TWI526414B - Modified bone cement composition - Google Patents
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Description
本發明是有關於一種骨水泥組成物，特別是指一種改質型骨水泥組成物。
1960年來，骨科技術上面最大的突破，是將壓克力樹脂填充至人工關節與骨頭組織之間的空腔，並將人工關節有效地固定在骨頭組織裡面，而這種壓克力樹酯便是我們常稱的骨水泥。
聚(甲基)丙烯酸烷基酯[通常為聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)]骨水泥，已在市面上使用多年。傳統用於形成聚(甲基)丙烯酸烷基酯骨水泥之骨水泥組成物通常由一骨水泥材料所構成，該骨水泥材料包括一具有含聚(甲基)丙烯酸烷基酯之共聚物與起始劑的粉體，及一具有(甲基)丙烯酸烷基酯單體與加速劑的液體，並於室溫下調和該粉體與該液體後，再依後續需求塑形成骨水泥。然而，由傳統骨水泥材料所形成之聚(甲基)丙烯酸烷基酯骨水泥與骨頭之間的生物相容性較差、不能和骨頭表面形成良好結合、機械強度不足，及在固化時會形成過高的熱積聚溫度而造成周圍組織及脊髓損傷等缺點。因此，目前有許多研究都在努力尋找能添加在該骨水
泥組成物中的改質劑，以期望該骨水泥組成物經添加改質劑後所形成之聚(甲基)丙烯酸烷基酯改質型骨水泥能減少上述的缺點。
過去研究發現，於該骨水泥組成物中添加多壁奈米碳管(multi-walled carbon nanotube，MWCNT)/聚(甲基)丙烯酸烷基酯複合材改質劑能使其所形成之改質型骨水泥具有良好的機械性質，並增加機械強度(Materials Science and Engineering B,169,2010,134-137；Acta Biomaterialia,8,2012,1201-1212)，但是添加多壁奈米碳管(MWCNT)仍會產生許多不良影響，例如純化與酸化多壁奈米碳(MWCNT)時需用到強酸，且清洗時強酸仍會殘留在多壁奈米碳管(MWCNT)管壁內，容易造成細胞的死亡，使其生物相容性變差。
另有研究發現，於該骨水泥組成物中添加氫氧基磷灰石(hydroxyapatite,HA)改質劑，使其於形成之改質型骨水泥的過程中，可有效降低固化溫度(Turkish Journal of Medical Sciences,30,2000,543-549)，但是若加入過量的氫氧基磷灰石會造成骨水泥機械強度大幅下降的問題(Biomaterials,25,2004,5715-5723)。
由上述說明可知，目前用於添加至骨水泥組成物中的改質劑仍有待持續研發。
有鑒於傳統添加有多壁奈米碳管(MWCNT)/聚(甲基)丙烯酸烷基酯複合材或氫氧基磷灰石改質劑的骨水
泥組成物，其所形成之聚(甲基)丙烯酸烷基酯改質型骨水泥仍會有生物相容性較差、不能和骨頭表面形成良好結合、機械強度不足、固化溫度過高等問題。本發明人首先思及利用習知具有優異熱傳導及熱穩定性、低成本、可量產，且相較於多壁奈米碳管(MWCNT)具有更高機械強度及生物相容性的未處理之石墨烯(graphene，GP)或經處理石墨烯[如氧化石墨烯(graphene oxide，GO)、還原石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)等]來改良用於添加在傳統骨水泥組成物中的改質劑，使該添加有改質劑的改質型骨水泥組成物所形成之改質型骨水泥能具有更佳生物相容性、和骨表面能形成良好結合、高機械強度及低固化溫度等優點。
因此，本發明之目的，即在提供一種可讓所形成之改質型骨水泥具有較佳生物相容性、和骨頭表面能形成良好結合、高機械強度及低固化溫度的改質型骨水泥組成物。
於是本發明改質型骨水泥組成物，包含一骨水泥材料及一改質劑。
該骨水泥材料包括一粉體及一液體，該粉體具有一含聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚物，該液體具有(甲基)丙烯酸烷基酯單體。
該改質劑選自含有未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材、含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物、或前述的組合。
本發明之功效是利用該未處理或經處理石墨烯來改良用於添加在該骨水泥組成物中的改質劑，使添加有透過未處理或經處理石墨烯改良後之改質劑的骨水泥組成物，其後續所形成之改質型骨水泥具有較佳生物相容性、和骨頭表面能形成良好結合、高機械強度及低固化溫度等優點。
在本發明詳細說明之前，本發明摘要、說明書及申請專利範圍中之「(甲基)丙烯酸烷基酯」一詞係涵蓋甲基丙烯酸烷基酯及丙烯酸烷基酯；而「聚(甲基)丙烯酸烷基酯」一詞係涵蓋聚甲基丙烯酸烷基酯及聚丙烯酸烷基酯。
以下將就本發明內容進行詳細說明：
[骨水泥材料]
本發明改質型骨水泥組成物中的骨水泥材料包括一粉體及一液體，該粉體具有一含聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚物，該液體具有(甲基)丙烯酸烷基酯單體。
較佳地，該粉體還具有一能引發自由基聚合反應之起始劑。更佳地，該起始劑為過氧化二苯甲醯(benzoyl peroxide，BPO)。
在該粉體之該含聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚物中，較佳地，該聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元為聚甲基丙烯酸烷基酯單元。更佳地，該聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元為聚甲基丙烯酸甲酯單元(polymethylmethacrylate，PMMA)。
