TWI510629B - 絲裂原蛋白激酶激酶激酶激酶３（ｍａｐ４ｋ３）作為自體免疫疾病、癌症、發炎及ｉｌ－１７相關疾病的生物標記及治療標的 - Google Patents

絲裂原蛋白激酶激酶激酶激酶３（ｍａｐ４ｋ３）作為自體免疫疾病、癌症、發炎及ｉｌ－１７相關疾病的生物標記及治療標的 Download PDF

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Description

絲裂原蛋白激酶激酶激酶激酶3(MAP4K3)作為自體免疫疾病、癌症、發炎及IL-17相關疾病的生物標記及治療標的
本發明大體上係關於自體免疫性及癌症，且更特定言之，係關於自體免疫反應及GLK/PKC/NF-κB信號傳導之調節，以及腫瘤轉移。
本申請案主張2011年7月14日申請之美國臨時申請案第61/508,057號之優先權，該案以全文引用的方式併入本文中。
NF-κB為負責調控細胞存活、生長及增殖之基因的主要轉錄因子。T細胞受體(TCR)接合將誘導NF-κB活化，此與宿主防禦感染以及發炎、癌症及自體免疫反應之產生有關。PKC-θ在IKK-NF-κB活化及T細胞功能中起關鍵作用。在TCR刺激時，PKC-θ活化需要SLP-76。然而，負責SLP-76至PKC-θ之信號傳導及活化PKC-θ之直接激酶仍不清楚。因此，在TCR誘導之NF-κB活化中之最關鍵問題為鑑別SLP-76與PKC-θ之間的重要連接。
PKC-θ活化需要其在T538處磷酸化。激酶PDK1與PKC-θ相互作用，且在PDK1缺乏之T細胞中，PKC-θ在T538處之磷酸化有缺陷。因此，已提出PDK1可能會使PKC-θ在T538處直接磷酸化，但無明確證據表明PDK1在體外實驗中直接磷酸化PKC-θ。此外，PDK1可僅由CD28而非TCR信號傳導來活化之觀測結果，進一步排除了PDK1為用於TCR信號傳導所誘導之PKC-θ活化之直接激酶的可能性。因 此，在T細胞活化期間直接活化PKC-θ之激酶仍難以捉摸。
GCK類激酶(GLK；亦稱為絲裂原蛋白激酶激酶激酶激酶3 MAP4K3)為MAP激酶激酶激酶激酶(MAP4K)之成員，而該MAP4K為Ste20樣絲胺酸/蘇胺酸激酶之子族。GLK含有一個N末端激酶結構、一個C末端枸據同源結構(citron homology domain)及位於中間之若干個富含脯胺酸之基元。GLK對外界壓力刺激產生反應，經由MEKK1及MKK4/SEK1來誘導Jnk磷酸化。GLK亦經由在胺基酸處理之後活化在上皮細胞株中之mTOR下游效應子S6K1及4E-BP1來調控細胞生長。然而，GLK之調控機制及生理作用基本上未知。
因此，在此項技術中，迄今為止尚未解決的問題為解決與GLK之調控作用，尤其與前述GLK在TCR信號傳導過程中之生理作用有關的機轉仍未知。
在一個態樣中，本發明係關於一種用於鑑別供治療生發中心激酶(GCK)類激酶(GLK)所介導之疾病之治療劑的方法。該方法包含偵測由測試化合物進行之對GLK介導之信號傳導的調節，其中該偵測步驟包含：a)在測試化合物存在下培養表現GLK之細胞，其中該調節係藉由量測GLK轉錄物或蛋白質之表現量、所產生之IL-17A之量或NF-κB之活性來偵測；或b)在測試化合物存在下，使GLK蛋白在ATP存在下與其受質反應，其中該調節係藉由量測所產生 之ADP之量、所消耗之ATP之量及/或經磷酸化之受質之量來偵測；或c)在測試化合物存在下培養表現GLK之癌細胞，其中該調節係藉由量測該等癌細胞之遷移/侵襲/創口癒合能力來偵測；或d)在測試化合物存在下使GLK蛋白與其受質蛋白相互作用，其中該調節係藉由量測GLK與受質蛋白之間的相互作用來偵測；及e)將在測試化合物存在下之該調節與對照相比較，鑑別用於治療GLK介導之疾病的治療劑。
