TWI519542B - 結合至ＨＥＲ３之β－髮夾結構及ＨＥＲ４之β－髮夾結構之抗ＨＥＲ３／ＨＥＲ４抗原結合蛋白 - Google Patents

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Description

結合至HER3之β-髮夾結構及HER4之β-髮夾結構之抗HER3/HER4抗原結合蛋白
本發明係關於結合至HER3之β-髮夾結構及HER4之β-髮夾結構之抗HER3/HER4抗原結合蛋白(例如抗HER3/HER4抗體)、選擇該等抗原結合蛋白之方法、其製備及作為藥劑之用途。
HER蛋白家族係由4個成員組成：HER1(亦稱為表皮生長因子受體(EGFR)或ErbB-1)、HER2(亦稱為ErbB-2)、ErbB-3(亦稱為HER3)及ErbB-4(亦稱為HER4)。ErbB家族蛋白為受體酪胺酸激酶且代表細胞生長、分化及存活之重要調介劑。HER家族代表如神經調節素(NRG)家族、雙調蛋白、EGF及(TGF-a)等不同配體之受體蛋白。神經生長因子(亦稱為HRG或神經調節素NRG-1)係例如HER3及HER4之配體。
人類HER3(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受體酪胺酸蛋白激酶erbB-3，SEQ ID NO：3)編碼受體酪胺酸激酶之表皮生長因子受體(EGFR)家族之成員，該家族亦包含HER1(亦稱為EGFR)、HER2及HER4(Kraus,M.H.等人，PNAS 86(1989)9193-9197；Plowman,G.D.等人，PNAS 87(1990)4905-4909；Kraus,M.H.等人，PNAS 90 (1993)2900-2904)。與原型表皮生長因子受體一樣，跨膜受體HER3係由以下組成：細胞外配體結合結構域(ECD)、ECD內之二聚化結構域、跨膜結構域、細胞內蛋白酪胺酸激酶結構域(TKD)及C端磷酸化結構域。此膜結合蛋白具有處在細胞外結構域內之神經生長因子(HRG)結合結構域，但並不具有活性激酶結構域。因此，其可結合此配體，但並不經由蛋白磷酸化將信號傳遞至細胞中。然而，其確實與具有激酶活性之其他HER家族成員形成異源二聚體。異源二聚化活化受體介導之信號傳導途徑並使其細胞內結構域轉磷酸化。HER家族成員之間之二聚體形成擴大了HER3之信號傳導潛能，且係一種不僅用於信號多樣化且用於信號放大之方式。例如，HER2/HER3異源二聚體經由HER家族成員中之PI3K及AKT途徑誘導最重要有絲分裂信號中之一者(Sliwkowski M.X.等人，J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665；Alimandi M等人，Oncogene.10(1995)1813-1821；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261；Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006)613-622)。關於HER3及其在HER受體家族及NGR配體家族內之多種相互作用之綜述參見例如G Sithanandam等人Cancer Gene Therapy(2008)15,413-448。
此基因之放大及/或其蛋白之過表現已在多種癌症中有所報導，包含前列腺癌、膀胱癌及乳癌。已表徵編碼不同亞型之替代性轉錄剪接變體。一種亞型缺乏膜間區域且分泌至細胞外。此形式發揮調節膜結合形式之活性之作用。亦已報導其他剪接變體，但其尚未經充分表徵。
令人感興趣的是，在其平衡狀態中，HER3受體以其「閉合構型」存在，此確實意味著異源二聚化HER3 β-髮夾結構基序係經由與HER3ECD結構域IV之非共價相互作用來連接(參見圖1c及圖1d)。假 定，可經由在特異性HER3神經生長因子結合位點處結合配體神經生長因子來打開「閉合」HER3構型。此係在由HER3 ECD結構域I及結構域III形成之HER3界面處發生。人們認為，HER3受體係藉由此相互作用活化並轉移至其「開放構型」(參見圖1e及圖1b以及例如Baselga,J.等人，Nat Rev Cancer 9(2009).463-475及Desbois-Mouthon,C.等人，Gastroenterol Clin Biol 34(2010)255-259)。在此開放構型中，可能與HER2進行異源二聚化及信號轉導誘導(參見圖1b)
WO 2003/013602係關於HER活性之抑制劑，包含HER抗體。WO 2007/077028及WO 2008/100624亦關於HER3抗體。
WO 97/35885及WO2010/127181係關於HER3抗體。
人類HER4(亦稱為ErbB-4 ERBB4、v-erb-a紅芽球白血病病毒致癌基因同源物4、p180erbB4、禽類紅芽球白血病病毒(v-erb-b2)致癌基因同源物4；SEQ ID NO：5)係具有以下結構之I型單次跨膜蛋白：多個富含弗林蛋白酶(furin)樣半胱胺酸之結構域、酪胺酸激酶結構域、磷脂醯肌醇-3激酶結合位點及PDZ結構域結合基序(Plowman G D等人，PNAS 90：1746-50(1993)；Zimonjic D B等人，Oncogene 10：1235-7(1995)；Culouscou J M等人，J.Biol.Chem.268：18407-10(1993))。該蛋白與以下蛋白結合並由其活化：神經調節素-2及-3、肝素結合EGF樣生長因子及β細胞調節素。配體結合誘導眾多種細胞反應，包含有絲分裂發生及分化。多重蛋白水解事件容許細胞質片段及細胞外片段釋放。此基因之突變與癌症有關。另一選擇為，已闡述編碼不同蛋白亞型之剪接變體；然而，並非所有變體皆經充分表徵。
用於抗癌療法中之抗HER4抗體係自例如以下文獻得知：US 5,811,098、US 7,332,579或Hollmén M等人，Oncogene.28(2009)1309-19(anti-ErbB-4 antibody mAb 1479)。
迄今，不可能選擇特異性結合至HER3及/或HER4之β-髮夾結構 之抗原結合蛋白(例如抗體)，此乃因HER3或HER4之該等β-髮夾結構皆代表隱蔽表位，其在該等受體之平衡狀態下不可及(參見圖1)。
現已發現使用在SlyD支架內以3維定向功能性呈現之HER3及HER4之β-髮夾結構(例如參見圖2及多肽SEQ ID NO.13及17至24)獲得該等抗原結合蛋白、具體而言抗體之方法。
本發明提供用於選擇結合至人類HER3且結合至人類HER4之抗原結合蛋白、具體而言抗體之方法，其中該抗原結合蛋白、具體而言抗體在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合；其中a)至少一種選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：1；及b)至少一種選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：2； 係用於選擇抗原結合蛋白、具體而言抗體，其顯示結合至a)之至少一種多肽及b)之至少一種多肽二者
且由此選擇在胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)及胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合之抗原結合蛋白、具體而言抗體。
本發明提供抗原結合蛋白、具體而言抗體，其係藉由該選擇方法獲得。
本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白、具體而言抗體，其中該抗原結合蛋白、具體而言抗體在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合。
本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白，a)其中該抗原結合蛋白結合至多肽SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，且b)其中該抗原結合蛋白結合至多肽SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4。
本發明進一步提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白，a)其中該抗原結合蛋白在包括於多肽SEQ ID NO：18(TtSlyDcys-Her3)中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合，且b)其中該抗原結合蛋白在包括於多肽SEQ ID NO：22(TtSlyDcys-Her4)中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結 合。
本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，a)其中該抗體結合至多肽SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，且b)其中該抗體結合至多肽SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4。
本發明進一步提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，a)其中該抗體在包括於多肽SEQ ID NO：18(TtSlyDcys-Her3)中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合，且b)其中該抗體在包括於多肽SEQ ID NO：22(TtSlyDcys-Her4)中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合。
本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，其中該抗體
a)結合至胺基酸序列SEQ ID NO：1；及/或b)結合至活化HER3中之胺基酸序列SEQ ID NO：1；及/或c)在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；及/或d)結合至HER3之β-髮夾結構區域；及/或 e)抑制HER3/HER2異源二聚體之異源二聚化；及/或f)結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為4.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))；及/或g)結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為2.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))；及/或h)特異性結合至胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或i)結合至活化HER4中之胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或j)在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；及/或k)結合至HER4之β-髮夾結構區域；及/或l)結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為20.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))；及/或m)結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為5.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))；及/或 n)作為單價Fab片段顯示與其二價全長親代抗體相比相同或更高的生物活性；及/或o)抑制MCF-7細胞中之HER3磷酸化；及/或p)不與神經生長因子競爭結合HER3/誘導神經生長因子結合至HER3；及/或q)抑制MDA-MB-175腫瘤細胞之增殖；及/或r)顯示活體內之腫瘤生長抑制活性；及/或s)以KD值1×10-8M之親和力結合至HER3-ECD(在一實施例中KD值為1×10-8M至1×10-13M；(在一實施例中KD值為1×10-9M至1×10-13M)；及/或t)以KD值1×10-8M之親和力結合至HER4-ECD(在一實施例中KD值為1×10-8M至1×10-13M；(在一實施例中KD值為1×10-9M至1×10-13M)；及/或u)結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽及由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；及/或v)結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽；及/或w)結合至由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；及/或x)在FACS分析中結合至表現HER3之T47D細胞；且其中在抗體暴露1h後量測時，與神經生長因子不存在下HER3之內化百分比相比，在神經生長因子存在下該抗體誘導之HER3之內化百分比高至少25%。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體係單株抗體。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體係人類、人類化或嵌合抗體。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體係結合人類HER3且結合人類HER4之抗體片段。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括
i)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；ii)或i)(a)、(b)、(d)及/或(e)抗體之HVR的人類化變體。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括
i)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或ii)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括胺基 酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或iii)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或iv)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：33具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：36具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：33之VH序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：36之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：33之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：33具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：37具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：33之VH序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：37之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括 SEQ ID NO：33之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：34具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：36具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：34之VH序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：36之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：34之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：34具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：37具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：34之VH序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：37之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：34之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：35具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：36具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：35之VH序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：36之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：35之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：35具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：37具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括 SEQ ID NO：35之VH序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：37之VL序列。在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：35之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體係全長IgG1抗體或IgG4抗體。
在一實施例中，該抗HER3/HER4抗體係Fab片段。
本發明進一步提供該抗HER3/HER4抗體之經分離核酸。
本發明進一步提供包括該核酸之宿主細胞。
本發明進一步提供產生抗體之方法，該方法包括培養該宿主細胞以產生抗體。
在一實施例中，該方法進一步包括自宿主細胞回收抗體。
本發明進一步提供包括該抗HER3/HER4抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物。
本發明進一步提供包括該抗HER3/HER4抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。
本發明進一步提供本文所闡述之抗HER3/HER4抗體，其用作藥劑。本發明進一步提供本文所闡述之抗HER3/HER4抗體或包括抗HER3/HER4抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物，其用於治療癌症。本發明進一步提供本文所闡述之抗HER3/HER4抗體，其用於抑制HER3/HER2二聚化。
一種該抗HER3/HER4抗體或包括抗HER3/HER4抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物之用途，其用於製造藥劑。在該用途中，該藥劑用於治療癌症。在該用途中，該藥劑用於抑制HER3/HER2二聚化。
本發明進一步提供治療患有癌症之個體之方法，該方法包括向個體投與有效量之本文所闡述之抗HER3/HER4抗體或包括抗HER3/HER4抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物。
本發明進一步提供誘導患有癌症之個體之癌細胞凋亡之方法，該方法包括向個體投與有效量之包括本文所闡述之抗HER3/HER4抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物，由此誘導個體之癌細胞凋亡。
本發明之一實施例係選自由以下組成之群之多肽：i)SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，ii)SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，iii)SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，iv)SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及v)SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，該多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO：1本發明之一實施例係選自由以下組成之群之多肽：i)SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，ii)SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，iii)SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及iv)SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，該多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO：2。
本發明進一步提供該等選自由以下組成之群之多肽中之一者的用途：i)SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，ii)SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，iii)SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，iv)SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及v)SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，其用於在實驗動物中誘發針對SEQ ID NO：1之免疫反應。
本發明進一步提供該等選自由以下組成之群之多肽中之一者的用途： i)SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，ii)SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，iii)SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及iv)SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，其用於在實驗動物中誘發針對SEQ ID NO：2之免疫反應。
本發明進一步提供產生特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之HER3之β-髮夾結構之抗體的方法，該方法包括以下步驟：a)向實驗動物投與選自由以下組成之群之多肽：i)SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，ii)SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，iii)SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，iv)SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及v)SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，至少一次，其中該多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之HER3之β-髮夾結構，b)最後投與後3至10天自實驗動物回收多肽B細胞，該等多肽B細胞產生特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之HER3之β-髮夾結構之抗體，及c)培養包括核酸之細胞，該核酸編碼特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之HER3之β-髮夾結構之抗體；及自細胞或培養基回收抗體並由此產生特異性結合至靶抗原之抗體。
本發明進一步提供選自由以下組成之群之多肽之用途：i)SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，ii)SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，iii)SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，iv)SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及 v)SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，其用於表位定位，其中該多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之HER3之β-髮夾結構中之表位。
一種用於產生特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之HER4之β-髮夾結構之抗體的方法，該方法包括以下步驟：a)向實驗動物投與選自由以下組成之群之多肽：i)SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，ii)SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，iii)SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及iv)SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，至少一次，其中該多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之HER4之β-髮夾結構，b)最後投與後3至10天自實驗動物回收多肽B細胞，該等多肽B細胞產生特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之HER4之β-髮夾結構之抗體，及c)培養包括核酸之細胞，該核酸編碼特異性結合至具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之HER4之β-髮夾結構之抗體；及自細胞或培養基回收抗體並由此產生特異性結合至靶抗原之抗體。
本發明進一步提供選自由以下組成之群之多肽之用途：i)SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，ii)SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，iii)SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及iv)SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，其用於表位定位，其中該多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之HER4之β-髮夾結構中之表位。
使用在SlyD支架內以3維定向功能性呈現之HER3及HER4之β-髮 夾結構(例如參見圖2以及多肽SEQ ID NO.13及17至24)，可選擇本文所闡述結合至該等β-髮夾結構之抗HER3/HER4抗原結合蛋白、具體而言抗體。發現本發明之抗原結合蛋白、具體而言抗體具有高度有價值之性質，例如表現HER3之癌細胞之強生長抑制、與癌細胞增殖相關之HER3介導之信號轉導(例如HER3磷酸化)之強抑制或極特異性藥物代謝動力學性質(例如與神經生長因子不存在下(「閉合構型」)相比時活化HER3在神經生長因子存在下(「開放構型」)之較快締合速率及較高結合莫耳比)。
圖1(a)-1(e) 「閉合」及「開放」HER3構型及神經調節素家族配體(例如神經生長因子，在本文中簡寫為HR)對構型變化之影響之示意性概圖。
圖2 在嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)之SlyD支架內以3維定向功能性呈現之HER3之β-髮夾結構之3D-結構。
圖3 TtSlyD-FKBP-Her3之Ni-NTA純化之SDS-PAGE分析。E1及E2顯示經純化流份12及13。SN：純化前之大腸桿菌(E.coli)溶解物上清液。
圖4 嗜熱棲熱菌SlyD-FKBP-Her-3之經Ni-NTA純化流份之SEC溶析曲線。
圖5 所選純系在IHC中之特異性及反應性測試。所有三個純系皆顯示與Her3之結合及針對Her4之交叉反應性。無法檢測到針對Her1及Her2之交叉反應性。
圖6 T47D細胞中M-05-74抗體誘導之時間依賴性HER3內化之FACS分析。
圖7 Biacore疊加感應圖。1：100nM M-05-74*神經生長因子/Her-3 ECD相互作用。2：100nM M-08-11*神經生長因子/Her-3 ECD 相互作用。3及4：100nM M-05-74及100nM M-08-11*Her-3 ECD相互作用。5：參考緩衝液。
圖8 Biacore表位框并實驗之疊加感應圖。一級抗體M-05-74(在圖中為M-074)將Her-3 ECD呈現至二級抗體M-208、GT(=8B8)、M-05-74及M-08-11(在圖8中為M-011)。量測之雜訊為5 RU。
圖9 Biacore疊加感應圖。1：90nM神經生長因子* M-05-74上之Her-3 ECD複合物。2：90nM神經生長因子* M-08-11上之Her-3 ECD複合物。3：90nM神經生長因子* 8B8抗體上之Her-3 ECD複合物。
圖10藉由Biacore功能分析鑑別之示意性作用模式。1：M-08-11結合至神經生長因子活化之Her-3 ECD且誘導延遲的神經生長因子解離，M-08-11藉此保留在Her-3 ECD受體複合物中。2：M-05-74結合至神經生長因子活化之Her-3 ECD。神經生長因子捕集於複合物中且抗體保留在複合物中。3：8B8結合神經生長因子活化之Her-3ECD。整個複合物自抗體解離。
圖11表位定位及丙胺酸掃描方式之策略。研究EGFR、Her-2 ECD、Her-3 ECD及Her-4 ECD之肽髮夾結構序列(肽髮夾結構)，包含其結構性嵌入(結構性)。藉由絲胺酸替代半胱胺酸。
圖12抗體M-05-74在HER3及HER4上之表位之CelluSpotsTM合成及表位定位。抗HER3/HER4抗體M-05-74結合至HER3 ECD結合表位VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)及HER4 ECD結合表位VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)。
圖13抗HER3/HER4抗體M-05-74(在圖中稱為M-074)及抗HER3抗體M-08-11(稱為M-011，無HER4交叉反應性)之CelluSpotsTM Ala掃描結果，對抗HER3/HER4抗體M-05-74與其HER3 ECD結合表位VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)及其HER4 ECD結合表位VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之結合貢獻最大之胺基酸係加下劃線/ 粗體。
圖14M-05-74(M-074)之結合誘導/促使HRG結合至HER3-ECD。
圖15MCF7細胞中HER2/HER3異源二聚體/異源二聚化之抑制(免疫沈澱及西方墨點(Western Blot)，HER3-IP=用HER3抗體之免疫沈澱/HER2-IP=用HER2抗體之免疫沈澱)。
圖16用M-05-74處理MDA-MB175細胞使得抑制細胞增殖。
圖17用M-05-74(M-074)(10mg/kg q7d，腹膜內)處理導致FaDu HNSCC移植之異種移植物之腫瘤停滯(stasis)。
圖18用M-05-74-Fab-假單胞菌(Pseudomonas)外毒素偶聯物(M-074-PE)(10mg/kg q7d，腹膜內)處理在HRG存在(粗線)下導致較HRG不存在(細線)下更強之對細胞增殖之抑制。
圖19M-05-74-Fab-假單胞菌外毒素偶聯物(M-05-74-PE)之活體內腫瘤細胞生長抑制。圖例：實線(媒劑)；虛線(M-05-74-Fab-假單胞菌外毒素偶聯物(M-05-74-PE))。
圖20 Biacore疊加感應圖：與WO2012/22814中所闡述之抗HER3抗體MOR09823(2)相比，本發明抗體M-05-74(1)與TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)之結合。本發明抗體M-05-74(1)顯示與TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)之清晰結合信號，而抗體抗HER3抗體MOR09823(2)顯示與TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)完全不結合。完全不含抗體之對照量測(3)顯示與TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)無任何結合。
I. 定義
