TWI551608B

TWI551608B - 決定B型肝炎病毒表面抗原pre-S2區域內缺失的抗體與其方法

Info

Publication number: TWI551608B
Application number: TW103138969A
Authority: TW
Inventors: 黃溫雅; 蘇益仁; 李芸萍
Original assignee: 財團法人國家衛生研究院
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2016-10-01
Also published as: TW201617365A

Description

判定B型肝炎病毒表面抗原pre-S2區域內缺失的抗體與其方法

相關申請案之交互參照

本申請案主張於2013年7月16日提出之美國臨時申請案61/846,764之效益，其揭露之全部內容於此併入做為參考。

本發明相關於抗B型肝炎病毒表面蛋白抗體；包括其抗體的免疫分析套組；以及偵測B型肝炎病毒表面蛋白的方法，特別是針對B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體、大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體、野生型大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體；包含該抗體的免疫分析套組；以及偵測pre-S₂ 缺失突變大B型肝炎病毒表面蛋白的方法。

慢性B型肝炎病毒感染是全世界肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的主要原因，且在亞洲是最重要的原因。B型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)相關的HCC通常發生在40歲或更年長的年紀，暗示HBV可能在HCC真正發展之前持續存在於帶原者內幾十年。長期追蹤慢性HBV帶原者內的高風險標記物以判定需要經常追蹤或採取預防性治療的帶原者是重要的。此外，在接受肝切除手術的HCC患者內的高風險復發標記物的發展，對於臨床醫師判定需要尋求積極的治療之具有相對差的預後的患者也是重要的。雖然到目前為止已經建立診斷HCC的方法(例如，超音波)和腫瘤標記物(例如，甲型胎兒蛋白)，用於HCC發病率和復發率的高風險標記物並沒有被完全鑑定，鑒於HCC腫瘤形成是在宿主和病毒因素之間被多種串擾調控的複雜過程。

從第二型毛玻璃肝細胞(ground-glass hepatocyte, GGH)分離的pre-S₂ 缺失突變大B型肝炎病毒表面蛋白(large hepatitis B virus surface protein , LHBS)，和HCC高度相關⁽¹⁾ 。GGH廣佈在有慢性HBV感染和有HBV誘導的HCC腫瘤的肝臟內。第一型GGH通常單一地散布在肝的小葉內，以HBS的緻密均勻或像包涵體狀(inclusion-like)表現。這種GGH的類型通常開始出現在早期帶原者階段或有活動性病變的病患，通常與核或細胞質核心抗原共表現^(2,3) 。先前的研究發現第一型GGH含有LHBS部分pre-S₁ 區域的缺失並累積在內質網內腔⁽⁴⁾ 。另一方面，第二型GGH在細胞邊緣或周邊表現HBS的獨特型式(對於GGH形態，見第1圖)。最有趣和最重要的是，GGH的這種類型始終叢聚成小瘤並通常出現在病毒複製的晚期或低複製階段，且通常與肝硬化或HCC相關，其暗示第二型GGH可代表HCC的無性繁殖增殖、腺瘤性、或前腫瘤病灶^(2,3) 。藉由解剖含有第二型GGH的肝硬化小瘤，HBV基因體被無性繁殖增殖且統合，支持第二型GGH的無性或腺瘤性的概念。GGH的這類型展現「邊緣」類型表面抗原的獨特型式且含有LHBS部分地pre-S₂ 區域的缺失，標定pre-S₂ 突變LHBS⁽³⁾ 。pre-S₂ 突變LHBS高度表現在大多數的HBV誘發的肝硬化小瘤內，透過前腫瘤病灶、早期HCC、和大HCC腫瘤的階段，其暗指在HCC的腫瘤進程內pre-S₂ 突變LHBS的重要角色。pre-S₂ 缺失區域叢聚在pre-S₂ 區域的胺基端，主要在40至60個核苷酸長度的範圍內，雖然某些情況包含短至10個核苷酸的缺失且仍表現第二型GGH形態⁽³⁾ 。某些pre-S₂ 突變LHBS也含有在pre-S₂ ATG起始密碼子的點突變，造成無中間S抗原的合成(第2圖)。常見在pre-S₂ 突變LHBS內缺失的區域包含CD8 T-細胞表位，其提出突變LHBS的此類型從免疫監視中逃脫接著變成在HBV的長期持續性感染中選擇性克隆的假說。

在過去10年左右的時間內，本發明的發明人聚焦在研究由pre-S突變LHBS造成的病理效應，特別是pre-S₂ 類型，因為LHBS的此種種類是特別與HCC高度相關。被發現的是，pre-S₁ 和–S₂ 突變LHBS兩者分佈在肝細胞的內質網(endoplasmic reticulum, ER)裡並誘導內質網壓力⁽⁴⁾ 。然而，pre-S₂ 突變LHBS特異性地誘導透過NFκB路徑中介的ER壓力誘導生長增殖⁽⁵⁾ 。 pre-S₂ 突變LHBS也包括相較於野生型或pre-S₁ 突變LHBS，明顯較高的ER壓力依賴氧化壓力和氧化DNA損壞程度，其導致基因體的不穩定性，及細胞癌變的結果⁽⁶⁾ 。此外，pre-S₂ 突變LHBS特異性地包括周期蛋白A過表現⁽⁷⁾ 和直接地與Jun活化結構域結合蛋白1(Jun activation domain-binding protein 1, JAB1)以造成腫瘤抑制因子視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)和細胞週期進程的去活化⁽⁸⁾ 。聚集這些研究提供pre-S₂ 突變 LHBS可能在HBV誘導HCC裡扮演重要角色的證據之清晰線索。

pre-S₂ 突變LHBS在HBV感染的急性發病期相對低但在HBV感染的長期期間大幅增加。在HCC，高於60%，這指明其在慢性的HBV感染的晚期內是高度廣佈的，且顯著地與晚期的肝臟疾病像是肝硬化和HCC相關⁽⁹⁾ 。為了偵測在LHBS內的pre-S缺失，我們先前發展Pre-S基因晶片(Pre-S Gene Chip)，其基於在病患內的HBS基因的DNA雜合至在該晶片上的DNA探針，來偵測pre-S缺失。被發現WT和pre-S突變LHBS常常共存在一個獨立HBV帶原者內，其使得偵測pre-S突變困難。此外，在晶片分析之前需要用於複製和分離每個個體的基因產物的勞動密集過程。

