可以抑制登革熱病毒及日本腦炎病毒之複製，且誘導登革熱病毒及日本腦炎病毒所抑制之干擾素生成作用，因而可以作為製備抗登革熱病毒及日本腦炎病毒之藥物的活性成分，亦可以作為抗登革熱病毒及日本腦炎病毒之保健食品或營養補充品的活性成分，為本發明之功效。

第1a圖：係本發明五味子甲素之化學結構式。

第1b圖：係本發明五味子乙素之化學結構式。

第1c圖：係本發明五味子丙素之化學結構式。

第2a圖：係證實本發明五味子甲素對肝癌細胞無細胞毒性。

第2b圖：係證實本發明五味子乙素對肝癌細胞無細胞毒性。

第2c圖：係證實本發明五味子丙素對肝癌細胞無細胞毒性。

第3a圖：係證實本發明五味子甲素抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之RNA複製能力。

第3b圖：係證實本發明五味子甲素抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之非結構蛋白合成能力。

第4a圖：係證實本發明五味子乙素抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之RNA複製能力。

第4b圖：係證實本發明五味子乙素抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之非結構蛋白合成能力。

第5a圖：係證實本發明五味子丙素抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之RNA複製能力。

第5b圖：係證實本發明五味子丙素抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之 非結構蛋白合成能力。

第6a圖：係證實本發明五味子甲素誘導肝癌細胞表現干擾素IFNα-2。

第6b圖：係證實本發明五味子甲素誘導肝癌細胞表現干擾素IFNα-5。

第6c圖：係證實本發明五味子甲素誘導肝癌細胞表現干擾素IFNα-17。

第7a圖：係證實本發明五味子甲素誘導肝癌細胞表現抗病毒基因OAS-1。

第7b圖：係證實本發明五味子甲素誘導肝癌細胞表現抗病毒基因OAS-2。

第7c圖：係證實本發明五味子甲素誘導肝癌細胞表現抗病毒基因OAS-3。

第7d圖：係證實本發明五味子甲素誘導肝癌細胞表現抗病毒基因PKR。

第8a圖：係證實本發明五味子甲素提升受登革熱病毒感染之乳鼠的臨床成績。

第8b圖：係證實本發明五味子甲素提升受登革熱病毒感染之乳鼠的生長狀態。

第8c圖：係證實本發明五味子甲素提升受登革熱病毒感染之乳鼠的存活率。

第9a圖：係證實本發明五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素抑制日本腦炎病毒於肝癌細胞中之RNA複製能力。

第9b圖：係證實本發明五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素抑制日本腦炎病毒於肝癌細胞中之非結構蛋白合成能力。

