TWI522473B

TWI522473B - 新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸以及鑑定鮑氏志賀氏菌之引子對、檢驗套組及其鑑定方法

Info

Publication number: TWI522473B
Application number: TW103116411A
Authority: TW
Inventors: 廖朝財; 何明隆; 蔡德君; 王冠傑; 彭茹讌; 李明憲
Original assignee: 中臺科技大學
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2016-02-21
Also published as: TW201542823A

Description

新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸以及鑑定鮑氏志賀氏菌之引子對、檢驗套組及其鑑定方法

本發明係關於一種新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸、以及鑑定鮑氏志賀氏菌之引子對、檢驗套組及其方法。

志賀氏菌可引起人或其他哺乳類動物桿菌性痢疾(shigellosis)，而桿菌痢疾為高度傳染性疾病，只要10至100個病源體就會造成感染。志賀氏菌感染時，會侵入大腸表皮，造成結腸膿傷，導致出血，而產生發燒、腹痛、血便、水瀉、電解質不平衡等症狀，但患者很少發生菌血症。成人大都可於數天後自癒，老人和小孩可能因脫水或酸中毒而死亡。少數人痊癒後，成為慢性帶菌者，仍然有發病可能。志賀氏菌主要是經由病患的排泄物汙染了食物、水、或手，而進入他人口中，造成感染。此外志賀氏菌為食品工業三個主要來源的細菌病源菌之一。

桿菌性痢疾流行為世界性，常在擁擠及環境衛生不良社區暴發大流行，如：學校、托兒所、療養院及難民營。流行病學研究估計，每年全球引起一億六千五百萬的案例，其中三分之二之病患及大半死亡病例均為10歲以下的幼童。居住在同一社區之患者常分離出不同血清型的痢疾桿菌，有時同時感染數種不同的致病菌。台灣地區大部分的病例為住在山區的原住民，而感染的病例多為10歲以下的兒童，且有地區性流行的現象，在台灣東部地區，桿菌性痢疾一直是重要的公共衛生問題。

臨床實驗室鑑定志賀氏菌的方法，主要是依靠生化試驗和血清型的方法鑑定，首先靠其培養基上菌落表現型的特徵，快速篩選出懷疑的菌落，再加上生化六小管降低成本，再利用血清套組做最後的菌屬之菌種確認。但是志賀氏菌種間，生化反應都非常相近，很難單獨利用此方式來判讀。此外，志賀氏菌的症狀及結構和大腸桿菌非常類似，也同屬腸道病源科，因此常對臨床實驗室在判讀時造成困擾。而且傳統的生化鑑定，例如：各種醣類發酵試驗、引朵(indole)產生、Ornithine decarboxylase等生化試驗，大都比較耗事費時，通常需要3-7天才能完全正確判讀，影響到往後治療的時機。

因此，本發明提供一種新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸，以及鑑定鮑氏志賀氏菌之引子對、檢驗套組及其方法，可以快速且準確的鑑定鮑氏志賀氏菌。

本發明之一態樣是在提供一種新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸，用以鑑定鮑氏志賀氏菌，其序列如序列辨識編號1所示。

本發明之另一態樣是在提供一種鑑定鮑氏志賀氏菌之引子對，包含如一序列辨識編號2所示之寡核苷酸以及一如序列辨識編號3所示序列之寡核苷酸，藉以放大如序列辨識編號1所示之一核酸片段。

本發明之再一態樣是在提供一種鑑定鮑氏志賀氏菌之檢驗套組，包含如一序列辨識編號2所示之寡核苷酸以及一如序列辨識編號3所示序列之寡核苷酸，藉以放大如序列辨識編號1所示之一核酸片段。

根據本發明之一實施例，其中更包含限制酶Sma I。

根據本發明之另一實施例，其中更包含限制酶BamH I。

本發明之又一態樣是在提供一種鑑定鮑氏志賀氏菌之方法，包含：提供一未知樣品之去氧核醣核酸作為一模版；將模版以序列辨識編號2所示之寡核苷酸及序列辨識編號3所示之寡核苷酸進行一聚合酶連鎖反應，以獲得一聚合酶連鎖反應產物；以及利用洋菜凝膠體電泳偵測聚合酶連鎖反應產物是否有具有如序列辨識編號1所示之序列或部分序列。