較佳地，該含聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚
物還含有苯乙烯(styrene)單元。更佳地，該共聚物是由聚甲基丙烯酸甲酯單元與苯乙烯單元所構成，也就是該共聚物為含有聚甲基丙烯酸甲酯單元與苯乙烯單元之共聚物{poly[(methylmethacrylate)-co-styrene]}。
較佳地，該液體還具有一能用於加快聚合速度的加速劑。更佳地，該加速劑為二甲基對甲苯胺(N,N-dimethyl-p-toluidine，DMPT)。
較佳地，該(甲基)丙烯酸烷基酯單體為甲基丙烯酸烷基酯單體。更佳地，該(甲基)丙烯酸烷基酯單體為甲基丙烯酸甲酯單體(methylmethacrylate，MMA)。
在本發明的具體實施例中，該粉體具有含聚甲基丙烯酸甲酯單元與苯乙烯單元的共聚物，及過氧化二苯甲醯起始劑；該液體具有甲基丙烯酸甲酯單體，及二甲基對甲苯胺加速劑。
[改質劑]
本發明改質型骨水泥組成物中的改質劑是選自含有未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材、含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)、或前述的組合。
以下分別針對(a)未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材，及(b)含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物進行詳細描述。
(a)未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材：
較佳地，該聚(甲基)丙烯酸烷基酯為聚甲基丙烯酸烷基酯。更佳地，該聚(甲基)丙烯酸烷基酯為聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。
較佳地，該經處理之石墨烯是選自氧化石墨烯(GO)、還原石墨烯(rGO)、或前述的組合。更佳地，該經處理之石墨烯是選自氧化石墨烯或還原石墨烯。
較佳地，該複合材為未經處理石墨烯(即石墨烯)與聚甲基丙烯酸甲酯複合材(GP/PMMA)、氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯複合材(GO/PMMA)或還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯複合材(rGO/PMMA)。
較佳地，該複合材的粒徑範圍為1~30μm。更佳地，粒徑範圍為12~23μm。
較佳地，該複合材是由(甲基)丙烯酸烷基酯與該未處理或經處理石墨烯進行混合並於起始劑存在下進行加熱聚合反應而製得。
較佳地，以該(甲基)丙烯酸烷基酯為100重量份計，該未處理或經處理之石墨烯的用量範圍為0.1~5重量份。
(b)含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)：
在該混合物中，較佳地，以該氫氧基磷灰石為1重量份計，該氧化石墨烯含量範圍為0.001~0.5重量份。更佳地，該氧化石墨烯含量範圍為不小於0.001重量份且小於0.02重量份。當該氧化石墨烯含量小於0.001重量份時，
會使該混合物中氧化石墨烯含量過少，導致該改質型骨水泥組成物所形成之改質型骨水泥的機械強度無法有效提升；而當該氧化石墨烯含量大於0.02重量份時，則會因氧化石墨烯團聚造成製備骨水泥時無法均勻分散混合，及因過多的氧化石墨烯影響到聚合反應，造成相分離產生，進而導致該改質型骨水泥組成物所形成之改質型骨水泥的機械強度下降。
較佳地，該混合物的粒徑範圍為1~30μm。更佳地，粒徑範圍為12~23μm。
該混合物是先將氧化石墨烯與氯化鈣(CaCl2)混合後，再加入磷酸二氫鈉(NaH2PO4．2H2O)，並透過共沉析法製備而得。
[改質型骨水泥組成物]
較佳地，當該改質劑為該含有未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材時，該粉體之該含聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚物與該改質劑的重量比例為19.9：0.1至15：5。更佳地，重量比例為15：3至14：3。
較佳地，當該改質劑為含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物時，該粉體之含聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚物與該改質劑的重量比例為19.9：0.1至15：5。更佳地，重量比例為16：2至15：2。
本發明之改質型骨水泥組成物的改質劑是添加於該骨水泥材料的該粉體中，且當需使用該改質型骨水泥
組成物來形成改質型骨水泥時，僅需先將該改質劑與該粉體混合後，再和該骨水泥材料的該液體混合，並進行捏合、定型步驟，即可形成改質型骨水泥。