更甚者，pre-S₂ 缺失突變在對慢性HBV帶原者使用核苷類似物的抗病毒療法之後也已經被顯示為增加，這暗示呈現pre-S₂ 突變大HBV表面(LHBS)蛋白的帶原者是HCC的高風險者。參見Zhang等人，2012年，生物醫學中心微生物學期刊，12期，頁次307-316 (Zhang et al. BMC Microbiology, 12: 307-316 (2012))。如此，有需要發展用於快速且精確的偵測在HBV Pre-S區域內的缺失之方法，藉此評估HBV帶原者發生肝硬化/HCC的風險。參考資料 1. Gerber MA、Hadziyannis S、Vernace S、Vissoulis C。「在肝細胞內胞質B型肝炎抗原的發生率和自然性質」(Incidence and nature of cytoplasmic hepatitis B antigen in hepatocytes)。實驗室研究期刊( Lab Invest)。 1975年，32:251-256。 2. Fan YF、Lu CC、Chang YC、Chang TT、Lin PW、Lei HY、Su IJ。「在慢性B型肝炎病毒感染的疾病晚期，於表現表面抗原的新型邊緣型式的肝細胞中的pre-S2突變的鑑定」(Identification of a pre-S2 mutant in hepatocytes expressing a novel marginal pattern of surface antigen in advanced disease of chronic hepatitis B virus infection)。胃腸病學和肝病學期刊(J. Gastroenterol. Hepatol.)。 2000年，15:519–528。 3. Fan YF、Lu CC、Chen WC等人。「在血清和肝臟內B型肝炎病毒(HBV)pre-S突變於慢性HBV感染的不同複製階段的患病率和意義」(Prevalence and significance of hepatitis B virus (HBV) pre-S mutants in serum and liver at different replicative stages of chronic HBV infection)。肝病學期刊(Hepatology)。 2001年，33:277-286。 4. Wang HC、Wu HC、Chen CF等人。「在慢性B型肝炎病毒感染中不同種類的毛玻璃肝細胞含有可誘導內質網壓力的特異性pre-S突變」(Different types of ground glass hepatocytes in chronic hepatitis B virus infection contain specific pre-S mutants that may induce endoplasmic reticulum stress)。病理學美國期刊(Am. J. Pathol)。2003年，163:2441–2449。 5. Hung JH、Su IJ、Lei HY等人。「內質網壓力透過NF-kappaB與pp38促分裂原活化蛋白激酶之活化刺激環氧合酶-2的表現」(Endoplasmic reticulum stress stimulates the expression of cyclooxygenase-2 through activation of NF-kappaB and pp38 mitogen-activated protein kinase)。生物化學期刊(J Biol Chem)。2004年，279:46384-46392。 6. Hsieh YH、Su IJ、Wang HC等人。「在慢性B型肝炎病毒感染誘發氧化壓力及DNA損害內之pre-S突變表面抗原」 (The pre-S mutant surface antigens in chronic hepatitis B virus infection induce oxidative stress and DNA damage)。致癌作用期刊(Carcinogenesis)。 2004年，25:2023-2032。 7. Wang HC、Huang W、Lai MD等人。「被B型肝炎病毒pre-S2突變誘發的異常周期蛋白A表現和中心體過複製以及其在肝細胞癌變的涵義」(Aberrant cyclin A expression and centrosome overduplication induced by hepatitis B virus pre-S2 mutants and its implication in hepatocarcinogenesis)。致癌作用期刊(Carcinogenesis)。 2012年，33:466-472。 8. Hsieh YH、Su IJ、Wang HC等人。「B型肝炎病毒pre-S2突變表面抗原透過c-Jun活化結構域結合蛋白1誘導周期蛋白依賴性激酶抑制因子p27Kip1」(Hepatitis B virus pre-S2 mutant surface antigen induces degradation of cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1 through c-Jun activation domain-binding protein 1)。分子癌症研究期刊(Mol Cancer Res)。2007年，5:1063-1072。 9. Shen FC、Su IJ、Wu HC等人。「Pre-S基因晶片以偵測在B型肝炎病毒大表面抗原內的pre-S缺失作為對於在慢性HBV帶原者內肝癌風險的預測標記物」(A Pre-S Gene Chip to detect the pre-S deletions in the hepatitis B virus large surface antigen as a predictive marker for hepatoma risk in the chronic HBV carriers)。生物醫學科學期刊(J. Biomed. Sci)。2009年，16:84-91。 10. Shafritz DA、Shouval D、Sherman HI等人。「B型肝炎病毒DNA整合入在慢性肝病和肝細胞癌中的肝細胞的基因體內。在經皮的肝臟活體組織切片與死後分析組織標本內的研究」(Integration of hepatitis B virus DNA into the genome of liver cells in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Studies in percutaneous liver biopsies and post-mortem tissue specimens)。新英格蘭醫學期刊(N Engl J Med)。1981年，305:1067-1073。 11. Guerrieri F、Belloni L、Pediconi N、Levrero M。「HBV相關的肝癌形成的分子機制」(Molecular mechanisms of HBV-associated hepatocarcinogenesis)。肝病研討會刊(Semin Liver Dis)。 2013年，33:147-156。 12. Hung L、Kumar V。「藉由小干擾RNAs之B型肝炎病毒X蛋白和c-myc的基因表現和反式活化功能的特異性抑制」(Specific inhibition of gene expression and transactivation functions of hepatitis B virus X protein and c-myc by small interfering RNAs)。歐洲生化學會聯盟快報(FEBS Lett)。2004年，560:210-214。 13. Becker SA、Lee TH、Butel JS等人。「B型肝炎病毒X蛋白干擾與細胞DNA修復」(Hepatitis B virus X protein interferes with cellular DNA repair)。病毒學期刊(J Virol)。1998年，72:266-272。 14. Chen BF、Liu CJ、Jow GM等人。「在具有漸進的肝臟疾病B型肝炎病毒帶原者內高患病率和pre-S缺失定位」( High prevalence and mapping of pre-S deletion in hepatitis B virus carriers with progressive liver diseases)。胃腸學期刊(Gastroenterology)。 2006年，130:1153-1168。 15. Chen CH、Hung CH、Lee CM等人。「在HBeAg陰性患者內相關於末期肝臟疾病之B型肝炎病毒的pre-S缺失和複雜突變」(Pre-S deletion and complex mutations of hepatitis B virus related to advanced liver disease in HBeAg-negative patients)。胃腸學期肝(Gastroenterology)。 2007年，133:1466-1474。 16. Tsai HW、Lin YJ、Lin PW等人。「手術後叢聚的毛玻璃肝細胞型式展示對肝細胞癌的復發之新的預後標記物」(A clustered ground-glass hepatocyte pattern represents a new prognostic marker for the recurrence of hepatocellular carcinoma after surgery)。癌症期刊(Cancer)。 2011年，117:2951-2960。 17. Zhang D、Dong P、Zhang K等人。「在抗病毒治療期間全基因體HBV缺失圖譜及pre-S缺失突變的累積」(Whole genome HBV deletion profiles and the accumulation of pre-S deletion mutant during antiviral treatment)。生物醫學中心微生物學期刊(BMC Microbiol)。2012年，12:307。

因此，本發明的主要目的是提供HBS特異性抗體、LHBS特異性抗體、野生型(WT)LHBS特異性抗體、包含該抗體的免疫分析套組、以及使用該免疫分析套組偵測pre-S₂ 缺失突變LHBS，以評估pre-S₂ 缺失突變LHBS，做為在慢性HBV帶原者中HCC發病率以及在肝切除手術後HCC病患復發的潛在高風險標記物的方法。