出於本文目的，「受體人類框架」係包括源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白 框架或人類共有框架之受體人類框架可包括其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。
「親和力成熟」抗體係指與不具有改變之親代抗體相比在一或多個超變區(HVR)中具有一或多個改變之抗體，該等改變使得可改良抗體與抗原之親和力。
如本文所使用之術語「抗原結合蛋白」係指如本文所闡述之抗體或支架抗原結合蛋白。在一較佳實施例中，抗原結合蛋白係如本文所闡述之抗體。業內已知支架抗原結合蛋白，例如，纖連蛋白及經設計之錨蛋白-重複蛋白(DARPin)已作為抗原結合結構域之替代支架來使用，例如，參見Gebauer及Skerra，Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin Chem Biol 13：245-255(2009)及Stumpp等人，Darpins：A new generation of protein therapeutics.Drug Discov Today 13：695-701(2008)，該兩個文獻之全文皆以引用方式併入本文中。B.選擇本發明抗原結合蛋白之親代可變結構域及受體之標準.在一實施例中，支架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4(厄維體(Evibody))；脂質運載蛋白；蛋白A源分子，例如蛋白A之Z-結構域(親和體，SpA)、A-結構域(多聚物/大抗體)；熱休克蛋白，例如GroEl及GroES；運鐵蛋白(穿體)；錨蛋白重複蛋白(DARPin)；肽適配體；C型凝集素結構域(四締素)；人類γ-晶體蛋白及人類泛素(親和素)；PDZ結構域；人類蛋白酶抑制劑之蠍毒素庫尼茲型結構域；及纖連蛋白(阿德奈汀(adnectin))；其已經歷蛋白改造以獲得至除天然配體外之配體之結合。
CTLA-4(細胞毒性T淋巴球相關抗原4)係在主要CD4+ T細胞上表 現之CD28家族受體。其細胞外結構域具有可變結構域樣Ig摺疊。對應於抗體之CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結合性質。經改造以具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為厄維體。關於其他細節參見Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
脂質運載蛋白係運輸小疏水性分子(例如類固醇、後膽色素(bilin)、類視色素及脂質)之細胞外蛋白家族。其於錐形結構之開口端具有含有諸多環之剛性β-摺疊二級結構，該結構可經改造以結合至不同靶抗原。抗運載蛋白(Anticalin)之大小係介於160個胺基酸與180個胺基酸之間，且源自脂質運載蛋白。關於其他細節參見Biochim Biophys Acta 1482：337-350(2000),US 7,250,297 B1及US 2007/0224633。
親和體係源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白A之支架，其可經改造以結合至抗原。結構域係由約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。關於其他細節參見Protein Eng.Des.SeI.17,455-462(2004)且EP1641818A1厄維體為源自A-結構域支架家族之多結構域蛋白。約35個胺基酸之天然結構域呈現經界定二硫鍵結結構。藉由使由A-結構域家族展現之天然變化改組來產生多樣性。關於其他細節參見Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。
運鐵蛋白係單體血清運輸糖蛋白。運鐵蛋白可藉由在允許式表面環中插入肽序列來改造以結合不同靶抗原。經改造運鐵蛋白支架之實例包含穿體。關於其他細節參見J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
經設計錨蛋白重複蛋白(DARPin)係源自介導整合膜蛋白至細胞骨架之附接之蛋白家族的錨蛋白。單一錨蛋白重複係由兩個α-螺旋及 一個β-小彎組成之33殘基基序。其可藉由隨機化每一重複之第一個α-螺旋及-β-小彎中之殘基來改造以結合不同靶抗原。可藉由增加模組數目(親和力成熟方法)來增大其結合界面。關於其他細節參見J.MoI.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)及J.MoI.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。
纖連蛋白係可經改造以結合至抗原之支架。阿德奈汀係由人類纖連蛋白III型(FN3)之15個重複單元之第10結構域之天然胺基酸序列的骨架組成。β-三明治(beta-sandwich)一端處之3個環可經改造以使阿德奈汀能夠特異性識別所關注之治療靶。關於其他細節參見Protein Eng.Des.SeI.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764及US6818418B1。
肽適配體係由恆定支架蛋白(通常為硫氧還蛋白(TrxA))組成之組合識別分子，該蛋白含有插入活性位點之限制性可變肽環。關於其他細節參見Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微體係源自長度為25-50個胺基酸之天然微生物蛋白，其含有3-4個半胱胺酸橋，微生物蛋白之實例包含KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)以及打結素(knottin)。微生物蛋白之環可經改造以包含多達25個胺基酸，而不會影響微生物蛋白之總體摺疊。關於經改造打結素結構域之其他細節參見WO2008098796。
其他抗原結合蛋白包含已用作支架以改造不同靶抗原結合性質之蛋白，包含人類γ-晶體蛋白及人類泛素(親和素)、人類蛋白酶抑制劑之庫尼茲型結構域、Ras-結合蛋白AF-6之PDZ-結構域、蠍毒素(卡律蠍毒素(charybdotoxin))、C型凝集素結構域(四締素)綜述於以下文獻之第7章中：Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007，由Stefan Dubel編輯)及Protein Science 15：14-27(2006)。本發明之表位結合結構域可源自該等替代蛋白結構域中之任 一者。
術語「抗HER3/HER4抗原結合蛋白」、「結合至(人類)HER3及結合至(人類)HER4之抗原結合蛋白」及「特異性結合至人類HER3及特異性結合至人類HER4之抗原結合蛋白」係指能夠以足夠親和力結合HER3或HER4以使抗體可用作靶向HER3及/或HER4之診斷及/或治療劑之抗原結合蛋白。
術語「抗HER3/HER4抗體」、「結合至(人類)HER3及結合至(人類)HER4之抗體」及「特異性結合至人類HER3及特異性結合至人類HER4之抗體」係指能夠以足夠親和力結合HER3或HER4以使抗體可用作靶向HER3及/或HER4之診斷及/或治療劑之抗體。在一實施例中，抗HER3/HER4抗體與無關非HER3/HER4蛋白結合之程度低於該抗體與HER3或HER4結合之約10%，如藉由(例如)表面電漿子共振分析(例如BIACORE)所量測。在某些實施例中，結合至人類HER3之抗體對結合至人類HER3之結合親和力之KD值為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，結合至人類HER4之抗體對結合至人類HER4之結合親和力之KD值為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。b在一較佳實施例中，結合親和力之各別KD值係在表面電漿子共振分析中分別使用針對HER3結合親和力之人類HER3之野生型細胞外結構域(ECD)(HER3-ECD)及針對HER4結合親和力之野生型人類HER4-ECD測定。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包含(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展示期望抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包括完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原之部分。抗體片段之實例包含(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙特異性抗體、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及自抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合至相同表位之抗體」作為參考抗體係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高的抗體，且反之，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高。實例性競爭分析提供於本文中。
如本文所使用之術語「癌症」可係例如肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊椎腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦脊膜瘤、扁平細胞癌、垂體腺瘤，包含任一上述癌症之難治性病種或一或多種上述癌症之組合。在一較佳實施例中，該癌症係乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌或前列腺癌。在一較佳實施例中，該等癌症之特徵進一步在於HER3及/或HER4表現或過表現。本發明之又一實施例係本發明之抗HER3/HER4抗體用於同時治療原發性腫瘤與新轉移。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自具體來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種之抗體。
抗體「種類」係指重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。 存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類中之若干種可進一步分成子類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所使用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包含(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲蝶呤、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(vinblastine))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、瘤克寧錠(chlorambucil)、唐黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如來自細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。在一較佳實施例中，「細胞毒性劑」係假單胞菌外毒素A或其變體。在一較佳實施例中，「細胞毒性劑」係毒傘肽(amatoxin)或其變體。
「效應子功能」係指彼等歸因於抗體Fc區之生物活性者，其隨抗體同種型變化。抗體效應子功能之實例包含：Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞調介之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。
術語「表位」包含能夠特異性結合至抗體之任何多肽決定簇。 在某些實施例中，表位決定簇包含分子之化學活性表面基團(例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中可具有特異性三維結構特徵及/或特異性電荷特徵。表位係抗原由抗體結合之區。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C端區域。該術語包含天然序列Fc區及變體Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，可存在或可不存在Fc區之C端離胺酸(Lys447)。除非在本文中另外指出，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU指數)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所闡述。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常係由4個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有實質上與天然抗體結構類似之結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包含「轉化體」及「經轉化細胞」，其包含原代經轉化細胞及源自其之子代(與傳代次數無關)。子代與親代細胞之核酸含量可能並不完全相同，但可含有突變。本文包含經篩選或選擇用於原始經轉化細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。
「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列之胺基酸序 列者：由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體庫或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包括非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共有框架」係代表在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變結構域序列亞組。通常，序列亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242，第1-3卷中之亞組。在一實施例中，對於VL而言，亞組係如Kabat等人所述之亞組κ I(參見上文)。在一實施例中，對於VH而言，該亞組係如Kabat等人所述之亞組III(參見上文)。
「人類化」抗體係指包括來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包括基本上所有中之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)對應於非人類之彼等HVR，且所有或基本上所有FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包括源自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化變體」係指已經受人類化之抗體。在一較佳實施例中，將鼠類HVR移植至人類抗體之框架區中以製備「人類化抗體」。例如，參見Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327及Neuberger,M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。將鼠類可變區胺基酸序列與人類種系抗體V-基因之集合比對，且根據序列一致性及同源性分選。受體序列係基於高總體序列同源性亦及視情況受體序列中已有之正確規範殘基之存在來選擇(參見Poul,M-A.及Lefranc,M-P.，「Ingénierie des anticorps banques combinatores」，Lefranc,M-P.及Lefranc,G.編輯，Les Editions INSERM,1997)。種系V-基因僅編碼直至HVR3起點(對於 重鏈)及直至HVR3中間(對於輕鏈)之區域。因此，不在整個V-結構域內比對種系V-基因之基因。人類化構築物包括人類框架1至3、鼠類HVR及源自人類JK4之人類框架4序列及分別用於輕鏈及重鏈之JH4序列。在選擇一條具體受體序列之前，可確定供體抗體之所謂的規範環結構(參見Morea,V.等人，Methods，第20卷，第3期(2000)267-279)。 該等規範環結構係藉由所謂的規範位置處存在之殘基類型來確定。該等位置位於(部分)HVR區域外部，且在最終構築物中應保持功能等效以保持親代(供體)抗體之HVR構型。在WO 2004/006955中報導用於人類化抗體之方法，該方法包括以下步驟：鑑別非人類成熟抗體中HVR之規範HVR結構類型；獲得針對人類抗體可變區之肽序列文庫；確定文庫中可變區之規範HVR結構類型；及選擇規範HVR結構與非人類抗體規範HVR結構類型在非人類及人類可變區內之相應位置處相同之人類序列。總之，基於高總體同源性及另外視情況在受體序列中已存在正確規範殘基下選擇潛在受體序列。在一些情形下，簡單HVR移植僅部分保留非人類抗體之結合特異性。已發現，至少一些特異性非人類框架殘基為重構結合特異性所必需且亦必須移植至人類框架中，即除引入非人類HVR外必須製造所謂的「回復突變」(例如參見Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10,029-10,033；Co等人，Nature 351(1991)501-502)。該等特異性框架胺基酸殘基參與FR-HVR相互作用且穩定HVR之構型(環)(例如參見Kabat等人，J.Immunol.147(1991)1709)。在一些情形下，亦引入正向突變以更嚴密地使用人類種系序列。因此，「本發明抗體之人類化變體」(其為例如小鼠源)係指基於小鼠抗體序列之抗體，其中VH及VL係藉由上文所闡述之標準技術(包含HVR移植及視情況框架區及HVR-H1、HVR-H2、HVR-L1或HVR-L2中某些胺基酸之隨後突變形成，而HVR-H3及HVR-L3保持不變)人類化。
如本文所使用之術語「超變區」或「HVR」係指序列(「互補決定區」或「CDR」)超變及/或結構上形成所定義之環(「超變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸」)之抗體可變結構域中之每一區域。通常，抗體包括6個HVR：3個位於VH中(H1、H2、H3)，且3個位於VL中(L1、L2、L3)。本文之實例性HVR包含：(a)實例性超變環，其出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)CDR，其出現於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；(c)抗原接觸，其出現於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包含HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據Kabat等人所述來編號(參見上文)。
「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子(包含(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。
「個體(individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包含(但不限於)家養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體係人類。
「經分離」抗體係自其天然環境組份分離者。在一些實施例中，將抗體純化至具有大於95%或99%之純度，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。對於評估抗體純度之方法之綜述參見例如Flatman,S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
「經分離」核酸係指自天然環境組份分離之核酸分子。經分離核酸包含通常含有核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。
「編碼抗HER3/HER4抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包含單一載體或單獨載體中之該(等)核酸分子及存在於宿主細胞中一或多個位置處之該(等)核酸分子。
如本文所使用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群獲得之抗體，即，包括該群之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，該等變體通常以較小量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單個決定簇。因此，修飾語「單株」指示自實質上同源之抗體群獲得之抗體之特徵，且不應解釋為需要藉由任一具體方法產生抗體。例如，用於本發明中之單株抗體可藉由多種技術來製造，包含(但不限於)雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，製備單株抗體之該等方法及其他實例性方法闡述於本文中。
術語「Mab」係指單株抗體，而術語「hMab」係指該等單株抗體之人類化變體。
「裸抗體」係指不與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標 記偶聯之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。(若先前技術具有免疫偶聯物則包含)。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異四聚體糖蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N-至C端，每一重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，隨後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N-至C端，每一輕鏈依次具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)及恆定輕鏈(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈分配為兩種類型中之一者，稱為卡帕型(κ)及拉姆達(λ)。
術語「包裝插頁」用於指通常包含於治療性產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於該等治療性產品之使用之警告的資訊。
就參考肽序列而言，「胺基酸序列一致性百分數(%)」定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分數後，候選序列中與參考肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分數之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之合適參數，包含在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech公司設計，且原始碼與使用者文件已一起編入美國版權局，Washington D.C.,20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自源代碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包含數位UNIX V4.0D)中。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A相對於、與或對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B具有或包括一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下：100×分數X/Y
其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則如本文所使用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係根據前面緊接段落中所闡述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指以下製劑：其所呈現形式允許其中所含活性成份之生物活性有效，且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性的額外組份。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包含(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另有指示，否則如本文所使用之術語「HER3」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然HER3，該脊椎動物來源包含哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未處理HER3以及自處理細胞產生之任一形式的HER3。該術語亦涵蓋HER3之天然變體，例如，剪接變體或對偶基因變體。實例性人類HER3之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：3中。「人類 HER3」(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受體酪胺酸蛋白激酶erbB-3、SEQ ID NO：3)編碼受體酪胺酸激酶之表皮生長因子受體(EGFR)家族之成員，該家族亦包含HER1(亦稱為EGFR)、HER2及HER4(Kraus,M.H.等人，PNAS 86(1989)9193-9197；Plowman,G.D.等人，PNAS 87(1990)4905-4909；Kraus,M.H.等人，PNAS 90(1993)2900-2904)。與原型表皮生長因子受體一樣，跨膜受體HER3係由以下組成：細胞外配體結合結構域(ECD)、ECD內之二聚化結構域、跨膜結構域、細胞內蛋白酪胺酸激酶結構域(TKD)及C端磷酸化結構域。此膜結合蛋白具有處在細胞外結構域內之神經生長因子(HRG)結合結構域，但並不具有活性激酶結構域。因此，其可結合此配體，但並不經由蛋白磷酸化將信號傳遞至細胞中。然而，其確實與具有激酶活性之其他HER家族成員形成異源二聚體。異源二聚化活化受體介導之信號傳導途徑並使其細胞內結構域轉磷酸化。HER家族成員之間之二聚體形成擴大了HER3之信號傳導潛能，且係一種不僅用於信號多樣化且用於信號放大之方式。例如，HER2/HER3異源二聚體經由HER家族成員中之PI3K及AKT途徑誘導最重要有絲分裂信號中之一者(Sliwkowski M.X.等人，J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665；Alimandi M等人，Oncogene.10(1995)1813-1821；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261；Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006)613-622)。關於HER3及其在HER受體家族及NGR配體家族內之多種相互作用之綜述參見例如G Sithanandam等人Cancer Gene Therapy(2008)15,413-448。
令人感興趣的是，在其平衡狀態中，HER3受體以其「閉合構型」存在，此確實意味著異源二聚化HER3 β-髮夾結構基序係經由與HER3 ECD結構域IV之非共價相互作用來連接(參見圖1c)。假定，可 經由在特異性HER3神經生長因子結合位點處結合配體神經生長因子來打開「閉合」HER3構型。此係在由HER3 ECD結構域I及結構域III形成之HER3界面處發生。人們認為，HER3受體係藉由此相互作用活化並轉移成其「開放構型」(參見圖1b及例如Baselga,J.等人，Nat Rev Cancer 9(2009).463-475及Desbois-Mouthon,C.等人，Gastroenterol Clin Biol 34(2010)255-259)。在此開放構型中，可能與HER2進行異源二聚化及信號轉導誘導(參見圖1b)。
除非另有指示，否則如本文所使用之術語「HER4」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然HER4，該脊椎動物來源包含哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未處理HER4以及自處理細胞產生之任一形式的HER4。該術語亦涵蓋HER4之天然變體，例如，剪接變體或對偶基因變體。實例性人類HER4之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：5中。「人類HER4」(亦稱為ErbB-4 ERBB4、v-erb-a紅芽球白血病病毒致癌基因同源物4、p180erbB4、禽類紅芽球白血病病毒(v-erb-b2)致癌基因同源物4；SEQ ID NO：5)係具有以下結構之I型單次跨膜蛋白：多個富含弗林蛋白酶樣半胱胺酸之結構域、酪胺酸激酶結構域、磷脂醯肌醇-3激酶結合位點及PDZ結構域結合基序(Plowman G D等人，PNAS 90：1746-50(1993)；Zimonjic D B等人，Oncogene 10：1235-7(1995)；Culouscou J M等人，J.Biol.Chem.268：18407-10(1993))。該蛋白與以下蛋白結合並由其活化：神經調節素-2及-3、肝素結合EGF樣生長因子及β細胞調節素。配體結合誘導眾多種細胞反應，包含有絲分裂發生及分化。多重蛋白水解事件容許細胞質片段及細胞外片段釋放。此基因之突變與癌症有關。另一選擇為，已闡述編碼不同蛋白亞型之剪接變體；然而，並非所有變體皆經充分表徵。
如本文所使用，「治療」(及其語法變化形式，例如「治療(treat 或treating)」係指嘗試改變所治療個體之自然病程的臨床干預，且可出於預防性目的或在臨床病理學病程期間實施。治療之合意效應包含(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與使抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有相似結構，其中各結構域包括4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如，參見，Kindt,T.J.等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman及Co.,N.Y.(2007)，第91頁)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合具體抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分離以分別篩選互補VL或VH結構域文庫。例如，參見，Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clarkson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。
如本文所使用之術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。該術語包含呈自複製核酸結構之載體，以及納入引入其之宿主細胞基因組中之載體。某些載體能夠引導與其可操作連接之核酸之表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。
II. 組合物及方法
在一態樣中，本發明部分基於以下發現：使用在SlyD支架內以3維定向功能性呈現之HER3及HER4之β-髮夾結構(例如參見圖2以及多肽SEQ ID NO.13及17至24)，可選擇對HER3及HER4之β-髮夾結構具有特異性之抗體。
在某些實施例中，本發明提供結合至人類HER3且結合至人類 HER4之抗體，其中該抗體在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合。
本發明抗體可用於(例如)診斷或治療癌症。
A. 實例性抗HER3/HER4抗原結合蛋白及抗體
本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白，a)其中該抗原結合蛋白結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，且b)其中該抗原結合蛋白結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4。
本發明進一步提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白，a)其中該抗原結合蛋白在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3， SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；且b)其中該抗原結合蛋白在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4。
本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白，a)其中該抗原結合蛋白結合至多肽SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，且b)其中該抗原結合蛋白結合至多肽SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4。
本發明進一步提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白，a)其中該抗原結合蛋白在包括於多肽SEQ ID NO：18(TtSlyDcas-Her3)中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合，且b)其中該抗原結合蛋白在包括於多肽SEQ ID NO：22(TtSlyDcas-Her4)中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合。
