TWI511724B - 治療出血性腦中風及顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之醫藥組成物 - Google Patents

Description

治療出血性腦中風及顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之醫藥組成物

本發明係關於一種治療出血性腦中風及顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之醫藥組成物，尤指一種以甲基天門冬酸(NMDA)受體拮抗劑治療出血性腦中風及顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之醫藥組成物。

腦中風為台灣十大死因之一，每年約有三萬至五萬人腦中風，且腦中風後產生二次中風之機率相當高。即便目前腦中風之死亡率因醫療進步而降低，但腦中風之發生率仍高居不下。此外，腦中風為長期慢性疾病，對於病患及其家屬均造成身心及經濟上的負擔。

腦中風主要分為缺血性腦中風及出血性腦中風。一般而言，缺血性腦中風約佔80%，而出血性腦中風約佔20%，且兩者起因相當不同。所謂的缺血性腦中風為腦部血液流通不良或阻塞所導致之腦缺血，一般亦稱之為腦梗塞；而所謂的出血性腦中風則為腦血管破裂所導致之腦出血。

出血性腦中風又可分為自發性顱內出血及蜘蛛膜下腔出血，其中，蜘蛛膜下腔出血之發生比例約佔腦中風(包括出血性及缺血性腦中風)之5-10%，且一旦發生會造成極高的死亡率與致殘率。統計結果顯示，約有三成的蜘蛛膜下腔出血所導致之腦中風之病患，病發後一個月內即死亡。此外，當蜘蛛膜下腔出血發生後，急性期會導致顱內壓上 升及伴隨的大腦灌注壓下降，使腦部呈現缺血狀態，造成神經細胞損害；且之後甚至會造成腦血管痙攣，而伴隨其他類型中風產生。

目前缺血性腦中風之治療發展較為完備，而對於出血性腦中風之治療仍尚待開發中。有鑒於出血性腦中風，特別是蜘蛛膜下腔出血之死亡率與致殘率相當高，故目前仍需發展藥物，期可減少出血性腦中風所導致之神經細胞損害及腦血管痙攣，進而提升出血性腦中風之治療效果。

本發明之主要目的係在提供一種治療出血性腦中風及顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之醫藥組成物，俾能減少細胞凋亡而達到神經保護的效果，進而減少腦神經損傷與血管痙癴。

為達成上述目的，本發明之治療出血性腦中風之醫藥組成物，包括：一有效劑量之甲基天門冬酸(NMDA)受體拮抗劑；以及一醫藥上可接受之載體。其中，本發明尤指治療顱內蜘蛛膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)所導致之出血性腦中風。

此外，本發明之治療顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之醫藥組成物，亦包括：一有效劑量之甲基天門冬酸受體拮抗劑；以及一醫藥上可接受之載體。

由於出血性腦中風及顱內蜘蛛膜下腔出血等腦部出血，會造成興奮性神經傳導物質谷胺酸(glutamate)大量釋 放，而此谷胺酸上升所引起之興奮毒效應(excitotoxicity)會造成神經細胞損害，並藉由增加細胞鈣離子的內流，而引發後續一連串訊號傳遞，最後導致細胞壞死或凋亡。特別是在顱內蜘蛛膜下腔出血發生初期(約1-3天內)，即會造成細胞壞死或凋亡。由於本發明之治療出血性腦中風及顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之醫藥組成物，NMDA受體拮抗劑可藉由抑制興奮毒效應，以減少後續細胞凋亡，進而達到神經保護的效果。此外，在顱內蜘蛛膜下腔出血發生一段時間後(約7-9天內)，更會產生腦血管痙攣(Vasospasm)的現象，而產生腦組織缺血缺氧，甚至是引發其他如缺血性腦中風之產生。由於本發明之醫藥組成物，NMDA受體拮抗劑可減少腦神經損傷及血管痙攣之發生率，故可提升出血性腦中風及顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之治療效果。