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1是一X-光繞射(XRD)圖，說明石墨、製備例1之氧化石墨、製備例2之石墨烯、製備例3之氧化石墨烯與、製備例4之還原石墨烯之X-光繞射情形；圖2是一X-光繞射圖，說明製備例7之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材、製備例10之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材、製備例13之還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材之X-光繞射情形；圖3是一X-光繞射圖，說明製備例14~16之含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物之X-光繞射情形；圖4是一FT-IR光譜圖，說明石墨、製備例1之氧化石墨、製備例2之石墨烯、製備例3之氧化石墨烯、製備例4之還原石墨烯、製備例10之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材、製備例16之含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物的FT-IR光譜；圖5是一SEM相片，說明製備例7之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材的表面外觀；圖6是一長條圖，說明製備例7之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材之粒徑大小與數量分布；
圖7是一SEM相片，說明製備例10之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材之表面外觀；圖8是一長條圖，說明製備例10之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材之粒徑大小與數量分布；圖9是一SEM相片，說明製備例13之還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材之表面外觀；圖10是一長條圖，說明製備例13之還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材之粒徑大小與數量分布；圖11是一SEM相片，說明製備例14之含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物的表面外觀；圖12是一SEM相片，說明製備例15之含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物的表面外觀；圖13是一EDS圖，說明製備例14之含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物的元素分析；圖14是一EDS圖，說明製備例15之含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物的元素分析；圖15是一曲線圖，說明比較例1之非改質型骨水泥組成物、實施例1~3之改質型骨水泥組成物之時間與溫度變化關係；圖16是一曲線圖，說明比較例1之非改質型骨水泥組成物、實施例4~6之改質型骨水泥組成物之時間與溫度變化關係；圖17是一曲線圖，說明比較例1之非改質型骨水泥組成物、實施例7~9之改質型骨水泥組成物之時間與溫度變
化關係；圖18是一曲線圖，說明比較例1之非改質型骨水泥組成物、比較例2、實施例10~12之改質型骨水泥組成物之時間與溫度變化關係；圖19是一長條圖，說明MTS分析樣品(實施例3、6、9)與控制組樣品於490nm的吸收光強度；圖20是一長條圖，說明MTS分析樣品(比較例1、實施例10~12)與控制組樣品於490nm的吸收光強度；圖21是一螢光影像相片，說明染色細胞分析樣品放置0天後之螢光影像[(a)比較例1；(b)實施例10；(c)實施例11；(d)實施例12]；圖22是一螢光影像相片，說明染色細胞分析樣品放置1天後之螢光影像[(a)比較例1；(b)實施例10；(c)實施例11；(d)實施例12]；圖23是一螢光影像相片，說明染色細胞分析樣品放置3天後之螢光影像[(a)比較例1；(b)實施例10；(c)實施例11；(d)實施例12]；及圖24是一螢光影像相片，說明染色細胞分析樣品放置5天後之螢光影像[(a)比較例1；(b)實施例10；(c)實施例11；(d)實施例12]。
本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。
製備氧化石墨(graphite oxide，GeO)
將3g石墨(graphite)與3g NaNO3先放入1L的玻璃反應器中，再加入138mL濃度為90wt%的硫酸以超音波震盪5分鐘後，於0~4℃冰浴下攪拌10分鐘，並在攪拌同時緩慢加入9g的過錳酸鉀(KMnO4)混合攪拌24小時後(此時顏色轉變為綠色)，緩慢加入150mL去離子水進行中和，再加入350mL去離子水，最後加入30mL濃度為30~35wt%的H2O2攪拌30分鐘終止氧化(此時呈現金黃色)，得到一溶液。將溶液靜置24小時使其沉澱並取出沉澱物。以體積比為1：10(HCl：H2O)之酸洗液清洗該沉澱物，最後用去離子水將沉澱物洗至pH值為7，再利用冷凍乾燥機去除水分，即獲得氧化石墨(GeO)。
製備石墨烯(graphene，GP)
將製備例1所得的氧化石墨(GeO)，以5℃/分的升溫速率加溫至800℃進行高溫膨脹後，再降回室溫，即獲得石墨烯(GP)。
製備氧化石墨烯(graphene oxide，GO)
將製備例1所得的氧化石墨(GeO)加入純水中(氧化石墨：水=1mg：2mL)，以超音波震盪24小時，經離心過濾後，再以冷凍乾燥機乾燥，即獲得氧化石墨烯(GO)。
製備還原石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)