本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，a)其中該抗體結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3， SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，且b)其中該抗體結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4。
本發明進一步提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，a)其中該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；且b)其中該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4。
本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體， a)其中該抗體結合至多肽SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，且b)其中該抗體結合至多肽SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4。
本發明進一步提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，a)其中該抗體在包括於多肽SEQ ID NO：18(TtSlyDcas-Her3)中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合，且b)其中該抗體在包括於多肽SEQ ID NO：22(TtSlyDcas-Her4)中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合。
在一態樣中，本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，其中該抗體在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合。
在某些實施例中，本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，其中該抗體具有一或多個以下性質(本文亦涵蓋每一單一性質之每一組合)：a)該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：1；及/或b)該抗體結合至活化HER3中之胺基酸序列SEQ ID NO：1；及/或c)該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及 SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；及/或d)該抗體結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；及/或e)該抗體結合至HER3之β-髮夾結構區域；及/或f)在HER3/HER2共沈澱分析中該抗體抑制MCF-7細胞中HER3/HER2異源二聚體之異源二聚化(參見實例7)；及/或g)該抗體結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為4.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))(參見實例3b)；及/或h)該抗體結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為2.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))(參見實例3b)；及/或i)該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或j)該抗體結合至活化HER4中之胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或k)該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；及/或 l)該抗體結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；及/或m)該抗體結合至HER4之β-髮夾結構區域；及/或n)該抗體結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為20.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))(參見實例3b)；及/或o)該抗體結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為5.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))(參見實例3b)；及/或p)該抗體作為單價Fab片段顯示與其二價全長親代抗體相比相同或更高的生物活性(在MCF-7細胞之HER3磷酸化抑制分析中，當以等莫耳量比較時)(參見實例6)；及/或q)該抗體抑制MCF-7細胞中之HER3磷酸化(在6.66nM濃度下為至少90%)(參見實例6)；及/或r)該抗體並不與神經生長因子競爭結合HER3/誘導神經生長因子結合至HER3(參見實例5)；及/或s)該抗體抑制MDA-MB-175腫瘤細胞之增殖(EC50為5μg/ml或更低)；及/或t)該抗體顯示活體內之腫瘤生長抑制活性；及/或u)該抗體以KD值1×10-8M之親和力結合至HER3-ECD(在一實施例中KD值為1×10-8M至1×10-13M；(在一實施例中KD值為1× 10-9M至1×10-13M)；及/或v)該抗體以KD值1×10-8M之親和力結合至HER4-ECD(在一實施例中KD值為1×10-8M至1×10-13M；(在一實施例中KD值為1×10-9M至1×10-13M)；及/或w)該抗體結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽及由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；及/或x)該抗體結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽；及/或y)該抗體結合至由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；及/或z)該抗體在FACS分析中結合至表現HER3之T47D細胞；且其中在抗體暴露1h後量測時，與神經生長因子不存在下HER3之內化百分比相比，在神經生長因子存在下該抗體誘導之HER3之內化百分比高至少25%。(參見實例2e)。
在某些實施例中，本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，其中該抗體具有一或多個以下性質(本文亦涵蓋每一單一性質之每一組合)：a)該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：1；且該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或b)該抗體結合至活化HER3中之胺基酸序列SEQ ID NO：1；且該抗體結合至活化HER4中之胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或c)該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3， SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；且該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；及/或d)該抗體結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；該抗體結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；及/或e)該抗體結合至HER3之β-髮夾結構區域；且該抗體結合至HER4之β-髮夾結構區域；及/或 f)該抗體結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為4.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))(參見實例3b)；且該抗體結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為20.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))(參見實例3b)；及/或g)該抗體結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為2.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))(參見實例3b)；且該抗體結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為5.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))(參見實例3b)；及/或h)該抗體以KD值1×10-8M之親和力結合至HER3-ECD(在一實施例中KD值為1×10-8M至1×10-13M；(在一實施例中KD值為1×10-9M至1×10-13M)；且該抗體以KD值1×10-8M之親和力結合至HER4-ECD(在一實施例中KD值為1×10-8M至1×10-13M；(在一實施例中KD值為1×10-9M至1×10-13M)；及/或i)該抗體結合至包括胺基酸序列VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)之長度為15個胺基酸之多肽及包括胺基酸序列VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之長度為15個胺基酸之多肽；及/或j)該抗體結合至包括胺基酸序列VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)長度為長度為15個胺基酸之多肽；及/或k)該抗體結合至包括胺基酸序列VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之長度為15個胺基酸之多肽。
在某些實施例中，本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，其中：該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：1；且該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：2。
在某些實施例中，本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，其中：該抗體結合至活化HER3中之胺基酸序列SEQ ID NO：1；且該抗體結合至活化HER4中之胺基酸序列SEQ ID NO：2；在某些實施例中，本發明提供結合至人類HER3且結合人類HER4之經分離抗體，其中該抗體結合至包括(人類HER3之)胺基酸序列VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)之長度為15個胺基酸之多肽及包括(人類HER4之)胺基酸序列VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之長度為15個胺基酸之多肽。
在一態樣中，本發明提供包括至少1、2、3、4、5或6個選自以下之HVR之抗HER3/HER4抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個 選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在又一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1。在又一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明抗體包括(a)VH結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2及(iii)包括選自SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)VL結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少1、2、3、4、5或6個選自以下之HVR之抗HER3/HER4抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在又一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H1。在又一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明抗體包括(a)VH結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2及(iii)包括選自SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)VL結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少1、2、3、4、5或6個選自以下之HVR之抗HER3/HER4抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個 選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在又一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H1。在又一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明抗體包括(a)VH結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2及(iii)包括選自SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)VL結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少1、2、3、4、5或6個選自以下之HVR之抗HER3/HER4抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在又一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H1。在又一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明抗體包括(a)VH結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2及(iii)包括選自SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)VL結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少1、2、3、4、5或6個選自以下之HVR之抗HER3/HER4抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個 選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在又一實施例中，抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3、包含胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3及包含胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2。在又一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。在一實施例中，抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明抗體包括(a)VH結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2及(iii)包括選自SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)VL結構域，其包括至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(i)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1、(ii)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗體：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗HER3/HER4抗體
i)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；ii)或i)(a)、(b)、(d)及/或(e)抗體之HVR的人類化變體。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗HER3/HER4抗體
(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗HER3/HER4抗體
(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1； (e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗HER3/HER4抗體
(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供包括以下之抗HER3/HER4抗體
(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在任一上述實施例中，抗HER3/HER4抗體係經人類化。在一實施例中，抗HER3/HER4抗體包括如任一上述實施例中之HVR，且進一步包括受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在另一實施例中，抗HER3/HER4抗體包括如任一上述實施例中之HVR，且進一步包括包含人類種系IGHV1-46-01或IMGT_hVH_1_46之框架區之VH及包含人類種系IGKV3-11-01或IMGT_hVK_1_39之框架區的VL。人類種系之框架區及序列闡述於Poul,M-A.及Lefranc,M-P.，「Ingénierie des anticorps banques combinatores」Lefranc,M-P.及Lefranc,G.編輯，Les Editions INSERM,1997中。所有人類種系之人類重鏈及輕鏈可變框架區列示於例如Lefranc,M.P.,Current Protocols in Immunology(2000)-附錄1P A.1P.1-A.1P.37中且可經由IMGT(國際ImMunoGeneTics資訊系統®)(http：//imgt.cines.fr)或經由http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk獲得。
在另一態樣中，抗HER3/HER4抗體包括與胺基酸序列SEQ ID NO：33具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包括該序列之抗HER3/HER4抗體保留分別結合至HER3及HER4之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：33中，總共有1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視情況，抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：33之VH序列，包含該序列之轉譯後修飾。在具體實施例中，VH包括一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在另一態樣中，抗HER3/HER4抗體包括與胺基酸序列SEQ ID NO：34具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包括該序列之抗HER3/HER4抗體保留分別結合HER3及HER4之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：34中，總共有1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視情況，抗 HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：34之VH序列，包含該序列之轉譯後修飾。在具體實施例中，VH包括一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在另一態樣中，抗HER3/HER4抗體包括與胺基酸序列SEQ ID NO：35具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包括該序列之抗HER3/HER4抗體保留分別結合HER3及HER4之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：35中，總共有1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視情況，抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：35之VH序列，包含該序列之轉譯後修飾。在具體實施例中，VH包括一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
在另一態樣中提供抗HER3/HER4抗體，其中該抗體包括與胺基酸序列SEQ ID NO：36具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包括該序列之抗HER3/HER4抗體保留分別結合至HER3及HER4之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：36中，總共有1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視情況，抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：36之VL序列，包含該序列之轉譯後修飾。在具體實施例中，VL包括一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中提供抗HER3/HER4抗體，其中該抗體包括與胺基酸序列SEQ ID NO：37具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包括該序列之抗HER3/HER4抗體保留分別結合至HER3及HER4之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：37中，總共有1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視情況，抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：37之VL序列，包含該序列之轉譯後修飾。在具體實施例中，VL包括一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
在另一態樣中，提供抗HER3/Her4抗體，其中該抗體包括如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一實施例中，抗體分別包括SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：36之VH及VL序列、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：37之VH及VL序列 SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：36之VH及VL序列、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：37之VH及VL序列、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36之VH及VL序列或SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：37之VH及VL序列，包含彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中提供抗HER3/Her4抗體，其中該抗體包括與包括以下之抗體具有至少95%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列及與包括以下之抗體具有至少95%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)
分別為a)EQ ID NO：33及SEQ ID NO：36之VH及VL序列、b)EQ ID NO：33及SEQ ID NO：37之VH及VL序列c)EQ ID NO：34及SEQ ID NO：36之VH及VL序列、d)EQ ID NO：34及SEQ ID NO：37之VH及VL序列、e)EQ ID NO：35及SEQ ID NO：36之VH及VL序列或f)EQ ID NO：33及SEQ ID NO：37之VH及VL序列，其中該抗體具有一或多個以下性質：在某些實施例中，本發明提供結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，其中該抗體具有一或多個以下性質：該抗體
a)在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；b)結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3， SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；c)在HER3/HER2共沈澱分析中抑制MCF-7細胞中HER3/HER2異源二聚體之異源二聚化；d)在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；e)結合至選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；f)作為單價Fab片段顯示與其二價全長親代抗體相比相同或更高的生物活性(當以等莫耳量比較時，在MCF-7細胞之HER3磷酸化抑制分析中)；g)顯示活體內之腫瘤生長抑制活性；h)以KD值1×10-8M之親和力結合至HER3-ECD(在一實施例中KD值為1×10-8M至1×10-13M；(在一實施例中KD值為1×10-9M至1×10-13M)；i)以KD值1×10-8M之親和力結合至HER4-ECD(在一實施例中KD值為1×10-8M至1×10-13M；(在一實施例中KD值為1×10-9M 至1×10-13M)；j)其中該抗體結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽或由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；k)其中該抗體結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽；及/或l)其中該抗體結合至由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽。
在又一態樣中，本發明提供與本文所提供之抗HER3/HER4抗體結合至相同表位之抗體。例如，在某些實施例中，提供與抗HER3/HER4抗體結合至相同表位之抗體，該抗HER3/HER4抗體包括SEQ ID NO：31之VH序列及SEQ ID NO：32之VL序列。在某些實施例中，提供以下抗體：結合至由胺基酸VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之人類HER3片段內之表位及/或結合至由胺基酸VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之人類HER4片段內的表位。
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供之抗體具有以下解離常數(KD)：1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一較佳實施例中，KD係在25℃下以約10個反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片使用表面電漿子共振分析使用BIACORE®來量測。簡言之，根據供應商說明書使用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，然後以5μl/分鐘之流速注射以達成約10個反應單位(RU)之偶聯蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻 斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以約25μl/min之流速注射Fab存於含有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑之PBS(PBST)中之兩倍連續稀釋物(0.78nM至500nM)。使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合及解離感應圖來計算締合速率(k締合或ka)及解離速率(k解離或kd)。以比率kd/ka(k締合/k解離)來計算平衡解離常數KD。例如，參見Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881。若藉由上述表面電漿子共振分析測得之締合速率超過106M-1S-1，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術進行測定，該技術在25℃下於濃度遞增之抗原存在下量測存於PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度的增加或降低(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)，其係於分光光度計中所量測，例如具有攪拌光析管之停流裝備之分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic)。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本文所提供之抗體係抗體片段。抗體片段包含(但不限於)Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段及下文所闡述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述參見Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。關於scFv片段之綜述參見例如Pluckthün,A.,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore(編輯)，Springer-Verlag,New York(1994)，第269-315頁；亦參見WO 93/16185及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包括補救受體結合表位殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段之論述參見美國專利第5,869,046號。
雙鏈抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等 人，Nat.Med.9(2003)129-134；及Hollinger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三鏈抗體及四鏈抗體亦闡述於Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(20039 129-134)中。
單一結構域抗體係包括抗體之重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。
可藉由各種技術來製造抗體片段，包含(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)來產生，如本文所闡述。