於本發明之醫藥組成物中，NMDA受體拮抗劑可為本技術領域已知之NMDA受體拮抗劑，如ACBC、DL-AP5及其鈉鹽、D-AP5、L-AP5、D-AP7、DL-AP7、魁蛤素硫酸鹽(Arcaine sulfate)、(R)-4-羧苯基甘氨酸((R)-4-Carboxyphenylglycine)、CGP 37849、CGP 39551、CGP 78608氫氯酸鹽(hydrochloride)、CGS 19755、7-氯犬尿氨酸(7-Chlorokynurenic acid)及其鈉鹽、(2R,3S)-克洛費葛((2R,3S)-Chlorpheg)、CNQX、Co 101244氫氯酸鹽、芋螺毒素-R(Conantokin-R)、芋螺毒素-T、(R)-CPP、(RS)-CPP、D-CPP-ene、氫溴酸右美沙芬(Dextromethorphan hydrobromide)、5,7-二氯犬尿喹啉酸(5,7-Dichlorokynurenic acid)及其鈉鹽、(±)-1-(1,2-二苯乙基)馬來酸哌啶酯((±)-1-(1,2-Diphenylethyl)piperidine maleate)、依利羅地(Eliprodil)、非爾氨酯片(Felbamate)、馬來酸氟吡汀(Flupirtine maleate)、加維斯替奈(Gavestinel)、(S)-(-)-HA-966、HU 211、N-(4-羥基苯基乙醯基)精胺(N-(4-Hydroxyphenylacetyl)spermine)、酒石酸艾芬地爾(Ifenprodil hemitartrate)、threo-酒石酸艾芬地爾、氯胺酮鹽酸鹽(Ketamine hydrochloride)、(S)-(+)-氯胺酮鹽酸鹽、L-689,560、L-701,252、L-701,324、鹽酸洛呱丁胺(Loperamide hydrochloride)、LY 233053、LY 235959、鹽酸美金剛(Memantine hydrochloride)、(-)-MK 801馬來酸酯((-)-MK 801 maleate)、(+)-MK 801馬來酸酯、去甲基愷他命氫氯酸鹽(Norketamine hydrochloride)、NPEC-類-D-AP5(NPEC-caged-D-AP5)、噴他脒羥乙磺酸鹽(Pentamidine isethionate)、鹽酸苯環利定(Phencyclidine hydrochloride)、PMPA、PPDA、PPPA、瑞馬西氯酸鹽(Remacemide hydrochloride)、Ro 04-5595氯酸鹽(Ro 04-5595 hydrochloride)、Ro 25-6981馬來酸鹽(Ro 25-6981 maleate)、Ro 61-8048、Ro 8-4304氯酸鹽(Ro 8-4304 hydrochloride)、SDZ 220-040、SDZ 220-581、合成靈(Synthalin sulfate)、TCN 201、TCN 213及TCS 46b。較佳為，NMDA受體拮抗劑係為美金剛(Memantine)、其鹽類、或其醫藥上可接受之類似物。更佳為，NMDA受體拮抗劑係為美金剛。

於本發明之醫藥組成物中，以一般成人來計，NMDA受體拮抗劑之有效劑量可為1-1000mg/天；較佳為25-250mg/天；且更佳為50-100mg/天。特別是，美金剛之有效劑量可為1-1000mg/天；較佳為25-250mg/天；且更佳為50-100mg/天。在此，「mg/天」係指每天投予治療主體之劑量(mg)。

此外，於本發明之醫藥組成物中，NMDA受體拮抗劑或美金剛之有效劑量亦可為0.05-100mg/Kg；較佳為1-50mg/Kg；且更佳為5-30mg/Kg。在此，「mg/Kg」係指每公斤之主體所投予之劑量(mg)。

「醫藥上可接受之載體」意指載體須能與活性成分相容(較佳係能穩定活性成分)，且不可在治療過程中危害個體。其中，載體可為至少一選自：活性劑、輔劑、分散劑、潤濕劑、及懸浮劑所組成之群組，如微晶質纖維素(microcrystalline cellulose)、甘露糖醇(mannitol)、葡萄糖、脫脂奶粉、聚乙烯、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylprrolidone)、澱粉、或其組合物。

此外，於本發明之醫藥組成物中，所謂之「可接受」，即其必須與醫藥組成物中之活性藥物相容(較佳係能穩定活性藥物)，並且不能對被治療之試體造成傷害。於此所使用的「治療」一詞，係指將本發明之醫藥組成物，投予至出血性腦中風或顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷的主體，以期達到抑制、醫治、改善、改進、治癒、減輕、減緩、改變或影響細胞凋亡、腦神經損傷，或細胞凋亡、腦神經損傷之傾向。此外，於此所使用之「有效劑量」一詞， 係指能夠對於受治療主體產生預期療效所需的活性藥劑量，且其會根據投藥路徑、使用賦形劑、以及與其它藥劑共同使用的可能性而改變。