根據本發明之一實施例，其中聚合酶連鎖反應之條件為94℃高溫變性(Denaturation)1分鐘、50℃至65 ℃引子黏合(Annealing)1分鐘及72℃延伸(Extension)1分鐘30秒，至少進行30個循環反應。

根據本發明之另一實施例，其中更包含：利用限制酶Sma I剪切聚合酶連鎖反應產物，以獲得若干Sma I剪切片段；以及利用洋菜凝膠電泳偵測Sma I剪切片段之分子量大小是否為207bp、262bp及528bp。

根據本發明之再一實施例，其中更包含：利用限制酶BamH I剪切聚合酶連鎖反應產物，以獲得若干BamH I剪切片段；以及利用洋菜凝膠電泳偵測BamH I剪切片段之分子量大小是否為433bp及564bp。

藉此，本發明提供一種新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸，其係為鮑氏志賀氏菌獨有之核酸片段，為一種理想的鑑定鮑氏志賀氏菌之目標核酸片段。而依據此新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸所設計之引子對、檢驗套組及其鑑定鮑氏志賀氏菌的方法，可以快速且準確的鑑定鮑氏志賀氏菌，用以解決傳統鑑定方法耗事費時、操作不易及結果判讀困難的問題。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖繪示以隨意引子進行四種志賀氏菌種之RAPD-PCR之洋菜凝膠電泳分析圖。

第2圖繪示本發明之引子對進行志賀氏菌參考菌株之特異性聚合酶連鎖反應之洋菜凝膠電泳分析圖。

第3圖繪示本發明之引子對進行臨床常見革蘭氏陽性及陰性細菌之特異性聚合酶連鎖反應之洋菜凝膠電泳分析圖。

第4圖繪示本發明之引子對進行志賀氏菌臨床分離菌株之特異性聚合酶連鎖反應之洋菜凝膠電泳分析圖。

第5圖繪示以限制酶剪切鮑氏志賀氏菌之聚合酶連鎖反應產物之洋菜凝膠電泳分析圖。

第6圖繪示本發明之引子對於不同黏合溫度進行志賀氏菌參考菌株之特異性聚合酶連鎖反應之洋菜凝膠電泳分析圖。

第7圖繪示本發明之引子對進行鮑氏志賀氏菌之特異性聚合酶連鎖反應之敏感性測試之洋菜凝膠電泳分析圖。

第8圖繪示本發明之引子對進行含鮑氏志賀氏菌之水檢體之特異性聚合酶連鎖反應之敏感性之洋菜凝膠電泳分析圖。

本說明書揭露內容提出一種新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸，以及根據此單離核酸設計鑑定鮑氏志賀氏菌之引子對、檢驗套組及鑑定鮑氏賀氏菌之方法。其係以隨意引子對四種志賀氏菌進行隨機增幅多型性聚合酶連鎖反應(Random Amplified Polymorphic DNA-polymerase chain reaction；RAPD-PCR)，於鮑氏志賀氏菌中發現一特有的核酸片段，根據此核酸片段設計引子對進行聚合酶連鎖反應，只有鮑氏志賀氏菌能增幅出聚合酶連鎖反應產物，因此可以利用檢測此特有的核酸片段，鑑定鮑氏志賀氏菌。

「志賀氏菌」係指shigella species，為革蘭氏陰性菌，不會產生胞子，為引起桿菌性痢疾的病源菌。志賀氏菌依據抗原結構及生化特性分4種菌種：鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)及宋內氏志賀氏菌(Shigella sonnei)。一般而言，開發中國家較常見的是鮑氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌和福氏志賀氏菌。而已開發國家較常見的是宋內氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌並不多見，因此對於開發中的國家大規模且快速的篩檢出鮑氏志賀氏菌非常重要。