將製備例1所得的氧化石墨(GeO)加入純水中，以超音波震盪24小時，並用1M氫氧化鈉將pH值調至11後，加熱到80℃，之後緩慢加入1000mL、6g/1000mL氫硼酸鈉水溶液攪拌並進行還原反應4小時，用純水離心過濾後，再進行冷凍乾燥，即可獲得還原石墨烯(rGO)。
製備未處理或經處理之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA、GO/PMMA、rGO/PMMA)
依照下表1之比例，分別將石墨烯(GP)、氧化石墨烯(GO)、還原石墨烯(rGO)與甲基丙烯酸甲酯單體(MMA)以超音波震盪均勻混合，並分別加入2g的過氧化二苯甲醯(benzoyl peroxide，BPO)起始劑，分裝到10至15mL的試管中，再利用原位(in situ)聚合法於50℃下以超音波震盪6小時，使其進行的加熱聚合後，放入恆溫水槽進一步做加熱聚合，其加熱步驟為：(1)於65℃下聚合3小時，(2)於75℃下聚合4小時後，得一聚合樣品。將該聚合樣品放入烘箱進行乾燥，其乾燥步驟為：(1)於60℃下乾燥2小時，(2)於80℃下乾燥2小時，(3)於100℃下乾燥3小時，乾燥完成後將該經乾燥的聚合樣品取出磨成粉末，並透過140mesh的篩網做粒徑分離，即可獲得製備例5~7之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA)、製備
例8~10之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GO/PMMA)、製備例11~13之還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(rGO/PMMA)。
製備含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)
分別依照下表2之氧化石墨烯(GO)克數，取其克數與相對應之氧化石墨烯克數相同之氧化石墨(GeO)溶入40mL超純水中，以超音波震盪4小時，再進行離心(7000rpm)，製得40mL氧化石墨烯水溶液。將10.06mL 1M氯化鈣(CaCl2)水溶液分別滴加到該等氧化石墨烯水溶液中，以超音波震盪2小時，之後邊攪拌邊滴加6.04mL 1M磷酸二氫鈉(NaH2PO4．2H2O)水溶液，同時利用1M氫
氧化鈉(NaOH)水溶液維持pH值在10，攪拌反應24小時後，離心過濾並以去離子水清洗至中性，再利用高溫鍛燒爐進行90℃熱處理24小時後，得到一粉體。利用140mesh的篩網使此粉體過篩，即獲得含有氧化石墨烯(GO)與氫氧基磷灰石(HA)之混合物(製備例14~18)。
製備改質劑為「未處理或經處理之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材」之改質型骨水泥組成物
分別取3g製備例5~7所製得之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA)、製備例8~10所製得之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GO/PMMA)、製備例11~13所製得之還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(rGO/PMMA)，先與17g的商用粉末(Zimmer，成分如下表3所示)混合，再加入10mL的商用液體(Zimmer，成分如下表3所示)，即製得實施例1~9之改質型骨水泥組成物，其中，實施例1~9之製備比例如下表4所示。
製備改質劑為「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物」之改質型骨水泥組成物
分別取2g製備例14~18所製得的含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)，與18g的商用粉末(Zimmer，成分如上表3所示)混合，再加入10mL的商用液體(Zimmer，成分如上表3所示)，即製得實施例10~14之改質型骨水泥組成物，其中，實施例10~14之製備比例如下表5所示。
製備非改質型骨水泥組成物
取20g商用粉末(Zimmer，成分如表3所示)與10mL商用液體(Zimmer，成分如表3所示)混合，即製得比較例1之非改質型骨水泥組成物。
製備改質劑為氫氧基磷灰石(HA)之改質型骨水泥組成物
取2g氫氧基磷灰石(HA)，與18g的商用粉末(Zimmer，成分如上表3所示)混合，再加入10mL的商用液體(Zimmer，成分如上表3所示)，即製得比較例2之改
質型骨水泥組成物。
將實施例1~14與比較例2所製得之改質型骨水泥組成物，及比較例1所製得之非改質型骨水泥組成物分別經3分鐘的捏合，並放入固定模具經24小時定型後，即製得比較應用例2及應用例1~14之改質型骨水泥(由比較例2、實施例1~14所形成)與比較應用例1之非改質型骨水泥(由比較例1所形成)。
將石墨(graphite)、製備例1~4所製得的氧化石墨(GeO)、石墨烯(GP)、氧化石墨烯(GO)與還原石墨烯(rGO)、製備例7所製得之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA)、製備例10所製得之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GO/PMMA)、製備例13所製得之還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(rGO/PMMA)、製備例14~16所製得的含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)分別進行X-光繞射分析(靶材為銅靶，掃描速度為2°/min，角度範圍為2θ=10°~60°)，所得結果如圖1(石墨與製備例1~4)、圖2(製備例7、10、13)及圖3(製備例14~16)所示，而各成分之特徵峰的2θ角度變化整理如下表6所示。