3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第US 4,816,567號及Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81(1984)6851-6855)中。在一實例中，嵌合抗體包括非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區)及人類恆定區。在又一實例中，嵌合抗體係種類或子類已自親代抗體發生變化之「種類轉換」抗體。嵌合抗體包含其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包括一或多個可變結構域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)係源自非人類抗體，且FR(或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦可包括人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於(例如)Almagro,J.C.及Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann,I.等人，Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri,S.V.等人，Methods 36(2005)25-34(闡述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(闡述「表面重修」)；Dall’Acqua,W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(闡述「FR改組」)；及Osbourn,J.等人，Methods 36(2005)61-68及Klimka,A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(闡述FR改組之「導向選擇」方式)。Morea,V.等人，Methods，第20卷，第3期(2000)267-279)及WO2004/006955(藉助規範結構之方式)。
4. 人類抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體概述於van Dijk,M.A.及van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。
可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生完整人類抗體或具有響應抗原性激發之人類可變區的完整抗體。該等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座替代內源免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法之綜述參見Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。例如，亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HuMab®技術；美國專利第7,041,870 號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VelociMouse®技術)。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區組合來修飾由該等動物產生之完整抗體的人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製造。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker公司，New York(1987)，第51-63頁；及Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。經由人類B-細胞雜交瘤技術產生之人類抗體基因亦闡述於Li,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中。其他方法包含彼等闡述於例如美國專利第7,189,826號(闡述自雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(闡述人類-人類雜交瘤)中者。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於以下文獻中：Vollmers,H.P.及Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937以及Vollmers,H.P.及Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191。
亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生人類抗體。然後，該等可變結構域序列可與期望之人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
5. 源自文庫之抗體
可藉由自組合文庫篩選具有一或多種期望活性之抗體來分離本發明抗體。例如，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自該等文庫篩選具有期望結合特性之抗體的各種方法。該等方法綜述於(例如)Hoogenboom,H.R.等人，Methods in Molecular Biology 178(2001)1- 37中且進一步闡述於(例如)以下文獻中：McCafferty,J.等人，Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.及Bradbury,A.，Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；及Lee,C.V.等人，J.Immunol.Methods 284(2004)119-132。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因庫且將其於噬菌體文庫中隨機重組，然後可針對結合抗原之噬菌體進行篩選，如Winter,G.等人，Ann.Rev.Immunol.,12(1994)433-455中所闡述。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段之抗體片段。來自免疫化源之文庫可不經構築雜交瘤即提供針對免疫原之高親和力抗體。另一選擇為，可選殖(例如，自人類)天然庫以不經任何免疫即提供針對眾多種非自體抗原亦及自體抗原之抗體之單一來源，如由Griffiths,A.D.等人，EMBO J,12(1993)725-734所闡述。最終，亦可藉由以下方式合成製造天然文庫：自幹細胞選殖未重排V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變之CDR3區域並達成活體外重排，如由Hoogenboom,H.R.及Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所闡述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包含(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段可視為本文中之人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對HER3/HER4且另一者係針對任一其他抗原。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現HER3或HER4之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製備。
製造多特異性抗體之技術包含(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein,C.及Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540、WO 93/08829及Traunecker,A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)及「隆凸與孔洞(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製造多特異性抗體：改造用於製造抗體Fc-異源二聚體分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan,M.等人，Science 229(1985)81-83)；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.,148(1992)1547-1553；使用用於製造雙特異性抗體片段之「雙鏈抗體」技術(例如，參見Hollinger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(例如，參見Gruber,M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；及製備三特異性抗體，如(例如)Tutt,A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69)中所闡述。
本文亦包含具有三個或更多個功能抗原結合位點之經改造抗體(包含「章魚抗體」)(例如，參見US 2006/0025576)。
本文之抗體或片段亦包含包括結合至HER3/HER4以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙重作用之Fab」或「DAF」(例如，參見US 2008/0069820)。
本文之抗體或片段亦包含闡述於以下文獻中之多特異性抗體
WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2010/145793。
7. 抗體變體
在某些實施例中，本發明涵蓋本文所提供抗體之胺基酸序列變體。例如，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。 抗體之胺基酸序列變體係藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適宜修飾或藉由肽合成來製備。該等修飾包含(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以達成最終構築體，前提為最終構築體具有期望特性，例如抗原結合性。
a)取代、插入及缺失變體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代誘變之所關注位點包含HVR及FR。保守取代顯示於表1之「較佳取代」標題下。更多實質性變化提供於表1之「實例性取代」標題下，且如下文參考胺基酸側鏈種類進一步闡述。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)經保持/改良抗原結合、經降低免疫原性或經改良ADCC或CDC。
可根據常見側鏈性質對胺基酸進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代使得需要將該等種類之一種之成員與另一種類交換。
一種取代變體類型涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於 親代抗體在某些生物學性質(例如，增加之親和力、降低之免疫原性)中具有修飾(例如，改良)及/或實質上保持親代抗體之某些生物學性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地(例如)使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如彼等本文所闡述者)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗體展示於噬菌體上並篩選具體生物學活性(例如結合親和力)。
可對HVR作出變化(例如，取代)以(例如)改良抗體親和力。該等改變可在HVR「熱點」(即，由在體細胞成熟過程期間發生高頻突變之密碼子編碼之殘基)(例如，參見Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)及/或SDR(a-CDR)中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由自二級文庫構築及重新選擇來達成親和力成熟已闡述於(例如)Hoogenboom,H.R.等人，Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之誘變)中之任一者將多樣性引入所選用於成熟之可變基因中。然後建立二級文庫。然後篩選文庫以鑑別具有期望親和力之任一抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可特異性地鑑別(例如，使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。具體而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要該等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可對HVR作出不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，本文所提供之保守取代)。該等改變可位於HVR「熱點」或SDR外部。在上文所提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
可用於鑑別抗體上可靶向誘變之殘基或區域之方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham,B.C.及Wells,J.A.,Science,244(1989)1081-1085所闡述。在此方法中，已鑑別殘基或靶殘基組(例如，帶電殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)，並經中性或帶負電之胺基酸(例如，丙胺酸或多丙胺酸)替代以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。另一選擇為或另外，抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原間之接觸點。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其排除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。
胺基酸序列插入包含胺基-及/或羧基端融合物(長度介於一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。端插入之實例包含具有N-端甲二磺醯殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包含酶(例如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期之多肽與抗體N端或C端之融合物。
b)糖基化變體
在某些實施例中，改變本文所提供之抗體以增加或降低抗體發生糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列以產生或去除一或多個糖基化位點來便利地達成抗體糖基化位點的添加或缺失。
若抗體包括Fc區，則其所附接之碳水化合物可有所改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包括具支鏈、二分枝寡糖，其通常藉由N-連接附接至Fc區之CH2結構域的Asn297。例如，參見Wright,A.及Morrison,S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32。寡糖可包含多種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及附接至雙觸角寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具有某些改良性質之抗體變體。
在一實施例中，提供具有缺乏附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變體。例如，此抗體中岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖之量係藉由計算糖鏈內Asn297處之岩藻糖相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複雜、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來測定，如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，如(例如)WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區中約位置297處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，因抗體中具有微小序列變化，故Asn297亦可位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，即，介於位置294與位置300之間。該等岩藻糖基化變體可具有經改良ADCC功能。例如，參見US 2003/0157108；US 2004/0093621。關於「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體變體之公開案之實例包含：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包含缺乏蛋白岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka,J.等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其實例11)及基因敲除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因敲除CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；及WO 2003/085107)。
進一步提供二等分寡糖之抗體變體，例如，其中附接至抗體Fc 區之二分枝寡糖由GlcNAc二等分。該等抗體變體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變體之實例闡述於例如WO 2003/011878、美國專利第6,602,684號及US 2005/0123546中。亦提供在寡糖中至少一個半乳糖殘基附接至Fc區之抗體變體。該等抗體變體可具有經改良之CDC功能。該等抗體變體闡述於例如WO 1997/30087、WO 1998/58964及WO 1999/22764中。
c)Fc區變體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此產生Fc區變體。Fc區變體可包括人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包括胺基酸修飾(例如取代)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些(但非全部)效應子功能之抗體變體，此情況使其成為許多應用之合意候選物，在該等應用中抗體之活體內半衰期至關重要，但某些效應子功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。例如，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於調介ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現匯總於Ravetch,J.V.及Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492之第464頁之表3中。用以評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063)及Hellstrom,I.等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。另一選擇為，可採用非放射性分析方法(例如，參見用於流 式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。可用於該等分析之效應子細胞包含外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。另一選擇為或另外，可在活體內評估所關注分子之ADCC活性，例如，在諸如Clynes,R.等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中所揭示之動物模型中。亦可實施Clq結合分析以確認抗體無法結合Clq且因此缺乏CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA。 為評估補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro,H.等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006：1759-1769)。
具有降低效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包含在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包含殘基265及297經丙胺酸取代之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有改良或降低之與FcR之結合的某些抗體變體。(例如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)
在某些實施例中，抗體變體包括具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如，在Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號)。
在一些實施例中，Fc區中有所改變，從而改變(即，改良或減小)Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，如(例如)美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所闡述。
具有延長之半衰期及改良之與新生Fc受體(FcRn，其負責將親代IgG轉移至胎兒中，Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593及Kim,J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)之結合的抗體闡述於US 2005/0014934中。彼等抗體包括具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。該等Fc變體包含彼等在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變體之其他實例亦參見Duncan,A.R.及Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸改造之抗體變體
在某些實施例中，可能期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在具體實施例中，經取代殘基於抗體之可及位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫偶聯物，如本文進一步所闡述。在某些實施例中，下列殘基中之任一個或多個可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)、重鏈之A118(EU編號)及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所闡述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供之抗體，以含有業內已知且易於獲得之額外非蛋白質性部分。適用於衍生抗體之部分包含(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包含(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數目可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。通常，衍生化所使用聚合物之數量及/或類型可根據包含(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：欲改良抗體之具體性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。
在另一實施例中，提供抗體及非蛋白性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一實施例中，非蛋白性部分係碳奈米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包含(但不限於)以下波長之輻射：其不危害正常細胞，但將非蛋白性部分加熱至將毗鄰抗體-非蛋白性部分之細胞殺死之溫度。
B. 重組方法及組合物
可使用重組方法及組合物來產生抗體，例如，如美國專利第4,816,567號中所闡述。在一實施例中，提供本文所闡述之編碼抗HER3/HER4抗體之經分離核酸。該核酸可編碼抗體中包括VL之胺基酸序列及/或包括VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在又一實施例中，提供一或多個包括該核酸之載體(例如，表現載體)。 在又一實施例中，提供包括該核酸之宿主細胞。在一該實施例中，宿主細胞包括以下物質(例如，已經該等物質轉化)：(1)包括如下核酸之載體：其編碼包括抗體之VL之胺基酸序列及包括抗體之VH之胺基酸序列，或(2)包括編碼包括抗體之VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包括編碼包括抗體之VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一實施例中，提供製造抗HER3/HER4抗體之方法，其中該方法包括在適於表現抗體之條件下培養包括編碼如上文所提供抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
對於抗HER3/HER4抗體之重組產生，分離(例如)如上文所闡述之編碼抗體之核酸並將其插入一或多個載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸可使用習用程序容易地分離出來並定序(例如，藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)。
用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包含本文所闡述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，尤其在無需糖基化及Fc效應子功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523(亦參見Charlton,K.A.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編輯)，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。表現後，可自細菌細胞團以可溶部分形式分離出抗體且可進一步純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母菌等真核微生物亦係用於抗體編碼載體之適宜選殖或表現宿主，包含糖基化途徑已經「人類化」從而產生具有部分或全部人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌 菌株。參見Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
適用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦源自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包含植物及昆蟲細胞。已確定多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述產生轉基因植物中之抗體之PLANIBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，可使用適於懸浮液生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係由SV40轉化之猴腎CV1系(COS-7)；人類胚腎系(293或293細胞，如(例如)Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所闡述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠支持細胞(TM4細胞，如(例如)Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所闡述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如)Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所闡述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包含DHFR- CHO細胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述參見例如Yazaki,,P.及Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編輯)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268頁。
C. 分析及抗體選擇方法
可藉由業內已知之各種分析來鑑別本文所提供之抗HER3/HER4抗體(或抗原結合蛋白)，篩選或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。
本發明之一態樣係用於選擇結合至人類HER3且結合至人類HER4之抗體(或抗原結合蛋白)之方法，其中該抗體(或抗原結合蛋白)在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合；其中a)至少一種選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：1；及b)至少一種選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：2；係用於(在結合分析中)選擇抗體(或抗原結合蛋白)，其顯示結合至a)之至少一種多肽及b)之至少一種多肽二者
且藉此選擇在胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)(在人類HER3內)及胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)(在人類HER4內)內結合之抗體(或抗原結合蛋白)。
在一實施例中，該選擇方法進一步包括使用選自由以下組成之群之多肽(測試與多肽之結合)複篩所選抗體(或抗原結合蛋白)之步驟：
SEQ ID NO：14 TtSlyD-野生型
SEQ ID NO：15 TtSlyDcas
SEQ ID NO：16 TgSlyD△IF
以確認所選抗體(或抗原結合蛋白)並未結合至不包括胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)或胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)之多肽支架。
本發明提供藉由該選擇方法獲得之抗體(或抗原結合蛋白)。
一種用於選擇特異性結合至人類HER3及人類HER4之抗體(或抗原結合蛋白)之方法，其包括以下步驟：a)測定複數個抗體(或抗原結合蛋白)與具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之HER3之β-髮夾結構之結合親和力，藉此HER3之β-髮夾結構呈現為選自由以下組成之群之多肽：i)SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，ii)SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，iii)SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，iv)SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及v)SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，其包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之HER3之β-髮夾結構，b)選擇表觀複合物穩定性大於預定臨限位準之抗體；c)測定步驟b)下所選抗體(或抗原結合蛋白)與具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之HER4之β-髮夾結構的結合親和力，藉此HER4之β-髮 夾結構呈現為選自由以下組成之群之多肽：i)SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，ii)SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，iii)SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及iv)SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，其包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之HER4之β-髮夾結構，d)選擇表觀複合物穩定性大於預定臨限位準之抗體(或抗原結合蛋白)。
1. 結合分析及其他分析
在一態樣中，藉由例如已知方法(例如ELISA、西方墨點，包含表面電漿子共振(例如BIACORE)等)測試本發明抗體(或抗原結合蛋白)之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與M-05-74競爭結合HER3及/或至HER4之抗體。在某些實施例中，該競爭抗體結合至M-05-74所結合之相同表位(例如，線性或構型表位)。用於定位抗體結合之表位之詳細實例性方法提供於Morris,G.E.(編輯)，Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology，第66卷，Humana Press,Totowa,NJ(1996)中。其他方法詳細闡述於使用CelluSpotTM技術之實例4中。