除上述醫藥組成物外，本發明更提供一種出血性腦中風或顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之治療方法，包括：投予一有效劑量之甲基天門冬酸受體拮抗劑(NMDA受體拮抗劑)至一所需主體。其中，所使用之甲基天門冬酸受體拮抗劑係如前所述，故在此不再贅述。

此外，於本發明之治療方法中，NMDA受體拮抗劑之投予劑量係與前述相同，故在此不再贅述。

再者，於本發明之治療方法中，NMDA受體拮抗劑之投予方式，係為於出血性腦中風或顱內蜘蛛膜下腔出血發生時，先注射高濃度(第一劑量)之NMDA受體拮抗劑，其中第一劑量可為10-100mg/Kg，較佳為10-50mg/Kg；且更佳為5-30mg/Kg；而後，於施予第一劑量之隔天以後，則注射低濃度(第二劑量)之NMDA受體拮抗劑，其中第二劑量可為0.05-20mg/Kg；較佳為0.1-10mg/Kg；且更佳為0.1-5mg/Kg。藉由持續施予第二劑量之NMDA受體拮抗劑，可達到保護神經細胞，減少後續腦血管痙或其他類型中風之發生率。

本發明之醫藥組成物及方法可經由非口服、噴霧吸入、局部、經直腸、經鼻、舌下、陰道、或經由植入型藥盒(implanted reservoir)等方式投藥。於此使用之「非口服」(“parenteral”)係指皮下注射、皮內注射、靜脈內注射、肌 肉內注射、關節腔內注射、動脈內注射、關節液內注射、胸腔內注射、脊髓內注射、疾病部位內注射、及顱內注射或注入技術。在此，本發明之醫藥組成物及治療方法所使用之投藥方式並無限制，可依照治療患者之病情及生理狀況進行調整。

實驗小鼠

於本發明中，係使用雄性SD鼠(Sprague-Dawley rat)進行試驗，且此些SD鼠係購自國立成功大學之實驗動物中心。此些SD鼠體重約350-450g，且區分為三組：進行假手術之sham組(33隻)、進行蜘蛛膜下腔出血(SAH)處理且投與生理實驗水進行治療之SAH組(36隻)、及進行蜘蛛膜下腔出血處理且投與美金剛進行治療之SAH+M組(40隻)。

在此，係使用本技術領域已知之頸內動脈(internal carotid artery,ICA)穿線法製作蜘蛛膜下腔出血動物模型，其手術步驟約略如下所述。首先，使用異氟烷(4%誘導麻醉，並以1.5%維持麻醉狀態)進行小鼠麻醉。於整個手術及甦醒過程中，以加熱墊或燈泡維持肛溫在37±5℃。將右外頸動脈(external carotid artery,ECA)分離去除，並保留血管殘端(stump)。以血管夾暫時鉗夾右總頸動脈(common carotid artery,CCA)及ICA，再將縫線(sharpen 3-0 prolene filament,Ethicon,Inc.)導入ECA之殘端中，並於ECA殘端處打結。鬆開CCA及ICA之血管夾，將縫線穿過頸部ICA並於分 叉處刺穿頸部頸部ICA。刺穿部位約在ECA及ICA分叉處20mm處。當小鼠抵抗時，將縫線向前更推進3mm，再移除縫線。手術後，將小鼠至於培養箱中進行甦醒步驟。經由上述步驟，則可建立小鼠蜘蛛膜下腔出血模型。除此之外，進行上述步驟，但不進行刺穿步驟，則可建立假手術之模型。至於SAH模型是否建立成功，則以解剖方式加以確認。

經上述手術後，於SAH+M組中，係在SAH處理後立即注射載劑(生理食鹽水)或腹膜注射美金剛，其中美金剛係溶於生理食鹽水中，並使其濃度為20mg/l；於SAH處理後隨即注射劑量為20mg/Kg之美金剛溶液，而後每天注射兩次且注射劑量為1mg/Kg之美金剛溶液。此外，sham組與SAH組則分別注射與SAH+M組相同體積之磷酸鹽緩衝溶液(PBS)及生理時鹽水。

