TWI519309B - 降低前列腺癌細胞對放射線之抗性及／或治療前列腺癌之藥劑及其應用 - Google Patents

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Description

降低前列腺癌細胞對放射線之抗性及/或治療前列 腺癌之藥劑及其應用
本發明係關於前列腺癌之治療，尤其關於降低前列腺癌細胞對放射線之抗性或治療前列腺癌之藥劑的提供與應用，其中該藥劑係包含一活性成分，該活性成分係一經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B(cytolethal distending toxin subunit B，CdtB)蛋白之奈米粒子。該藥劑可與放射線併用，提供優異之治療前列腺癌效果。
前列腺(prostate)又稱攝護腺，係一男性特有的生殖器官。近年來，前列腺癌已成為全球男性最普遍的癌症之一，其發生與年齡有關。在台灣，隨著國人飲食習慣改變，高脂肪性食物之攝取量增加，以及平均年齡增長，使得罹患前列腺癌的危險因子增加，前列腺癌的發生率與死亡率因而逐年上升，成為台灣男性十大癌症死因之一。惟前列腺癌之發生原因迄今未明，一般認為可能與遺傳、荷爾蒙、飲食及環境因素有關。早期攝護腺癌通常沒有症狀，但腫瘤侵犯或阻塞尿道、膀胱頸時，會發生類似下泌尿道阻塞或刺激的症狀，嚴重者可能出現急性尿瀦留、血 尿、尿失禁。於骨轉移時，甚至會引起骨骼疼痛、病理性骨折、貧血、脊髓壓迫導致下肢癱瘓等。
常見的前列腺癌治療方法，包括外科手術、荷爾蒙 療法以及放射線療法。其中，對於已有淋巴結轉移或骨轉移現象的前列腺癌患者而言，由於外科手術並無法完全切除已轉移的癌細胞，故無法有效根治前列腺癌。此外，由於前列腺癌好發於年長的患者，術後恢復情形較為緩慢，故通常傾向於不使用外科手術方法來治療。
至於荷爾蒙療法，係由於前列腺癌細胞起初為雄性 素依賴性(androgen-dependent)，須要雄性素之刺激始能生長或分裂繁殖，若缺乏雄性素則會呈現退化(regression)現象。因此，降低癌病患體內的雄性素可使癌細胞萎縮而死亡，臨床上經常使用雄性素壓抑(androgen suppression或androgen ablation)之荷爾蒙療法來進行前列腺癌治療。然而，荷爾蒙療法亦無法有效根治前列腺癌，蓋因部分前列腺癌細胞於一段時間後會轉變為雄性素非依賴性(androgen-independent)，其對雄性素壓抑之治療方式已不再有反應，而仍可持續地生長。
因此，不論外科手術治療或行荷爾蒙療法，通常皆須搭配其他治療方式，例如放射線療法。放射線療法是以集中的輻射線破壞前列腺癌細胞的DNA結構，使前列腺癌細胞無法持續增長。放射線療法之另一優點為，可對各種年齡及各種狀況之病患進行治療，且藉由儀器的輔助，使得其劑量及範圍更加精準。然而，於以放射線療法治療前列腺癌之後期，由於前列腺癌細胞中會產生一對放射線具抗性之癌細胞族群，該細胞族群於放射線 照射下仍可持續生長，使患者之病情又趨於惡化。
鑒於已知前列腺癌之治療成效有限，因此，於臨床 醫學上，仍需一種可有效治療前列腺癌，尤其是降低前列腺癌細胞對放射線之抗性的方法或藥物，以提升前列腺癌之治癒率。
本發明即係針對上述需求所為之研究。本案發明人 研究發現，經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B(cytolethal distending toxin subunit B，CdtB)之奈米粒子可使對放射線具抗性之前列腺癌細胞對放射線的敏感性增加，降低前列腺癌細胞對放射線之抗性，當該經載體包覆之CdtB蛋白奈米粒子與放射線併用時，可大幅增加放射線治療效益，降低患者前列腺癌復發率，對於中老年或不適合開刀之患者而言，實為一大福音。
本發明之一目的，在於提供一種使用一活性成分於製造降低前列腺癌細胞對放射線之抗性之藥劑的用途，其中該活性成分係一經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B(cytolethal distending toxin subunit B，CdtB)蛋白之奈米粒子。
本發明之另一目的，在於提供一種使用一活性成分於製造治療前列腺癌之藥劑的用途，其中該藥劑係與放射線併用，且該活性成分係一經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子。
本發明之又一目的，在於提供一種於一個體中降低前列腺癌細胞對放射線之抗性之方法，其係包含對該個體施用一有效量之活性成分，其中該活性成分係一經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子。
本發明之又一目的，在於提供一種於一個體中治療 前列腺癌之方法，其係包含於搭配放射線治療之情形下，對該個體施用一有效量之活性成分，其中該活性成分係一經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子。