由圖1及表6可知，石墨於2θ為26.78°時有很強的繞射峰，表示石墨具有很強的結晶性，而當石墨經強氧化劑氧化過後，碳平面上會帶有許多含氧官能基，如：羥基(hydroxyl)、羧基(carboxyl)、環氧基(epoxy group)，該等含氧官能基會在碳層間撐開碳與碳之間的距離，如氧化石墨(製備例1)之X-光繞射圖，於2θ為10.9°及43.53°有明顯的繞射峰，此為氧化石墨的晶面衍射峰，表明已成功將石墨製備成氧化石墨。
製備例2~4之石墨烯、氧化石墨烯與還原石墨烯的X-光繞射圖則是發現原先在10.9°處的衍射峰消失，而在約24~25°處出現一個微弱且較寬的衍射峰，表明氧化石墨層間距被撐開，產生典型石墨烯晶體結構，證實氧化
石墨已被成功製備成石墨烯、氧化石墨烯及還原石墨烯。
由圖2之未處理或經處理之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA、GO/PMMA、rGO/PMMA)的X-光繞射圖；而由圖3之含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)的X-光繞射圖及表6可以發現到氫氧基磷灰石的特徵峰(2θ為26°、32°、47°、49°)，證實該等複合材與該等混合物中確實分別含有聚甲基丙烯酸甲酯與氫氧基磷灰石，但由於該等複合材之石墨烯、氧化石墨烯及還原石墨烯與該等混合物之氧化石墨烯添加量皆很少，因此不容易由X-光繞射圖看到石墨烯的特徵峰。
將石墨、製備例1~4所製得的氧化石墨(GeO)、石墨烯(GP)、氧化石墨烯(GO)與還原石墨烯(rGO)、製備例10所製得之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GO/PMMA)，及製備例16所製得的含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)分別與溴化鉀(KBr)經充分乾燥後，以1：10(溴化鉀)之重量比例於瑪瑙研缽內研磨，再置於模具內壓成透光薄片，隨後置於FT-IR儀器中進行檢測(解析度4cm-1，頻率範圍：450~4000cm-1)，所得結果如圖4所示。
由圖4可以觀察到，氧化石墨(製備例1)與氧化石墨烯(製備例3)圖譜相似，在3430cm-1處皆有屬於OH基團的收縮震動，於3000~3700cm-1會出現較寬的波峰則是因吸附水分子所造成，而在1720cm-1處則是屬於羧酸基
團C=O的收縮震動，在1620cm-1的吸收峰震動則為C=C基團，在1221cm-1處則屬於羧酸基團C-O的收縮震動。
石墨烯(製備例2)與還原石墨烯(製備例4)的圖譜相似，由於氧化石墨製備成石墨烯的熱還原過程中需消耗大量氧，並與碳反應生成CO、CO2氣體逸散，所以由圖4可以明顯看出，石墨烯在3400cm-1及1623cm-1的O-H吸收峰相較於氧化石墨(製備例1)明顯減弱許多，1723cm-1的C=O與1223cm-1的C-O吸收峰也幾乎無法辨識，1735cm-1、1225cm-1及1053cm-1的氧官能基吸收峰也大幅減弱，而還原石墨烯是透過還原劑去除含氧官能基，所呈現的吸收峰會與石墨烯相似。因此，由上述實驗可知，氧化石墨已成功地製備成石墨烯及還原成石墨烯。
氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(製備例10)則是在3560cm-1處有OH基團的收縮震動，此外2911cm-1處有典型聚甲基丙烯酸甲酯的C-H收縮震動，而在1700~1744cm-1處為C=O的收縮震動，1439cm-1處為CH3基團的收縮震動，在1195cm-1的吸收峰則為OCH3的收縮震動，證實該複合材中確實含有聚甲基丙烯酸甲酯。
含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(製備例16)的圖譜中有四個主要官能基特徵峰，在563與605cm-1有明顯的PO4 3- ν4鍵結區帶分叉，亦即呈現磷灰石的晶體結構，而從900~1200cm-1的數個區帶則代表了P-O鍵結的伸展模式，PO4 3-的ν1鍵結位於962cm-1，ν3鍵結位於1038cm-1，一般而言，1119cm-1代表對稱的氫氧基磷灰石
結構。而在657cm-1和1636cm-1附近，由H2O分子震動所產生的特徵峰為對稱性H-O-H的鍵結官能基。在光譜波長3420~3200cm-1這個範圍則呈現一寬廣特徵峰帶，其為OH基團震動所產生的不對稱性的O-H鍵結官能基，在之間的寬化區帶表示表面吸附有水分子，而氫氧基磷灰石中O-H族群的伸展與震動則位於3586cm-1。因此，由上述結果可以證實，該混合物中確實含有氫氧基磷灰石。
將製備例7所製得之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA)、製備例10所製得之氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GO/PMMA)、製備例13所製得之還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(rGO/PMMA)、製備例14~15所製得的含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)分別利用場發射掃描電子顯微鏡觀察並拍照，所得相片如圖5(製備例7)、圖7(製備例10)、圖9(製備例13)、圖11(製備例14)與圖12(製備例15)所示，並將圖5、7、9之相片所觀察到的粒徑大小與數量分布分別繪成圖6(製備例7)、圖8(製備例10)、圖10(製備例13)之長條圖。
