CN107365366B - 一种蛋白及其编码基因以及疫苗和它们在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白及其编码基因以及疫苗和它们在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用。具体地，本发明公开了一种蛋白，其中，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了编码上述蛋白的基因，和含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌，以及含有上述蛋白作为活性成分的疫苗，还公开了它们在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用。将本发明提供的蛋白制备成疫苗注射入小鼠体内，能够产生高效价抗体，该抗体对寨卡病毒具有很强的中和作用，免疫原性良好；同时，本发明提供的疫苗由于不含活病毒，所以其安全性较高，因此，将本发明提供的蛋白制成疫苗对预防寨卡病毒感染具有良好的应用前景。

Description

一种蛋白及其编码基因以及疫苗和它们在制备用于预防寨卡 病毒感染的疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种蛋白及其编码基因，以及含有该蛋白作为活性成分的疫苗和它们在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用。

背景技术

寨卡病毒(Zika Virus)感染病例自2015年在美洲大面积爆发传播以来，受到世界各国高度关注。该病由伊蚊传播，感染后患者一般出现发热、头痛、皮疹等临床症状，但孕妇感染出现的小头畸形患儿以及成人感染出现的格里巴利神经综合征使其成为严重的世界公共卫生问题。该病毒在进化上形成非洲、亚洲两个主要的分支，2007年在密克罗尼西亚联邦Yap岛发生寨卡病毒感染暴发疫情，其总人口7391人中就有185人出现感染症状，其中108例为确诊或疑似寨卡病毒感染病例。2013-2014年在法属波利尼西亚群岛出现寨卡病毒感染更大规模的暴发，有8510例临床病例和约占总人口10％的29000例估计病例，并且患者出现神经系统症状。2015年5月巴西证实出现首例美洲本土的寨卡病毒感染病例，并且出现数千例脑部神经系统发育异常的小头畸形病例。随后哥伦比亚、墨西哥、委内瑞拉等拉美和加勒比海地区国家相继发现该病毒感染病例。随着全球疫情加剧扩散，而且受到媒介传播、交流运输等多种因素影响，寨卡病毒感染在中国也出现多例输入感染病例，潜在威胁我国公共卫生安全及母婴健康。

寨卡病毒属于黄病毒家族，其基因组为全长约11kb的单股正链RNA，主要编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白。其中寨卡病毒E蛋白核苷酸的全长为1512bp，含有504个氨基酸，分子量约为50kD。目前寨卡病毒尚无有效的疫苗或治疗药物，因此急需对其进行研发以应对日益严峻的疫情形势。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述缺陷，提供一种可以用于制备预防寨卡病毒感染的疫苗的蛋白及其编码基因，以及含有该蛋白作为活性成分的疫苗和它们的应用。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种蛋白，其中，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明提供了编码第一方面所述的蛋白的基因。

第三方面，本发明提供了含有第二方面所述的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

第四方面，本发明提供了一种疫苗，其中，所述疫苗含有第一方面所述的蛋白作为活性成分。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的蛋白、第二方面所述的基因和第三方面所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌中的任意一项在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用。

将本发明提供的蛋白制备成疫苗注射入小鼠体内，能够产生高效价抗体，该抗体对寨卡病毒具有很强的中和作用，免疫原性良好；同时，本发明提供的疫苗由于不含活病毒，所以其安全性较高，因此，将本发明提供的蛋白制成疫苗对预防寨卡病毒感染具有良好的应用前景。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的实施例1制备得到的蛋白的镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE图；

图2是本发明的实施例2中蛋白纯化的SDS-PAGE检测图；

图3是本发明的实施例2中蛋白的Western Blot检测图；

图4是本发明的实施例3中免疫小鼠血清的间接免疫荧光检测结果图。

附图标记

M：蛋白标志物 1：500mM咪唑洗脱组分

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种蛋白，其中，该蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明提供了编码第一方面所述的蛋白的基因。

在本发明中，本领域技术人员公知的是，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此，该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。

优选地，所述基因的序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明中，本发明对获得本发明提供的核苷酸序列的方法没有特别的限定，可以采用本领域常规使用的获得核苷酸序列的方法，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或化学合成的方法获得。

第三方面，本发明提供了含有第二方面所述的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

在本发明中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明的基因相连获得。优选地，所述表达盒还包括启动子和/或增强子。

在本发明中，所述重组载体可以含有本发明提供的基因。

在本发明中，所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可以为重组表达载体。优选地，所述重组载体为重组表达载体。进一步优选地，所述重组表达载体选自重组原核表达载体中的任意一种。在本发明的一种优选的实施方式中，所述重组载体为将本发明提供的基因与原核表达载体pET28a连接构建得到的重组载体。