本發明之又一目的，在於提供一種降低前列腺癌細 胞對放射線之抗性之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分，其中該活性成分係一經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子。
本發明之又一目的，在於提供一種治療前列腺癌之 醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分，其中該醫藥組合物係與放射線併用，且該活性成分係一經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描 述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
第1A圖顯示根據本發明一具體實施態樣之經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白(CdtB蛋白)之奈米粒子的照片圖；
第1B圖顯示一未包覆有CdtB之載體奈米粒子的照片圖；
第2圖顯示根據本發明一具體實施態樣之經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子之粒徑尺寸分布的長條圖，其中縱軸代表奈米粒子數目(百分比)，橫軸代表該奈米粒子之粒徑尺寸(奈米)；以及
第3圖係比較以不同方式處理之具放射線抗性之前列腺癌細胞 的存活率(*表示：P值小於0.01，具顯著差異)，縱軸代表相對於控制組之細胞存活率(百分比)，其中控制組係僅由載體奈米粒子(即，不含CdtB蛋白)處理前列腺癌細胞。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」或「治療有效量」，係指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體之病情的化合物數量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物。
空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)係造成人類腸胃炎的主要致病菌之一。經研究證實，細胞致死腫脹毒素(cytolethal distending toxin，Cdt)在空腸彎曲桿菌的致病過程中扮演了非常重要角色，此毒素會造成細胞腫脹，並使細胞週期停留在第二間期/分裂期(Gap 2 phase/Mitosis phase，G2/M phase)，最終導致細胞走向凋亡的機制。細胞致死腫脹毒素係一全毒素(holotoxin)，其係由CdtA、CdtB以及CdtC等三個次單元所組成，其中CdtA及CdtC具有結合到細胞膜上的功能，而CdtB則為細胞致死腫脹毒素中負責酵素活性的次單元，其具有能夠構造成DNA損傷的第一型去氧核醣核酸水解酶(type I deoxyribonuclease，DNase I)活性，並能夠使細胞週期暫停。
本案發明人研究後發現，將上述細胞致死腫脹毒素 次單元B(cytolethal distending toxin subunit B，CdtB)蛋白以載體包覆所提供之奈米粒子，可使對放射線具抗性之前列腺癌細胞對放射線的敏感性增加，有效降低前列腺癌細胞對放射線之抗性，當與放射線併用時，可提供顯著之治療前列腺癌的效果。
因此，本發明係關於經載體包覆之細胞致死腫脹毒 素次單元B(cytolethal distending toxin subunit B，CdtB)蛋白之奈米粒子於治療前列腺癌之應用，包括使用該經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白之奈米粒子於製造降低前列腺癌細胞對放射線之抗性的藥劑及/或製造治療前列腺癌的藥劑、對有需要之個體投予該經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白之奈米粒子以降低前列腺癌細胞對放射線的抗性及/或治療前列腺癌、以及提供包含該經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白之奈米粒子的醫藥組合物，該醫藥組合物係用於降低前列腺癌細胞對放射線之抗性，或與放射線併用以治療前列腺癌。
本發明所涉之細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白，可 以選殖與純化方式自空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)取得，此等方法可參見例如Lin et al.,Cholesterol depletion reduces entry of Campylobacter jejuni cytolethal distending toxin and attenuates intoxication of host cells,Infect.Immun.79(9),3563-3575(2011)，該文獻全文併於此處以供參考。