在此，於SAH處理前後，所有的小鼠均飼養於室溫下，且可自由攝取食物及水；並使用加熱墊維持小鼠體溫在37℃。

體重測量

小鼠食慾係以測量體重方式進行評估。其中，於SAH或假手術進行前測量小鼠體重，並於手術後24及72小時時測量體重。結果係如圖1A所示，其中係以SAH或假手術前之小鼠體重作為100%，#表示p<0.05，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

如圖1A所示，當SAH手術後，小鼠之食慾及飲水均受到嚴重影響。於手術1天後，sham組體重減少至92.93±3.34 %，SAH組體重減少至89.78±2.76%；於手術3天後，sham組體重減少至92.47±3.17%，SAH組體重減少至84.83±5.38%。然而，於手術3天後，相較於SAH組，SAH+M組小鼠之明顯增加至90.77±4.12%。於sham組及SAH+M組之小鼠體重變化並不太大差異，此結果顯示，投予20mg/Kg之美金剛確實可達到抑制小鼠體重減少之效果，且對於小鼠活動力有改善的功效。

自發活動力(locomotor activity)測量

於手術1天及3天後，將小鼠放置在動物活動測量儀(Optovarimax,Med Associates,Inc./USA)內之客製化透明耐熱有機玻璃腔室中(plexiglas chamber,41cm 41cm 30cm)約10分鐘，以紅外線測量小鼠活動力。

將小鼠分別放置在腔室中央，並使其自由活動10分鐘。垂直射線(IR)中斷數目則作為縱向移動指標，而水平移動距離則作為行走活動指標。在此，所謂的自發活動數值係為縱向移動指標與行走活動指標之加總數值。結果係如圖1B所示，自發活動數值係列於縱軸，而縱軸所示之「紅外線感測數值」即為垂直射線中斷數目與水平移動距離之加總數值，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

如圖1B所示，相較於sham組，SAH組小鼠之自發活動力大幅降低。然而，投予美金剛治療之SAH+M組小鼠，無論是手術1天或3天後，其活動力均與sham組小鼠相仿。特 別是，於手術3天後，SAH+M組小鼠活動力幾乎完全恢復。此結果顯示，投予美金剛確實提升SAH小鼠之活動力。

感覺運動活動力(sensoimotor activity)測量

在此，係以加速轉棒測試(Ugo Basile Biological Research Apparatus,Italy)測量小鼠之感覺運動活動力。首先，先訓練小鼠可在加速轉棒上停留，其中轉棒前5分鐘之轉速為4-40rpm，而後每30秒將轉速提升4rpm，每天每回訓練小鼠三次，共訓練三回，且共訓練五天。

當小鼠訓練完後，進行手術，並於手術1天及3天後，測量小鼠停留在轉棒上之時間。結果係如圖1C所示，其中**表示p<0.01，***表示p<0.001。

如圖1C所示，於手術1天及3天後，SAH小鼠之活動力大幅減少；而投予美金剛治療之SAH+M組小鼠，其活動力均與sham組小鼠相仿。特別是於手術3天後，SAH+M組小鼠之活動力仍持續提升。此結果顯示，投予美金剛確實提升SAH小鼠之感覺運動活動力。

平衡測試

平衡測試係用以評估前庭大肌肉活動力。此測試係將小鼠置於60cm方形木棒(1.0cm寬且具地板50cm高)上，並將小鼠直立於木棒中間最多60秒，且持續紀錄小鼠維持在木棒上的時間60秒。結果係如圖1D所示，其中*表示p<0.05，***表示p<0.001。

如圖1D所示，SAH組小鼠平衡感明顯較sham組差；但SAH+M組小鼠平衡感卻與sham組相仿。此結果顯示，投予美金剛確實提升SAH小鼠之平衡感。

抓力測試

抓力測試係用以測量小鼠肌肉神經系統，其係在一般實驗室條件下從早上9點測試至下午4點。結果係如圖2A所示，其中**表示p<0.01，***表示p<0.001。

如圖2A所示，相較於sham組小鼠，SAH組小鼠抓力明顯降低；但SAH+M組小鼠抓力卻與sham組相仿。

楔形樑平衡測試

楔形樑平衡測試可用以評估身體運動(somatomotor)、動機與注意功能(motivational and attentional function)、及自發活動力。