由圖5與圖6觀察到，石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA=0.43/100g/g)粒徑範圍為14~23μm，平均粒徑大小為19.78±2.89μm；由圖7與圖8觀察到，氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GO/PMMA=0.43/100g/g)粒徑範圍為12~18μm，平均粒徑
大小為14.51±1.17μm；由圖9與圖10觀察到，還原石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(rGO/PMMA=0.43/100g/g)粒徑範圍為14~20μm，平均粒徑大小為16.97±1.76μm。從上述結果可知，該等複合材粒徑範圍為12~23μm。
將製備例14~15所製得的含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)經前述場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)觀察取得之影像，再利用能量散佈光譜儀進行元素分析，所得結果分別如圖13(製備例14)與圖14(製備例15)所示，且其所得元素分析表如下表7(製備例14)與表8(製備例15)所示。
由圖13與14、表7與8可觀察到鈣與磷的存
在，證明該等混合物確實含有氫氧基磷灰石。
根據ASTM F451方法，將比較例2、實施例1~12所製得之改質型骨水泥組成物，及比較例1所製得之非改質型骨水泥組成物分別倒入圓柱型鐵氟龍容器中，經過1分鐘的揉捏後，由熱電偶溫度計量測該等骨水泥組成物於固化成骨水泥過程中之溫度變化[本實驗中每個樣品測3次(n=3)求取其平均值]，所得結果如圖15(比較例1與實施例1~3)、圖16(比較例1與實施例4~6)、圖17(比較例1與實施例7~9)及圖18(比較例1~2與實施例10~12)所示，再藉由下列公式(I)計算出固化溫度(Tset)，並將於該固化溫度時的固化時間及固化過程中的最高溫度整理如下表9(比較例1與實施例1~9)及表10(比較例1、2與實施例10~12)所示。
公式(I)：Tset=(Tamb+Tmax)/2
Tset=固化溫度(℃)
Tamb=室溫(23±1℃)
Tmax=最高溫度(℃)
由圖15~17與表9可以發現，添加「未處理或經處理之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA、GO/PMMA、rGO/PMMA)」改質劑的改質型骨水泥組成物(實施例1~9)與未添加改質劑的比較例1相較，除了實施例4外，其固化成骨水泥過程中的最高溫度皆有略微降低的趨勢(皆低於比較例1之67.5℃)，雖實施例4之最高溫度(67.9℃)略微提升，但與比較例1(67.5℃)相較差異不大。
由圖18與表10可以發現，添加「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)」改質劑的改質型骨水泥組成物(實施例10~12)，其固化成骨水泥過程中的最高溫度降至約50~55℃，與未添加改質劑的比較例1(67.5±1.1℃)及僅添加氫氧基磷灰石作為改質劑的比較例2(60.8±3.2℃)相較，最高溫度有大幅下降趨勢，證實本發明添加「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物」改質
劑之改質型骨水泥組成物，能有效降低固化成骨水泥時的溫度，因此能避免位於骨水泥周圍的細胞因固化時溫度過高而死亡。
此外，由表9與10可知，實施例1~9固化時間都是維持在250到430秒之間；實施例10~12固化時間都是維持在530到570秒之間，說明本發明之改質型骨水泥組成物固化成骨水泥的時間，皆在適於醫師操作之時間範圍內。
製備骨水泥壓縮樣品
依據ASTM F451方法，將比較例1所製得之非改質型骨水泥組成物，及比較例2、實施例1~14所製得之改質型骨水泥組成物，分別注入壓縮樣品模具(由不鏽鋼依據ASTM F451方法製造)，並經固化成骨水泥後，製得長度為12mm、直徑為6mm之骨水泥壓縮樣品。
測試骨水泥壓縮樣品抗壓強度
分別將由比較例1~2、實施例1~14所製得之骨水泥壓縮樣品浸泡於鹽水溶液(saline solution，由Otsuka Taiwan製造的0.9%氯化鈉水溶液)，並保持在恆溫37℃下48小時後，置於1噸萬能試驗機(MTS Insight Electromechanical)之載台上進行壓縮檢測[壓縮速率為25mm/min，每個樣品皆做4次(n=4)求取其平均值]，其抗壓強度結果如下表11(比較例1、實施例1~9)與表12(比較例1~2、實施例10~14)所示。
經由表11可以發現，添加「未處理或經處理之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA、GO/PMMA、rGO/PMMA)」改質劑的改質型骨水泥組成物(實施例1~9)與未添加改質劑的比較例1相較，其所形成之骨水泥壓縮樣品的抗壓強度顯著地提高(實施例1~9為88.22~95.29MPa，比較例1為84.86MPa)，證實本發明添加有「未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材」改質劑之改質型骨水泥組成物，其所形成之骨水泥的抗壓機械強度確實能有效地提高。