奈米粒子近年來係被廣泛應用於許多不同的領域 中，包括生物醫學、光學、以及電子領域，其潛在能力相當可觀，故在許多醫學研究係利用奈米粒子之粒徑非常微小的特性，而將 其進一步應用於藥物的包覆及遞送。於本發明中，細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白(CdtB蛋白)即係以經載體包覆而呈奈米粒子之形式。
於本發明中，包覆CdtB蛋白之載體係生物可相容之 物質。舉例言之，但不以此為限，可使用選自以下群組之至少一種生物可相容物質作為載體物質：幾丁聚醣、肝素、聚麩胺酸、三聚磷酸、聚丙烯酸、及聚乙二醇-幾丁聚醣。於本發明部分具體實施態樣中，係使用幾丁聚醣及肝素以包覆CdtB蛋白，提供所欲奈米粒子。
可視需要採用任何合宜的方法，以製備本發明經載 體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子。舉例言之，於本發明一具體實施態樣中，係透過一簡單的離子凝膠化法(ionic gelation method)，於室溫下混合載體物質及細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白，即可提供所欲之奈米粒子。
本發明經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子，其粒徑 通常不大於1000奈米，較佳不大於500奈米。其中，可視需要透過載體與細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白(CdtB蛋白)之相對用量，以調整奈米粒子之尺寸。一般而言，當CdtB蛋白之相對用量越高，所得奈米粒子之尺寸越大。舉例言之，當使用0.2毫升肝素溶液(2.0毫克/毫升)與2毫升幾丁聚醣溶液(1.5毫克/毫升)作為奈米粒子中的載體成分時，於0.2毫升且濃度分別為4.0、8.0、16毫克/毫升之CdtB蛋白用量下所提供之奈米粒子，其平均粒徑分別為約300奈米、約400奈米、以及約800-900奈米。
經發現，本發明經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒 子，可有效抑制對放射線具抗性之前列腺癌細胞的生長，增加對放射線具抗性之前列腺癌細胞對於放射線的敏感性。於不受理論限制下，咸信CdtB蛋白對於具放射線抗性之前列腺癌細胞具有高度的抑制能力，其主要原因在於CdtB蛋白可藉由作用於癌細胞的DNA以抑制其生長，而對放射線具抗性之前列腺癌細胞的複製能力較強，細胞內DNA含量較多，故容易為CdtB蛋白所抑制。因此，當合併使用該經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子與放射線於前列腺癌之治療時，可提供更有效之治療效果。
因此，本發明經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子， 可用以提供降低前列腺癌細胞對放射線之抗性或治療前列腺癌之醫藥組合物，及/或製造降低前列腺癌細胞對放射線之抗性或治療前列腺癌之藥劑，其中該治療係與放射線併用。該醫藥組合物或藥劑可視所欲的施用方式而呈對應之劑型。視使用形式及用途而定，該醫藥組合物或藥劑或可另外包含一醫藥上可接受之載劑。
舉例言之，但不以此為限，該醫藥組合物或藥劑可 以口服、皮下、或靜脈內等投藥方式施用至個體上。以適於口服投藥之劑型為例，於使用本發明經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子所製造之藥劑或所提供之醫藥組合物中，可含有不會不利影響經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子之所欲活性的醫藥可接受載劑，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。可利用任何合宜之方法，將該藥劑製成適於口服投藥的劑型或以適於口服投藥的劑型提供該醫藥組合物，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。
至於適於皮下或靜脈內注射之劑型，則可於使用本 發明經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子所製造之藥劑或所提供之醫藥組合物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該醫藥組合物或藥劑。
