TWI531583B - 用以對抗ｐｒｒｓｖ之融合胜肽及ｐｒｒｓｖ疫苗 - Google Patents

Description

用以對抗PRRSV之融合胜肽及PRRSV疫苗

本發明係關於一種融合胜肽，特別關於一種用以對抗PRRSV病毒之融合胜肽。本發明另關於包含該融合胜肽之PRRSV疫苗。

豬繁殖和呼吸障礙綜合症(porcine reproductive and respiratory syndrome，簡稱PRRS)俗稱為藍耳病，會導致妊娠母豬發生流產、死產等繁殖障礙，及使仔豬出現嚴重呼吸道疾病，為一種嚴重影響經濟效益之豬隻傳染疾病。

豬繁殖和呼吸障礙綜合症主要由豬繁殖和呼吸障礙綜合症病毒(PRRS virus，簡稱PRRSV)所引起，其係為具封套之正向單股RNA病毒(enveloped,positive sense,single stranded RNA virus)，基因體大小約15kb，包含9個重疊開放讀碼區(overlapping open reading frames，簡稱ORFs)，其中，用以調控封套及膜蛋白之ORF5(其蛋白質產物被稱為GP5)係為一醣基化之穿膜蛋白。

為對抗PRRSV病毒之感染，遂發展出一習用PRRSV疫苗，其係以PRRSV病毒之ORF5所表現出的蛋白質產物GP5作為抗原，藉此，當以該習用PRRSV疫苗免疫豬隻後，豬隻體內即可以產生對於PRRSV病毒具有專一性之抗體。

惟，該習用PRRSV疫苗之免疫反應產生效率不佳，需要針對豬隻進行多次的免疫，因此，該習用PRRSV疫苗仍然具有改善之空間。

本發明係提供一種融合胜肽，係用以提升生物體對PRRSV病毒之抵抗力者。

本發明更提供一種PRRSV疫苗，可以快速、有效提升生物體對PRRSV病毒之抵抗力者。

本發明之用以對抗PRRSV之融合胜肽，係包含：一第一胜肽片段，具有如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列；及一第二胜肽片段，具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列。

本發明之用以對抗PRRSV之融合胜肽，其中，該融合胜肽為由如SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列所組成。

本發明之用以對抗PRRSV之融合胜肽，其中，該融合胜肽由大腸桿菌所表現。

本發明之用以對抗PRRSV之融合胜肽，其中，大腸桿菌係藉由表現一質體以獲得該融合胜肽，該質體係包含如SEQ ID NO：1及2所示之核苷酸序列。

本發明之用以對抗PRRSV之融合胜肽，其中，該質體係包含如SEQ ID NO：3所示之核苷酸序列。

本發明之PRRSV疫苗，係包含：前述之融合胜肽；及一醫藥學上可接受之佐劑。

本發明之用以對抗PRRSV之融合胜肽，係藉由衍生自羧肽酶E蛋白的第二胜肽片段，提升生物體對於衍生自GP5蛋白之第一胜肽片段的辨識能力，僅需進行一次免疫注射，即可以使生物體於短時間內(兩週)產生足以對抗PRRSV病毒之抗體，達到提升生物體對PRRSV病毒抵抗力之功效。

本發明之PRRSV疫苗，係包含可以快速、有效提升生物體 對PRRSV病毒之抵抗力的融合胜肽，因而能夠僅藉由單次免疫注射，即可以提升生物體對於PRRSV病毒之抵抗力，可以減少業者施予免疫注射之繁雜度，以達到提升PRRSV疫苗使用之便利度的功效。

第1圖：係感染PRRSV病毒之免疫保護力試驗長條圖(p<0.05)。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之用以對抗PRRSV之融合胜肽係包含：一第一胜肽片段及一第二胜肽片段，該第一胜肽片段係衍生自豬繁殖和呼吸障礙綜合症病毒之GP5蛋白的部分片段，該第二胜肽片段則衍生自產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)之羧肽酶E蛋白(carboxypeptidase E)的部分片段。

該融合胜肽係可以由大腸桿菌所表現，例如能夠構築可以表現該融合胜肽之一質體，藉由將該質體轉型(transform)至一大腸桿菌菌株，使該大腸桿菌菌株表現該融合胜肽，另可以經由純化獲得經純化之融合胜肽。

詳言之，該質體係包含對應該第一胜肽片段之一第一核苷酸片段及對應該第二胜肽片段之一第二核苷酸片段，且為了提升大腸桿菌之表現效率，該第一核苷酸片段及該第二核苷酸片段較佳係可以採用大腸桿菌之密碼使用(codon usage)；於本實施例中，該第一核苷酸片段係具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列，該第二核苷酸片段則具有如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列，且藉由大腸桿菌之表現產生之第一胜肽片段及第二胜肽片段分別具有如SEQ ID NO：4及5所示之胺基酸序列。

又，該第一核苷酸片段及該第二核苷酸片段之間更可以利用一連接片段(linker fragment)所連接，該連接片段之序列設計為本發明所屬技術領域之通常知識，於此不再贅述。於本實施例中，該質體係包含如SEQ ID NO：3所示之核苷酸序列，且以大腸桿菌所表現出之融合胜肽則為由如SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列所組成。

該質體之構築為本發明所屬技術領域之通常知識，於此僅揭露本實施例之構築流程，並不以此為限。本實施例中，係人工合成由如SEQ ID NO：3所示之核苷酸序列之核苷酸片段，將該核苷酸片段以EcoR I及Sal I限制酶(restriction enzyme)辨識切割後，續以接合酶(ligase)接合於pET32a載體，以完成該質體之構築。