「隨意引子」係指隨意設計核苷酸序列的引子，可以在不知道將欲增幅染色體的核苷酸序列下，快速隨意將染色體放大成不同長度的核酸片段，所放大的核酸片段具多型性，故此技術稱為隨機增幅多型性聚合酶連鎖反應(RAPD-PCR)。

下列實驗例用於示範說明本發明，係用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制，但用於如何實施本發明的材料及方法。

實驗例1：以RAPD-PCR增幅鮑氏志賀氏菌特有之核酸

為尋找鮑氏志賀氏菌獨有的核酸片段，以如序列辨識編號4所示序列之隨意引子與四種志賀氏菌參考菌株進行RAPD-PCR，4種志賀氏菌參考菌株分別為鮑氏志賀氏菌BCRC 15958、痢疾志賀氏菌BCRC 13983、福氏志賀氏菌BCRC 10772、宋內氏志賀氏菌BCRC 10773。請參照第1圖，為RAPD-PCR後以1.5%洋菜凝膠電泳分析圖，其中M為核酸之分子量標記。結果顯示四種志賀氏菌參考菌株可隨意增幅出各種不同大小的核酸片段。泳道1為痢疾志賀氏菌BCRC 13983，主要增幅出1個大小為0.75kb的核酸片段。泳道2為福氏志賀氏菌BCRC 10772，主要增幅出大小分別為0.75kb、0.9kb、2.5kb和2.7kb的4個核酸片段。泳道3為宋內氏志賀氏菌BCRC 10773，主要增幅出大小為0.75kb和1.3kb的2個核酸片段。泳道4為鮑氏志賀氏菌BCRC 15958，主要增幅出大小分別為0.75kb、1.1kb、1.3kb、2.3kb和2.4kb的5個核酸片段。鮑氏志賀氏菌可增幅出一個1.1kb特異性的核酸片段，而其它志賀氏菌菌種並沒有增幅出此片段。

實驗例2：新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸定序及引子設計

以GENECLEAN III Kit(QBioGene)回收鮑氏志賀氏菌BCRC 15958之1.1kb核酸片段，將回收的1.1kb核酸片段與pGEM®-T easy vector(Promega)進行接合作用，並以T7及SP6引子進行1.1kb核酸片段的核苷酸定序，分別從兩端各清楚的定序出大小約1053bp的核酸片段，利用兩段重疊的地方，定序出一段大小為1057bp之鮑氏志賀氏菌BCRC 15958核苷酸序列，其序列如序列辨識編號1所示。

將此1057bp核酸序列利用BLASTN與GenBank資料庫中的其他序列做比對，依照較具特異性的序列片段，設計一對菌種特異性引子(species-specific primers)，分別為如序列辨識編號2所示之正向引子SB-1057-5F3及如序列辨識編號3所示之負向引子SB-1057-3R3，預期以此對引子進行聚合酶連鎖反應可增幅出大小為997bp之聚合酶連鎖反應產物。

實驗例3：鮑氏志賀氏菌特異性引子聚合酶連鎖反應

首先利用商品化套組或以習知萃取方法萃取實驗組菌種之染色體作為模板，接著以引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3引子進行特異性聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：5μl 10X Taq緩衝液、1μl之10mM dNTP混合液、10μM之引子各1μl、1μl之Taq DNA polymerase(5U/μl)和100ng染色體模板，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為50μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行30個周期之熱循環，包括變性95℃反應1分鐘、黏合65℃反應1分鐘、延長72℃反應1分鐘，之後進行最終延長72℃反應2分鐘，終止溫度為4℃。將增幅出之聚合酶連鎖反應產物以洋菜凝膠電泳分離。聚合酶連鎖反應另增幅每一個實驗組之16S rDNA，以確保作為每一個實驗組之模版的染色體品質，增加實驗的客觀性。