視需要地，可於使用本發明經載體包覆的CdtB蛋白 之奈米粒子所製造之藥劑或所提供之醫藥組合物中另含有調味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高該藥劑或醫藥組合物於服用時的口適感及視覺感受；另可添加合宜用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善該藥劑或醫藥組合物的儲存性。此外，該藥劑或醫藥組合物可視需要另含一或多種其他活性成分或與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該藥劑或醫藥組合物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子之所欲效益沒有不利的影響即可。
施用本發明經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子所 製造之藥劑或所提供之醫藥組合物時，該藥劑或醫藥組合物與放射線可同時、分開或連續施用。舉例言之，可以口服或注射方式投予本發明藥劑或醫藥組合物，不待時間經過即進行放射線治療；或者，可先以口服或注射方式投予本發明藥劑或醫藥組合物，於一段時間經過後(通常為24至48小時)，再進行放射線治療；又或者，可先進行放射線治療，於治療一段時間後，再以口服或注射方式投予本發明藥劑或醫藥組合物，其後再施以放射線治療。
可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥 頻率施用本發明經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子所製造之藥劑或所提供之醫藥組合物，端視投予個體之需求而異。舉例言之，當使用於人體以降低前列腺癌細胞對放射線之抗性時，可每天投藥一次，以CdtB蛋白計，經載體包覆之CdtB蛋白奈米粒子的用量為約1毫克/公斤體重至約5毫克/公斤體重，較佳為約2.5毫克/公斤體重至約4毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』係指每公斤體重個體所須之投藥量。當本發明經載體包覆的CdtB蛋白之奈米粒子所製造之藥劑或所提供之醫藥組合物與放射線併用以治療前列腺癌時，可每天投藥一次，以CdtB蛋白計，經載體包覆之CdtB蛋白奈米粒子的用量為約1毫克/公斤體重至約5毫克/公斤體重，較佳為約1.5毫克/公斤體重至約3毫克/公斤體重。 舉例言之，該藥劑或醫藥組合物與放射線併用時，每天投藥一次約2.5毫克/公斤體重之該藥劑或醫藥組合物，即可提供良好之治療效果。惟，對於前列腺癌病情嚴重之患者而言，其用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。
本發明亦提供一種於一個體中降低前列腺癌細胞對 放射線之抗性之方法，其係包含對該個體施用一有效量之活性成分，其中該活性成分係一經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子。其中，有關該載體之選用以及該經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子的施用型態與劑量，均如上述之說明。
本發明另提供一種於一個體中治療前列腺癌之方法，其係包含於搭配放射線治療之情形下，對該個體施用一有效量之活性成分，其中該活性成分係一經載體包覆之CdtB蛋白之奈 米粒子。其中，有關該載體之選用以及該經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子的施用型態與劑量，亦均如上述之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
[實施例]
實施例1：經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白之奈米粒子之製備
先混合0.2毫升之CdtB蛋白(4.0毫克/毫升)、0.2毫升之肝素溶液(2.0毫克/毫升)、再將混合液加入2毫升之幾丁聚醣溶液(1.5毫克/毫升)中，於室溫下攪拌歷時10分鐘。以15,000g離心該混合液歷時50分鐘，去除上清液而收集沉澱物(即，經載體包覆之CdtB蛋白顆粒)。
將所收集之沉澱物分散於去離子水中，以得到一懸浮液，以穿透電子顯微鏡觀察該懸浮液中之粒子型態，且以動態光散射光譜儀(或稱粒徑分析儀)(型號：Zetasizer ZS90；廠牌：Malvern分析儀器公司，英國)分析該懸浮液中之顆粒的粒徑分布，結果分別示於第1A圖及第2圖。如第1A圖及第2圖所示，所製得經載體包覆之CdtB蛋白顆粒，其粒徑皆小於500奈米，屬於奈米粒子範圍，且平均粒徑為約300奈米(下簡稱為「經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子」)。