首先，於有燈光及聲音的干擾下，訓練小鼠可在起始處寬6cm而末端寬1.5cm之長1.6m的楔形樑上移動。將寬度小於楔形樑2公分之木塊貼附在楔形樑底面，以作為小鼠在楔形樑頂面不平衡時可選擇降落之階梯。而後，當小鼠越過楔形樑並進入暗房中後，將燈光及聲音瞬間關閉。此訓練共進行五天，每天進行三次，並以錄影方式紀錄小鼠活動。一般而言，正常小鼠會停留在楔形樑上而不會降落至階梯上，但有活動力缺陷的小鼠則會降落至階梯上。在此，係紀錄小鼠停留在楔形樑上所需時間，並測量小鼠降落至階梯上之數目。結果係如圖2B所示，其中縱軸表示*表示p<0.05。

當小鼠經過5天訓練後，可正確穿越楔形樑，則進行手術。如圖2B所示，於手術1天後，sham組小鼠不平衡步數比例為5.76±2.45%，SAH組小鼠為37.97±12.99%；於手術3天後，sham組小鼠為6.36±1.22%，而SAH組小鼠為36.56±11.33%。然而，相較於SAH組小鼠，SAH+M組小鼠不平衡步數比例大幅降低，甚至與sham組小鼠差不多。此結果顯示，投予美金剛確實提升SAH小鼠之步態正確性。

由上述圖1A至圖1D及圖2A至圖2B結果顯示，以美金剛治療SAH小鼠時，確實可達到提升小鼠活動力之功效，且可改善蜘蛛膜下腔出血後之神經行為。

檢測細胞中凋亡蛋白酶-3表現量

由於蜘蛛膜下腔出血會活化細胞凋亡，而有凋亡蛋白酶-3(caspase-3)表現量增加的情形發生。在此，係以西方墨點法檢測各組小鼠之凋亡蛋白酶-3蛋白表現量。本實驗中所使用之西方墨點法係與本技術領域常用之方法相同，故在此僅約略描述。

於假手術或SAH手術後24小時，收集小鼠腦組織，並在RIPA裂解液中均質化腦組織，而得到腦部萃取液。而後，以8-12%的SDS PAGE分析萃取液，轉漬至硝基纖維素薄膜，以5%脫脂牛奶(溶於PBST中)固定1小時，以一級抗體係為抗凋亡蛋白酶-3抗體(1：1000,Cell Signaling)於4℃下反應一小時，經多次PBST清洗後，再與連接有辣根過氧化物酶之抗老鼠IgG抗體(1：5000,Gene Tex)之二級抗體進行反應，經多次PBST清洗後，以增強型化學發光套組 (enhanced chemiluminescence kit,Pekin Elmer)進行測量。於本實驗中，係以β-肌動蛋白作為內標準，且測量後之量化數據係如3所示，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01。

如圖3所示，於SAH手術24小時後，腦組織中之凋亡蛋白酶-3表現明顯增加(SAH組)；然而，於於SAH+M組小鼠與sham組小鼠之凋亡蛋白酶-3表現量卻差異不大。此結果顯示，SAH所誘發之細胞凋亡確實可受到美金剛所抑制，故美金剛確實可達到抑制細胞凋亡之功效，進而達到保護神經細胞之目的。

檢測神經細胞凋亡

為了驗證細胞凋亡是否發生在神經細胞上，在此，係使用雙螢光標記法進行測試。其中，以NeuN/凋亡蛋白酶-3檢測神經細胞凋亡，並以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)複染劑染細胞核。

於抗原修復後，將組織切片細胞打動，並以含有0.5% Triton X-100之5%正常驢子血清(sigma)固定1小時。本實驗中，一級抗體係為抗-NeuN之單株抗體(1：50,Millipore)；二級抗體係為NeuN之Alexa Fluor 488結合羊之抗老鼠抗體(1：300,Invitrogen)、及凋亡蛋白酶-3之Alexa Fluor 555結合羊之抗老鼠抗體(1：300,Invitrogen)。將組織切片與DAPI反應，以固定液(螢光固定液；Dako)將細胞接種在載玻片上，並以螢光顯微鏡(Olympus BX-51)與全景組織體細胞定量分析儀(FACS-like Tissue Cytometry)進行檢測。當進行SAH手 術三天後，所測得之結果係如圖4A至圖7B所示，其中*表示p<0.05，***表示p<0.001。