本實施例中，該質體係轉型進入大腸桿菌菌株BL21後，係可以藉由IPTG之誘導，使該大腸桿菌菌株BL21表現出帶有6x His標記之融合蛋白，將大腸桿菌菌液進行破菌後，通過0.22μm之過濾膜，於4℃下與鎳離子反應12小時，使帶有6x His標記之融合蛋白結合於鎳離子管柱(Ni column，HiTrap Chelating HP Column，購自Amersham Biosciences)上，續以結合緩衝液(binding buffer，含有20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉)沖洗出無法專一結合於鎳離子管柱之雜蛋白，續以含有250mM咪唑(imidazole)之沖提緩衝液(elution buffer，另含有20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉)沖提取得純化之融合胜肽。經純化之融合胜肽可以額外添加20μL之蛋白酶抑制劑(苯甲基磺醯氟，PMSF)後，保存於-20℃冰箱備用。

前述經純化之融合胜肽可以作為抗原，直接投予一生物體，使該生物體產生對抗PRRSV病毒之抗體，提升該生物體對PRRSV病毒之抵抗能力，例如能夠以每公斤之生物體體重投予3毫克之融合胜肽之投予劑量，投予該生物體。

此外，前述經純化之融合胜肽亦可以混合一醫藥學上可接受 之佐劑，以共同形成一PRRSV疫苗，藉由該醫藥學上可接受之佐劑提升該融合胜肽於該生物體體內之穩定度，或提升該融合胜肽之力價，使該融合胜肽具有較佳促進該生物體產生抗體之能力。該醫藥學上可接受之佐劑可以為油質佐劑或水包油包水佐劑，於本實施例中，該醫藥學上可接受之佐劑為佛氏完全佐劑(購自Sigma)。

為證實本發明用以對抗PRRSV之融合胜肽確實可以作為抗原，使生物體產生足以對抗PRRSV之抗體，遂以該第一胜肽片段(SEQ ID NO：4)作為控制組(第A1組)及該融合胜肽(SEQ ID NO：6)作為實驗組(第A2組)，分別以上述胜肽免疫BALB/c小鼠，並於免疫當天(第0天)及一、二、四週(第7、14、28天)後分別取得小鼠血清，以進行後續分析。

以IDEXX PRRSV抗體測試套組，分別針對不同天數之小鼠血清進行酵素連結免疫反應試驗(ELISA)，偵測反應後之405nm的吸光值，藉由其吸光值評估免疫後小鼠之血清中抗體的能力，結果如第1圖所示，相較於第A1組，本發明融合胜肽(第A2組)即可以有效提升免疫後7、14、28天之小鼠血清中之抗體。

綜合上述，本發明之用以對抗PRRSV之融合胜肽，係藉由衍生自羧肽酶E蛋白的第二胜肽片段，提升生物體對於衍生自GP5蛋白之第一胜肽片段的辨識能力，僅需進行一次免疫注射，即可以使生物體於短時間內(兩週)產生足以對抗PRRSV病毒之抗體，達到提升生物體對PRRSV病毒抵抗力之功效。

此外，本發明之PRRSV疫苗，係包含可以快速、有效提升生物體對PRRSV病毒之抵抗力的融合胜肽，因而能夠僅藉由單次免疫注射，即可以提升生物體對於PRRSV病毒之抵抗力，可以減少業者施予免疫注射之繁雜度，以達到提升PRRSV疫苗使用之便利度的功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 莊國賓

<120> 用以對抗PRRSV之融合胜肽及PRRSV疫苗

<130> PK13796

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一核苷酸片段之核苷酸序列，其所表現之胜肽係對應豬繁殖和呼吸障礙綜合症病毒GP5蛋白之第30~63個胺基酸殘基

<400> 1

<210> 2

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二核苷酸片段之核苷酸序列，其所表現之胜肽係對應產氣莢膜梭菌羧肽酶E蛋白之第194~319個胺基酸殘基

<400> 2

<210> 3

<211> 474

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用以表現本發明融合胜肽之核苷酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一胜肽片段之胺基酸序列，對應豬繁殖和呼吸障礙綜合症病毒GP5蛋白之第30~63個胺基酸殘基

<400> 4

<210> 5

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二胜肽片段之胺基酸序列，對應產氣莢膜梭菌羧肽酶E蛋白之第194~319個胺基酸殘基

<400> 5

<210> 6

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 本發明融合胜肽之胺基酸序列

<400> 6

Claims (6)

1. 一種用以對抗PRRSV之融合胜肽，係包含：一第一胜肽片段，具有如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列；及一第二胜肽片段，具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用以對抗PRRSV之融合胜肽，其中，該融合胜肽為由如SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列所組成。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之用以對抗PRRSV之融合胜肽，其中，該融合胜肽由大腸桿菌所表現。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用以對抗PRRSV之融合胜肽，其中，大腸桿菌係藉由表現一質體以獲得該融合胜肽，該質體係包含如SEQ ID NO：1及2所示之核苷酸序列。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用以對抗PRRSV之融合胜肽，其中，該質體係包含如SEQ ID NO：3所示之核苷酸序列。
6. 一種PRRSV疫苗，係包含：如申請專利範圍第1~5項中任一項所述之融合胜肽；及一醫藥學上可接受之佐劑。