在實例性競爭分析中，在包括分別結合至HER3或HER4之第一標記抗體(例如M-05-74)及第二未經標記抗體之溶液中培育經固定HER3或HER4，其中測試該第二未經標記抗體與該第一抗體競爭結合HER3或HER4之能力。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包括第一標記抗體但不包括第二未經標記抗體之溶液中培育經固定HER3或HER4。在允許第一抗體結合至HER3或HER4之條件下培育後，去除過量未結合之抗體，且量測與經固定HER3或HER4締合之標 記之量。若與經固定HER3或HER4締合之標記之量在測試樣品中相對於對照樣品實質上有所減少，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合HER3或HER4。參見Harlow,E.及Lane,D.,Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1988)。
2. 活性分析
在一態樣中，提供分析以鑑別其具有生物活性之抗HER3/HER4抗體(或抗原結合蛋白)。生物活性可包含例如抑制HER3(或HER4)磷酸化、抑制表現或過表現HER3及/或HER4之癌細胞之癌細胞增殖、抑制HER3/HER2異源二聚化、藉助FACS分析之(時間依賴性)內化、表現或過表現異種移植之HER3及/或HER4之癌細胞的異種移植物動物(例如小鼠或大鼠)模型中之活體內腫瘤生長抑制。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體。
在某些實施例中，測試本發明抗體之該生物活性。針對指定生物活性之實例性活體外或活體內分析闡述於實例2e、實例3、實例5至9及實例11中。
D. 免疫偶聯物
本發明亦提供包括偶聯至一或多種細胞毒性劑之本文所闡述抗HER3/HER4抗體(或抗原結合蛋白)之免疫偶聯物，該等細胞毒性劑係(例如)化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一實施例中，免疫偶聯物係抗體-藥物偶聯物(ADC)，其中抗體偶聯至一或多種藥物，該等藥物包含(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見US 5,208,020、US 5,416,064及EP 0 425 235 B1)；奧裏斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裏斯他汀藥物部分DE及 DF(MMAE及MMAF)(參見US 5,635,483、US 5,780,588及US 7,498,298)；朵拉斯達汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001及US 5,877,296；Hinman,L.M.等人，Cancer Res.53(1993)3336-3342；及Lode,H.N.等人，Cancer Res.58(1998)2925-2928)；艾達黴素(anthracycline)，例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(參見Kratz,F.等人，Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等人，Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D.等人，J.Med.Chem.45(20029 4336-4343；及美國專利第6,630,579號)；胺甲蝶呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷，例如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇、拉羅他塞(larotaxel)、特西他塞(tesetaxel)及歐他紫杉烷(ortataxel)；單端孢黴烯；及CC1065。
在另一實施例中，免疫偶聯物包括如本文所闡述偶聯至酶促活性毒素或其片段之抗體，該酶促活性毒素或其片段包含(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲裂吉菌素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族毒素(tricothecene)。
在另一實施例中，免疫偶聯物包括如本文所闡述偶聯至假單胞菌外毒素A或其變體之抗體。假單胞菌外毒素A或其變體闡述於例如WO2011/32022、WO2009/32954、WO2007/031741、WO2007/016150、WO2005/052006及Liu W等人，PNAS 109(2012)11782-11787中。
在另一實施例中，免疫偶聯物包括如本文所闡述偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。實例包含At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。在使用放射性偶聯物來檢測時，其可包括用於閃爍法研究之放射性原子，例如TC99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記，例如碘-123(同上)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之偶聯物可以下列方式製造：a)使用重組表現技術(例如用於在例如大腸桿菌中表現融合至Fab或Fv抗體片段之基於胺基酸序列之毒素)或b)使用多肽偶合技術(如基於胺基酸序列之毒素至Fab或Fv抗體片段的基於分選酶之偶合)或c)使用眾多種雙功能蛋白偶合劑，例如3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、亞胺基硫(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta,E.S.等人，Science 238(1987)1098-1104中所闡述來製備。經碳-14-標記之1-異硫氰酸苄基-3-甲基二 伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於偶聯放射性核苷酸與抗體之實例性螯合劑。參見WO 94/11026。連接體可為促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接體」。例如，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含有二硫化物之連接體(Chari,R.V.等人，Cancer Res.52(1992)127-131；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫偶聯物或ADC明確涵蓋(但不限於)該等使用以下交聯劑試劑製備之偶聯物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB以及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑可自市面購得(例如，購自Pierce Biotechnology公司，Rockford,IL.,U.S.A)。
E. 用於診斷及檢測之方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供之任一抗HER3/HER4抗體(或抗原結合蛋白)可用於分別檢測生物樣品中HER3及/或HER4之存在。如本文所使用之術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物學樣品包括細胞或組織，例如腫瘤組織。
在一實施例中提供用於診斷或檢測方法中之抗HER3/HER4抗體。在又一態樣中提供分別檢測生物樣品中HER3或HER4之存在之方法。在某些實施例中，該方法包括在允許抗HER3/HER4抗體分別結合至HER3或HER4之條件下使用如本文所闡述之抗HER3/HER4抗體接觸生物樣品，及檢測是否分別在抗HER3/HER4抗體與HER3或HER4之間形成複合物。該方法可為活體外或活體內方法。在一實施例中，使用抗HER3/HER4抗體選擇適於抗HER3/HER4抗體療法之個體，例如其中HER3及HER4二者分別係用於選擇患者之生物標記。
可使用本發明抗體診斷之實例性病症包含癌症。
在某些實施例中提供標記之抗HER3/HER4抗體。標記包含(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包含(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯、傘形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶聯)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。
F. 醫藥調配物
如本文所闡述之抗HER3/HER4抗體(或抗原結合蛋白)之醫藥調配物係藉由混合具有期望純度之該抗體與一或多種醫藥上可接受之可選載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編輯)(1980))以凍乾調配物或水溶液形式製備。醫藥上可接受之載劑通常在所採用劑量及濃度下對接受者無毒，且包含(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯化苄烷銨；氯化苄甲乙氧銨；酚類、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚 乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包含間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rhuPH20(HYLENEX®,Baxter International公司)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包含rhuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，將sHASEGP與一或多種額外糖胺多糖酶(例如軟骨素酶)組合。
實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包含彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO 2006/044908中者，後一些調配物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文調配物亦可視所治療之具體適應症之需要含有一種以上活性成份。
活性成份可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或界面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或粗滴乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編輯)(1980)中。
亦可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包含含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如，膜或微膠囊。
欲用於活體內投與之調配物通常無菌。無菌性可藉由(例如)使用無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。
G. 治療方法及組合物
本文所提供之抗HER3/HER4抗體(或抗原結合蛋白)或抗HER3/HER4抗體(或抗原結合蛋白)偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物中之任一者皆可用於治療方法中。
在一態樣中，提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物，其用作藥劑。在其他態樣中，提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物，其用於治療癌症。在某些實施例中，提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物，其用於治療方法中。在某些實施例中，本發明提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物用於治療患有癌症之個體之方法中，該方法包括向個體投與有效量之抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物。在其他實施例中，本發明提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物，其用於誘導癌細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。在某些實施例中，本發明提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物用於在個體中誘導癌細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖之方法中，該方法包括向個體投與有效量之抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物以誘導癌細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。任一上述實施例之「個體」較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性劑之免疫偶聯物之用途，其用於製造或製備藥劑。在一實施例中，該醫藥係用於治療癌症。在另一實施例中，該藥劑用於治療癌症之方法中，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之藥劑。在又一實施例中，該藥劑用於誘導癌細胞凋亡/或抑制癌細 胞增殖。在又一實施例中，該藥劑用於在患有癌症之個體中誘導癌細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖之方法，該方法包括向個體投與有效量之藥劑以誘導癌細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。任一上述實施例之「個體」可為人類。
在又一態樣中，本發明提供用於治療癌症之方法。在一實施例中，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之抗HER3/HER4抗體。任一上述實施例之「個體」可為人類。
在又一態樣中，本發明提供用於在患有癌症之個體中誘導癌細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖之方法。在一實施例中，該方法包括向個體投與有效量之抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體偶聯至細胞毒性化合物之免疫偶聯物以在患有癌症之個體中誘導癌細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。在一實施例中，「個體」係人類。
在又一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包括本文所提供之任一種抗HER3/HER4抗體以(例如)用於任一上述治療方法中。在一實施例中，醫藥調配物包括本文所提供之任一種抗HER3/HER4抗體及醫藥上可接受之載劑。
本發明抗體(及任一額外治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包含非經腸、肺內及鼻內、以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包含肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑給藥，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，此部分地端視投與時間長短而定。本文涵蓋各種投藥方案，包含(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
本發明抗體應以符合良好醫療實踐之方式調配、調劑及投與。在此上下文中需考慮之因素包含所治療之具體病症、所治療之具體哺乳動物、個體患者之臨床病況、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。抗體不必(但視情況)與一 或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量端視調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型以及上文所討論之其他因素而定。該等藥劑通常以相同劑量且以如本文所闡述之投與途徑、或本文所闡述之約1%至99%之劑量、或以經驗/臨床確定為合適之任一劑量及任一途徑使用。
對疾病之預防或治療而言，本發明抗體之合適劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)應端視欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體係一次性或經一系列治療以適當方式投與患者。 端視疾病之類型及嚴重程度，不論(例如)係藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注來投與，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)抗體可係投與患者之初始候選劑量。端視上述因素而定，一種典型日劑量可介於約1μg/kg至100mg/kg範圍內或更高。在經若干天或更長時間重複投與時，端視病況而定，治療通常持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體之一種實例性劑量可介於約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此，可投與患者約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其組合)之一或多個劑量。該等劑量可間歇性投與，例如每週一次或每三週一次(例如，以使患者接受約兩個至約20個、或例如約6個劑量之抗體)。可在開始時投與較高負荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。實例性給藥方案包括投與約4mg/kg之初始負荷劑量，然後每週維持約2mg/kg抗體之劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可容易地藉由習用技術及分析來監測。
應理解，可使用本發明之免疫偶聯物替代抗HER3/HER4抗體或與其一起來實施任一上述調配物或治療方法。
III. 製品
在本發明另一態樣中提供含有用於治療、預防及/或診斷上文所闡述病症之材料的製品。該製品包括容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包含(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合時可有效治療、預防及/或診斷病況之組合物，且可具有無菌存取通道(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該組合物中至少一種活性劑係本發明抗體。標記或包裝插頁指示該組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包括(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包括本發明抗體；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包括另一細胞毒性劑或治療劑。本發明此實施例中之製品可進一步包括指示組合物可用於治療具體病狀之包裝插頁。另一選擇為或另外，該製品可進一步包括第二(或第三)容器，該容器包括醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可另外包含自商業及使用者角度來看期望之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾膜、針及注射器。
應理解，上述製品中之任一者皆可包含本發明免疫偶聯物來替代抗HER3/HER4抗體或與其一起使用。
胺基酸序列說明
SEQ ID NO：1 人類HER3之β-髮夾結構
SEQ ID NO：2 人類HER4之β-髮夾結構
SEQ ID NO：3 人類HER3
SEQ ID NO：4 人類HER3細胞外結構域(ECD)
SEQ ID NO：5 人類HER4
SEQ ID NO：6 人類HER4細胞外結構域(ECD)
SEQ ID NO：7 人類HER1
SEQ ID NO：8 人類HER1細胞外結構域(ECD)
SEQ ID NO：9 人類HER2
SEQ ID NO：10 人類HER2細胞外結構域(ECD)
SEQ ID NO：11 人類神經生長因子片段(HRG)
SEQ ID NO：12 人類神經生長因子β-1片段(如Preprotech所提供)
SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3
SEQ ID NO：14 TtSlyD-野生型
SEQ ID NO：15 TtSlyDcas
SEQ ID NO：16 TgSlyD△IF
SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3
SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3
SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3
SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3
SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4
SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4
SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4
SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4
SEQ ID NO：25 重鏈HVR-H1，M-05-74
SEQ ID NO：26 重鏈HVR-H2，M-05-74
SEQ ID NO：27 重鏈HVR-H3，M-05-74
SEQ ID NO：28 輕鏈HVR-L1，M-05-74
SEQ ID NO：29 輕鏈HVR-L2，M-05-74
SEQ ID NO：30 輕鏈HVR-L3，M-05-74
SEQ ID NO：31 重鏈可變結構域VH，M-05-74
SEQ ID NO：32 輕鏈可變結構域VL，M-05-74
SEQ ID NO：33 重鏈可變結構域VH之人類化變體1，M-05- 74_VH1
SEQ ID NO：34 重鏈可變結構域VH之人類化變體2，M-05-74_VH2
SEQ ID NO：35 重鏈可變結構域VH之人類化變體3，M-05-74_VH3
SEQ ID NO：36 輕鏈可變結構域VL之人類化變體1，M-05-74_VL1
SEQ ID NO：37 輕鏈可變結構域VL之人類化變體2，M-05-74_VL2
SEQ ID NO：38 HVR-H1之人類化變體1，M-05-74_HVR-H1_V1
SEQ ID NO：39 HVR-H2之人類化變體1，M-05-74_HVR-H2_V1
SEQ ID NO：40 HVR-L1之人類化變體1，M-05-74_HVR-L1_V1
SEQ ID NO：41 HVR-L2之人類化變體1，M-05-74_HVR-L2_V1
SEQ ID NO：42 HVR-L2之人類化變體2，M-05-74_HVR-L2_V2
SEQ ID NO：43 人類HER3之β-髮夾結構內之結合表位
SEQ ID NO：44 人類HER4之β-髮夾結構內之結合表位
SEQ ID NO：45 假單胞菌外毒素變體PE24LR8M_3G(包含GGG連接體)
SEQ ID NO：46 M-05-74之輕鏈(M-05-74_LC)
SEQ ID NO：47 具有分選酶標籤之M-05-74 HC之重鏈(M-05-74_HC)
SEQ ID NO：48 偶聯至假單胞菌外毒素變體PE24LR8M之M-05-74 HC之重鏈(Fab-074-PE重鏈1)
SEQ ID NO：49 作為直接PE24LR8M融合物之偶聯至假單胞菌外毒素變體PE24LR8M之M-05-74 HC之重鏈(Fab-074-PE重鏈2)
SEQ ID NO：50 可溶性金黃色葡萄球菌分選酶A
SEQ ID NO：51 重鏈可變結構域VH，<Her3>M-08-11
SEQ ID NO：52 輕鏈可變結構域VL，<Her3>M-08-11
SEQ ID NO：53 人類κ輕鏈恆定區
SEQ ID NO：54 人類λ輕鏈恆定區
SEQ ID NO：55 源自IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：56 源自L234A及L235A突變之IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：57 源自L234A、L235A及P329G突變之IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：58 源自IgG4之人類重鏈恆定區
提供以下實例及圖以幫助理解本發明，本發明之實際範疇陳述於隨附申請專利範圍中。應理解，可在不偏離本發明之精神下對所述程序作出修改。
下文列示本發明之若干實施例：
1.一種用於選擇結合至人類HER3且結合至人類HER4之抗原結合蛋白之方法，其中該抗原結合蛋白在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合；其中a)至少一種選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3， 其包括胺基酸序列SEQ ID NO：1；及b)至少一種選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：2；係用於選擇抗原結合蛋白，其顯示結合至a)之至少一種多肽及b)之至少一種多肽二者
且藉此選擇在胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)及胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合之抗原結合蛋白。
2.一種抗原結合蛋白，其係藉由如實施例1之選擇方法獲得。
3.如實施例1之方法或如實施例2之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體。
4.一種結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合。
5.如實施例3之抗原結合蛋白
a)其中該抗原結合蛋白結合至多肽SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，且b)其中該抗原結合蛋白結合至多肽SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4。
6.如實施例4或5之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體。
7.一種結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗體，其中該抗體具有一或多個以下性質：a)該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：1；及/或b)該抗體結合至活化HER3中之胺基酸序列SEQ ID NO：1；及/或c)該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；及/或d)該抗體結合至HER3之β-髮夾結構區域；及/或e)該抗體抑制HER3/HER2異源二聚體之異源二聚化；及/或f)該抗體結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為4.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))；及/或g)該抗體結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為2.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))；及/或h)該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或i)該抗體結合至活化HER4中之胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或 j)該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；及/或k)該抗體結合至HER4之β-髮夾結構區域；及/或l)該抗體結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為20.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))；及/或m)該抗體結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為5.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))；及/或n)該抗體作為單價Fab片段顯示與其二價全長親代抗體相比相同或更高的生物活性；及/或o)該抗體抑制MCF-7細胞中之HER3磷酸化；及/或p)該抗體並不與神經生長因子競爭結合HER3/誘導神經生長因子結合至HER3；及/或q)該抗體抑制MDA-MB-175腫瘤細胞之增殖；及/或r)該抗體顯示活體內之腫瘤生長抑制活性；及/或s)該抗體以KD值1×10-8M之親和力結合至HER3-ECD；及/或t)該抗體以KD值1×10-8M之親和力結合至HER4-ECD；及/ 或u)該抗體結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽及由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；及/或v)該抗體結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽；及/或w)該抗體結合至由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；及/或x)該抗體在FACS分析中結合至表現HER3之T47D細胞；且其中在抗體暴露1h後量測時，該抗體顯示與神經生長因子不存在下之內化百分比相比，在神經生長因子存在下之內化百分比高至少25%。
8.一種結合至人類HER3且結合人類HER4之抗體，其中該抗體結合至包括(人類HER3之)胺基酸序列VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)之長度為15個胺基酸之多肽及包括(人類HER4之)胺基酸序列VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之長度為15個胺基酸之多肽。
9.如實施例6至8中任一者之抗體，其係人類、人類化或嵌合抗體。
10.如實施例6至8中任一者之抗體，其係結合人類HER3且結合人類HER4之抗體片段。
11.如實施例6至8中任一者之抗體，其中該抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
12.如請求項6至8或11中任一項之抗體，其包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
13.如實施例6至8中任一者之抗體，其中該抗體包括i)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1； (b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；ii)或i)(a)、(b)、(d)及/或(e)抗體之HVR的人類化變體。
14.如實施例6至8或13中任一者之抗體，其中該抗體包括i)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或ii)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或iii)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或iv)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1； (b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
15.如實施例6至8中任一者之抗體，其包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：33具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：36具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
16.如實施例15之抗體，其包括SEQ ID NO：33之VH序列。
17.如實施例135之抗體，其包括SEQ ID NO：36之VL序列。
18.一種抗體，其包括SEQ ID NO：33之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列。