為了達到前述目的，本發明提供大B型肝炎病毒表面蛋白(LHBS)特異性抗體，特異性地結合至顯示為SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之重組蛋白。

優選地，LHBS抗體可藉由103年9月1日寄存在300新竹市食品路331號的食品工業發展研究所，登錄號BCRC960490的融合瘤細胞株產生。

優選地，融合瘤細胞株可以顯示為SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的重組蛋白接種的小鼠的骨髓瘤細胞和脾細胞融合。

優選地，抗體可為抗原結合片段或LHBS特異性抗體的功能性變異，並且功能性變異包括與LHBS特異性抗體相同的互補決定區(CDRs)。

為了達成上述目的，本發明提供野生型大B型肝炎病毒表面蛋白(WT LHBS)特異性抗體，特異性地結合至顯示為SEQ ID NO: 2的胺基酸序列之胜肽。

優選地，WT LHBS抗體可藉由103年7月16日寄存在300新竹市食品路331號的食品工業發展研究所，登錄號BCRC960488的融合瘤細胞株產生。

優選地，融合瘤細胞株可藉由以顯示為SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的胜肽接種的小鼠的骨髓瘤細胞和脾細胞融合。

優選地，抗體可為抗原結合片段或WT LHBS特異性抗原的功能性變異，且該功能性變異包含如WT LHBS特異性抗體相同的互補決定區(CDRs)。

為了達成上述目的，本發明提供B型肝炎病毒表面蛋白(HBS)特異性抗體，特異性地結合至顯示為SEQ ID NO: 3的胺基酸序列之胜肽。

優選地，HBS抗體可藉由103年10月22日寄存在300新竹市食品路331號的食品工業發展研究所，登錄號BCRC960491的融合瘤細胞株產生。

優選地，融合瘤細胞株可藉由以顯示為SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的胜肽接種的小鼠的骨髓瘤細胞和脾細胞融合。

優選地，抗體可為抗原結合片段或HBS特異性抗體的功能性變異，且該功能性變異包括與HBS特異性抗體相同的互補決定區(CDRs)。

優選地，抗原結合片段可為Fab或F(ab’)₂ 片段。

優選地，訊號產生單元可進一步共軛至該抗體。

優選地，訊號產生單元可包括放射性標記、螢光標記、磷光標記、化學發光標記、或標籤酵素。

優選地，標籤酵素可包含山葵過氧化酶或鹼性磷酸酶。

為了達成前述目的，本發明進一步提供偵測在生物樣本裡LHBS和WT LHBS的免疫分析套組，其包含：受質；固定在該受質上的第一抗體，且第一抗體特異性地結合至B型肝炎病毒表面蛋白的胺基酸殘基1-226；用於阻斷未共軛蛋白之阻斷溶液；特異性地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的胺基酸殘基1-119之第二抗體，和特異性地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的胺基酸殘基125-142之第三抗體；以及用於與共軛至第二和第三抗體的訊號產生單元反應之反應基質。

優選地，第一抗體可為藉由103年10月22日寄存在300新竹市食品路331號的食品工業發展研究所，登錄號BCRC960491或其後代的融合瘤細胞株所產生的B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體。

優選地，第二抗體可為藉由103年9月1日寄存在300新竹市食品路331號的食品工業發展研究所，登錄號BCRC960490或其後代的融合瘤細胞株所產生的大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體。

第三抗體可為藉由103年7月16日寄存在300新竹市食品路331號的食品工業發展研究所，登錄號BCRC960488或其後代的融合瘤細胞株所產生的野生型大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體。

優選地，阻斷溶液可包括脫脂牛乳、牛血清蛋白、或酪蛋白。

優選地，免疫分析套組可更包括洗滌溶液，且洗滌溶液包括PBS、TBS、包括清潔劑的PBS、或包括清潔劑的TBS。

優選地，若訊號產生單元可為山葵過氧化酶，則反應受質可為四甲基聯苯胺(TMB)。

為了達成前述目標，本發明進一步提供一種在生物樣本裡偵測pre-S₂ 缺失突變大B型肝炎病毒表面蛋白的方法，其包括：孵育生物樣本與固定在受質上的第一抗體，用以結合B型肝炎病毒表面蛋白至該第一抗體，其中該第一抗體特異性地結合至B型肝炎病毒表面蛋白的胺基酸殘基1-226；分別藉由孵育結合的B型肝炎病毒表面蛋白與特異性地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的胺基酸殘基1-119的第二抗體以及特異性地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的胺基酸殘基125-142的第三抗體，來偵測結合至固定的第一抗體的大B型肝炎病毒表面蛋白和野生型B型肝炎病毒表面蛋白；以及藉由從大B型肝炎病毒表面蛋白的數量減去野生型大B型肝炎病毒表面蛋白的數量，來計算pre-S₂ 缺失突變大B型肝炎病毒表面蛋白的數量。

優選地，生物樣本可從人類分離。

優選地，人類可為HBV帶原者或肝癌患者。

優選地， B型肝炎病毒帶原者可為HBeAg-陰性、具有高於生物樣本的10⁴ copies/ml的HBV病毒量或其組合。

優選地，方法可進一步包括評估HBV帶原者發展肝細胞癌或肝硬化之風險的步驟。

優選地，HBV帶原者可已經經歷使用核苷類似物或干擾素藥物的抗病毒療法。

優選地，方法可進一步包括評估在抗病毒療法之後發展肝細胞癌或肝硬化之風險的步驟。

優選地，肝癌患者可為經歷過肝切除手術的肝細胞癌患者。

優選地，方法可進一步包括評估手術之後1至12個月，肝細胞癌患者的癌症復發之風險的步驟。

優選地，生物樣本可為全血、血漿或血清。

優選地，方法可進一步包括從生物樣本分離B型肝炎病毒表面蛋白的步驟。

HBS特異性抗體、LHBS特異性抗體、WT LHBS特異性抗體、包含該些抗體的免疫分析套組、以及根據本發明的實施例使用該免疫分析套組來偵測pre-S₂ 缺失突變LHBS的方法可具有下列優點：

(1)本發明之包含此些抗體的免疫分析套組以及使用其偵測pre-S₂ 缺失突變LHBS的方法可易於計算在生物樣本內pre-S₂ 缺失突變LHBS的數量，而無在野生型和pre-S突變LHBS之間的相互影響。

(2) 本發明之包含此些抗體的免疫分析套組以及使用其偵測pre-S₂ 缺失突變LHBS的方法，與Pre-S 基因晶片分析相比，可減少在分析之前用於複製和分離每個個體的基因產物的勞動密集過程。