第10圖：係本發明赤芝酮之化學結構式。

第11圖：係證實本發明赤芝酮對肝癌細胞無細胞毒性。

第12a圖：係證實本發明赤芝酮抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之RNA複製能力。

第12b圖：係證實本發明赤芝酮抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之非結構蛋白合成能力。

第13圖：係證實本發明赤芝酮抑制登革熱病毒於肝癌細胞中之蛋白酶活性。

第14a圖：係證實本發明赤芝酮誘導肝癌細胞表現干擾素。

第14b圖：係證實本發明赤芝酮誘導肝癌細胞表現干擾素IFNα-2。

第14c圖：係證實本發明赤芝酮誘導肝癌細胞表現干擾素IFNα-17。

第15a圖：係證實本發明赤芝酮誘導肝癌細胞表現抗病毒基因OAS-1。

第15b圖：係證實本發明赤芝酮誘導肝癌細胞表現抗病毒基因OAS-2。

第15c圖：係證實本發明赤芝酮誘導肝癌細胞表現抗病毒基因OAS-3。

第15d圖：係證實本發明赤芝酮誘導肝癌細胞表現抗病毒基因PKR。

第16a圖：係證實本發明赤芝酮提升受登革熱病毒感染之乳鼠的生長狀態。

第16b圖：係證實本發明赤芝酮提升受登革熱病毒感染之乳鼠的存活率。

第17a圖：係證實本發明赤芝酮抑制日本腦炎病毒於肝癌細胞中之RNA複製能力。

第17b圖：係證實本發明赤芝酮抑制日本腦炎病毒於肝癌細胞中之非結構蛋白合成能力。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明第一實施例所述之「五味子素」係為五味子甲素 (schizandrin A，具有如第1a圖所示之化學結構式)，其IUPAC名稱為(6R,7S)-1,2,3,10,11,12-六甲氧基-6,7-二甲基-5,6,7,8-環辛烯[a,c][8]輪烯((6R,7S)-1,2,3,10,11,12-hexamethoxy-6,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrodibenzo[a,c][8]annulene)、五味子乙素(schizandrin B，具有如第1b圖所示之化學結構式)，其IUPAC名稱為(6R,7S)-1,2,3,13-四甲氧基-6,7-二甲基-5,6,7,8-四氫苯並[3’,4’]環辛基[1’,2’：4,5]苯並[1,2-d][1,3]間二氧環戊基((6R,7S)-1,2,3,13-tetramethoxy-6,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrodibenzo[3’,4’]cycloocta[1’,2’：4,5]benzo[1,2-d][1,3]dioxole)及五味子丙素(schizandrin C，具有如第1c圖所示之化學結構式)，其IUPAC名稱為(6R,7S,13aS)-5,6,7,8-四氫基-13,14-甲氧基-6,7-二甲基環辛基[1,2-f：3,4-f’]雙[1,3]亞甲二氧基苯((6R,7S,13aS)-5,6,7,8-tetrahydro-13,14-dimethoxy-6,7-dimethylcycloocta[1,2-f：3,4-f’]bis[1,3]benzodioxole)之統稱，其可以為化學合成之化合物，亦可以為萃取自五味子(Schisandra chinensis)等植物之天然化合物，於此不加以限制。

本發明第一實施例之五味子素係可以投予一所需個體，其劑量可以依據該所需個體之狀況加以調整，例如以每天每公斤體重之該所需個體投予5~20毫克之劑量將五味子素以口服之方式投予該個體，較佳能夠以每天每公斤體重之該所需個體投予10毫克之劑量將五味子素以口服之方式投予該個體，進而可以抑制黃病毒屬病毒之複製，且可以誘導黃病毒屬病毒所抑制之干擾素生成作用，因而可以作為製備抗黃病毒屬病毒之藥物，或作為抗黃病毒屬病毒之保健食品或營養補充品。

為證實本發明第一實施例之五味子素確實可以抑制黃病毒屬病毒之複製，且可以誘導黃病毒屬病毒所抑制之干擾素生成作用，進而可以應用於製備抗黃病毒屬病毒之藥物，遂進行以下試驗：

(A)五味子素對肝癌細胞之細胞毒性

請參照第1表所示，本試驗係選用人類肝癌細胞株Huh-7進行，係分別以0、25、30、35、40μM之五味子素(溶於0.1%之DMSO)處理該肝癌細胞，於三天後以細胞毒性測試套組(MTS assay kit)觀察該肝癌細胞之細胞存活率，以未處理五味子素之肝癌細胞的細胞存活率作為100%。

請參照第2a圖所示，五味子甲素對該肝癌細胞並無顯著細胞毒性；此外，於第2b圖所示之五味子乙素、第2c圖所示之五味子丙素亦有相同的結果。

(B)五味子素抑制登革熱病毒之生理活性

請參照第2表所示，本試驗係分別以0、25、30、35、40μM之五味子素處理受登革熱病毒感染之肝癌細胞，於三天後分別收取總蛋白質及總RNA，以西方墨點法偵測非結構蛋白NS2B之蛋白質含量，另以反轉錄即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)偵測非結構蛋白NS5之RNA含量，並以GAPDH之蛋白質含量及RNA含量作為內控制組。

請參照第3a、3b圖所示，五味子甲素對於登革熱病毒之蛋白質生成、RNA複製均有顯著抑制效果，且其濃度與抑制效果呈正相關；此外，於第4a、4b圖所示之五味子乙素、第5a、5b圖所示之五味子丙素亦有相同的結果。