請參照第2圖，為以引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3引子與14株志賀氏菌的參考菌株進行菌種特異性引子聚合酶連鎖反應之洋菜凝膠電泳分析圖，其中M為核酸之分子量標記，泳道1至15分別為鮑氏志賀氏菌BCRC 15958、鮑氏志賀氏菌BCRC 15960、痢疾志賀氏菌BCRC 13983、福氏志賀氏菌BCRC 10772、福氏志賀氏菌BCRC 15962、福氏志賀氏菌BCRC 15963、福氏志賀氏菌BCRC 15964、福氏志賀氏菌BCRC 13984、宋內氏志賀氏菌BCRC 10773、宋內氏志賀氏菌BCRC 10774、宋內氏志賀氏菌BCRC 15965、宋內氏志賀氏菌BCRC 15966、宋內氏志賀氏菌BCRC 15967、宋內氏志賀氏菌BCRC 15968和負控制組。結果顯示只有泳道1和2之鮑氏志賀氏菌菌株(BCRC 15958和15960)能增幅出大小為997bp的聚合酶連鎖反應產物，其他志賀氏菌菌種均無增幅出任何核酸片段。

另外，請參照第3圖，為以引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3引子與臨床上常見的17種革蘭氏陰性細菌及10種革蘭氏陽性細菌進行特異性聚合酶連鎖反應之洋菜凝膠電泳分析圖。其中M為核酸之分子量標記，N為負控制組。泳道1至28分別為鮑氏志賀氏菌BCRC 15958、Klebsiella pneumoniae ATCC 15627、Proteus mirabilis BCRC 10725、Acinetobacter baumannii(臨床菌株)、Citrobacter freundii ATCC 12291、Serratia marcescens ATCC 10768、Providencia stuartii ATCC 13998、Echerichia coli ATCC 11460、Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853、Yersinia enterolitica ATCC 10807、Enterobacter cloacae(臨床菌株)、Haemophilus influenzae(臨床菌株)、Morganella morganii(臨床菌株)、Salmonella typhimurium CN 258、Aermonas hydrophila(臨床菌株)、Vibrio cholerae(臨床菌株)、Neisseria gonorrhoeae(臨床菌株)、Neisseria meningitides(臨床菌株)、Listeria monocytogenes ATCC 14846、Enterococcus faecalis ATCC 29212、Erysipelothrixrhusiopathiae ATCC 15839、Lactobacillus lactis CCRC 10791、Streptococcus pyogenes CF 103、Strepococcus pneumonia(臨床菌株)、Corynebacterium spp.(臨床菌株)、Micrococcus spp.(臨床菌株)、Bacillus subtilis DB2(土壤分離菌株)及Staphylococcus aureus ATCC 25923。結果顯示，僅泳道1之鮑氏志賀氏菌BCRC 15958可增幅出大小為997bp的聚合酶連鎖反應產物，其他17種革蘭氏陰性細菌及10種革蘭氏陽性細菌皆無增幅出任何核酸片段。

請參照第4圖，為以引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3與18株志賀氏菌的臨床分離株進行特異性聚合酶連鎖反應之洋菜凝膠電泳分析圖，18株志賀氏菌臨床分離株為2株福氏志賀氏菌(SF-1和SF-2)及16株宋內氏志賀氏菌(SS1-SS16)，其中M為核酸之分子量標記，P為鮑氏志賀氏菌BCRC 15958，N為負控制組。泳道1至18分別為SF-1、SS-1、SS-2、SS-3、SS-4、SS-5、SS-6、SS-7、SS-8、SS-9、SS-10、SS-11、SS-12、SS-13、SS-14、SS-15、SS-16及SF-2。實驗結果顯示非鮑氏志賀氏菌的臨床分離株，均不會增福出任何核酸片段，和參考菌株的結果一致。