本發明的技術內容將藉著下列實施例的詳細說明以及以下相關附圖的圖示而變得顯而易見。

定義

用語「HBS」被使用於本文中指稱B型肝炎病毒(HBV)的表面蛋白。HBS包括大HBS、中HBS和小HBS，其為表面蛋白的不同剪接形式。

用語「LHBS」被使用於本文中指稱包含pre-S₁ 、pre-S₂ 和S區域的大表面蛋白。

用語「WT LHBS」被使用於本文中指稱包括有著401個胺基酸的長度的pre-S₁ 、pre-S₂ 和S區域之野生型大表面蛋白。

用語「pre-S₂ 缺失突變LHBS」被使用於本文中指稱在pre-S₂ 區域內有著大約20個胺基酸的缺失之大表面蛋白。

用語「偵測」以最廣泛的意義使用以涵蓋目標分子的定性和定量測量。一個態樣中，本文所述的偵測方法是用來判定在生物樣本裡的HBS、LHBS或WT LHBS的存在本身。在另一個態樣中，方法被使用以測試在樣本內的HBS、 LHBS或WT LHBS是否在可偵測的量。又另一個態樣中，方法能夠被使用以量化在樣本內HBS、LHBS或WT LHBS的數量並進一步比較來自不同樣本的HBS、LHBS或WT LHBS的量。

用語「生物樣本」指稱來自任何動物的體樣本，但優選地是來自哺乳類，更優選地是來自人類。最優選地，這樣的生物樣本是來自HBV帶原者或肝癌患者。這樣的樣本包括其中可偵測到HBS的生物液體，像是血清、血漿、玻璃樣液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、全血、尿液、腦脊液、唾液、痰、淚液、汗液、黏液、和組織培養基，還有組織萃取物像是均質化組織、以及細胞萃取物。這裡優選的生物樣本是血清、血漿或全血。

用語「第一抗體」指稱在樣本內，能夠結合且捕捉目標分子HBS的抗體，使得在合適情況下，第一抗體-HBS複合物可與其餘的樣本分開。典型的，第一抗體是被固定的或可固定的。在夾心式免疫分析法(sandwich immunoassay)中，第一抗體是針對HBS的優選抗體、抗原結合片段、功能性變異或其混合物。

用語「第二抗體」和「第三抗體」指稱能夠不論以直接透過標記訊號產生單元，或是間接地透過，例如，標記有訊號產生單元的另一個抗體，而被偵測到的抗體。優選的第二抗體和第三抗體分別是LHBS特異性抗體和WT LHBS特異性抗體。

用語「訊號產生單元」指稱於本文之免疫分析內被使用以偵測第二抗體和第三抗體的存在的部分或技術，且包括放大固定的標籤像是捕捉至微量培養盤(Microtiter plate)上的標籤之偵測藥劑。優選地，訊號產生單元是放射性標記、螢光標記、磷光標記、化學發光標記、或標籤酵素。更優選地，訊號產生單元是包括山葵過氧化酶(horse radish peroxidase)或鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)的標籤酵素。

用語「抗體」以最廣泛的意義使用且包括單株抗體(包括促效劑、拮抗劑、和中性抗體)、多株抗體、多價抗體、多特異性抗體、以及抗體片段，只要其展現渴望的結合特異性。

材料和方法

特異性地辨識LHBS和WT LHBS的單株抗體的發展

為了產生特異性地辨識LHBS的單株抗體，簡要地，發明人從E. coli 純化重組pre-S區域蛋白(SEQ ID NO: 1)並將其腹腔注射至BALB/C小鼠以產生單株抗體。活化的脾細胞與黑色素瘤細胞(melanoma cell)融合以產生融合瘤。在所有中對pre-S₁ 區域蛋白顯示最高親和力的融合瘤殖株(clone)被腹腔注射進入小鼠來腹水生產以放大抗體。進一步挑選在所有中顯示對LHBS有高親和力的抗體殖株以進一步調查。優選地，LHBS抗體可藉由103年9月1日寄存在300新竹市食品路331號的食品工業發展研究所，登錄號BCRC960490的融合瘤細胞株來產生。

為了產生特異性地辨識WT LHBS的單株抗體，在pre-S₂ 缺失突變LHBS內被刪除的蛋白區域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)已經被合成為胜肽並注射進入小鼠以產生WT LHBS特異性抗體。挑選對野生型LHBS顯示最高的親和力的血清的小鼠以進一步研究。優選地，WT LHBS抗體可藉由103年7月16日寄存在300新竹市食品路331號的食品工業發展研究所，登錄號BCRC960488的融合瘤細胞株來產生。詳細的實施例將被描述於下。

用於小鼠預防接種(immunization)的抗原製備

用於E. coli 細胞溶菌液的製備

重組蛋白、pre-S₁ 、從NCBI(生物技術資訊國家中心)查詢的蛋白質序列、以及B型肝炎病毒血清型、adw2，被用作為轉殖模板基準。LHBS的pre-S₁ 區域(a.a. 1-119，SEQ ID NO: 1)以Rosetta株由E. coli 蛋白質表現系統表現。在E. coli 細胞內的pre-S₁ 重組質體係從被設計以被轉殖進入在pre-S₁ 基因的5’端具有6x-His目標基因的質體，pET21c，的pre-S₁ 段之實驗室庫存改編。藉著轉殖此質體進入Rosetta細胞，接著挑選群體被並在LB培養基，37°C下孵育直到吸光值OD₆₀₀ 達到0.6-0.8約16小時；且於新批次的LB培養基(pH8) 再生該培養基且當吸光值OD₆₀₀ 讀數為0.8-1.0時在37°C孵育；100mM IPTG被加入至最終濃度0.2 mM以用於25°C下 6小時的誘導。誘導樣本接著以6000 rpm收成，10分鐘離心，移除上清液，且蒐集片粒狀沉澱物以用於音波處理以獲得細胞溶菌液。蒐集的細胞片粒狀沉澱物被重新懸浮於1x結合緩衝液(20mM磷酸鹽溶液，pH 7.4，0.5 M NaCl，以及20 mM 咪唑)，且藉由於130瓦特，20 kHz音波處理，每次75%放大釋出30秒，3至4次。隨後於4℃以10000 rpm離心30分鐘以丟棄細胞碎屑，可獲得用於Ni²⁺ -NTA層析純化之細胞溶菌液的上清液。

藉由Ni²⁺ -螯合層析的蛋白質純化

以包涵體Ni²⁺ (packing Ni²⁺ )樹脂處理Pre-S₁ 重組蛋白純化，首先藉由加入100 mM Ni²⁺ (100 mM NiSO₄ )的2樹脂體積與合適體積的螯合樹脂。接著以5樹脂體積的MiniQ水洗滌管柱，且以5樹脂體積的結合緩衝劑條件處理。接著E. coli 細胞溶菌液被加入至Ni²⁺ 管柱並接著以各以10樹脂體積的洗滌緩衝液1(60 mM 咪唑，20 mM 磷酸鈉，0.5 M 氯化鈉，pH 7.4)、洗滌緩衝液2 (80 mM咪唑，20 mM磷酸鈉，0.5 M氯化鈉，pH 7.4)洗滌。最後，以3樹脂體積的洗脫緩衝液(500 mM咪唑，20 mM磷酸鈉， 0.5 M 氯化鈉，pH 7.4) 洗脫目標蛋白，並且接著藉由SDS-PAGE電泳和免疫印漬法(immunoblotting)於從每個步驟收集的樣本上，檢查蛋白純化質量和效率。 Pre-S₁ 重組蛋白進一步被DEDE-離子交換管柱純化以達到小鼠預防接種的基準。