(C)五味子素提升肝癌細胞之抗病毒能力

請參照第3表所示，本試驗係分別以0、25、30、35、40μM之五味子甲素處理受登革熱病毒感染之肝癌細胞，於三天後收取總RNA，以反轉錄即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)偵測干擾素基因IFNα-2、IFNα-5及IFNα-17之RNA含量，並以GAPDH之RNA含量作為內控制組。

請參照第6a圖所示，五味子甲素可以有效提升干擾素IFNα-2的合成，且其濃度與提升效果呈正相關；此外，於第6b圖所示之 IFNα-5、第6c圖所示之IFNα-17亦有相同的結果。

仍請參照第3表所示，本試驗續分別以0、25、30、35、40μM之五味子甲素處理受登革熱病毒感染之肝癌細胞，於三天後收取總RNA，以反轉錄即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)偵測抗病毒基因2’-5’寡腺苷酸合成酶1(2’-5’-oligoadenylate synthetase 1，簡稱OAS1)、OAS2、OAS3及蛋白質激酶R(protein kinase R，簡稱PKR)之RNA含量，並以GAPDH之RNA含量作為內控制組，其結果如第7a圖所示，五味子甲素可以有效提升抗病毒基因OAS1的合成，且其濃度與提升效果呈正相關；此外，於第7b圖所示之OAS2、第7c圖所示之OAS3及第8d圖所示之PKR亦有相同的結果。

(D)五味子素提升乳鼠對抗登革熱病毒之能力

請參照第4表所示，本試驗係選用ICR乳鼠，以腦內注射之方式將2.5×10⁵PFU之登革熱病毒感染出生後4天之乳鼠，並於感染後的第1、3、5天分別投予五味子甲素；於試驗過程中每天觀察該乳鼠之外觀、活動行為，評估其臨床成績，另紀錄該乳鼠之體重增長，以及該乳鼠之存活率。

請參照第8a圖所示，感染登革熱病毒之第D1組乳鼠的臨床 成績呈上升勢，顯示其生理狀態漸漸惡化，而同時投予五味子甲素之第D2組乳鼠的臨床成績的上升趨勢則較為緩和，顯示五味子甲素可以改善感染登革熱病毒之症狀；續請參照第8b圖所示，五味子素之投予亦可以改善感染登革熱病毒後的體重下降現象；另請參照第8c圖所示，同時投予五味子甲素更可以有效改善感染登革熱病毒所造成之死亡現象。

(E)五味子素抑制日本腦炎病毒之生理活性

請參照第5表所示，本試驗係分別以0、25、30、35、40μM之五味子素處理受日本腦炎病毒感染之肝癌細胞，於三天後分別收取總蛋白質及總RNA，以西方墨點法偵測非結構蛋白NS2B之蛋白質含量，另以反轉錄即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)偵測非結構蛋白NS5之RNA含量，並以GAPDH之蛋白質含量及RNA含量作為內控制組。

請參照第9a、9b圖所示，五味子甲素、五味子乙素及五味子丙素對於日本腦炎病毒之蛋白質生成、RNA合成均有顯著抑制效果。

綜合上述試驗結果，本發明第一實施例之五味子素可以抑制黃病毒屬病毒之RNA的複製及蛋白質的生成，同時亦可以誘導黃病毒屬病 毒所抑制之干擾素生成作用，使受感染之細胞能夠正常生成干擾素，進而可以使干擾素下游之抗病毒基因正常作用，因而本發明之五味子素可以改善受到黃病毒屬病毒感染之哺乳類動物的正常生理狀態，改善哺乳動物受到黃病毒屬病毒感染所造成之死亡現象。

又，本發明第二實施例所述之「赤芝酮」係具有如第10圖所示之化學結構式，其IUPAC名稱為2-[(1Z,2E)-1-羥基-3-苯基-2-亞丙烯基]-4-甲基-4-環戊基-1,3-二酮(2-[(1Z,2E)-1-hydroxy-3-phenyl-2-propenylidene]-4-methoxy-4-cyclopentene-1,3-dione)，其可以為化學合成之化合物，或者為萃取自靈芝(Ganoderma lucidum)、紅果釣樟(Lindera erythrocarpa Makino)等植物之天然化合物，於此不加以限制。