實驗例4：限制酶剪切

為了進一步確認以引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3進行特異性聚合酶連鎖反應所增幅出997bp的聚合酶連鎖反應產物序列的正確性，利用國家衛生研究院TBI生物資訊核心設施軟體GCG 3.1.2軟體之Mapping分析其序列限制酶切位圖譜(restriction enzyme mapping)。發現限制酶Sma I可將聚合酶連鎖反應產物剪切成3個核酸片段，大小分別為207bp、262bp及528bp，BamH I可將聚合酶連鎖反應產物剪切成2個核酸片段，大小分別為433bp及564bp。請參照第5圖，第5(A)圖為以限制酶Sma I剪切鮑氏志賀氏菌之聚合酶連鎖反應產物之洋菜凝膠電泳分析圖，第5(B)圖為以限制酶BamH I剪切鮑氏志賀氏菌之聚合酶連鎖反應產物之洋菜凝膠電泳分析圖。其中M和M2為核酸之分子量標記，泳道1和5為未經限制酶剪切的鮑氏志賀氏菌BCRC 15958之聚合酶連鎖反應產物，泳道3和7為經限制酶剪切的鮑氏志賀氏菌BCRC 15958之聚合酶連鎖反應產物，泳道4和8為經限制酶剪切的鮑氏志賀氏菌BCRC 15960之聚合酶連鎖反應產物。結果顯示兩株鮑氏志賀氏菌參考菌株的聚合酶連鎖反應產物以限制酶Sma I和限制酶BamH I剪切後切出的核酸片段都如預期之長度。

實驗例5：聚合酶連鎖反應條件測試

為了瞭解以引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3進行特異性聚合酶連鎖反應增幅的997bp聚合酶連鎖反應產物之特異性，特異性聚合酶連鎖反應條件如實驗例3所述，但黏合溫度分別以60、55、50、45、40、和35℃進行測試。請參照第6圖，為引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3於不同黏合溫度進行志賀氏菌參考菌株之特異性聚合酶連鎖反應之洋菜凝膠電泳分析圖。第6(A)圖為黏合溫度60℃，第6(B)圖為黏合溫度55℃，第6(C)圖為黏合溫度50℃，第6(D)圖為黏合溫度45℃，第6(E)圖為黏合溫度40℃，第6(F)圖為黏合溫度35℃。其中M為核酸之分子量標記。泳道1為鮑氏志賀氏菌BCRC 15958，泳道2為痢疾志賀氏菌BCRC 13983，泳道3為福氏志賀氏菌BCRC 10772，泳道4為宋內氏志賀氏菌BCRC 10773。結果顯示在50℃以上的黏合溫度下，只有鮑氏志賀氏菌BCRC 15958染色體能夠專一性的增幅出大小為997bp之聚合酶連鎖反應產物，但在50℃以下的黏合溫度下，其它志賀氏菌種的染色體也會增幅出其它大小的核酸片段。

實驗例6：聚合酶連鎖反應敏感性偵測

為了瞭解以引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3進行特異性聚合酶連鎖反應增幅997bp之聚合酶連鎖反應產物的敏感性，將鮑氏志賀氏菌BCRC 15958染色體濃度依序稀釋為100、10、1、10^-1、10^-2及10^-3ng，設定黏合溫度為65℃的條件下，以引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3進行特異性聚合酶連鎖反應。請參照第7圖，為引子SB-1057-5F3和SB-1057-3R3之敏感性測試之洋菜凝膠電泳分析圖，其中M為核酸之分子量標記，泳道1至6分別為鮑氏志賀氏菌BCRC 15958染色體濃度100ng、10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng和10^-3ng，泳道7為負控制組。結果顯示，在鮑氏志賀氏菌染色體濃度為10^-2ng時，仍可增幅出997bp之聚合酶連鎖反應產物。

另外將系列稀釋的鮑氏志賀氏菌BCRC 15958菌株取1ml加入50ml水檢體中，然後利用引子SB-1057-5F3及SB-1057-3R3進行特異性聚合酶連鎖反應，進一步測試需要多少鮑氏志賀氏菌BCRC 15958的菌株於水檢體就能偵測出來。請參照第8圖，其中M為核酸之分子量標記，P為鮑氏志賀氏菌BCRC 15958，N為負控制組。泳道1至9之鮑氏志賀氏菌BCRC 15958菌數分別2.8×10⁶、2.8×10⁵、2.8×10⁴、2.8×10³、2.8×10²、2.8×10¹、2.8×10⁰、2.8×10^-1、2.8×10^-2。結果顯示於50ml水檢體只要有2.8×10² CFU鮑氏志賀氏菌BCRC 15958，就可以增幅出大小為997bp之聚合酶連鎖反應產物。