Pre-S₁ 區域單株抗體(LHBS特異性抗體)生產

從E. coli 系統中獲得的0.5 mg/ml Pre-S₁ 區域重組蛋白，總共大約3mg被寄出用於商業抗體生產。以臺灣的Protech公司處理小鼠的預防接種和融合瘤生產。小鼠抗血清能夠在滴定抗原特異性抗體以挑選用於犧牲與融合瘤融合實驗的理想小鼠的2.5個月之後獲得。之後，亦可獲得來自融合瘤的培養基以滴定抗原特異性抗體數次以挑選用於抗原特異性單株抗體生產的完美殖株。接著獲得融合瘤細胞且同型以確保這些細胞是單株或尚未單株並限制需要得到具有單株抗體的細胞的稀釋。

免疫化的小鼠血清滴定

酵素免疫吸附法(ELISA)

滴定抗原的抗體被以1x 磷酸鹽緩衝液(PBS) 稀釋至20 ng/μl並以每個孔50 μl (1 μg)的量施加至96孔盤(96-well plate)，且抗原於4°C下塗佈整晚(12-16 小時)。在隨後的日子，每個孔以每次200 μl 的PBST(1x PBS, 0.1% Tween-20)洗滌2次，且以100 μl 1% 牛血清白蛋白 (BSA)於室溫(約 25 °C)阻斷2小時。接著各孔以每次200 μl 的PBST洗滌2次，接著添加10倍的測試血清/抗體連續稀釋，在37°C孵育2小時。經過抗血清/抗體與抗原2小時的孵育之後，96孔盤接著以200 μl的 PBST洗滌各孔 4次，且確保完全地丟棄來自孔的溶液，接著加入與山葵過氧化酶(HRP)共軛的二級抗體以偵測結合的初級抗體。根據初級抗體的物種使用二級抗體；通常是抗小鼠IgG，或抗兔子IgG二級抗體。二級抗體被1:5000稀釋於PBST內且每個孔50 μl，且在37°C內孵育30分鐘。孵育之後，每個96孔盤以PBST洗滌4次，並添加TMB、HRP的受質各50 μl，並等待可見的色彩反應且以另一個50 μl的 2N H₂ SO₄ 停止該反應，接著在450nm下偵測吸光值以計算並繪製抗體特異性的曲線。

產生融合瘤的抗原特異性抗體的挑選

從臺灣的Protech公司取得融合瘤培養基，在1.5至2個月之後，藉由ELISA檢查抗原特異性滴定並挑選陽性殖株。以抗原、用於預防接種的pre-S₁ 區域蛋白，WT LHBS(pre-S₁ +pre-S₂ 區域)重組蛋白、pre-S₂ 突變(pre-S₁ +pre-S₂ 缺失突變區域)重組蛋白、以及帶His-標籤的E. coli 重組人類巨噬細胞移動抑制因子(hMIF) 塗佈 96孔盤，用以排除his的標籤特異性。對每個孔塗佈的抗原是1 μg，且蛋白質被稀釋在PBS內為20 ng/μl，每個孔50 ul。接著添加這些融合瘤培養基作為初級抗體，每個孔100 ul，在37°C下孵育2小時。以下的步驟與上述用於小鼠抗血清滴定的ELISA標準流程相同。

用於LHBS和WT LHBS的單株抗體的驗證和放大

用於LHBS和WT LHBS的單株抗體進一步放大且對其特質定性。其敏感性和特異性在下列實驗中以ELISA評估。此外，為了使用這些抗體以發展高敏感性免疫分析套組，純化的LHBS和WT LHBS抗體亦直接地與山葵過氧化酶(HRP)共軛以用於比色法偵測。抗體共軛至HRP的簡單流程如下：將2mg的過氧化酶與100 uL 的新鮮製備的0.1 M過碘酸鈉混合並於室溫下在黑暗中攪拌該溶液20分鐘。於4°C透析對1mM醋酸鈉緩衝液(pH4.4)修飾的酵素一夜。在500 uL的 10 mM 碳酸鈉緩衝液(pH 9.5)溶解4 mg的 IgG，並接著藉著使用硼氫化鈉溶液調整透析酵素溶液的pH值至9.5。於PBS內在Sepharose CL-6B的管柱上藉由凝膠過濾攪拌該混合物。判定A₂₈₀ 和A₄₀₃ 。匯集在第一峰(A₂₈₀ 和A₄₀₃ 兩者重合)的部分。最後，加入BSA以提供最後濃度5 mg/mL，並於-20°C等分儲存共軛物(conjugate)。

製備溶解溶液並使用以從血清中的HBV病毒顆粒釋出HBV表面抗原。溶解溶液由2% HP-beta-CD (羥丙基-β-環糊精(hydroxypropyl-beta-cyclodextrin))、0.5% Triton X-114、0.5% Tween-20、2 mM DTT (二硫蘇糖醇(Dithiothreitol))、以及1%的2-巰乙醇，全部溶解在 20 mM HEPES中， pH 7而組成。夾心式ELISA以每個孔濃度 2 μg/ml且體積 50 μl地作為捕捉的抗體地塗布在96孔盤內的抗HBS多株抗體處理。在 4°C下一夜的抗體塗佈步驟之後，96孔盤接著以PBST(0.1% Tween-20於醋酸鹽緩衝鹽水) 每個孔200μl地洗滌2次且以1% BSA於室溫下(~25℃)阻斷2至3小時。利用1% BSA (牛血清血蛋白)，具有非特異性活性的抗體可被血清蛋白質阻斷。接著停止阻斷步驟並以PBST洗滌2至3次以移除多餘的血清蛋白。

血清樣本於醋酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋 100倍，且加進有著抗HBS抗體塗佈的96孔盤內，每個孔50μl。作用如同偵測抗體的LHBS特異性及WT LHBS特異性單株抗體以1:5000稀釋於先前提到的溶解溶液內並以50μl的稀釋血清加入每個孔。LHBS和WT LHBS偵測反應接著在37 °C下孵育2小時。96孔盤接著以200 μl 的PBST (0.1% Tween-20於PBS)洗滌每個孔5次且1:5000 PBS稀釋HRP共軛抗小鼠IgG接著以50μl加入每個反應孔內作為二級抗體，並在37°C下額外孵育1小時。最後，反應盤以200 μl 的PBST每個孔洗滌5次，以及為了可視顏色反應加入50 μl HRP受質，TMB，於37°C孵育5至10分鐘。且OD值在ELISA偵測器上以450nm偵測。