如圖4A及圖4B所示，相較於SAH小鼠，SAH+M小鼠之腦皮層中可染到較少之凋亡蛋白酶-3；若以SAH小鼠陽性凋亡蛋白酶-3作為100%，則可得到如圖5A與圖5B之數據圖。

此外，如圖6A至圖7B所示，無論是在腦海馬體(與認知功能相關區域)之DG區域(圖6A及圖6B)或是CA區域(圖7A及圖7B)，相較於SAH小鼠，SAH+M小鼠之腦海馬體之DG區域與CA區域，均可染到較少之凋亡蛋白酶-3。

如圖4A至圖7B所示，於SAH組小鼠中，無論是腦皮層、腦海馬體DG區域及腦海馬體CA區域，其陽性染色細胞數目均較SAH+M組小鼠多。此結果顯示，當施予美金剛時，可達到抑制神經細胞凋亡之效果，進而達到神經保護之功效。

為了驗證細胞凋亡是否發生在膠質細胞(glia)上，在此更以凋亡蛋白酶-3/GFAP染色檢測SAH手術一天後之組織切片。結果係如圖8A及圖8B所示，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01。

如圖8A及圖8B，相較於SAH小鼠，SAH+M小鼠之神經細胞凋亡數目較少；此結果顯示，當施予美金剛時，美金剛可抑制膠質細胞凋亡，進而達到保護神經之功效。

當於SAH手術五天後，計算NeuN之螢光免疫染色結果，以代表腦內神經細胞數目。在此，係以SAH組小鼠之 腦內神經細胞數目作為100%，結果係如圖9所示，其中*表示p<0.05。

如圖9所示，當以美金剛治療SAH手術處理之小鼠後(SAH+M組)，小鼠之腦內神經細胞數目遠多於未以美金剛治療之SAH小鼠(SAH組)；此結果顯示，施予美金剛確實可達到防止神經細胞凋亡之功效。

血腦屏障(BBB)檢測

在此，係使用伊文思藍色染劑(EB)作為白蛋白外滲(albumin extravasation)之標記，以減測血腦屏障通透度。

於SAH手術24小時後以頸靜脈注射EB(2%，溶於生理食鹽水中，4ml/kg)，並使其循環30分鐘。而後，開胸並在110mmHg壓力下以250ml生理食鹽水穿心灌注15分鐘。將小鼠犧牲後，取出腦部且解剖取得腦皮層與小腦，將此部分分開秤重，以進行EB-白蛋白外滲定量。於添加2.5ml之60%三氯乙酸沉澱蛋白質後，以2.5ml磷酸鹽緩衝溶液透過震盪2分鐘將腦樣品均質化。將樣品冷卻，並於1000g下離心30分鐘。使用光譜儀(Shimadzu UV1208,Japan)於620nm波長夏測量上清液中EB吸收值，而腦組織中之EB值係以μg/g表示之。以sham組小鼠之EB值作為100%(藍色染劑顯色比例)，其結果係如圖10A及圖10B所示，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01。

如圖10A所示，於腦皮層中，SAH組小鼠所測得之EB值(10.90±2.06μg/g)遠高於sham組小鼠所測得之EB值(4.56±0.96μg/g)。如圖10B所示，於小腦中，SAH組小鼠所 測得之EB值(9.45±0.73μg/g)亦遠高於sham組小鼠所測得之EB值(6.31±0.93μg/g)。然而，如圖10A與圖10B所示，當施予美金剛後，無論是在腦皮層或小腦中，相較於SAH組小鼠，SAH+M組小鼠所測得之EB值均顯著降低；此結果代表施予美金剛可於SAH後恢復血腦屏障。

腦血管痙攣檢測

於SAH手術後72小時，進行腦血管痙攣檢測。在此，係使用本技術領域已知之組織切片染色進行檢測；並選取基底動脈(BA)與中腦動脈(MCA)最窄區域以全景方式測量直徑、圓周及動脈血管壁。動脈直徑定義係為長軸與短軸之平均值；動脈血管壁厚度則為延著血管周圍在四個等距離點上，管腔表面至血管橫切面中層外緣之距離；並比較各組之基底動脈管壁厚度比例。結果係如圖11A及圖11B所示，其中*表示p<0.05，且以sham組小鼠之數值作為100%。

如圖11A所示，SAH組小鼠之中腦動脈直徑較sham組小鼠小，而SAH+M組小鼠之中腦動脈直徑則幾乎可恢復至與sham組小鼠差不多。此結果顯示，SAH會造成血管痙攣的現象，而施予美金剛則可減緩血管痙攣的現象。