19.如實施例6至8中任一者之抗體，其包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：33具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：37具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
20.如實施例19之抗體，其包括SEQ ID NO：33之VH序列。
21.如實施例19之抗體，其包括SEQ ID NO：37之VL序列。
22.一種抗體，其包括SEQ ID NO：33之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列。
23.如實施例6至8中任一者之抗體，其包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：34具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：36具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
24.如實施例23之抗體，其包括SEQ ID NO：34之VH序列。
25.如實施例23之抗體，其包括SEQ ID NO：36之VL序列。
26.一種抗體，其包括SEQ ID NO：34之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列。
27.如實施例6至8中任一者之抗體，其包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：34具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：37具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
28.如實施例27之抗體，其包括SEQ ID NO：34之VH序列。
29.如實施例27之抗體，其包括SEQ ID NO：37之VL序列。
30.一種抗體，其包括SEQ ID NO：34之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列。
31.如實施例6至8中任一者之抗體，其包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：35具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：36具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
32.如實施例31之抗體，其包括SEQ ID NO：35之VH序列。
33.如實施例31之抗體，其包括SEQ ID NO：36之VL序列。
34.一種抗體，其包括SEQ ID NO：35之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列。
35.如實施例6至8中任一者之抗體，其包括(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：35具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：37具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
36.如實施例35之抗體，其包括SEQ ID NO：35之VH序列。
37.如實施例35之抗體，其包括SEQ ID NO：37之VL序列。
38.一種抗體，其包括SEQ ID NO：35之VH序列及SEQ ID NO：37 之VL序列。
39.如實施例6至38中任一者之抗體，其係全長IgG1抗體或IgG4抗體。
40.如實施例6至38中任一者之抗體，其為Fab片段。
41.一種經分離核酸，其編碼如實施例6至38中任一者之抗體。
42.一種宿主細胞，其包括如實施例41之核酸。
43.一種產生抗體之方法，其包括培養如實施例42之宿主細胞以產生該抗體，及自該細胞培養物或細胞培養物上清液回收該抗體。
44.一種免疫偶聯物，其包括如實施例6至38中任一者之抗體及細胞毒性劑。
45.一種醫藥調配物，其包括如實施例6至38中任一者之抗體或如實施例44之免疫偶聯物及醫藥上可接受之載劑。
46.如實施例6至38中任一者之抗體或如實施例44之免疫偶聯物，其用作藥劑。
47.如實施例6至38中任一者之抗體或如實施例44之免疫偶聯物，其用於治療癌症。
48.如實施例6至38中任一者之抗體，其用於抑制HER3/HER2二聚化。
49.一種如實施例6至38中任一者之抗體或如實施例44之免疫偶聯物之用途，其用於製造藥劑。
50.如實施例49之用途，其中該藥劑用於治療癌症。
51.如實施例49之用途，其中該藥劑用於抑制HER3/HER2二聚化。
52.一種治療患有癌症之個體之方法，其包括向個體投與有效量之如前述實施例中任一者之抗體或包括如前述實施例中任一者之抗體及細胞毒性劑的免疫偶聯物。
53.一種誘導患有癌症之個體之癌細胞凋亡之方法，其包括向個體投與有效量之包括如前述實施例中任一者之抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物，藉此誘導個體之癌細胞凋亡。
54.一種多肽，其選自由以下組成之群：i)SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，ii)SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，iii)SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，iv)SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及v)SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，該多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO：1
55.一種多肽，其選自由以下組成之群：i)SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，ii)SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，iii)SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及iv)SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，該多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO：2
實例： 材料及一般方法 重組DNA技術
如以下文獻中所闡述使用標準方法來操作DNA：Sambrook,J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989。根據製造商說明書使用分子生物學試劑。
基因合成
期望基因區段係自由化學合成製造之寡核苷酸製備。側接單數限制性內切酶裂解位點之400-1600bp長的基因區段係藉由以下方式 來組裝：退火並連接寡核苷酸(包含PCR放大)及隨後經由所指示限制性位點(例如EcoRI/BlpI或BsmI/XhoI)選殖至下文所闡述之表現載體中。藉由DNA測序確認亞選殖基因片段之DNA序列。根據Geneart(Regensburg,Germany)之給定說明書定購基因合成片段。
DNA序列測定
藉由Sequiserve GmbH(Vaterstetten,Germany)實施之雙鏈測序來測定DNA序列。
DNA及蛋白質序列分析及序列數據管理
Infomax之Vector NT1 Advance suite第11.5.0版用於序列產生、定位、分析、註解及闡釋。
實例1 抗原及篩選蛋白之製備-用於選擇結合至HER3之β-髮夾結構及HER4之β-髮夾結構之抗體的功能性β-髮夾結構HER3及β-髮夾結構HER4構築物之產生
為產生功能性β-髮夾結構HER3及HER4構築物，將HER3(SEQ ID NO：1)及HER4(SEQ ID NO：2)之β-髮夾結構之胺基酸序列移植至包括FKBP結構域之SlyD多肽框架中。在該等構築物中，與HER3或HER4之天然未活化構型中之隱蔽結構(在如(例如)HRG等配體不存在下)(參見圖1c及圖1d，其中HER3之β-髮夾結構隱蔽)相反，可自由到達經移植之β-髮夾結構。
可藉由使用幾乎一致的方案來純化並再摺疊所有融合SlyD多肽。使轉化有具體表現質體之大腸桿菌BL21(DE3)細胞在37℃下在含有用於選擇性生長之各別抗生素(康黴素(Kanamycin)30μg/ml或氨苄青黴素(Ampicillin)(100μg/ml))之LB培養基中生長至OD600為1.5，且藉由添加1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導細胞溶質過表現。誘導後3小時，藉由離心(5,000g下20min)收穫細胞，冷凍且儲存 在-20℃下。為使細胞溶解，將冷凍沈澱物重懸於補充有7M GdmCl及5mM咪唑之50mM冷磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)中。此後在冰上將懸浮液攪拌2-10小時以完成細胞溶解。離心(25,000g,1h)並過濾(硝酸纖維素膜，8.0μm,1.2μm,0.2μm)後，將溶解物施加至經溶解緩衝液平衡之Ni-NTA管柱上。在隨後洗滌步驟中，將咪唑濃度升高至10mM(存於包括7M GdmCl之50mM磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)中)且添加5mM TCEP以使硫醇部分保持還原形式且防止早熟的二硫化物橋接。施加至少15至20體積還原性洗滌緩衝液。此後，藉由包括100mM NaCl、10mM咪唑及5mM TCEP之50mM磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)替代GdmCl溶液以誘導基質結合之SlyD融合多肽之構型再摺疊。為避免共純化之蛋白酶再活化，將蛋白酶抑制劑混合物(Complete® EDTA-free，Roche)添加至再摺疊緩衝液中。在過夜程序中施加總共15至20管柱體積之再摺疊緩衝液。此後，藉由用包括100mM NaCl及10mM咪唑之10管柱體積50mM磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)洗滌來去除TCEP及Complete® EDTA-free抑制劑混合物二者。在最後洗滌步驟中，將咪唑濃度升高至30mM(10管柱體積)以去除黏性污染物。然後藉由施加存於相同緩衝液中之250mM咪唑溶析再摺疊多肽。藉由三(羥甲基)甲基甘胺酸-SDS-PAGE評估含有蛋白質之流份之純度(Schaegger,H.及von Jagow,G.,Anal.Biochem.166(1987)368-379)。隨後，使用磷酸鉀緩衝液系統(50mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)、100mM KCl、0.5mM EDTA)使蛋白經歷粒徑排阻層析(SuperdexTM HiLoad,Amersham Pharmacia)。最終，彙集含有蛋白質之流份並在Amicon cell(YM10)中濃縮至約5mg/ml之濃度。TtSlyD-FKBP-Her3之Ni-NTA純化之實例性SDS-PAGE分析顯示於圖3中且嗜熱棲熱菌SlyD-FKBP-Her-3之Ni-NTA純化流份之SEC溶析曲線顯示於圖4中。嗜熱棲熱菌SlyD(TtSlyD)-Her-3融合多肽可成功地純化為呈其單體形式之可溶且穩定的多肽。自流份12及流 份13之16.4mg純化蛋白量化最終產量。
表2：所研發之基於SlyD之表位支架(其攜載呈插入物形式之HER3二聚化結構域片段(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))或呈插入物形式之HER4二聚化結構域片段(HER4之β-髮夾結構(SEQ ID NO：2)))之胺基酸序列的概述.
TtSlyD-FKBP-Her3、TtSlyDcas-Her3、TtSlyDcys-Her3、伽馬特蘭熱球菌(Thermococcus gammatolerans)TgSlyDser-Her3及TgSlyDcys-Her3攜載呈插入物形式之Her3二聚化結構域片段(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))且用作免疫原及ELISA篩選中之陽性對照。
使用TtSlyD-野生型、TtSlyDcas、TgSlyD△IF作為ELISA篩選中之陰性對照(不含呈插入物形式之Her3二聚化結構域片段(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))或Her4二聚化結構域片段(HER4之β-髮夾結構(SEQ ID NO：2)))。
TtSlyDcas-Her4、TtSlyDcys-Her4、TgSlyDser-Her4及TgSlyDcys-Her4(其攜載呈插入物形式之Her4二聚化結構域片段(HER4之β-髮夾結構(SEQ ID NO：2)))用於ELISA篩選中以檢查所發展純系之HER4交叉反應性。
由於表位支架在大腸桿菌中有所表現，故可存在或不存在N端甲硫胺酸殘基。(Nt=N端；Ct=C端)
實例2 a)HER3抗體之免疫接種法及選擇
為產生針對HER3及HER4之β-髮夾結構之抗體，用不同抗原對Balb/C、NMRI或SJL小鼠實施免疫。使用以下蛋白質作為抗原：全長Her3 ECD或表位支架蛋白TtSlyD-FKBP12-Her3、TtSlyDcys-Her3、 TtSlyDcas-Her3、TgSlyDcys-Her3及TgSlyDser-Her3。TtSlyD-FKBP12-Her3變體代表第一代之表位支架，其用於產生Her3二聚化結構域特異性抗體。儘管使用第一代SlyD-FKBP12支架已可證實使用SlyD變體作為表位支架之一般原理，但亦研發出具有更高穩定性之支架之經改良變體。該等SlyD變體係源自嗜熱棲熱菌及伽馬特蘭熱球菌。
在免疫接種計畫開始後之0、6及10週時間點下使所有小鼠經歷3次免疫。在每一時間點下，用溶解於100μl PBS中之100μg不含內毒素之免疫原免疫接種每一小鼠。對於首次免疫，將免疫原與100μl CFA混合。對於第二及第三次免疫，將免疫原與IFA混合。首次及第三次免疫係經由腹膜內路徑施加，第二次免疫係經皮下施加。在使用雜交瘤技術製備用於發展出抗體之脾細胞之前2及3天，用存於100μl PBS中之12.5μg免疫原且在不含佐劑下對小鼠經靜脈內追加免疫。
效價分析
為測定針對各別免疫原及針對篩選蛋白質之血清效價，在開始免疫接種計畫後第11週收集每一小鼠之少量血清。對於ELISA，將免疫原或篩選支架蛋白固定在板表面上。固定化之Her3 ECD濃度為1μg/ml，且使用濃度為0.5μg/ml之支架蛋白TtSlyD-FKBP12-Her3、TtSlyD-FKBP12、TtSlyDcys-Her3、TtSlyDcas-Her3、TtSlyDcas、TgSlyDcys-Her3、TgSlyDser-Her3及TgSlyD△IF。使用支架蛋白TtSlyDcas及TgSlyD△IF作為陰性對照。將來自每一小鼠之血清稀釋於含有1% BSA之PBS中且將稀釋液添加至板中。在1：300、1：900、1：2700、1：8100、1：24300、1：72900、1：218700及1：656100稀釋度下測試血清。使用經HRP標記之F(ab`)2山羊抗小鼠Fcγ(Dianova)及作為受質之ABTS(Roche)來檢測結合抗體。
即使在血清滴定階段即已顯而易見，經免疫小鼠對針對Her3 β- 髮夾結構之結構域之發展出抗體。在經Her3 ECD免疫之小鼠中，此可藉由滴定其中一種含有二聚化β-髮夾結構環之支架蛋白來顯示。顯著減少的信號可由以下事實來解釋：藉由經Her3 ECD免疫而增多之大部分抗體靶向ECD內之其他部分且僅小部分結合至二聚化β-髮夾結構結構域。在經含有Her3二聚化環之支架免疫之小鼠中，靶向環之抗體部分可藉由滴定Her3 ECD(陽性對照)及滴定不含Her3插入物之對照支架(陰性對照)來顯示。
b)抗體發展及ELISA篩選/選擇
使用本文所闡述之表位支架技術原則上提供兩種用於發展出靶向Her3二聚化結構域(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))之抗體的策略。一種策略係使用全長Her3 ECD免疫並使用支架篩選二聚化結構域特異性抗體。另一策略係直接使用該支架進行免疫並使用Her3 ECD、具有另一骨架之支架或不含插入物之支架來複篩。使用雜交瘤技術藉由融合原代B-細胞與P3X63Ag8.653骨髓瘤細胞來發展出抗體。最終加強免疫後2天，殺死經免疫小鼠且製備脾細胞群。藉由使用PEG融合技術融合脾細胞與P3X63Ag8.653。在37℃下在5% CO2下將來自融合物之細胞分批培養物培育過夜。第二天，將含有融合細胞之細胞批料在400g下離心10min。此後，將細胞懸浮於補充有0.1×偶氮絲胺酸-次黃嘌呤(Sigma)之雜交瘤選擇培養基中且以2.5×104個細胞/孔之濃度接種於96孔板中。將板在37℃下在5% CO2下培養至少1週。在ELISA分析之前3天更換選擇培養基。
在針對Her3 ECD及多種支架蛋白之ELISA中測試原代培養物上清液。實施針對支架蛋白之測試以證實，所選純系結合至天然Her3 ECD之二聚化結構域β-髮夾結構。實施針對對照支架TtSlyDcas及TgSlyD△IF之測試以顯示，所選純系結合插入之Her3源序列而非支架骨架。為檢查交叉反應性，針對Her家族之其他成員(即Her1、Her2及 Her4)之全長ECD測試所得純系。如所顯示，所有所選純系皆具有針對Her3之高度特異性且可檢測到對HER4之高度特異性交叉反應性，而未檢測到對Her家族其他成員之交叉反應性。對於ELISA，使用抗原向下格式(down format)之篩選。將Her3 ECD固定在1μg/ml之濃度下且將支架蛋白TtSlyD-FKBP12-Her3、TtSlyD-FKBP12、TtSlyDcys-Her3、TtSlyDcas-Her3、TtSlyDcas、TgSlyDcys-Her3、TgSlyDser-Her3及TgSlyD△IF固定在0.5μg/ml之濃度下。將雜交瘤上清液添加至板中且在室溫下培育1h。使用經HRP標記之F(ab`)2山羊抗小鼠Fcγ(Dianova)檢測結合抗體且使用ABTS(Roche)作為HRP-受質。
表3：藉由ELISA評估所選純系. 針對支架蛋白TtSlyDcas-Her3、TtSlyDcys-Her3、TgSlyDser-Her3及TgSlyDcys-Her3及全長Her3 ECD測試該等純系以驗證其Her3二聚化結構域插入物(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))特異性。使用支架蛋白TtSlyDcas及TgSlyD△IF作為陰性對照。另外，針對Her1、Her2、Her3及Her4之全長ECD測試純系以驗證潛在交叉反應性。純系顯示結合至全長Her3 ECD且具有針對全長Her4 ECD之交叉反應性。
c)免疫組織化學
在IHC中測試所有所選純系之反應性及特異性。因此，使用分別編碼全長HER1、HER2、HER3或HER4之質體瞬時轉染HEK293細胞。轉染後2天時，收穫現在表現HER1、HER2、HER3或HER4之不同細胞系，隨後固定於福馬林(formalin)中且包埋於瓊脂糖中以產生IHC對照。於福馬林中再固定過夜後，將瓊脂糖塊包埋於石蠟中。使用未經轉染之HEK293細胞作為陰性對照且按照轉染細胞加以處理。嵌入石蠟後，使用切片機制備3μm薄切片。將切片安裝於顯微鏡載玻片上且乾燥2h。使用Ventana Benchmark XT實施免疫組織化學染色程序之所有其他步驟。對載玻片脫蠟並藉由加熱1小時來實施抗原修復。使用Ventana緩衝液CC1來進行抗原修復。使用濃度為1μg/ml之抗體。使用Ventana UltraView檢測套組來檢測結合抗體。結果顯示於圖5中。所有三個純系皆顯示結合至HER3及針對HER4之交叉反應性。無法檢測到針對HER1及HER2之交叉反應性。
d)所選抗Her3雜交瘤之DNA測序
為獲得所選雜交瘤純系之DNA序列，實施5`Race PCR。對於RT-PCR，藉由使用總RNA純化套組(Qiagen)自5×106個細胞製備總RNA。使用5`引發RACE PCR套組(Roche)實施逆轉錄及PCR。藉由凝膠電泳及隨後凝膠純化來純化自重鏈及輕鏈獲得之PCR片段。使用Topo Zero-Blunt選殖套組(Invitrogen)選殖PCR片段且轉化至勝任細胞中。提交每一雜交瘤之若干純系進行測序以獲得所選純系之共有序列。提交M-05-74 M-15-02 M-15-04進行測序，獲得用於所有3個純系之一致的VH及VL序列。以類似方式對M-15-03、M-15-05、M-15-08、M-15-09、M-15-11、M-16-01進行測序且亦獲得用於所有純系之一致的VH及VL序列。
e)藉助FACS之M-05-74之時間依賴性內化分析
在FACS中使用表現HER3之腫瘤細胞系T47D分析所選純系M-05-74與HER3之結合及HER3之內化。使用50ng重組人類神經生長因子片段(HRG)(SEQ ID NO：11)處理5×105個細胞。將包含SEQ ID NO：11之胺基酸之片段選殖於pCDNA.1載體(Invitrogen)中。根據Invitrogen所闡述之方案在FreeStyleTM 293-F細胞中表現HRG片段。(FreeStyleTM 293表現系統目錄編號K9000-01)。將經純化HRG片段溶解於20mM組胺酸、140mM NaCl(pH 6.0)中且儲存在-80C下。
使用未處理(-)細胞作為陰性對照。在神經生長因子誘導活化後不久，將1μg M-05-74添加至細胞中。在37℃下將細胞培育0、5、15、30、45、60、75、90、105、120、180或240min。培育後，將細胞立即置於冰上。用3ml FACS緩衝液將細胞洗滌一次且然後用1μgR-藻紅素山羊抗小鼠IgG(H+L)二級抗體染色30分鐘。使用FACSCantoTM流式細胞儀(BD Biosciences)實施流式細胞術。結果為在T47D細胞中M-05-74誘導之時間依賴性HER3受體內化之FACS分析。M-05-74顯示在補充或不補充重組人類神經生長因子片段(HRG)下皆結合至經表現HER3 ECD。M-05-74使Her3受體內化持續4h時間段。結果顯示於圖6中。同種型對照指示為恆定水平黑色線條。M-05-74顯示在含或不含人類神經生長因子片段(-)及(+HRG)下皆結合至經表現Her3 ECD。M-05-74使Her3受體內化持續4h時間段。同種型對照指示為恆定水平黑色線條。在HRG存在下，抗體誘導之HER3內化較快(例如1h後，當與HRG不存在下(-)之值比較時，在HRG存在下(+ HRG)HER3內化多至少25%)。
實例3 a)HER3抗體之動力學篩選/結合性質
動力學篩選係根據Schraeml等人(Schraml,M.及M.Biehl,Methods Mol Biol 901(2012)171-181)在安裝有Biacore CM5感測器之BIAcore 4000儀器上實施。在所有分析中捕獲測試抗體。該系統受軟體V1.1版控制。儀器緩衝液為HBS-EP(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)。在25℃下操作系統。使用EDC/NHS化學法根據製造商之說明書將存於10mM乙酸鈉緩衝液(pH 4.5)中之30μg/ml兔多株抗體(RAM IgG(具有Fc γ特異性之兔抗小鼠IgG)GE Healthcare)固定在流動細胞1、2、3及4中之點1、2、4及5上。使用1M乙醇胺飽和感測器。在每一流動細胞中，使用點1-2及點5-4計算參考信號，點3用作空白對照。將抗原(人類重組Her-3 ECD(68kDa)及包括HER3之β-髮夾結構肽(SEQ ID NO：1)之重組嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her3(15kDa))於補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖，Sigma)之儀器緩衝液中稀釋至150nM以阻抑非特異性結合。在其施加之前，將雜交瘤培養物上清液於儀器緩衝液中稀釋至1：5。以30μl/min之流速經2min注射稀釋混合物。監測抗體捕獲級別(CL)(以反應單位表示)。此後立即以30μl/min之流速經3min締合時間注射各別抗原。此後，經5min記錄抗體-抗原複合物解離信號。藉由以30μl/min之流速經2min注射10mM甘胺酸-HCl溶液(pH 1.7)來使感測器再生。在抗原注射即將結束之前所記錄之信號表示為滯後結合(BL)(以反應單位表示)。在解離之記錄即將結束之前所記錄之信號表示為滯後穩定性(SL)(以反應單位表示)。測定並計算解離速率常數。使用下式來計算抗體-抗原複合物穩定性(以分鐘表示)：ln(2)/60*kd。使用下式來計算莫耳比：MW(抗體)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗體)。
滯後結合(BL)代表分析物注射結束時之反應單位。在感測器表面上作為配體捕獲之抗體之量係以捕獲級別(CL)量測(以反應單位表示)。結合所測試分析物、抗體及溶液中之分析物之分子量資訊，可計算莫耳比。在感測器經組態具有適量抗體配體捕獲級別之情形下，每一抗體應能夠至少功能性結合至一種溶液中之分析物，此表示為莫 耳比MR=1.0。則莫耳比亦係分析物結合之效價模式之指標。結合兩種分析物之抗體之最高效價可為MR=2，每一種分析物具有一個Fab效價。在空間限制或功能失調分析物結合之情形下，莫耳比可指示低於化學計量之結合，如同在Her-3 ECD以其「閉合」構型經結合時之情形。莫耳比測定中之最大分析偏差為MR=0.2。
抗HER3/HER4抗體M-05-74之篩選/選擇：
在一實驗中，使用來自不同融合物之雜交瘤原代培養物來驅動動力學篩選，該等融合物係自免疫具有人類重組Her-3 ECD之小鼠獲得。目的在於選擇對Her-3異源二聚化結構域β-髮夾結構肽(SEQ ID NO：1)具有結合特異性之培養物。使用人類重組Her-3 ECD(68kDa)及包括HER3之β-髮夾結構肽(SEQ ID NO：1)之重組嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her3(15kDa)作為溶液中之抗原。陽性匹配物分類為對兩種抗原皆具有結合活性之原代培養物上清液。
表4實例性顯示原代培養物上清液，來自其之M-05-74滿足該等要求，從而指示對HER3之β-髮夾結構之表位特異性。因此，此係一種篩選結合至Her-3髮夾結構SEQ ID NO：1之抗HER3抗體之適宜方法。
表4：使用一組來自融合物之雜交瘤原代培養物自動力學篩選實驗獲得之實例性結果，其中抗體M-05-74鑑別為結合至HER3 ECD及嗜熱SlyD-Her3(thermo SlyD-Her3)構築物內之HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1)二者。
已發現，M-05-74顯示在其至人類Her-3 ECD分析物之結合中降低的莫耳比(MR=0.5)，而在其至分析物包括β-髮夾結構HER3(SEQ ID NO：1)之嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her3之結合中，M-05-74顯示經改良莫耳比(MR=1.1)，此指示具有經改良表位可及性(與人類Her-3 ECD相比)之功能性化學計量1：1結合。
b)HER3抗體M-05-74之動力學、研究M-05-74在神經生長因子(HRG)不存在及存在下之作用模式之M-205及M-208動力學
在其平衡狀態中，Her-3 ECD呈其「閉合構型」，此確實意味著異源二聚化Her-3 β-髮夾結構基序係經由與HER3 ECD結構域IV之非共價相互作用來連接(參見圖1c及圖1d)。假定，可經由在特異性Her-3神經生長因子結合位點處結合配體神經生長因子來打開「閉合」Her-3構型。此係在由Her-3 ECD結構域I及結構域III形成之Her-3界面處發生。人們認為，藉由此相互作用Her-3受體活化並轉移至其「開放構 型」(參見圖1b及圖1e)。當此發生時，所闡述抗體可到達Her-3 β-髮夾結構。此作用模式可在活體外藉由Biacore實驗模擬。
使用Biacore T100儀器(GE Healthcare)以動力學方式評估單株抗體對神經生長因子活化之Her-3細胞外結構域(Her3_ECD)之行為。將CM5感測器安裝至系統中且根據製造商之說明書在HBS-ET緩衝液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% w/v Tween 20)中標準化。樣品緩衝液係補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖，Sigma編號86524)之系統緩衝液。在25℃下操作系統。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學法將6500 RU RAM-Fcγ(Fcγ-片段RamIgG之相對單位，GE Healthcare)固定在所有四種流動細胞上。用1M乙醇胺使感測器去活化。
以動力學方式測試各別抗體針對分析物之結合活性。在35nM濃度下藉由以5μl/min注射1min來捕獲抗體。流速設定為100μl/min。
所測試之溶液中之分析物係人類神經生長因子片段(HRG)(SEQ ID NO：11)、44kDa同二聚蛋白(根據實例2e製備)、人類重組HER2 ECD(SEQ ID NO：10)(69.6kDa)、人類重組HER3 ECD(SEQ ID NO：4)(68kDa)、人類重組HER4 ECD(SEQ ID NO：6)及100nM Her-3 ECD及Her-4 ECD，其各自在室溫下與5倍莫耳濃度過量之神經生長因子一起培育60min，從而產生HER3 ECD-HRG複合物及HER4 ECD-HRG複合物(對於複合物，加和MW)。
在下列不同濃度階梯下經3.5min注射溶液中之分析物：0nM、1.1nM、3.7nM、11.1nM、33.1nM及90nM。經15min監測解離。若可能，根據Langmuir擬合來評估動力學特徵。
MR=莫耳比，BL=滯後結合，CL=捕獲級別；n.d.=無法檢測=未結合。使用下式來計算莫耳比：MW(抗體)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗體)。
抗體M-205係具有針對靠近Her-3 ECD神經生長因子結合位點(闡述為WO2011/076683中之Mab205.10.2)之表位之結合活性的鼠類單株抗體。M-205與神經生長因子在其於Her-3 ECD上之結合位點周圍競爭。
抗體M-208係具有針對Her-3 ECD結構域IV之結合活性之鼠類單株抗體。M-208結合至獨立於Her-3 ECD構型狀態之Her-3 ECD。
M-05-74(在表5中=M-074)以經改良動力學結合至呈其活性「開放」構型之Her-3 ECD(在配體(例如神經生長因子HRG)存在下)，此乃因呈其「開放」構型之Her-3髮夾結構具有較佳可及性。MR為至少 兩倍高。
未觀察到針對陰性對照分析物神經生長因子β(HRG)及細胞外HER-2結構域(HER2_ECD)之抗體結合(n.d.)。測試抗體顯示皆結合至Her3-ECD(HER3_ECD)，但具有顯著不同之BL值。
與具有較快ka=4.9 E+04 l/Ms及BL(235 RU)下之高信號振幅之純系M-205及具有較快ka=5.8E+04 l/Ms亦及BL(367 RU)下之高信號振幅之M-208相比時，M-05-74以較慢締合速率常數ka=1.3E+04 l/Ms及較小BL(70 RU)結合至呈其「閉合」構型之Her-3 ECD。此涉及結合之化學計量(MR)，其中M-205(MR=1.0)及M-208(MR=1.0)二者顯示針對HER3-ECD之功能性1：1結合，而M-05-74顯示非功能性結合(MR=0.2)。在此處假定，M-05-74對Her-3 ECD之此相互作用係結構缺陷型Her-3 ECD分析物之一部分之殘餘結合。對於M-05-74對Her-4 ECD之相互作用亦作出此假定，其亦顯示具有BL(27 RU)及(MR=0.1)之非功能性結合。
令人驚奇的結果為M-05-74締合速率常數ka自「閉合」Her-3 ECD至「開放」Her-3 ECD/神經生長因子複合物大於4倍的增加(幾乎5倍)；自ka=1.3E+04 l/Ms(Her3_ECD)增加至ka=6.3E+04 l/Ms(Her3-ECD-HRG)。因此，M-05-74結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為4.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子)=ka(Her3-ECD-HRG)/ka(Her3-ECD)=6.3E+04[l/Ms]/1.3E+04[l/Ms])=4.85))。由此莫耳比改良3倍，此現指示M-05-74與Her-3 ECD神經生長因子複合物之1：1相互作用。因此，M-05-74結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為3.0(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子)=0.6/0.2= 3)。
此對於Her-4 ECD/神經生長因子複合物亦有效，其中莫耳比改良6倍，此指示M-05-74與Her-4 ECD神經生長因子複合物之1：1相互作用。因此，M-05-74係以下列結合之莫耳比MR之比率結合至HER4-ECD：在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之比率為3.0(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子)=0.6/0.1=6)。且此外，令人驚奇的是，M-05-74締合速率常數ka自「閉合」Her-4 ECD至「開放」Her-4 ECD/神經生長因子複合物增加，自ka=6.7E+03 l/Ms(Her3_ECD)增加至ka=1.6E+05，增加20倍以上。因此，M-05-74結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為20.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子)=ka(Her4-ECD-HRG)/ka(Her4-ECD)=6.7E+04[l/Ms]/1.6E+05[l/Ms])=23.88))。
如預期，神經生長因子置換劑M-205減小其BL值及莫耳比。莫耳比減小至五分之二，自MR=1.0(Her3-ECD)且BL為235 RU之完全功能性1：1相互作用減小至BL為164 RU之較低功能性MR=0.4(Her3-ECD-HRG)。此指示功能性因過量神經生長因子之競爭性存在而有所損失。