經由表12可以發現，添加有「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)」改質劑的改質型骨水泥組成物(實施例10~12)，其所形成之骨水泥壓縮樣品的抗壓強度會隨著混合物中氧化石墨烯的含量增加而有提升的現象，且高於未加改質劑之比較例1與僅添加氫氧基磷灰石(HA)改質劑的比較例2所形成之骨水泥壓縮樣品(實施例10~12為93.18~94.46MPa，比較例1為84.86MPa，比較例2為74.12MPa)，但當相對於1g氫氧基磷灰石，氧化石墨烯含量等於或大於0.02g(實施例13~14)時，抗壓強度開始有下降的趨勢，這是由於氧化石墨烯含量等於或大於0.02g時會在製備料過程中容易產生團聚現象，所以無法均勻分散並與氫氧基磷灰石複合，導致抗壓強度下降。因此，由上述結果可知，本發明添加有「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物」改質劑的改質型骨水泥組成物，當以該混合物的該氫氧基磷灰石為1重量份計，該氧化石墨烯含量範圍為不小於0.001重量份且小於0.02重量份時，該改質型骨水泥組成物所形成之骨水泥具有較佳抗壓機械強度。
製備骨水泥拉伸樣品
將比較例1所製得之非改質型骨水泥組成物，及比較例2、實施例1~3、5、8、10~12所製得之改質型骨水泥組成物，分別依據前述製備骨水泥壓縮樣品的方法，製得長度為75mm、寬度為6mm、厚度為5mm之骨水泥
拉伸樣品。
測試骨水泥拉伸樣品拉伸強度
利用萬能試驗機(Unicersal Tensile Machine，廠牌：CANTDN MA,USA，型號：INSTRON-4467，最大乘載：30kN)分別將由比較例1~2及實施例1~3、5、8、10~12所製得之骨水泥拉伸樣品，以5mm/min上升速度做拉伸檢測[每個樣品皆做3次(n=3)求取其平均值]，所得結果如下表13(比較例1、實施例1~3)與表14(比較例1~2及實施例10、12)所示。
由表13可以發現，添加「未處理或經處理之石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GP/PMMA)」改質劑的改質型骨水泥組成物(實施例1~3)與未添加改質劑之比較例1相較，其所形成之骨水泥拉伸樣品的拉伸強度顯著地提高(實施例1~3為50~57MPa，比較例1為38.36MPa)，證實本發明添加有「未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)
丙烯酸烷基酯的複合材」改質劑之改質型骨水泥組成物，其所形成之骨水泥的拉伸機械強度確實能有效地提高。
由表14可以發現，添加「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)」改質劑的改質型骨水泥組成物(實施例10、12)與未添加改質劑之比較例1及僅添加氫氧基磷灰石(HA)之比較例2相較，其所形成之骨水泥壓縮樣品拉伸強度顯著地提高(實施例10、12約50~52MPa，比較例1為38.36MPa，比較例2為29.96MPa)，證實本發明添加有「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物」改質劑之改質型骨水泥組成物，其所形成之骨水泥的拉伸機械強度確實能有效地提高。
下面以人骨肉瘤細胞株(Human osteosarcoma cell line)MG63(MG63細胞，由成大醫工所葉明龍教授實驗室提供)來進行細胞增生與毒性測試。
首先，將MG63細胞培養於含有最低必需培養基(minimum essential medium，MEM)[添加有2.2g/L之碳酸氫鈉、100mL/L的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及10mL/L三合一抗生素]的培養皿中，並於溫度為37℃，CO2含量為5%之二氧化碳培養箱(CO2 incubator)中進行培養。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，更換新鮮的培養基。
接著，分別將由比較例1所形成的非改質型骨
水泥、由實施例3、6、9、10~12所形成的改質型骨水泥製成骨水泥樣品片(約為長度：8mm、寬度8mm、厚度1mm)後，放入24井(well)培養盤的各井中，再將MG63細胞分別以4×104細胞/井的數量接種至其中，並於溫度為37℃，CO2含量為5%之二氧化碳培養箱(CO2 incubator)中進行培養。
當分別培養0、1、3、5天後，移除各井中的液體，並於每井中加入1000μL含有10%(v/v)5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4,5-二甲基噻唑基-3-(4-磺苯基)四唑內鹽[MTS，5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethylthiazoly)-3-(4-sulfophenyl)tetrazolium,inner salt]試劑，於溫度為37℃，CO2含量為5%之二氧化碳培養箱(CO2 incubator)內進行培養歷時2小時後，分裝至96井培養盤(100μL/井)，獲得比較例1與實施例3、6、9、10~12的MTS分析樣品，並同時根據前述方法，製備一未加入任何骨水泥的控制組樣品。利用酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader，SpectraMax Plus384 Molecular Devices)量測該等MTS分析樣品與該控制組樣品於490nm的吸收光強度，所得結果如圖19(控制組、實施例3、6及9)、圖20(控制組、比較例1、實施例10~12)所示。