此外，使用相同條件但不添加CdtB，製造未包覆有CdtB之載體奈米粒子，供以下實驗之用，其粒子型態亦經穿透電子顯微鏡觀察，結果示於第1B圖。如第1B圖所示，所製得未包 覆有CdtB之載體奈米粒子，其粒徑約為200至250奈米。
實施例2：癌細胞毒殺試驗
於此實施例中，透過1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯甲腊(1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan，簡稱MTT)之使用，來了解經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子是否會影響前列腺癌細胞之存活率。
MTT是一種水溶性的四唑鹽，可作用於活細胞粒線體中的呼吸鏈，在琥珀酸去氫酶(succinate dehydrogenase，簡稱SDH)與細胞色素C(cytochrome c，簡稱cyt c)的作用下，將MTT結構中的四氮唑溴鹽(tetrazolium bromide)代謝還原，產生不溶於水的藍紫色結晶甲腊(formazan)。該結晶物的生成量與活細胞數目成正比(死細胞中的琥珀酸去氫酶消失，無法將MTT還原)，且粒腺體乃細胞中對環境因素最為敏感的胞器，故可以MTT分析作為細胞經藥物處理後存活率的指標。
以每孔5×103的起始細胞數目，將對放射線具抗性之前列腺癌細胞(DAB2IP缺失的PC3-KD細胞株)培養於96孔的細胞培養盤中(共四組)，於37℃、含有體積5%二氧化碳的培養箱中培養24小時後，分別以如下方式處理：(i)以500毫微莫耳濃之未包覆有CdtB之載體奈米粒子處理24小時(下簡稱為「參考組」)、(ii)500毫微莫耳濃度之經載體包覆之CdtB蛋白奈米粒子處理24小時(下簡稱為「CdtB奈米粒子組」)、(iii)以放射線照射(吸收劑量：2戈雷(Gray，Gy)；照射時間：3分鐘)(下簡稱為「放射線組」)、以及(iv)先以500毫微莫耳濃度之經載體包覆之CdtB蛋白之奈米粒子處理後，再以放射線照射(吸收劑量： 2戈雷；照射時間：3分鐘)，並反應24小時(下簡稱為「CdtB奈米粒子+放射線」)。分別於處理完畢之後，移除上清液，並於培養盤的每個孔中分別加入10微升MTT與100微升培養液，避光反應歷時4小時，移除全部培養液，再於每個孔分別加入100微升二甲基亞碸(DMSO)，避光反應歷時10分鐘，測定570奈米波長之吸光值。以「參考組」所測得之吸光值設為控制組(存活率為100%)，據此計算各組前列腺細胞之存活率，結果示於第3圖及表1。
由第3圖及表1的結果可知，「放射線組」之癌細胞存活率仍高達95.30%，此說明單獨以放射線處理並無法有效殺死對放射線具抗性之前列腺癌細胞，並確認所實驗之前列腺癌細胞對有放射腺具抗性；「CdtB奈米粒子組」之結果顯示，單獨使用CdtB奈米粒子即可使對放射線具抗性之前列腺癌細胞的存活率降低至69.73%，說明CdtB奈米粒子本身即具有治療前列腺癌之效果；「CdtB奈米粒子+放射線」組之結果顯示，以「CdtB奈米粒子」合併「放射線」處理對放射線具抗性之前列腺癌細胞，可使前列腺癌細胞的存活率降低至55.4%，此說明「CdtB奈米粒子」具有降低前列腺癌細胞對放射線之抗性的能力，故於併用放射線時，可使癌細胞存活率由單獨使用CdtB奈米粒子所提供之69.73%， 進一步降低至55.4%。

Claims (6)

  1. 一種使用一活性成分於製造降低前列腺癌細胞對放射線之抗性之藥劑的用途，其中該活性成分係一經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B(cytolethal distending toxin subunit B，CdtB)蛋白之奈米粒子，且該載體係包含幾丁聚醣及肝素。
  2. 一種使用一活性成分於製造治療前列腺癌之藥劑的用途，其中該藥劑係與放射線併用，且該活性成分係一經載體包覆之細胞致死腫脹毒素次單元B(cytolethal distending toxin subunit B，CdtB)蛋白之奈米粒子，該載體係包含幾丁聚醣及肝素。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該奈米粒子的粒徑係不大於1000奈米。
  4. 如請求項3之用途，其中該奈米粒子的粒徑係不大於500奈米。
  5. 如請求項1或2之用途，其中該奈米粒子的平均粒徑為300奈米至400奈米。
  6. 如請求項1或2之用途，其中該細胞致死腫脹毒素次單元B蛋白係選殖自空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)。
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