免疫分析套組的發展以偵測血清內WT和pre-S₂ 缺失突變LHBS

LHBS和WT LHBS特異性單株抗體的純化和共軛後，這些抗體被使用以發展免疫分析套組。收集50 個HBV帶原者的血清並使用作為正控制組。LHBS和WT LHBS於血清內的濃度藉由使用重組E. coli pre-S區域WT和pre-S₂ 缺失突變LHBS作為標準來判定。ELISA系統的示意性表示被顯示於第7圖。共軛至LHBS-和WT LHBS-特異性抗體的HRP量分別表示LHBS和WT LHBS的量。因而，在相同的血清標本內， LHBS 減去WT LHBS的值是在標本內pre-S₂ 缺失突變的量。

結果

在實施例裡，含有顯示於SEQ ID NO: 1的胺基酸的蛋白質表現在E. coli 作為重組蛋白，純化該蛋白至均質化接著注射入小鼠內用於抗體的產生。在使用SEQ ID NO: 1的pre-S₁ 區域蛋白的抗體提高(boosting)幾次之後，移除小鼠的脾臟。均質化的脾細胞與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤細胞，該融合瘤細胞分泌抗LHBS單株抗體。將表現高抗體效價的融合瘤細胞腹腔注射進小鼠體內以產生腹水，在其中有大量的抗體存在。從腹水中純化單株抗體，與山葵過氧化酶共軛。運用純化的抗體藉由ELISA分析法結合至E. coli 重組LHBS pre-S₁ 區域蛋白。已發展用於LHBS、WT LHBS和總HBS(包含LHBS、MHBS和主要HBS)的單株抗體。第4圖內的結果顯示LHBS抗體辨認WT和pre-S₂ 缺失突變LHBS兩者同等良好，以10 ng蛋白的敏感性(第4圖，A部分)，以及在高達5 X 10⁴ 稀釋下，抗體仍維持對LHBS的結合親和力(第4圖，B部分)。為了進一步的免疫測定使用，此抗體被大規模地放大、純化和與HRP共軛。

至於對於WT LHBS特異性抗體，其發展過程相似於LHBS特異性抗體，除了抗原是SEQ ID NO: 2的多胜肽，其於此不進一步描述。第5圖的結果顯示WT LHBS抗體特異性地辨識WT LHBS但不辨識pre-S₂ 缺失突變LHBS。該抗體對WT LHBS的結合敏感性大約為30 ng(第5圖，A部分)，以及在高達10⁴ 稀釋後該抗體維持對LHBS的結合親和力(第5圖，B部分)。此抗體已經被大規模地放大、純化和與HRP共軛，以為了ELISA的使用。

在實施例中產生的單株抗體被運用以建構夾心式的ELISA系統以偵測LHBS 和WT LHBS蛋白(第3圖)。使用此分析套組，WT LHBS特異性抗體對WT LHBS蛋白的結合特異性在WT/pre-S₂ 缺失突變 LHBS混合中被偵測。在第6圖的結果顯示pre-S₂ 缺失突變的存在沒有干擾WT LHBS特異性抗體對WT LHBS蛋白的結合，表示此ELISA系統能夠高特異性地偵測兩種LHBS類型。

在本研究中發展的夾心式ELISA系統被使用以偵測在HBV帶原者內血清裡的LHBS量。調查先前使用Abbott HbsAg偵測系統偵測的50個HBsAg⁽⁺⁾ 和5個 HBsAg^(-) 血清。結果發現所有的HBsAg⁽⁺⁾ 個案顯示比HBsAg^(-) 個案顯著較高的LHBS量(第7圖，A部分)。接受者操作特徵(ROC) 曲線的分析顯示設置0.02 ng LHBS/μl血清的截止值可以高敏感性和特異性區別陽性和陰性個案(第7圖，B部分)。至於pre-S₂ 缺失突變LHBS的偵測，在LHBS和WT LHBS中偵測到的訊號作為蛋白質各別的數量，被使用於計算pre-S₂ 缺失突變LHBS的數量，藉由LHBS特異性抗體而非WT LHBS特異性抗體可偵測到pre-S₂ 缺失突變LHBS (表1)。透過此計算，可獲得pre-S₂ 缺失突變LHBS的數量。表1，對於在HBV帶原者的人類血清裡，用於偵測野生型和pre-S₂ 突變LHBS的ELISA偵測的代表結果 *OD：光吸收的光密度，其藉由ELISA反應產物產生。

討論

慢性B型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝細胞瘤是世界上最常見的內臟腫瘤。病毒感染透過導致在帶原者中攜帶病毒的長期期間內累積遺傳變異的多重前致癌物產生過程誘發HCC。在HBV急性或免疫清除感染期，肝臟表現免疫反應誘發的壞死發炎症(necroinflammation)並導致肝細胞重新再生。在慢性肝炎期間，病毒效價通常降低，其衰減肝臟發炎反應，但其通常伴隨著病毒基因體插入⁽¹⁰⁾ 。以來自宿主基因體的病毒基因的持續表現，這些慢性病毒肝炎發展成肝硬化和發育不良，且終究發展成肝細胞癌。在此過程中，病毒蛋白被認為是重要的角色，其與多種宿主蛋白交互作用以調控肝細胞癌變的機制⁽¹¹⁾ 。一些HBV基因產物已經被鑑定為病毒癌蛋白(viral oncoprotein)。病毒反式活化蛋白HBx造成細胞週期基因p53和p21^Waf1 的解除調控，並活化c-myc 和c-jun 癌蛋白^(11,12) 。其也結合DNA修復DNA損害結合1(DDB1)蛋白並抑制其活性⁽¹³⁾ 。此外，在該蛋白的pre-S₂ 區域內部份地刪除大約18個胺基酸的pre-S₂ 突變LHBS，被首先在第二型毛玻璃肝細胞(GGH)裡鑑定，其為在慢性HBV感染內的末期階段內的肝組織學特點^(2,3) 。被發現的是^{(14, 15)} 在血清裡表現有pre-S₂ 缺失突變LHBS的HBV帶原者易患末期肝臟疾病，包括肝硬化和HCC。我們近來的研究⁽¹⁶⁾ 也顯示第二型GGH與經歷肝切除手術的HCC病患之腫瘤復發的增加與存活率的降低有關。此發現全面地描述pre-S₂ 缺失突變LHBS是對於在慢性HBV帶原者中的HCC及對於在有著HCC的病患之不良預後的高風險標記物。