本發明第二實施例之赤芝酮係可以投予一所需個體，其劑量可以依據該所需個體之狀況加以調整，例如以每天每公斤體重之該所需個體投予2~5毫克之劑量將赤芝酮以靜脈注射之方式投予該所需個體，較佳能夠以每天每公斤體重之該所需個體投予4.8毫克之劑量將赤芝酮以靜脈注射之方式投予該所需個體，進而可以抑制黃病毒屬病毒之複製，且可以誘導黃病毒屬病毒所抑制之干擾素生成作用，因而可以作為製備抗黃病毒屬病毒之藥物，或作為抗黃病毒屬病毒之保健食品或營養補充品。

為證實本發明第二實施例之赤芝酮確實可以抑制黃病毒屬病毒之複製，且可以誘導黃病毒屬病毒所抑制之干擾素生成作用，進而可以應用於製備抗黃病毒屬病毒之藥物，遂進行以下試驗：

(F)赤芝酮對肝癌細胞之細胞毒性

請參照第6表所示，本試驗係分別以0、5、10、20、40μM之赤芝酮(溶於0.1%之DMSO)處理該肝癌細胞，於三天後以細胞毒性測試套組(MTS assay kit)觀察該肝癌細胞之細胞存活率，以未處理赤芝酮 之肝癌細胞的細胞存活率作為100%。

請參照第11圖所示，赤芝酮對該肝癌細胞並無顯著細胞毒性。

(G)赤芝酮抑制登革熱病毒之生理活性

請參照第7表所示，本試驗係分別0、5、10、20、40μM之赤芝酮處理受登革熱病毒感染之肝癌細胞，於三天後分別收取總蛋白質及總RNA，以西方墨點法偵測非結構蛋白NS2B之蛋白質含量，另以反轉錄即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)偵測非結構蛋白NS5之RNA含量，並以GAPDH之蛋白質含量及RNA含量作為內控制組。

請參照第12a、12b圖所示，赤芝酮對於登革熱病毒之蛋白質生成、RNA複製均有顯著抑制效果，且其濃度與抑制效果呈正相關。

仍請參照第7表所示，本試驗另於受登革熱病毒感染之肝癌細胞轉染NS2B/3表現載體pCMV-NS2B/3-Myc及NS2B/3反應載體pEGFP-LRRG-SEAP，續以0、5、10、20、40μM之赤芝酮處理前述肝癌細胞，於三天後偵測SEAP之活性，其結果如第13圖所示，赤芝酮對於登革熱病毒之蛋白酶活性具有顯著抑制效果，且其濃度與抑制效果呈正相關。

(H)五味子素提升肝癌細胞之抗病毒能力

請參照第8表所示，本試驗係於受登革熱病毒感染之肝癌細胞轉染IFN冷光報導載體pISRE-Luc，並分別以0、5、10、20、40μM之赤芝酮處理受登革熱病毒感染之肝癌細胞，於三天後收取總蛋白質，並分析冷光酵素活性。

請參照第14a圖所示，赤芝酮有效提升IFN冷光酵素活性，且其濃度與提升效果呈正相關。

仍請參照第8表所示，本試驗續分別以0、20、40μM之赤芝酮處理受登革熱病毒感染之肝癌細胞，於三天後收取總RNA，以反轉錄即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)偵測干擾素IFNα-2及IFNα-17之 RNA含量，並以GAPDH之RNA含量作為內控制組，其結果如第14b圖所示，赤芝酮可以有效提升干擾素IFNα-2的合成，且其濃度與提升效果呈正相關；此外，於第14c圖所示之IFNα-17亦有相同的結果。

仍請參照第8表所示，本試驗續分別以0、20、40μM之赤芝酮處理受登革熱病毒感染之肝癌細胞，於三天後收取總RNA，以反轉錄即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)偵測抗病毒基因OAS1、OAS2、OAS3及PKR之RNA含量，並以GAPDH之RNA含量作為內控制組，其結果如第15a圖所示，赤芝酮可以有效提升抗病毒基因OAS1的合成，且其濃度與提升效果呈正相關；此外，於第15b圖所示之OAS2、第15c圖所示之OAS3及第15d圖所示之PKR亦有相同的結果。