結合至Her-3 ECD結構域IV之抗體M-208保持完全不受神經生長因子存在之影響。無法檢測到莫耳比之顯著變化。
圖7顯示抗HER3/HER4 β-髮夾結構抗體M-05-74至神經生長因子-活化Her-3 ECD複合物之結合模式。M-05-74(參見曲線1)捕獲神經生長因子且阻止其自複合物解離。M-05-74係神經生長因子之捕集器(「神經生長因子池(sink)」)。M-05-74並不與神經生長因子競爭Her-3 ECD上之結合位點。為比較，顯示M-08-11(曲線2)；M-08-11(VH及 VL參見SEQ ID NO：51及52)係不具HER4 ECD及HER4 β-髮夾結構交叉反應性之另一HER3 β-髮夾結構結合劑，其結合至與M-05-74不同之表位。
在又一實驗中，量測亦包含不具HER3 β-髮夾結構之HER1 ECD、T.T.SlyD-cysHer3及T.T.SlyD-cas，結果顯示於表5b中，此實質上揭露M-05-74之相同結合性質。
為Biacore T200儀器(GE Healthcare)安裝CM5系列感測器。根據製造商之說明書在HBS-ET緩衝液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% w/v Tween 20)中標準化感測器。樣品緩衝液係補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖，Sigma編號86524)之系統緩衝液。在25℃下操作系統。根據製造商之說明書使用胺偶合之EDC/NHS化學法將6500 RU RAM-Fcγ(Fcγ-片段RamIgG之相對單位，GE Healthcare)固定在所有四種流動細胞上。用1M乙醇胺使感測器去活化。藉由以10μl/min注射1min在感測器表面上捕獲單株抗體(CL，捕獲級別)。量測濃度依賴性動力學。各自在下列濃度下注射一系列濃度之分析物HER-1-ECD、HER-2-ECD、HER-3-ECD、HER-4-ECD、T.T.SlyD-cysHer3及T.T.SlyD-cas：0nM、1.1nM、3.3nM、2×10nM、30nM及90nM。注射0nM、17nM、2×50nM、150nM及450nM之神經生長因子β(HRG)，將90nM HER-3 ECD及90nM HER-4 ECD與5倍莫耳濃度過量之HRG β一起預培育2hr且在以下HER濃度階梯下注射：0nM、1.1nM、3.3nM、2×10nM、30nM及90nM。 以100μl/min流速經5min締合時間及10min解離時間注射所有分析物。藉由以10μl/min經3min注射10mM甘胺酸(pH 1.7)使感測器捕獲系統再生。若可能，使用Biacore T200評估軟體來評估動力學數據。 使用Langmuir擬合模型來評估HER-3-ECD、HER-4-ECD及T.T.SlyD-cysHer3動力學。根據Langmuir擬合模型來評估M-5-74之HER-3-ECD HRG及HER-4-ECD-HRG動力學。
MR=莫耳比，BL=滯後結合，CL=捕獲級別；n.d.=無法檢測=未結合。M-05-74以1：1化學計量結合HER-3-ECD-HRG及HER-4-ECD-HRG且以10：1化學計量結合無活性HER-3-ECD及HER-4-ECD。M-05-74以高於HER-4-ECD及HER-4-ECD-HRG之親和力結合HER-3-ECD及HER-3-ECD-HRG。M-05-74不與HER-1、HER-2及HRG相互作用。M-05-74以1：2化學計量結合T.T.SlyD-cysHer3且不與T.T.SlyD-cas相互作用。
實例4 抗HER3抗體M-05-74之表位定位及作用分析之模式 具有獨特表位(HER3及HER4之β-髮夾結構)之M-05-74
使用Biacore 2000(GE Healthcare)儀器來評估可及表位純系培養物上清液之結合特異性。將CM5感測器安裝至系統中且根據製造商之說明書在HBS-ET緩衝液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% w/v Tween 20)中標準化。樣品緩衝液係補充有1 mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖，Sigma)之系統緩衝液。在37℃下操作系統。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學法將10000 RU RAM-Fcγ(Fcγ-片段兔抗小鼠IgG之相對單位/Jackson Laboratories)固定在所有四種流動細胞上。用1M乙醇胺使感測器去活化。
在10μl/min流速下對所有流動細胞經1min捕獲一級抗體50nM抗HER3 M-05-74。流速設定為30μl/min且經5分鐘注射IgG封阻溶液(50μg/ml IgG(20：2：1 IgG1-Fcγ、IgG2a-Fcγ、IgG2b),Roche)。經3min注射1.5μM之抗原Her-3 ECD。
此後，以30μl/min經3分鐘注射100nM每一抗HER3二級抗體(a)M-05-74 b)來自WO97/35885之8B8(在圖中稱為GT)c)結合至HER3之結構域IV之M-208及d)M-08-11；不具HER4 ECD及HER4 β-髮夾結構交叉反應性之另一HER3 β-髮夾結構結合劑)。使用以30μl/min經60秒連續三次注射10mM甘胺酸(pH 1.7)來達成感測器表面之酸性再生。
藉由二級M-05-74注射物之再結合定義量測之雜訊，該再結合使已解離之原代M-05-74再飽和。實驗顯示(參見圖8)，M-208及M-05-74佔據Her-3 ECD上之不同表位，此乃因在M-05-74存在下二級M-208信號使Her-3 ECD完全飽和。M-08-11結合因M-05-74之存在而完全阻斷。M-08-11二級信號甚至在雜訊以下。然而，M-08-11結合至與M-05-74不同之表位，此乃因M-08-11不與人類HER4 ECD及HER4 β-髮夾結構結合。(亦參見下文關於HER3及HER4之β-髮夾結構之準確表位定位數據)。8B8(=GT)二級抗體在M-05-74存在下產生顯著信號，該信號在雜訊以上。因此，8B8(=GT)抗體結合與M-05-74及M-08-11不同之另一表位。
具有獨特表位及作用模式之M-05-74
使用Biacore B3000儀器(GE Healthcare)評估純系培養物M-05-74 及抗體8B8(來自WO 97/35885，在圖中稱為GT)針對Her-3 ECD之「閉合」構型及神經生長因子活化之Her-3 ECD之「開放」構型之動力學。將CM5感測器安裝至系統中且根據製造商之說明書在HBS-ET緩衝液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% w/v Tween 20)中標準化。樣品緩衝液係補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖)之系統緩衝液。在25℃下操作系統。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學法將10000 RU RAM-Fcγ(Fcγ-片段兔抗小鼠IgG之相對單位/Jackson Laboratories)固定在所有流動細胞上。用1M乙醇胺使感測器去活化。在下列不同濃度階梯下以100μl/min經2min注射溶液中之分析物：0nM、1.1nM、3.7nM、11.1nM、33.1nM及90nM。經5min監測解離。使用以30μl/min經60秒連續三次注射10mM甘胺酸(pH 1.7)達成感測器表面之酸性再生。根據Langmuir擬合評估動力學數據。
MR=莫耳比，BL=滯後結合，CL=捕獲級別
在上表中，列示抗體純系M-05-74及抗體8B8之動力學數據。M-05-74以高功能性MR=0.8結合至神經生長因子活化之Her-3 ECD。M-05-74用作神經生長因子捕集器。(亦參見圖Biacore感應圖實例3b及圖 7)。
t1/2解離=0.8min之8B8抗體之複合物穩定性較弱。8B8以MR=0.4結合。無法鑑別8B8抗體與神經生長因子解離之分開解離相。神經生長因子以與8B8相同之時程及相同速率完全解離。8B8抗體並不延遲神經生長因子解離。
M-05-74以KD=27nM功能性結合(MR=1.5)至包括HER3 β-髮夾結構SEQ ID NO：1之嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her3。由於抗體8B8並未結合至包括HER3 β-髮夾結構之嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her-3融合多肽，故此抗體靶向與M-05-74不同之另一表位。
圖9係抗HER3/HER4抗體M-05-74、抗HER3抗體M-08-11及抗HER3抗體8B8(來自WO97/35885)之biacore感應圖之疊加圖，其顯示不同結合作用模式。抗HER3/HER4抗體M-05-74以t1/2解離=18min捕集神經生長因子活化之Her-3 ECD(1)且起神經生長因子池作用。抗HER3抗體M-08-11 HER3(不具HER4 ECD及HER4 β-髮夾結構交叉反應性之β-髮夾結構結合劑)延遲神經生長因子解離(2)且產生複合雙態動力學。8B8抗體(3)並不捕集神經生長因子且亦不延遲神經生長因子自Her-3 ECD/神經生長因子複合物之解離。由於其係完美Langmuir相互作用，故神經生長因子/Her-3 ECD複合物快速且完全自8B8抗體解離為完整複合物。
在圖10中顯示該等結合作用模式之反應圖：1：M-08-11結合至神經生長因子活化之Her-3 ECD且誘導延遲的神經生長因子解離，藉此M-08-11保留在Her-3 ECD受體複合物中。2：M-05-74結合至神經生長因子活化之Her-3 ECD。神經生長因子捕集於複合物中且抗體保留在複合物中。3：8B8結合神經生長因子活化之Her-3 ECD。整個複合物自抗體解離。
基於肽之2D表位定位
在另一實施例中，實施基於肽之表位定位實驗以藉由使用CelluSpotsTM合成及表位定位技術來表徵Her-3 ECD表位。表位定位係藉助對應於人類Her-1 ECD、Her-2 ECD、Her-3 ECD及Her-4 ECD肽髮夾結構序列之重疊經固定肽片段(長度：15個胺基酸)之文庫來實施。在圖11中顯示表位定位及丙胺酸掃描方式之策略。研究HER1(EGFR)ECD、HER2 ECD、HER3 ECD及HER4 ECD之肽髮夾結構序列(β-髮夾結構)，包含其結構性嵌入(結構性)。藉由絲胺酸替代半胱胺酸。對於經由結合至該等β-髮夾結構之抗體之抗體選擇，HER3及HER4之β-髮夾結構定義為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。
所合成之每一肽遷移一個胺基酸，即其具有14個胺基酸分別與前一肽及後一肽重疊。為製備肽陣列，採用Intavis CelluSpotsTM技術。以此方式，藉助自動合成儀(Intavis MultiPep RS)在合成後溶解之經修飾纖維素盤上合成肽。然後將共價連接至大分子纖維素之個別肽之溶液點在經塗覆顯微鏡載玻片上。利用9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)化學法在經胺基修飾之纖維素盤上在384孔合成板中逐步實施CelluSpotsTM合成。在每一偶合循環中，用DIC/HOBt存於DMF中之溶液活化相應胺基酸。在偶合步驟之間，用乙酸酐、二異丙基乙胺及1-羥基苯并三唑之混合物封端未反應胺基。完成合成後，將纖維素盤轉移至96孔板中且用三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷、三異丙基矽烷(TIS)及水之混合物處理以供側鏈去保護。去除裂解溶液後，用TFA、TFMSA、TIS及水之混合物溶解纖維素結合之肽，用二異丙基醚預沈澱且重懸於DMSO中。隨後使用Intavis載玻片點樣儀將肽溶液點至Intavis CelluSpotsTM載玻片上。
對於表位分析，用乙醇洗滌如上文所闡述製備之載玻片且然後用經Tris緩衝之鹽水(TBS；50mM Tris、137mM NaCl、2.7mM KCl，pH 8)洗滌，然後在4℃下用5mL 10×西方封阻試劑(Roche Applied Science)、存於TBS、0.1% Tween 20中之2.5g蔗糖封阻16h。用TBS及0.1% Tween 20洗滌載玻片並此後在環境溫度下與1μg/mL存於TBS及0.1% Tween 20中之相應IGF1抗體一起培育2h且隨後用TBS+0.1% Tween 20洗滌。為檢測，將載玻片與抗兔/抗小鼠二級HRP-抗體(存於TBS-T中之1：20000)一起培育，然後與化學發光受質流明諾(luminol)一起培育並用LumiImager(Roche Applied Science)觀察。量化ELISA陽性點且經由比對相應肽序列鑑別抗體結合表位。
如圖12中所繪示，M-05-74顯示具有胺基酸序列VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)之HER3 ECD表位及對具有胺基酸序列VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之HER4 ECD表位之交叉反應性，且對EGFR及HER2 ECD中之髮夾結構基序無可檢測信號。使用8B8抗體完全無法檢測到信號，因此，8B8抗體靶向與髮夾結構肽基序不同之表位。M-08-11顯示具有胺基酸序列PLVYNKLTFQLE之HER3 ECD特異性表位，且無法檢測到對Her-家族之其他髮夾結構序列之交叉反應性。
在圖13中，加下劃線/粗體為藉由Ala掃描鑑別之胺基酸，該等胺基酸對抗HER3/HER4抗體M-05-74至其HER3 ECD結合表位VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)及其HER4 ECD結合表位VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之結合貢獻最大。
實例5 在HER3抗體存在下HRG至HER3-ECD之結合(ELISA)
在4℃下將塗覆有抗生蛋白鏈菌素之96孔板與含有經SBP標記之HER3-ECD之細胞培養物上清液一起培育。第二天，用洗滌緩衝液(PBS+0.05% Tween-20)將孔洗滌三次且用含有1% BSA之PBS封阻1小時。用洗滌緩衝液再洗滌三次後，將40μl抗體溶液(存於Delfia結合緩衝液中)添加至每一孔中作為具有期望最終濃度(10-3nM至103nM或10-4nM至102nM)之2×儲備溶液。立即添加40μl 20nM經銪標記之神 經生長因子-β(PeproTech，目錄編號100-03)以達成10nM之最終濃度。將板在振盪器上在室溫下培育2小時。用Delfia洗滌緩衝液洗滌三次後，添加Delfia增強溶液並在振盪器上培育15分鐘(經光保護)。最後，在Tecan Infinite F200讀數器中使用時間解析螢光量測方案量測板。M-05-74(在圖14中稱為M-074)之結合可促使HRG結合至HER3-ECD直至達到650信號下之平穩段。結果顯示於圖14中。
實例6 a)ZR-75-1細胞中HER3磷酸化之抑制
根據以下方案分析ZR-75-1細胞：以500,000個細胞/孔將細胞接種於多-D-離胺酸塗覆之6孔板中含有10% FCS之RPMI1640培養基中。培育24h。藉由抽吸去除培養基，與500μl/孔含有0.5% FCS之RPMI 1640一起培育過夜。在含有0.5% FCS之500μl RPMI 1640中添加抗體。培育1h。添加神經生長因子-β(PeproTech，目錄編號100-03)(最終濃度為500ng/ml)並保持10min。為溶解細胞，去除培養基且添加80μl冰冷Triton-X-100細胞溶解緩衝液並在冰上培育5分鐘。在將溶解物轉移至1.5ml反應管中且在4℃下在14000rpm下離心15min後，將上清液轉移至新反應管中。在SDS PAGE上分離存於SDS負載緩衝液中之含有等量蛋白質之樣品且藉由使用半乾燥西方墨點印跡至硝酸纖維素膜。藉由1×NET-緩衝液+0.25%明膠將膜封阻1小時且分別藉由抗體αPhospho-HER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3),Cell Signaling，編號4791檢測pHER3及藉由抗體αErbB3(C-17),Santa Cruz，編號sc-285檢測HER3。洗滌及藉由POD偶合之二級抗體檢測信號後，用密度計掃描條帶。在zr-75-1細胞中抗HER3抗體M-05-74對受體磷酸化之抑制百分數(%)顯示於下表7中。
b)二價親代M-05-74及M-05-74之Fab片段(Fab-74)對HER3磷酸化之抑制
將MCF-7細胞接種於24孔板(1ml RPMI、10% FCS，3×105個細胞/孔)中且在37℃/5%CO2下培育過夜。24小時後，將培養基替換為含有0.5% FCS之1ml培養基。48小時後，將抗體添加至10μg/ml、1μg/ml及0.1μg/ml(M-05-74)以及6.66μg/ml、0.66μg/ml及0.066μg/ml(Fab-074)之最終濃度。將板在37℃下培育50分鐘且然後將神經生長因子-β(PeproTech，目錄編號100-03)添加至500ng/ml之最終濃度。將板在37℃/5%CO2下再培育10分鐘。用PBS洗滌細胞且溶解於含有抑肽酶(10μg/ml)、正釩酸鹽(0.4mM)、苯基甲基磺醯氟(1mM)之40μl Triton溶解緩衝液(1% Triton)中。將26μl所收集之溶解物轉移至反應管中且添加14μl樣品緩衝液(NuPAGE LDS樣品緩衝液4×，NuPAGE樣品還原劑10×)。在70℃下將樣品培育10分鐘且然後藉由SDS-PAGE(NuPAGE,4%-12%雙-Tris-迷你凝膠)分析。使用iBlot乾燥印跡系統(Invitrogen)實施電印跡。將硝酸纖維素膜與磷酸HER3抗體(α磷酸Her3，Cellsignaling編號4791，兔1：1000)一起培育，然後與HRP偶聯之二級抗體(山羊抗兔1：5000，BioRad目錄：170-6515)一起培育。使用ECL檢測試劑(Amersham RPN2209)在X射線膠片(Roche Lumi-Film化學發光檢測膠片11666657001)上顯影信號。研究等莫耳量之抗HER3抗體M-05-74(自雜交瘤純化之全長)與抗體Fab-74之Fab片段(藉由木瓜酶自全長M-05-74裂解獲得)。Fab片段係藉由木瓜酶消化抗體 產生。簡言之，1ml含有約2mg/ml抗體之溶液補充有25mM半胱胺酸及70μg木瓜酶(Roche)。在37℃下培育1.5h後，藉由添加碘乙醯胺來終止消化反應且藉由MabSelect Sure(GE Healthcare)來純化反應混合物。藉由粒徑排阻層析(Superdex 200；GE Healthcare)進一步純化含有Fab之流出液。
在MCF7細胞中抗HER3抗體對受體磷酸化之抑制百分數(%)概述於下文及表8中。等莫耳濃度之抗體M-05-74(來自雜交瘤之全長)與此抗體Fab-74之Fab片段可在相當程度上抑制HER3磷酸化。
實例7 對MCF7細胞中HER2/HER3異源二聚體(免疫沈澱及西方墨點)之抑制
將MCF-7細胞接種於6孔板(2ml RPMI、10% FCS，8×105個細胞/孔)中且使其生長過夜。第二天，將培養基更換為2ml含有0.5% FCS之饑餓培養基。第三天，將抗體添加至10μg/ml之最終濃度且將板在37℃下培育。50分鐘後，將神經生長因子-β(PeproTech，目錄編號100-03)添加至500ng/ml之最終濃度並將板在37℃下再培育10分鐘。用PBS洗滌細胞且溶解於含有1%毛地黃皂苷之250μl Triton溶解緩衝液中。將60μl所收集之溶解物轉移至反應管中且與40μl抗體偶合之Sepharose(Herceptin或208號HER3-抗體)及含有0.3%毛地黃皂苷之500μl緩衝液一起培育。在4℃下將反應混合物於輪盤旋轉器上培育過 夜。第二天，用含有0.3%毛地黃皂苷之500μl緩衝液將反應混合物洗滌三次。最後洗滌後，丟棄上清液且添加10μl 4×負載緩衝液。在70℃下將管培育10分鐘且由此將上清液裝載至凝膠中用於SDS-PAGE。在以下半乾燥西方墨點後，將含有與HER2抗體免疫沈澱之樣品之膜與抗HER3/HER4抗體M-05-74(在圖15中為M-074)一起培育，且反之亦然。然後將膜與HRP-偶聯之二級抗體一起培育且將ECL信號轉移至X射線膠片上。結果顯示於圖15中，其顯示M-05-74對HER2/HER異源二聚體形成(HER2/HER異源二聚化)之強抑制。
實例8 M-05-74對MDA-MB-175細胞中之腫瘤細胞增殖之抑制.
在細胞增殖分析中，使用MDA-MB-175細胞(VII型人類乳癌細胞，ATCC目錄編號HTB-25)評估HER3抗體M-05-74之抗腫瘤功效。將20,000個細胞/孔接種於含有10% FCS之DMEM/F12細胞培養基之無菌96孔組織培養板中，且在37℃±1℃與5%±1% CO2下培育一天。該等細胞係緩慢生長之細胞，倍增時間為約3天。在稀釋系列中添加抗HER3抗體且再培育6天。然後使用alamarBlue®讀取器來評估細胞活力。計算EC50值。
實例9 抗HER3抗體M-05-74之活體內抗腫瘤功效
抗HER3抗體M-05-74(M-074)之活體內抗腫瘤功效可在基於細胞之於SCID beige上移植之多個腫瘤來源(例如SCCHN及胰臟癌)模型中檢測。作為實例，顯示SCCHN異種移植物模型FaDu(基於細胞系)之 數據。
測試藥劑
M-05-74提供為來自Roche,Penzberg,Germany之儲備溶液，其係自雜交瘤細胞表現並純化。抗體緩衝液包含組胺酸。在注射之前將抗體溶液自儲備溶液適當稀釋於緩衝液中。
細胞系及培養條件
FaDu人類HNSCC細胞最初係自ATCC獲得。在37℃下在水飽和氣氛中在5%CO2下於補充有以下成份之MEM伊格爾培養基(MEM Eagle medium)中以常規方式培養腫瘤細胞系：10%胎牛血清、2mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉及0.1mM NEAA。用胰蛋白酶/EDTA 1×實施培養物傳代，每三天分裂一次。
動物
自育種者(例如Charles River,Sulzfeld,Germany)購得雌性SCID beige或裸小鼠且根據既定指導方針(GV-Solas；Felasa；TierschG)在不含特定病原體條件下維持12h光照/12h黑暗之每日循環。由地方政府審閱並批準實驗研究方案。在運抵後，將動物在動物設施之隔離部分中維持一週以適應新環境並加以觀察。定期實施連續健康監測。可隨意獲得規定食物(Provimi Kliba 3337)及水(酸化，pH 2.5-3)。
每日控制動物之臨床症狀及不利效應之檢測。對於在整個實驗期間之監測，記載動物體重。
在細胞移植後動物隨機化後中值腫瘤大小為約100-150mm3時開始動物治療。將抗體作為單一藥劑以10mg/kg腹膜內q7d每週一次投與若干週，此端視模型而定。在相同天數時投與相應媒劑。
自研究第10天至第24天使用抗體M-05-74治療帶有FaDu HNSCC異種移植物之小鼠。由此，使用H-74抗體之治療顯示顯著抗腫瘤功效，且皮下FaDu異種移植物接近腫瘤停滯。腫瘤生長抑制(TGI)計算 為89%。
使用M-05-74之治療(10mg/kg q7d×3，腹膜內)使得FaDu接近腫瘤停滯。結果顯示於圖17中，其中M-05-74稱為M-074。
實例10 M-05-74-Fab-假單胞菌外毒素偶聯物(M-05-74-PE)之產生
M-05-74之Fab片段、PE24變體及M-05-74中偶聯至假單胞菌外毒素變體PE24LR8M之Fab片段之表現、純化及複性係基於序列SEQ ID NO：45、46、47、48(或49)。
Fab(例如用於分選酶偶合)之表現-表現載體
為表現所闡述之Fab片段，應用基於含或不含CMV-內含子A啟動子之cDNA結構或含有CMV啟動子之基因組結構瞬時表現(例如HEK293-F)細胞之表現質體。
除抗體表現盒外，該等載體含有：- 複製起點，其允許此質體在大腸桿菌中複製，及- β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌中之氨苄青黴素抗性。
抗體基因之轉錄單元由以下元件構成：
- 位於5’末端之獨特限制性位點
- 來自人類巨細胞病毒之立即早期增強子及啟動子，
- 在cDNA結構之情形下隨後為內含子A序列，
- 人類抗體基因之5’-非翻譯區，
- 免疫球蛋白重鏈信號序列，
- 具有免疫球蛋白外顯子-內含子結構之人類抗體鏈作為cDNA或基因組結構
- 具有多腺苷酸化信號序列之3’非翻譯區，及
- 位於3’末端之獨特限制性位點。
藉由PCR及/或基因合成產生包括如下文所闡述之抗體鏈之融合 基因且藉由已知重組方法及技術藉由例如使用各別載體中之獨特限制性位點連接相應核酸區段來組裝。藉由DNA測序驗證亞選殖核酸序列。對於瞬時轉染，藉由質體製備自經轉化大腸桿菌培養物來製備較大量質體(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)。
細胞培養技術
使用如以下文獻中所闡述之標準細胞培養技術：Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott-Schwartz,J.及Yamada,K.M.(編輯)，John Wiley & Sons公司。
藉由生長在如下文所闡述之懸浮液中之HEK293-F細胞中瞬時共轉染重鏈與輕鏈之表現質體來表現Fab片段。
HEK293-F系統中之瞬時轉染
根據製造商之說明書使用HEK293-F系統(Invitrogen)藉由使用各別質體(例如編碼重鏈及經修飾重鏈以及相應輕鏈及經修飾輕鏈)瞬時轉染來產生Fab片段。簡言之，在不含血清之FreeStyleTM 293表現培養基(Invitrogen)中使用四種表現質體與293-FreeTM(Novagen)或Fectin(Invitrogen)之混合物轉染生長在存於搖瓶或攪拌發酵槽中之懸浮液中之HEK293-F細胞(Invitrogen)。對於2L搖瓶(Corning)，以1.0E*6個細胞/mL之密度將HEK293-F細胞接種於600mL中且在120rpm、8% CO2下培育。第二天，使用約42mL以下之混合物以約1.5E*6個細胞/mL之細胞密度轉染細胞：A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)及600μg分別編碼等莫耳比之重鏈或經修飾重鏈與相應輕鏈之總質體DNA(1μg/mL)；及B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293-Free(Novagen)或Fectin(2μl/mL)。在發酵過程期間根據葡萄糖消耗添加葡萄糖溶液。5-10天後收穫含有分泌抗體之上清液且自上清液直接純化抗體或冷凍並儲存上清液。
用於分選酶偶合之假單胞菌外毒素變體PE24-LR8M之表現-表現載體
為表現PE24-LR8M，使用大腸桿菌表現質體。
除針對假單胞菌外毒素A結構域III之表現盒外，該載體含有：- 來自載體pBR322之複製起點，其用於在大腸桿菌中複製(根據Sutcliffe,G.等人，Quant.Biol.43(1979)77-90)，- 來自大腸桿菌之lacI抑制子基因(Farabaugh,P.J.,Nature 274(1978)765-769)，- 釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)之URA3基因，其編碼乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶(Rose,M.等人Gene 29(1984)113-124)，該酶允許藉由大腸桿菌pyrF缺失菌株(尿嘧啶營養缺陷型)之互補性來進行質體選擇。
毒素基因之轉錄單元由以下元件構成：- 位於5’末端之獨特限制性位點，- T5雜合啟動子(T5-PN25/03/04雜合啟動子，根據Bujard,H.,等人Methods.Enzymol.155(1987)416-433及Stueber,D.等人，Immunol.Methods IV(1990)121-152)，包含合成核糖體結合位點，根據Stueber,D.等人(參見上文)，- 假單胞菌外毒素A結構域III，其具有N端偶合標籤隨後為弗林蛋白酶位點(SEQ ID NO：45假單胞菌外毒素變體PE24LR8M_3G，包含用於分選酶偶合之GGG連接體)，- 兩個噬菌體源轉錄終止子，λ-T0終止子(Schwarz,E.等人，Nature 272(1978)410-414)及fd終止子(Beck,E.及Zink,B.,Gene 1-3(1981)35-58)，- 位於3’末端之獨特限制性位點。
假單胞菌外毒素A構築物變體PE24-LR8M_3G在大腸桿菌補料分批製程中在化學定義培養基上之培養及表現
為表現PE24-LR8M_3G_大腸桿菌(25kDa)，採用能夠藉由大腸桿菌營養缺陷型(PyrF)之互補來進行無抗生素選擇之大腸桿菌宿主/載體系統(EP 0 972 838及US 6,291,245)。
藉由電穿孔使用表現質體轉化大腸桿菌K12菌株。首先使經轉化大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。將自此板挑選之菌落轉移至3mL旋轉培養物中且使其在37℃下生長至1-2之光學密度(在578nm下量測)。然後將1000μl培養物與1000μl無菌的86%甘油混合且立即冷凍於-80℃下以供長時間儲存。首先以小規模搖瓶實驗驗證此純系之正確產物表現且用SDS-Page分析，然後轉移至10L發酵槽中。
預培養：
對於預發酵，使用化學成分限定培養基。對於預發酵，用原始種子庫安瓿中之1.0ml接種存於具有四個擋板之1000ml錐形燒瓶中之220ml培養基。在32℃及170rpm下在旋轉振盪器上實施培養8小時，直至獲得2.9之光學密度(578nm)為止。使用100ml預培養物來接種10L生物反應器之分批培養基。
發酵：
對於10 l Biostat C、DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中之發酵，使用限定化學成分之分批培養基。將所有組份溶解於去離子水中。用於pH調節之鹼性溶液係補充有11.25g/l L-甲硫胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液。
在31℃、pH 6.9±0.2、800毫巴反壓及10 l/min之初始充氣速率下自4.2 l無菌分批培養基加來自預培養物之100ml接種體開始實施分批發酵。在整個發酵中藉由將攪拌器速度增加至高達1500rpm將溶解氧之相對值(pO2)保持在50%下。在初始補充之葡萄糖耗盡(藉由溶解氧值之急劇增加來指示)後，將溫度遷移至25℃且15分鐘後發酵進入以兩次補料(分別為60g/h及14g/h)開始之補料分批模式。保持補料2 之速率恆定，同時使用預定補料曲線在7小時內將補料1之速率自60g/h逐步增加至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度值大於2%時，在5小時內將充氣速率自10 l/min恆定地增加至20 l/min。藉由在約120之光學密度下添加2.4g IPTG來誘導重組PE24-LR8M_3G_大腸桿菌蛋白之表現。靶蛋白在細胞質內表現為可溶。
培養24小時後，達成209之光學密度且將整個培養液冷卻至4℃-8℃。經由順流式離心機(13,000rpm,13 l/h)離心收穫細菌並將所獲得之生物質儲存在-20℃下直至進一步處理(細胞破壞)。產量為67.5g乾燥細胞/升。
產物形成之分析：
利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD靶=10)重懸於5mL PBS緩衝液中且經由在冰上進行音波處理來破壞。然後，對100μL之每一懸浮液進行離心(15,000rpm，5分鐘)且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現的可溶與不可溶靶蛋白質。向每一上清液(=可溶性蛋白流份)中添加100μL SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)，且向每一沈澱物(=不可溶蛋白流份)中添加200μL SDS樣品緩衝液。在95℃下在劇烈混合下將樣品加熱15分鐘，以溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL之每一樣品轉移至4%-20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，施加5μl分子量標準物(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)。
在200V下將電泳運行60分鐘，且此後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像儀(Bio-Rad)上並用UV輻射處理5分鐘。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。藉由比較產物條帶之體積與分子量標準物之 25kDa條帶之體積來進行蛋白質表現之相對定量。
抗體片段輕鏈構築物(VL)及抗體片段重鏈假單胞菌外毒素A變體融合物(Fab-PE24)在大腸桿菌補料分批製程中在化學成分限定培養基上之培養及表現
為表現Fab-輕鏈(23.4kDa)及Fab-重鏈PE24融合物(48.7kDa)，採用能夠藉由大腸桿菌營養缺陷型(PyrF)之互補進行無抗生素質體選擇之大腸桿菌宿主/載體系統(EP 0 972 838及US 6,291,245)。
藉由電穿孔使用各別表現質體轉化大腸桿菌K12菌株。首先使經轉化大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。對於每一轉化，將自此板挑選之菌落轉移至3mL旋轉培養物中且使其在37℃下生長至1-2之光學密度(在578nm下量測)。然後將1000μl培養物與1000μl無菌的86%甘油混合且立即冷凍於-80℃下以供長時間儲存。首先以小規模搖瓶實驗驗證此純系之正確產物表現且用SDS-Page分析，然後轉移至10L發酵槽中。
預培養：
對於預發酵，使用化學成分限定培養基。對於預發酵，用原始種子庫安瓿中之1.0ml接種存於具有四個擋板之1000ml錐形燒瓶中之220ml培養基。在37℃及170rpm下在旋轉振盪器上實施培養9小時，直至獲得7至8之光學密度(578nm)為止。使用100ml預培養物來接種10L生物反應器之分批培養基。
發酵(RC52編號003)：
對於10 l Biostat C、DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中之發酵，使用限定化學成分之分批培養基。用於pH調節之鹼性溶液係補充有11.25g/l L-甲硫胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液。