在本研究，我們發展了夾心式ELISA系統以偵測在血清內pre-S₂ 缺失突變LHBS。我們先前發展Pre-S基因晶片，其基於在病患中的HBS基因的DNA雜合至在晶片上的DNA探針，來偵測pre-S₂ 缺失⁽⁹⁾ 。然而，由於野生型和pre-S突變LHBS通常共存在一個個別的HBV帶原者內，通常需要分離個別HBS殖株的程序以可視化pre-S突變的個體。在本發明中發展的ELISA系統已經允許我們使用單步驟偵測方法在血清裡直接地偵測高風險pre-S₂ 缺失，其具有大幅提升之效率。以此方便的工具，發明人將在HBV慢性帶原者內的較大族群內持續偵測pre-S₂ 突變LHBS，並評估pre-S₂ 突變LHBS與包括肝硬化和HCC之肝臟疾病的多種階段之臨床結果的相關性。近來的研究也已經發現在慢性HBV帶原者內抗病毒療程之後增加的pre-S₂ 缺失突變，教示表現pre-S₂ 突變大HBV表面(LHBS)蛋白的帶原者是對HCC是高風險的人⁽¹⁷⁾ 。因此，在血清內pre-S₂ 缺失突變的偵測對於預測HCC發展或是手術後復發是重要的，特別是在抗病毒治療之後的案例。在本發明中發展的ELISA系統能夠提供偵測在HBV Pre-S區域內的缺失的快速且精確的方法，因而評估HBV帶原者發展肝硬化/HCC的風險。

在一實施例內，HBeAg-陰性且有著病毒量高於10⁴ copies/ml的病患被認為是高風險族群。這些病患應當測試pre-S₂ 缺失突變。簡言之，藉由上述的ELISA法偵測在有著高於10⁴ copies/ml之病毒量的HBeAg –陰性病患內的LHBS蛋白和WT LHBS蛋白，且pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白的數量藉由從LHBS蛋白的數量減去WT LHBS蛋白的數量而計算，如表1所顯示。若病患是有著pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白的HBV帶原者，該病患將被考慮為發展肝細胞癌(HCC)或肝硬化的高風險族群，與那些不具有pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白的HBV帶原者相比。

在另一個實施例，抗病毒治療3個月之後具有表面抗原或HBV DNA持久性的病患，代表pre-S₂ 缺失突變的存在且為發展HCC的高風險族群。這些病患應當測試血清HBV pre-S₂ 缺失突變。同樣地，在抗病毒治療1至12個月之後，優選地1-5個月之後，更優選地3個月之後，藉由上述ELISA方法偵測具有表面抗原或HBV DNA持久性的病患體內的LHBS蛋白和WT LHBS蛋白，且pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白的數量藉由從LHBS蛋白的數量減去WT LHBS蛋白的數量來計算，如表1所顯示。若病患在抗病毒治療之後帶有pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白，病患將被認為是發展肝細胞癌(HCC)或肝硬化的高風險族群，相比於那些不攜帶pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白的病患。

在又另一個實施例，接受HBV相關HCC的肝切除手術之病患將被在手術之後3個月篩查血清內的pre-S₂ 缺失突變。將同時進行評價毛玻璃肝細胞以評估HCC復發或發展新發HCC的風險。在血清裡之pre-S₂ 缺失突變和在肝臟組織內GGHs的存在被認為具有HCC復發的增加的風險。同樣地，藉由上述的ELISA方法偵測在接受HBV相關HCC的肝切除手術的病患內的LHBS蛋白和WT LHBS蛋白，且pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白的數量藉由從LHBS蛋白的數量減去WT LHBS蛋白的數量來計算，如表1所顯示。若手術之後的病患攜帶pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白，病患將被認為是癌症復發的高風險族群，相比於無攜帶pre-S₂ 缺失突變LHBS蛋白的病患。

雖然本發明特定的實施例的意義已經參照附圖描述，本領域之普通技術人員可對其進行多種修飾和變異，而不悖離發明專利申請範圍內描述的本發明的範疇和精神。修飾和變異應該在本發明說明書所限制的範圍內。

無

本專利或申請文件包含以彩色執行的至少一個附圖。具有彩圖之本專利或專利申請公佈的副本將依照智財局的要求和支付必要的費用來提供。

本發明的特質和效應將於下文中參照附圖更詳細地描述，附圖顯示本發明的多種實施例如下。

第1圖是GGH和B型肝炎病毒表面抗原的表現型式之示意圖。第一型GGH通常單獨散布(a，蘇木素及伊紅 [hematoxylin-eosin, HE]染色 ×200)並表現表面抗原的包涵體狀(b，對表面抗原的免疫組織化學[IHC]染色)。第二型GGH始終叢聚在小瘤內且表面表面抗原的邊緣型式(d)。

第2圖是野生型、pre-S₁ 及 pre-S₂ 突變 LHBS基因的示意圖。斜線的框是分別在pre-S₁ 和pre-S₂ 突變LHBS內的缺失區域。標記在基因底部的數字為指示在HBV基因體的核甘酸序列裡基因的pre-S₁ 、pre-S₂ 、以及S區域的區域。圖的頂部的箭頭指示HBV基因體的起始處(nt. 1)。

第3圖是根據本發明的實施例使用免疫分析套組偵測LHBS和WT LHBS的示意圖。

第4圖根據本發明的實施例演示以ELISA偵測之LHBS抗體的敏感性和特異性。(A)結合LHBS抗體至多種濃度的WT和pre-S₂ 缺失突變LHBS；以及(B)結合LHBS抗體的多種滴定至到在50ng的量內的WT和pre-S₂ 缺失突變LHBS。

第5圖根據本發明的實施例演示以ELISA偵測的WT LHBS特異性抗體的敏感性和特異性。(A) 結合WT LHBS特異性抗體至多種濃度的WT 和pre-S₂ 缺失突變LHBS；以及(B) 結合WT LHBS特異性抗體的多種滴定至在50ng的量內的WT 和pre-S₂ 缺失突變LHBS。

第6圖是根據本發明之實施例使用WT LHBS特異性抗體以偵測LHBS和WT LHBS的示意圖。●：只有WT。▲：WT/pre-S₂ 缺失突變LHBS以多種相對比值混合。LHBS數量是50ng。

第7圖是在HBsAg(+) 和HBsAg(-)病患血清裡LHBS的偵測的示意圖。(A)LHBS量(ng/μl)。(B)根據本發明實施例之免疫分析套組的ROC曲線。

國家：中華民國地點：財團法人食品工業發展研究所登錄號：

＜110＞國家衛生研究院＜120＞抗B型肝炎病毒表面蛋白抗體，包含其抗體之免疫分析套組，以及偵測pre-S₂ 缺失突變大B型肝炎表面蛋白之方法＜130＞ 61/846,764 ＜150＞ US 61/846,764 ＜151＞ 2013-07-16 ＜160＞ 3 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 119 ＜212＞ PRT ＜213＞ B型肝炎病毒(Hepatitis B virus) ＜400＞ 1 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn 1 5 10 15 Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu 20 25 30 Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe 35 40 45 Asn Pro Val Lys Asp Asp Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val 50 55 60 Gly Ala Phe Gly Pro Arg Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu 65 70 75 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr 80 85 90 Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro 95 100 105 Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 110 115 ＜210＞ 2 ＜211＞ 18 ＜212＞ PRT ＜213＞ B型肝炎病毒 (Hepatitis B virus) ＜400＞ 2 Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Pro ＜210＞ 3 ＜211＞ 226 ＜212＞ PRT ＜213＞ B型肝炎病毒(Hepatitis B virus) ＜400＞ 3 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln 20 25 30 Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr 35 40 45 Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His 50 55 60 Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 65 70 75 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys 80 85 90 Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 95 100 105 Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro 110 115 120 Cys Arg Thr Trp Thr Thr Pro Gly Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro 125 130 135 Ser Trp Cys Trp Thr Lys Pro Leu Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile 140 145 150 Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp 155 160 165 Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val 170 175 180 Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 185 190 195 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser 200 205 210 Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr 215 220 225 Ile