(I)赤芝酮提升乳鼠對抗登革熱病毒之能力

請參照第9表所示，本試驗係選用ICR乳鼠，以腦內注射之方式將2×10⁵PFU之登革熱病毒感染出生後6天之乳鼠，並於感染後的第1、3、5天分別投予赤芝酮；於試驗過程中每天該乳鼠之體重增長，以及該乳鼠之存活率。

請參照第16a圖所示，感染登革熱病毒之第I1組乳鼠的體重幾乎沒有增長，顯示其生理狀態漸漸惡化，而同時投予赤芝酮則可以改善感染登革熱病毒後的體重下降現象；另請參照第16b圖所示，同時投予赤芝酮亦可以有效改善感染登革熱病毒所造成之死亡現象。

此外，本試驗另將第I1、I2組乳鼠於感染6天後犧牲，續取乳鼠腦部組織之病毒上清液感染倉鼠腎臟細胞，並以結晶紫染色計算病毒數量，其結果如第10表所示，同時投予赤芝酮可以減低乳鼠腦部組織之病毒數量。

(J)赤芝酮抑制日本腦炎病毒之生理活性

請參照第11表所示，本試驗係分別以0、20、40μM之赤芝酮處理受日本腦炎病毒感染之肝癌細胞，於三天後分別收取總蛋白質及總RNA，以西方墨點法偵測非結構蛋白NS2B之蛋白質含量，另以反轉錄即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)偵測非結構蛋白NS5之RNA含量，並以GAPDH之蛋白質含量及RNA含量作為內控制組。

請參照第17a、17b圖所示，赤芝酮對於日本腦炎病毒之蛋白質生成、RNA合成均有顯著抑制效果。

綜合上述試驗結果，本發明第二實施例之赤芝酮可以抑制黃病毒屬病毒之RNA的複製及蛋白質的生成，同時亦可以誘導黃病毒屬病毒所抑制之干擾素生成作用，使受感染之細胞能夠正常生成干擾素，進而可以使干擾素下游之抗病毒基因正常作用，因而本發明之赤芝酮可以改善受到黃病毒屬病毒感染之哺乳類動物的正常生理狀態，改善哺乳動物受到黃病毒屬病毒感染所造成之死亡現象。

綜合上述，本發明之赤芝酮係可以抑制黃病毒屬病毒之複製，且誘導黃病毒屬病毒所抑制之干擾素生成作用，因而可以作為製備抗黃病毒屬病毒之藥物的活性成分，或作為抗黃病毒屬病毒之保健食品或營養補充品的活性成分，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (8)

1. 一種赤芝酮之用途，係用以製備抗登革熱病毒之藥物、保健食品或營養補充品，其中，赤芝酮係投予一所需個體，以抑制一登革熱病毒感染該所需個體。
2. 如申請專利範圍第1項所述之赤芝酮之用途，其中，赤芝酮係以靜脈注射之方式投予該所需個體。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之赤芝酮之用途，其中，赤芝酮係以每天每公斤體重之該所需個體投予2~5毫克之劑量投予該所需個體。
4. 如申請專利範圍第3項所述之赤芝酮之用途，其中，赤芝酮係以每天每公斤體重之該所需個體投予4.8毫克之劑量投予該所需個體。
5. 一種赤芝酮之用途，係用以製備抗日本腦炎病毒之藥物、保健食品或營養補充品，其中，赤芝酮係投予一所需個體，以抑制一日本腦炎病毒感染該所需個體。
6. 如申請專利範圍第5項所述之赤芝酮之用途，其中，赤芝酮係以靜脈注射之方式投予該所需個體。
7. 如申請專利範圍第5或6項所述之赤芝酮之用途，其中，赤芝酮係以每天每公斤體重之該所需個體投予2~5毫克之劑量投予該所需個體。
8. 如申請專利範圍第7項所述之赤芝酮之用途，其中，赤芝酮係以每天每公斤體重之該所需個體投予4.8毫克之劑量投予該所需個體。