在本发明中，所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞中获得。

在本发明中，所述重组菌可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株(如大肠杆菌感受态菌株Rosetta(DE3))中而获得。

在本发明中，本发明对获得所述转基因细胞系或重组菌的方法没有特别的限定，可以为本领域常规的选择，例如，可以通过氯化钙法化学转化或高压电击转化。

第四方面，本发明提供了一种疫苗，其中，所述疫苗含有本发明第一方面所述的蛋白作为活性成分(或唯一活性成分)。

在本发明中，以所述疫苗的总重量为基准，所述活性成分的含量为30-70重量％，优选为40-60重量％。

进一步优选地，所述疫苗还含有佐剂；更优选地，所述佐剂为铝佐剂、霍乱毒素和CpG-DNA中的至少一种；最优选为铝佐剂。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的蛋白、第二方面所述的基因和第三方面所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌中的任意一项在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的蛋白的制备。

(1)基因的获得

根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列通过化学合成法(委托上海生工生物工程有限公司进行)获得相应的基因。

(2)表达载体和重组菌株的构建

对由步骤(1)获得的基因以及原核表达载体pET28a(购于Novagen公司)均进行NdeI和Xho I双酶切，然后使用T4连接酶(购于Promega公司)将上述两个经酶切后的产物连接，以获得重组质粒。

将获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞(购于北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0811A)获得重组菌株。

(3)蛋白的诱导表达

a、小试培养选择最佳的诱导条件

挑取重组菌株Rosetta(DE3)的单菌落置于含LB培养基(30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)的试管中，37℃，220rpm摇床培养过夜。将培养的菌液按1：100比例接种于2.5mLLB培养基中，37℃下培养约3h。当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，购于Promega公司)，分别于20℃下诱导过夜；37℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。离心收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)重悬后超声破碎，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液(购于上海生工生物工程有限公司)溶解，取样品进行SDS-PAGE检测。

b、大量诱导

将活化过夜的菌液按1：100的比例接种于4L的LB液体培养基中，添加30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素，37℃，220rpm培养约3h，当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mMIPTG，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体。

(4)蛋白的纯化

将收集的细菌菌体冰浴中超声破碎菌体，超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行下一步纯化。

将样品加入5mL Ni-NTA层析柱，经500mM咪唑洗脱后收集洗脱液，将收集到的组分进行SDS-PAGE检测后(结果如图1所示)，将纯度最好的组分透析到PBS(pH8)中，得到蛋白溶液。

使用蛋白浓度测定试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司，货号为SK3071)测定蛋白溶液中的蛋白浓度(550μg/mL)。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的蛋白的表达量和反应原性的检测。

(1)蛋白表达量的检测

使用常规的SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测蛋白的表达量。结果如图2所示。从图2可以看出，重组菌株能够很好地表达目的蛋白，成功得到了纯化蛋白。

(2)蛋白反应原性的检测

使用Western Blot法检测蛋白的反应原性：一抗为兔抗His标签(1：500体积比稀释，购于上海生工生物工程有限公司)，37℃缓慢振荡60min。二抗为羊抗兔抗体(1：8000体积比稀释，购于上海生工生物工程有限公司)，37℃缓慢振荡60min。四甲基联苯胺(TMB)显色。结果如图3所示。从图3可以看出，在预期位置出现特异目的条带，表明本发明的蛋白具有良好的反应原性。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的疫苗的制备与免疫。

血清抗体效价和中和抗体水平检测：将由实施例1得到的蛋白溶液与Imject Alum铝佐剂(Thermo公司)按照1：1(体积比)等量混匀作为免疫原。选取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔接种注射上述蛋白与铝佐剂的等量混和液，每只小鼠免疫3次，每只每次50μg，首次免疫后2周进行加强免疫2次，隔周进行，末次免疫后2周采集血清，进行间接免疫荧光检测(结果如图4所示)并用ELISA方法测定其血清IgG抗体效价，用空斑减数中和试验测定血清中和抗体水平(即中和效价)。

从图4可以看出蛋白免疫后获得的小鼠血清能与病毒抗原发生特异反应，结果显示免疫血清IgG抗体效价可达1：10000，中和效价可达1：40。

实施例1-3的结果表明，将本发明提供的蛋白制成疫苗注射入小鼠体内能够产生高效价抗体，该抗体对寨卡病毒具有很强的中和作用，免疫原性良好；同时，本发明提供的疫苗由于未含有活病毒，所以其安全性较高，因此，将本发明提供的蛋白制成疫苗对预防寨卡病毒感染具有良好的应用前景。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.一种蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述的蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的序列如SEQ ID NO：2所示。

4.含有权利要求2或3所述的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求1所述的蛋白作为活性成分。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其中，所述疫苗还含有佐剂。

7.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的基因和权利要求4所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌中的任意一项在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的应用。

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