Claims

一種抗體用於在生物樣本裡偵測大B型肝炎病毒表面蛋白和野生型大B型肝炎病毒表面蛋白的免疫分析套組之用途，其中該免疫分析套組包括：一受質；一抗體；一阻斷溶液；以及一反應受質，用於與共軛至該第二抗體和該第三抗體的一訊號產生單元反應；其中該抗體包含一第一抗體、一第二抗體以及一第三抗體，且該第一抗體固定在該受質上，係特異性地結合至一B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：3的胺基酸序列；該第二抗體係特異性地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：1的胺基酸序列，以及一第三抗體，係特異地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該第一抗體是藉由103年10月22日寄存在食品工業發展研究所，登錄號BCRC960491或其後代的融合瘤細胞株產生的B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體；該第二抗體是藉由103年9月1日寄存在食品工業發展研究所，登錄號BCRC960490或其後代的融合瘤細胞株產生的大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體；以及該第三抗體是藉由103年7月16日寄存在食品工業發展研究所，登錄號BCRC960488或其後代的融合瘤細胞株產生的野生型大B 型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該阻斷溶液包括脫脂牛乳、牛血清蛋白、或酪蛋白。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中包括一洗滌溶液，其中該洗滌溶液包括PBS、TBS、包括一清潔劑的PBS、或包括一清潔劑的TBS。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中若該訊號產生單元是山葵過氧化酶，則該反應受質是四甲基聯苯胺(TMB)。
一種偵測在一生物樣本裡之pre-S₂缺失突變大B型肝炎病毒表面蛋白的方法，包括：孵育一生物樣本與固定在一受質上之一第一抗體，以結合一B型肝炎病毒表面蛋白至該第一抗體，其中該第一抗體特異性地結合至B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：3的胺基酸序列；分別藉由孵育結合的B型肝炎病毒表面蛋白與特異性地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：1的胺基酸序列的一第二抗體，和特異性地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：2的胺基酸序列的一第三抗體，偵測結合至固定的該第一抗體的大B型肝炎病毒表面蛋白和野生型B型肝炎病毒表面蛋白；以及藉由從大B型肝炎病毒表面蛋白的數量減去野生型大B型肝炎病毒表面蛋白的數量，計算pre-S₂缺失突變大B型肝炎病毒表面蛋白的數量。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該第一抗體是藉由103年10月22日寄存在食品工業發展研究所，登錄號BCRC960491或其後代的融合瘤細胞株產生的B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體；該第二抗體是藉由103年9月1日寄存在食品工業發展研究所，登錄號BCRC960490或其後代的融合瘤細胞株產生的大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體；以及該第三抗體是藉由103年7月16日寄存在食品工業發展研究所，登錄號BCRC960488或其後代的融合瘤細胞株產生的野生型大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該生物樣本是從人類分離。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中人類為B型肝炎病毒帶原者或肝癌患者。
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中B型肝炎病毒帶原者是HBeAg-陰性、具有高於生物樣本的10⁴copies/ml的HBV病毒量或其組合。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其進一步包括評估HBV帶原者發展肝細胞癌或肝硬化之風險的步驟。
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中B型肝炎病毒帶原者已經經歷使用核苷類似物或干擾素藥物的抗病毒療法。
如申請專利範圍第12項所述之方法，其進一步包括評估在抗病毒療法之後發展肝細胞癌或肝硬化之風險的步驟。
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中肝癌患者是經歷過肝切除手術的肝細胞癌患者。
如申請專利範圍第14項所述之方法，其進一步包括評估在手術之後1至12個月，肝細胞癌患者的癌症復發之風險的步驟。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該生物樣本是全血，血漿或血清。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其進一步包括從該生物樣本分離B型肝炎病毒表面蛋白的步驟。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該第一抗體係為一B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體，其特異性地結合至顯示為SEQ ID NO：3的胺基酸序列的一重組蛋白；該第二抗體係為一大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體，其特異性地結合至顯示為SEQ ID NO：1的胺基酸序列的一重組蛋白；以及該第三抗體係為一野生型大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體，其特異性地結合至顯示為SEQ ID NO：2的胺基酸序列的一胜肽。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中登錄號BCRC960490的融合瘤細胞株，係藉由以顯示為SEQ ID NO：1的胺基酸序列的該重組蛋白接種的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合；登錄號BCRC960488的融合瘤細胞株，係藉由以顯示為SEQ ID NO：2的胺基酸序列的該重組蛋白接種的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合；以及登錄號BCRC960491的融合瘤細胞株，係藉由以顯示為SEQ ID NO：3的胺基酸序列的該重組蛋白接種的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該第一抗體是一抗原結合片段或是B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體的一功能性變異，該功能性變異包括與B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體相同的互補決定區(CDRs)，且該抗原結合片段是Fab或F(ab’)₂片段。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該第二抗體是一抗原結合片段或是大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體的一功能性變異，該功能性變異包括與大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體相同的互補決定區(CDRs)，且該抗原結合片段是Fab或F(ab’)₂片段。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該第三抗體是一抗原結合片段或是野生型大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體的一功能性變異，該功能性變異包括與野生型大B型肝炎病毒表面蛋白特異性抗體相同的互補決定區(CDRs)，且該抗原結合片段是Fab或F(ab’)₂片段。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該第二抗體以及/或第三抗體進一步包括共軛至該抗體的一訊號產生單元，且該訊號產生單元包括一放射性標記、一螢光標記、一磷光標記、一化學發光標記、以及一標籤酵素。
如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該標籤酵素包括山葵過氧化酶或鹼性磷酸酶。
一種用於如申請專利範圍第6項所述方法之套組，其包括：一受質；一第一抗體，固定在該受質上，且該第一抗體特異性地結合至B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：3的胺基酸序列；一阻斷溶液；一第二抗體，特異性地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：1的胺基酸序列，以及一第三抗體，特異地結合至大B型肝炎病毒表面蛋白的SEQ ID NO：2的胺基酸序列；以及一反應受質，用於與共軛至該第二抗體和該第三抗體的一訊號產生單元反應。
如申請專利範圍第25項所述之套組，其中該第二抗體以及/或第三抗體進一步包括共軛至該抗體的一訊號產生單元，且該訊號產生單元包括一放射性標記、一螢光標記、一磷光標記、一化學發光標記、以及一標籤酵素。