在31℃、pH 6.9±0.2、800毫巴反壓及10 l/min之初始充氣速率下自4.2 l無菌分批培養基加來自預培養物之100ml接種體開始實施分 批發酵。在整個發酵中藉由將攪拌器速度增加至高達1500rpm將溶解氧之相對值(pO2)保持在50%下。在初始補充之葡萄糖耗盡(藉由溶解氧值之急劇增加來指示)後，將溫度遷移至37℃且15分鐘後發酵進入以兩次補料(分別為60g/h及14g/h)開始之補料分批模式。保持補料2之速率恆定，同時使用預定補料曲線在7小時內將補料1之速率自60g/h逐步增加至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度值大於2%時，在5小時內將充氣速率自10 l/min恆定地增加至20 l/min。藉由在約40之光學密度下添加2.4g IPTG來誘導呈位於細胞質中之不可溶包涵體形式之重組靶蛋白質之表現。
培養24小時後，達成185之光學密度且將整個培養液冷卻至4℃-8℃。經由順流式離心機(13,000rpm,13 l/h)離心收穫細菌並將所獲得之生物質儲存在-20℃下直至進一步處理(細胞破壞)。產量介於40g乾燥細胞/升與60g乾燥細胞/升之間。
產物形成之分析：
利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD靶標=10)重懸於5mL PBS緩衝液中且經由在冰上進行音波處理來破壞。然後，對100μL之每一懸浮液進行離心(15,000rpm，5分鐘)且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現的可溶與不可溶靶蛋白質。向每一上清液(=可溶性蛋白流份)中添加100μL SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)，且向每一沈澱物(=不可溶蛋白流份)中添加200μL SDS樣品緩衝液。在95℃下在劇烈混合下將樣品加熱15分鐘，以溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL之每一樣品轉移至4%-20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，施加5μl分子量標準物(Precision Plus Protein Standard，Bio-Rad)及3種量(0.3μl、0.6μl及0.9μl)之具有已知靶蛋白質濃度(0.1μg/μl)之量化標準物。
在200V下將電泳運行60分鐘，且此後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像儀(Bio-Rad)上並用UV輻射處理5分鐘。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。利用該三種標準物，使用>0.99之係數計算線性回歸曲線且由此計算原始樣品中靶蛋白質之濃度。
(M-05-74之Fab片段、PE24變體及M-05-74中偶聯至假單胞菌外毒素變體PE24LR8M之Fab片段之)純化、分選酶偶合及複性 Fab片段
根據製造商之說明藉由親和層析(Ni SepharoseTM高效HisTrapTM)來純化Fab片段。簡言之，將上清液裝載至於50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl中平衡之管柱中。使用pH 7.0之相同緩衝液與含有4mM咪唑然後最高100mM咪唑梯度之洗滌步驟實施蛋白溶析。彙集含有期望Fab片段之流份且針對20mM His、140mM NaCl(pH 6.0)透析。
用於分選酶偶合之PE24
在20mM Tris、2mM EDTA(pH 8.0)+完全蛋白酶抑制劑混合錠劑(Roche)中藉由高壓均質化(若需要細節：Christian Schantz)來溶解表現PE24之大腸桿菌細胞。過濾溶解物且裝載至於20mM Tris(pH 7.4)中平衡之Q sepharose FF(GE Healthcare)上。使用存於相同緩衝液中之最高500mM NaCl梯度來溶析蛋白質。藉由SDS PAGE鑑別含有PE24之流份。濃縮合併之彙集物並施加至於20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.4)中平衡之HiLoadTM SuperdexTM 75(GE Healthcare)中。根據SDS PAGE彙集含有PE24之流份且冷凍在-80℃下。
Fab片段至PE24之分選酶偶合
使用Amicon® Ultra 4離心過濾器裝置(Merck Millipore)將Fab片段及PE24單獨滲濾至50mM Tris、150mM NaCl、5mM CaCl2(pH 7.5)中且濃縮至5-10mg/ml。以1：1：0.8之莫耳比合併蛋白質與分選酶二者。在37℃下培育1小時後，將混合物裝載至於50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl中平衡之Ni SepharoseTM高效HisTrapTM)上。使用存於相同緩衝液(pH 7.0)中之最高100mM咪唑梯度實施溶析。濃縮含有最終產物Fab-PE24之流出液且裝載至存於20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.4)中之HiLoadTM SuperdexTM 200(GE Healthcare)上。彙集含有期望偶合蛋白之流份且儲存在-80℃下。使用可溶性金黃色葡萄球菌分選酶A作為分選酶(SEQ ID NO：50)。可溶性金黃色葡萄球菌分選酶係使用以下表現質體來表現並純化：分選酶基因編碼N-端截短金黃色葡萄球菌分選酶A(60-206)分子。用於在HEK293細胞中瞬時表現可溶性分選酶之表現質體除可溶性分選酶表現盒外包括來自載體pUC18之複製起點，其允許此質體在大腸桿菌中複製；及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌氨苄青黴素抗性。可溶性分選酶之轉錄單元包括以下功能元件：- 來自人類巨細胞病毒(P-CMV)之立即早期增強子及啟動子，包含內含子A，- 人類重鏈免疫球蛋白5’-非翻譯區(5’UTR)，- 鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，- 編碼核酸之N-端截短金黃色葡萄球菌分選酶A，及- 牛生長激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
源自大腸桿菌包涵體之Fab-PE24之複性
將VH-PE24及VL-Cκ之包涵體單獨溶解於8M鹽酸胍、100mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 8.0)+100mM二硫蘇糖醇(DTT)中。在室溫下保持12-16小時後，將增溶劑之pH調節至3.0，針對8M鹽酸胍、10mM EDTA(pH 3.0)透析離心溶液。藉由雙脲反應測定蛋白質濃度，藉由SDS PAGE估計包涵體製劑之純度。將等莫耳量之兩條鏈於 0.5M精胺酸、2mM EDTA(pH 10)+1mM GSH/1mM GSSG中以兩步稀釋至0.2-0.3mg/ml之最終濃度。在4℃-10℃下保持12-16h後，用H2O將複性蛋白質稀釋至<3mS/cm且裝載至於20mM Tris/HCl(pH 7.4)中平衡之Q sepharose FF(GE healthcare)上。使用存於相同緩衝液中之最高400mM NaCl梯度實施溶析。藉由SDS-PAGE及分析型粒徑排阻層析(SEC)鑑別含有正確產物之流份。濃縮所彙集流份且裝載至存於20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.4)或另一選擇為存於20mM組胺酸、140mM NaCl(pH 6.0)中之HiLoadTM SuperdexTM 200(GE Healthcare)上。根據分析型SEC分析且彙集流份並儲存在-80℃下。
基於SEQ ID NO：46及49，M-05-74之Fab片段與假單胞菌外毒素變體PE24LR8M(M-05-74-PE)之免疫偶聯物可以重組方式表現、純化且亦複性為直接PE24LR8M融合物。
實例11 M-05-74-Fab-假單胞菌外毒素偶聯物(M-05-74-PE)對不同腫瘤細胞系之細胞殺死
將過表現HER3之A549細胞接種於白色96孔板(平坦透明底部，1×104個細胞/孔)中且在RPMI(10% FCS)中生長過夜。第二天，將培養基更換為50μl饑餓培養基(RPMI,0.5% FCS)。至少4小時後，將5μl神經生長因子-β(PeproTech，目錄編號100-03)(HRG β)添加至500ng/ml之最終濃度。將50μl Fab-74-PE溶液添加至下列最終濃度：10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.04、0.014、0.005及0.002μg/ml。將板培育72h。24h及48h後，再將5μl神經生長因子-β添加至500ng/ml之最終濃度。72h後，在Tecan Infinite F200讀數器中使用Promega之CellTiter-Glo發光細胞活力分析(目錄編號G7571)量測發光。在HRG β不存在下M-05-74-Fab-假單胞菌外毒素偶聯物(M-05-74-PE)之EC50值為1.93μg/ml且在HRG β存在下之EC50值為0.13μg/ml。
實例12 本發明抗體之人類化變體
將鼠類抗體之結合特異性轉移至人類受體框架上以消除源自人體將識別為外源物之序列段之潛在免疫原性組織。此係藉由將鼠類(供體)抗體之整個HVR植入人類(受體)抗體框架上來實施，且稱為HVR(或CDR)移植或抗體人類化。
將鼠類可變區胺基酸序列與人類種系抗體V-基因之集合進行比對，且根據序列一致性及同源性分選。基於高總體序列同源性亦及視情況在受體序列中已存在正確規範殘基下選擇受體序列(參見Poul,M-A.及Lefranc,M-P.，「Ingénierie des抗corps banques combinatores」，Lefranc,M-P.及Lefranc,G.編輯，Les Editions INSERM,1997)。
種系V-基因僅編碼至重鏈之HVR3起點及至輕鏈之HVR3中間之區域。因此，並不在整個V-結構域內比對種系V-基因之基因。人類化構築物包括人類框架1至3、鼠類HVR及源自人類JK4之人類框架4序列及分別用於輕鏈及重鏈之JH4序列。
在選擇一條具體受體序列之前，可測定供體抗體之所謂的規範環結構(參見Morea,V.等人，Methods，第20卷，第3期(2000)267-279)。該等規範環結構係藉由所謂的規範位置處存在之殘基類型來確定。該等位置位於(部分)HVR區域外部，且在最終構築物中應保持功能等效以保持親代(供體)抗體之HVR構型。
在WO 2004/006955中報導用於人類化抗體之方法，該方法包括 以下步驟：鑑別非人類成熟抗體中HVR之規範HVR結構類型；獲得針對人類抗體可變區之肽序列文庫；確定文庫中可變區之規範HVR結構類型；及選擇規範HVR結構與非人類抗體規範HVR結構類型在非人類及人類可變區內之相應位置處相同之人類序列。
總之，基於高總體同源性及另外視情況在受體序列中已存在正確規範殘基下選擇潛在受體序列。
在一些情形下，簡單HVR移植僅部分保留非人類抗體之結合特異性。已發現，至少一些特異性非人類框架殘基為重構結合特異性所必需且亦必須移植至人類框架中，即除引入非人類HVR外必須製造所謂的「回復突變」(例如參見Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10,029-10,033；Co等人，Nature 351(1991)501-502)。該等特異性框架胺基酸殘基參與FR-HVR相互作用且穩定HVR之構型(環)(例如參見Kabat等人，J.Immunol.147(1991)1709)。
在一些情形下，亦引入正向突變以更嚴密地使用人類種系序列。
針對彼等經設計抗體序列之基因係藉由習用PCR技術產生。將重鏈可變區融合至人類IgG1重鏈恆定區(若需要效應子功能)或人類IgG1/IgG4重鏈恆定區變體(若不需要效應子功能；IgG1 L234A L235A P329G；IgG4 S228P L235E P329G)。將輕鏈可變結構域融合至用於構築表現質體之輕鏈κ或λ恆定結構域。
因此，小鼠抗HER3/HER4抗體M-05-74經人類化以獲得M-05-74之下列人類化變體：
在如HEK或CHO等哺乳動物細胞培養系統中表現抗體，且經由蛋白質A及粒徑排阻層析純化。人類化抗體係以全長抗體或抗體片段表現或包含於免疫毒素偶聯物中(參見實例10)。評估人類化變體之如上文所闡述之結合及生物學性質。
實例13 M-05-74-Fab-假單胞菌外毒素偶聯物(M-05-74-PE)對活體內腫瘤細胞生長的抑制
將經編碼人類HER3之表現載體穩定轉染之人類A431-B34非小細胞肺癌細胞系經皮下接種於雌性SCID beige小鼠之右側腹中(1×107個細胞/動物)。
在腫瘤接種後第21天，將動物隨機分成治療組及一個媒劑組，使每組獲得約110mm3之中值腫瘤體積。在當天，以靜脈內方式使用M-05-74-Fab-假單胞菌外毒素偶聯物(M-05-74-PE)(1.0mg/kg)將動物治療2個週期，每一週期係由3q7d(每隔一天)組成。使對照接受媒劑(Tris緩衝液)。藉由一週暫停治療將兩個週期分開。
根據NCI方案(TV=(長度×寬度2)/2)計算原代腫瘤體積(TV)，其中「長度」及「寬度」係腫瘤團塊之長徑及短徑(以mm表示)(Corbett等人，1997)。自分期日(腫瘤接種後第21天)直至腫瘤接種後第42天執行計算，且將值記載為中值及定義為第三四分位數與第一四分位數之差之四分位距(IQR)。
為計算治療時段期間之腫瘤生長抑制(TGI)百分比，比較每一治療組與其各別媒劑對照。TV 第z天 代表所定義研究天(第z天)時個體動物之腫瘤體積且TV 第x天 代表分期日(第x天)時個體動物之腫瘤體積。
應用下式：
使用非參數方法應用治療對對照比率(TCR)與置信區間(CI)之計算。中值腫瘤體積及四分位距之結果顯示於圖19中。腫瘤生長抑制為M-05-74-Fab-假單胞菌外毒素偶聯物(M-05-74-PE)之66%且TCR為0.509(CI：0.33-0.734)。
實例14 抗體M-05-74(1)與WO2012/22814中所闡述之抗HER3抗體MOR09823(2)相比之至TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)之結合.
為Biacore T200儀器(GE Healthcare)安裝CM5系列感測器且根據製造商之說明書在HBS-ET+緩衝液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% w/v Tween 20)中標準化。樣品緩衝液係補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖)之系統緩衝液。在37℃下操作系統。在感測器表面上建立雙抗體捕獲系統。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學法將6500 RU mAb<M-IgG>R固定在所有流動細胞上。用1M乙醇胺使感測器去活化。流動細胞1用作參考且以10μl/min用抗TSH IgG1抗體捕獲1min。在流動細胞2上以10μl/min經1min捕獲M-5-74。在流動細胞3上以10μl/min經1min捕獲鼠類抗人類FC pan抗體，然後以10μl/min經1min注射抗HER3抗體M-05-74(1)或抗HER3抗體MOR09823抗體。流速設定為60μl/min。經5min注射濃度為0nM及150nM之溶液中分析物TtSlyDcys-HER3(SEQ ID NO：18)且經600秒監測解離。藉由以10μl/min經3min注射10mM甘胺酸(pH 1.7)緩衝液一次來使感測器完全再生。
圖20繪示顯示TtSlyDcys-Her3及緩衝液在150nM下之結合信號之疊加感應圖。上述疊加圖顯示抗體M-5-74在150nM TtSlyDcys-Her3(1)下結合。MOR09823抗體不結合TtSlyDcas-Her3(2)。(3)顯示 TtSlyDcas-HER3對mAb<M-IgG>R捕獲表面之背景結合信號。WO2012/22814中所闡述之抗HER3抗體MOR09823(2)在150nM TtSlyDcys-Her3下並未顯示任何相互作用。陽性對照抗體M-05-74(1)顯示對TtSlyDcas-Her3之顯著結合。當注射150nM TtSlyDcys(無HER-3插入)時，無法測定與兩種抗體之相互作用(數據未顯示)。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
<120> 結合至HER3之β-髮夾結構及HER4之β-髮夾結構之抗HER3/HER4
抗原結合蛋白
<130> 31325 FT
<150> EP 12191871.8
<151> 2012-11-08
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
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Thr Pro
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<213> 小家鼠
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<220>
<223> 重鏈可變結構域VH之人類化變體1，M-05-74_VH1
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<213> 人工
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<223> 重鏈可變結構域VH之人類化變體2，M-05-74_VH2
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<213> 人工
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<223> 重鏈可變結構域VH之人類化變體3，M-05-74_VH3
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<213> 人工
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<223> 輕鏈可變結構域VL之人類化變體1，M-05-74_VL1
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<213> 人工
<220>
<223> 輕鏈可變結構域VL之人類化變體2，M-05-74_VL2
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<212> PRT
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<223> HVR-H1之人類化變體1，M-05-74_HVR-H1_V1
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<213> 人工
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<223> HVR-H2之人類化變體1，M-05-74_HVR-H2_V1
<400> 39
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> HVR-L1之人類化變體1，M-05-74_HVR-L1_V1
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> HVR-L2之人類化變體1，M-05-74_HVR-L2_V1
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<211> 7
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<223> HVR-L2之人類化變體2，M-05-74_HVR-L2_V2
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 假單胞菌外毒素變體PE24LR8M_3G(包含GGG連接體)
<400> 45
<210> 46
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之輕鏈(M-05-74_LC)
<400> 46
<210> 47
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工
<223> 具有分選酶標籤之M-05-74 HC之重鏈(M-05-74_HC)
<220>
<400> 47
<210> 48
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 偶聯至假單胞菌外毒素變體PE24LR8M之M-05-74 HC之重鏈(Fab-074-PE重鏈1)
<400> 48
<210> 49
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 作為直接PE24LR8M融合物之偶聯至假單胞菌外毒素變體PE24LR8M之M-05-74 HC之重鏈(Fab-074-PE重鏈2)
<400> 49
<210> 50
<211> 147
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌
<400> 50
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 51
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 52
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
<210> 54
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
<210> 55
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
<210> 56
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
<210> 57
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
<210> 58
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58

Claims (19)

  1. 一種選擇結合至人類HER3且結合至人類HER4之抗原結合蛋白之方法，其中該抗原結合蛋白在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合；其中使用a)一種下列多肽：SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：1；及b)一種下列多肽：SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，其包括胺基酸序列SEQ ID NO：2；來選擇與a)之多肽及b)之多肽二者結合之抗原結合蛋白，且藉此選擇在胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合及在胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合之抗原結合蛋白。
  2. 如請求項1之方法，其中該抗原結合蛋白係抗體。
  3. 一種抗原結合蛋白，其係藉由如請求項1之選擇方法獲得。
  4. 如請求項3之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體。
  5. 一種結合至人類HER3且結合至人類HER4之經分離抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合且在人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結 合，a)其中該抗原結合蛋白結合至多肽SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，且b)其中該抗原結合蛋白結合至多肽SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4。
  6. 如請求項5之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體。
  7. 如請求項6之抗原結合蛋白，其中該抗體具有一或多個以下性質：a)該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：1；及/或b)該抗體結合至活化HER3中之該胺基酸序列SEQ ID NO：1；及/或c)該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3，SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3，SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3，SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3，及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；及/或d)該抗體結合至HER3之β-髮夾結構區域；及/或e)該抗體抑制HER3/HER2異源二聚體之異源二聚化；及/或f)該抗體結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為4.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))；及/或 g)該抗體結合至HER3-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為2.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))；及/或h)該抗體結合至胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或i)該抗體結合至活化HER4中之該胺基酸序列SEQ ID NO：2；及/或j)該抗體在包括於選自由以下組成之群之多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4，SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4，SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4，及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；及/或k)該抗體結合至HER4之β-髮夾結構區域；及/或l)該抗體結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(Ka(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(Ka(-神經生長因子))之締合常數(Ka)之比率為20.0或更高(Ka(+神經生長因子))/(Ka(-神經生長因子))；及/或m)該抗體結合至HER4-ECD，且在神經生長因子存在下(MR(+神經生長因子))與神經生長因子不存在下(MR(-神經生長因子))之結合莫耳比MR之比率為5.0或更高(MR(+神經生長因子))/(MR(-神經生長因子))；及/或n)該抗體作為單價Fab片段顯示與其二價全長親代抗體相比為相同或更高的生物活性；及/或o)該抗體抑制MCF-7細胞中之HER3磷酸化；及/或 p)該抗體並不與神經生長因子競爭結合HER3/誘導神經生長因子結合至HER3；及/或q)該抗體抑制MDA-MB-175腫瘤細胞之增殖；及/或r)該抗體顯示活體內之腫瘤生長抑制活性；及/或s)該抗體以KD值1×10-8M之親和力結合至HER3-ECD；及/或t)該抗體以KD值1×10-8M之親和力結合至HER4-ECD；及/或u)該抗體結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽及由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；及/或v)該抗體結合至由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽；及/或w)該抗體結合至由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；及/或x)該抗體在FACS分析中結合至表現HER3之T47D細胞；且其中在抗體暴露1h後量測時，該抗體顯示與神經生長因子不存在下之內化百分比相比，在神經生長因子存在下之內化百分比高至少25%。
  8. 如請求項6之抗原結合蛋白，其中該抗體結合至包括胺基酸序列VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)之長度為15個胺基酸之多肽及包括胺基酸序列VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之長度為15個胺基酸之多肽。
  9. 如請求項6至8中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗體包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3。
  10. 如請求項6至8中任一項之抗原結合蛋白，其包括(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(c)包括胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
  11. 如請求項6至8中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗體包括i)(a)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：26之HVR-H2；(c)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：28之HVR-L1；(e)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：29之HVR-L2；及(f)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；ii)或i)(a)、(b)、(d)及/或(e)抗體之該等HVR的人類化變體。
  12. 如請求項6至8中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗體包括i)(a)包括胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或ii)(a)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：38之HVR-H1；(b)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或iii)(a)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1； (b)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：41之HVR-L2；及(f)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3；或iv)(a)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：25之HVR-H1；(b)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：39之HVR-H2；(c)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：27之HVR-H3；(d)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：40之HVR-L1；(e)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：42之HVR-L2；及(f)包括該胺基酸序列SEQ ID NO：30之HVR-L3。
  13. 如請求項6至8中任一項之抗原結合蛋白，其為全長IgG1抗體或IgG4抗體。
  14. 如請求項6至8中任一項之抗原結合蛋白，其為Fab片段。
  15. 一種抗體，其包括：a)SEQ ID NO：33之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列；或b)SEQ ID NO：33之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列；或c)SEQ ID NO：34之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列；或d)SEQ ID NO：34之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列；或e)SEQ ID NO：35之VH序列及SEQ ID NO：36之VL序列；或f)SEQ ID NO：35之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列。
  16. 如請求項15之抗體，其為全長IgG1抗體或IgG4抗體。
  17. 如請求項15之抗體，其為Fab片段。
  18. 一種免疫偶聯物，其包括如請求項3至14中任一項之抗原結合蛋白或如請求項15至17中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  19. 一種醫藥調配物，其包括如請求項3至14中任一項之抗原結合蛋 白、如請求項15至17中任一項之抗體或如請求項18之免疫偶聯物及醫藥上可接受之載劑。
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