此外，於組織切片結果可發現(請同時參考圖11B)，sham組小鼠之基底動脈具有較薄管壁且較大的管腔，SAH組小鼠其管壁較厚且管腔較窄，代表SAH組小鼠有血管痙攣的現象。然而，施予美金剛之SAH+M組小鼠，其血管管腔較SAH組小鼠大，且血管管壁厚度也較SAH小鼠薄，此結果代表經美金剛處理後，血管痙攣的現象則有所改善。

綜上所述，本發明利用NMDA受體拮抗劑，特別是美金剛，可於蜘蛛膜下腔出血後，抑制腦神經細胞凋亡，進而減少腦神經損傷，以達到神經保護之作用。同時，本發明所使用NMDA受體拮抗劑，特別是美金剛，更可達到改善血管痙攣之功效，故可防止因蜘蛛膜下腔出血所導致之出血性腦中風後所造成之腦組織缺血缺氧，進而減少引發其他如缺血性腦中風之二次中風發生率。

上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。

圖1A係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠之體重變化測量結果圖。

圖1B係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠之自發活動力測量結果圖。

圖1C係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠之感覺運動活動力測量結果圖。

圖1D係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠平衡測量結果圖。

圖2A係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠抓力測量結果圖。

圖2B係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠楔形樑測試結果圖。

圖3係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠之凋亡蛋白酶-3表現量化結果圖。

圖4A係為以雙螢光標記法檢測腦皮層神經細胞中之凋亡蛋白酶-3平均強度與DAPI平均強度之關係圖。

圖4B係為以雙螢光標記法檢測腦皮層神經細胞中之凋亡蛋白酶-3平均強度與NeuN平均強度之關係圖。

圖5A係顯示以雙螢光標記法檢測腦皮層神經細胞中之陽性凋亡蛋白酶-3之細胞百分比。

圖5B係顯示以雙螢光標記法檢測腦皮層神經細胞中之陽性凋亡蛋白酶-3/陽性NeuN之細胞百分比。

圖6A係顯示以雙螢光標記法檢測腦海馬體DG區域神經細胞中之陽性凋亡蛋白酶-3之細胞百分比。

圖6B係顯示以雙螢光標記法檢測腦海馬體DG區域神經細胞中之陽性凋亡蛋白酶-3/陽性NeuN之細胞百分比。

圖7A係顯示以雙螢光標記法檢測腦海馬體CA區域神經細胞中之陽性凋亡蛋白酶-3之細胞百分比。

圖7B係顯示以雙螢光標記法檢測腦海馬體CA區域神經細胞中之陽性凋亡蛋白酶-3/陽性NeuN之細胞百分比。

圖8A係顯示以雙螢光標記法檢測膠質細胞中之陽性凋亡蛋白酶-3之細胞百分比。

圖8B係顯示以雙螢光標記法檢測膠質細胞中之陽性凋亡蛋白酶-3/陽性GFAP之細胞百分比。

圖9係顯示SAH組及SAH+M組小鼠經SAH手術處理五天後之腦內神經細胞數目比。

圖10A係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠腦皮層之血腦屏障檢測結果圖。

圖10B係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠小腦之血腦屏障檢測結果圖。

圖11A係sham組、SAH組及SAH+M組小鼠血管直徑比例結果圖。

圖11B係顯示sham組、SAH組及SAH+M組小鼠血管半徑/管壁厚度比。

Claims (9)

1. 一種醫藥組成物用於製備治療出血性腦中風之藥劑之用途，包括：一有效劑量之美金剛(Memantine)、或其鹽類；以及一醫藥上可接受之載體。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物係為治療顱內蜘蛛膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)所導致之出血性腦中風。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該有效劑量係為0.05-100mg/Kg。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該有效劑量係為1-50mg/Kg。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該有效劑量係為5-30mg/Kg。
6. 一種醫藥組成物用於製備治療顱內蜘蛛膜下腔出血所導致之腦損傷之藥劑之用途，包括：一有效劑量之美金剛(Memantine)、或其鹽類；以及一醫藥上可接受之載體。
7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該有效劑量係為0.05-100mg/Kg。
8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該有效劑量係為1-50mg/Kg。
9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該有效劑量係為5-30mg/Kg。