因聚合酶連鎖反應本身之特性，引子與欲增幅之模版間之序列即便存在變異性，仍可藉調節聚合酶連鎖反應中黏合步驟之反應溫度而合成特定之去氧核醣核酸片段。因此，任何針對本發明實施例所述之引子所為之鹼基置換、加入或縮減所形成的引子，如其仍可與本發明實施例所述之相對應引子組成引子對而增幅出如序列辨識編號1所示全部或部分序列，皆不脫離本發明所欲保護之範圍。

根據上述，本發明提供一種獨有的新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸，為一種理想的鑑定鮑氏志賀氏菌之目標核酸片段。而依據此新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸所設計之引子對、檢驗套組及其鑑定鮑氏志賀氏菌的方法，可以快速且準確的從4種志賀氏菌、17種革蘭氏陰性細菌及10種革蘭氏陽性細菌中鑑定鮑氏志賀氏菌，且僅需要10^-2ng的鮑氏志賀氏菌染色體即可增幅出新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸，靈敏度極高，可以快速、敏感且專一性的將新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸從其它志賀氏菌菌種及一般細菌中進行區別鑑定。用以解決傳統鑑定方法耗事費時、操作不易及結果判讀困難的問題。

本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

<110> 中臺科技大學

<120> 新穎鮑氏志賀氏菌之單離核酸以及鑑定鮑氏志賀氏菌之引子對、檢驗套組及其鑑定方法

<160> 4

<210> 1

<211> 1057

<212> DNA

<213> Shigella boydii

<220> CDS

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> primer

<223> 進行PCR增幅序列辨識編號1片段的引子(forward)

<400> 2

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> primer

<223> 進行PCR增幅序列辨識編號1片段的引子(reversed)

<400> 3

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> primer

<223> 隨意引子

<400> 4

Claims

一種鑑定鮑氏志賀氏菌之引子對，包含如一序列辨識編號2所示之寡核苷酸以及一如序列辨識編號3所示序列之寡核苷酸，藉以放大如序列辨識編號1所示之一核酸片段。
一種鑑定鮑氏志賀氏菌之檢驗套組，包含如一序列辨識編號2所示之寡核苷酸以及一如序列辨識編號3所示序列之寡核苷酸，藉以放大如序列辨識編號1所示之一核酸片段。
如請求項2所述之鑑定鮑氏志賀氏菌之檢驗套組，其中該檢驗套組更包含限制酶Sma I。
如請求項2所述之鑑定鮑氏志賀氏菌之檢驗套組，其中該檢驗套組更包含限制酶BamH I。
一種鑑定鮑氏志賀氏菌之方法，包含：提供一未知樣品之去氧核醣核酸作為一模版；將該模版以序列辨識編號2所示之寡核苷酸及序列辨識編號3所示之寡核苷酸進行一聚合酶連鎖反應，以獲得一聚合酶連鎖反應產物；以及利用洋菜凝膠體電泳偵測該聚合酶連鎖反應產物是否有具有如序列辨識編號1所示之序列或部分序列。
如請求項5所述之鑑定鮑氏志賀氏菌之方法，其中該聚合酶連鎖反應之條件為94℃高溫變性(Denaturation)1分鐘、50℃至65℃引子黏合(Annealing)1分鐘及72℃延伸(Extension)1分鐘30秒，至少進行30個循環反應。
如請求項5所述之鑑定鮑氏志賀氏菌之方法，其中更包含：利用限制酶Sma I剪切該聚合酶連鎖反應產物，以獲得若干Sma I剪切片段；以及利用洋菜凝膠體電泳偵測該些Sma I剪切片段之分子量大小是否為207bp、262bp及528bp。
如請求項5所述之鑑定鮑氏志賀氏菌之方法，其中更包含：利用限制酶BamH I剪切該聚合酶連鎖反應產物，以獲得若干BamH I剪切片段；以及利用洋菜凝膠體電泳偵測該些BamH I剪切片段之分子量大小是否為433bp及564bp。