觀察圖19與20之控制組樣品的細胞都沒有明顯地生長，證明所使用的培養基不會讓細胞生長。再觀查實施例3、6、9、10~12的MTS分析樣品，可發現細胞數目皆大幅成長，由此證明本發明之改質型骨水泥組成物所
形成之改質型骨水泥在後續應用貼附於骨水泥上時，能與生物細胞有良好的結合。
更詳細地，由圖19可知，實施例3、6、9之MTS分析樣品細胞數目皆大幅成長，證實本發明添加「未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材」改質劑之改質型骨水泥組成物，其所形成之改質型骨水泥皆對細胞無毒性反應，且有助於細胞生長，並當改質劑為「氧化石墨烯與聚甲基丙烯酸甲酯的複合材(GO/PMMA)」時，細胞成長量更大。
再由圖20可以發現，第0天時，各MTS分析樣品的細胞數量並沒有顯著差異，但到了第3天時，實施例10~12之MTS分析樣品細胞數量與比較例1相較已有顯著差異，而第5天時實施例10~12之MTS分析樣品細胞數量依舊與比較例1有顯著的差異，但不同的是，實施例10、實施例11與實施例12間也有顯著的差異，尤其實施例12之MTS分析樣品具有最大細胞成長數量，證實本發明添加「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)」改質劑之改質型骨水泥組成物，其所形成之改質型骨水泥皆對細胞無毒性反應，且有助於細胞生長，並當GO/HA之重量比為0.01/1時，細胞成長量更大。
分別將由比較例1所形成的非改質型骨水泥、由實施例10~12所形成的改質型骨水泥製成骨水泥樣品片(約為長度：8mm、寬度8mm、厚度1mm)後，放入24井(well)
培養盤的各井中，再將MG63細胞(與前述細胞增生與毒性測試實驗中的MG63細胞相同)分別以4×104細胞/井的數量接種至其中，並於溫度為37℃，CO2含量為5%之二氧化碳培養箱(CO2 incubator)中進行培養。
當分別培養0、1、3、5天後，移除各井中的液體，並於每井中加入用於一般細胞膜標定的PKH26紅色螢光細胞連接染劑(PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling，供應商為SIGMA)，於溫度為37℃，CO2含量為5%之二氧化碳培養箱(CO2 incubator)內進行培養歷時5分鐘後，分裝至96井培養盤，獲得比較例1與實施例10~12的螢光影像分析樣品。利用螢光顯微鏡分別觀察該等螢光影像分析樣品的螢光影像並拍照，其所得相片如圖21(第0天)、圖22(第1天)、圖23(第3天)與圖24(第5天)所示，其中，圖21~24中的(a)圖為比較例1；(b)圖為實施例10；(c)圖為實施例11；(d)圖為實施例12。
由圖21~24可以發現，第0天時，各染色細胞分析樣品的細胞數量並沒有顯著差異，但當隨著天數增加，細胞數量也隨之增加，證實本發明添加「含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物(GO/HA)」改質劑之改質型骨水泥組成物，其所形成之改質型骨水泥皆對細胞無毒性反應，且有助於細胞生長。
綜上所述，藉由該未處理或經處理石墨烯來改良用於添加在該骨水泥組成物中的改質劑，使添加有透過
未處理或經處理石墨烯改良後之改質劑的骨水泥組成物，其所形成之改質型骨水泥具有較佳生物相容性、和骨頭表面能形成良好結合、高機械強度及低固化溫度等優點，故確實能達成本發明之目的。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
Claims (4)
- 一種改質型骨水泥組成物，包含：一骨水泥材料，包括一粉體及一液體，該粉體具有一含聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚物，該液體具有(甲基)丙烯酸烷基酯單體；及一改質劑，為含有未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材或含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物，該粉體之該含聚(甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚物與該改質劑的重量比例為19.9：0.1至15：5，當該改質劑為含有氧化石墨烯與氫氧基磷灰石之混合物時，以該氫氧基磷灰石為1重量份計，該氧化石墨烯含量範圍為不小於0.001重量份且小於0.02重量份。
- 如請求項1所述的改質型骨水泥組成物，其中，該經處理之石墨烯是選自氧化石墨烯、還原石墨烯、或前述的組合。
- 如請求項1所述的改質型骨水泥組成物，其中，該改質劑為該含有未處理或經處理之石墨烯與聚(甲基)丙烯酸烷基酯的複合材，該複合材是由(甲基)丙烯酸烷基酯與該未處理或經處理之石墨烯進行混合並於起始劑存在下進行加熱聚合反應而製得，以該(甲基)丙烯酸烷基酯為100重量份計，該未處理或經處理之石墨烯的用量範圍為0.1~5重量份。
- 如請求項1所述的改質型骨水泥組成物，其中，該含聚 (甲基)丙烯酸烷基酯單元的共聚物更含有苯乙烯單元。
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