在另一個態樣中，本發明係關於一種用於偵測生發中心激酶(GCK)類激酶(GLK)介導之疾病之存在及/或嚴重程度的方法。偵測GLK介導之疾病之存在及/或嚴重程度可包含測定癌症之預後。該方法包含：a)自懷疑患有GLK介導之疾病或癌症之個體獲得包含T細胞或癌細胞之樣品；b)量測T細胞或癌細胞中GCK類激酶(GLK)之表現量；及c)測定GLK介導之疾病之存在及/或嚴重程度；其中與對照中GLK之表現量相比，T細胞中或癌細胞中GLK之表現量增加為個體有發展或患上GLK介導之疾病之風險或有癌症復發及/或轉移風險的指示。該測定步驟可包含測定癌症之預後。
由以下較佳實施例之描述結合以下圖式，此等及其他態樣將顯而易知，但可在不背離本發明之新穎概念的精神及範疇之情況下，可在其中進行變化及修改。
附圖將說明本發明之一或多個實施例，且連同書面描述一起用以解釋本發明之原理。只要有可能，整個圖式中使 用相同元件符號指示實施例之相同或類似元件。
定義
本說明書所使用之術語一般具有其在此項技術中、在本發明之上下文中及在使用每一術語之特定上下文中之普通含義。用於描述本發明之某些術語將在下文或在說明書別處進行討論，以向從業者提供關於本發明之描述的額外指導。為方便起見，可例如使用斜體字及/或引號突出某些術語。使用突出對術語範疇及含義沒有影響；無論術語是否突出，在相同上下文中其範疇及含義均相同。應瞭解相同情況可以一種以上方式表達。因此，對於本文所討論之該等術語中之任一者或多者，可使用替代性語言及同義詞，無論術語在本文中是否經詳細描述或討論，其均不具有任何特殊意義。提供某些術語之同義詞。一或多個同義詞之敍述並不排除其他同義詞之使用。在本說明書中任何地方使用實例(包括本文所討論之任何術語的實例)僅為說明性的，且決不限制本發明或任何例示術語之範疇及含義。同樣，本發明不限於本說明書中給出之各種實施例。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有科技術語均具有與一般熟習本發明所屬領域之技術者通常所瞭解相同之含義。在出現矛盾之情況下，以本文獻(包括定義)為準。
如本文所用，「大約」、「約」或「大致」一般應意謂在給定值或範圍之20%內，較佳在10%內，且更佳在5%內。本文給定之數字量為近似值，意謂若未明確說明，則可表 示術語「大約」、「約」或「大致」。
視上下文而定，術語「對照」可指健康、正常的樣品或細胞，或指在不存在測試化合物下所進行之測試。將自患者個體之T細胞獲得之量測值與自健康正常個體之T細胞獲得之對照量測值相比較。將自患者之癌細胞獲得之量測值與自相同患者或健康正常個體之非腫瘤組織樣品的非癌症、正常細胞獲得之對照量測值相比較。
術語「GLK信號傳導」係指GLK介導之信號傳導，亦即GLK-PKC-θ-IKK-NF-κB-IL17A信號傳導。
FLAG標籤或FLAG多肽為可使用重組DNA技術添加至蛋白質中之多肽蛋白質標籤。FLAG標籤可用於需要藉由抗體識別之許多不同分析中。FLAG標籤之肽序列為：N-DYKDDDDK-C。myc標籤為可使用重組DNA技術添加至蛋白質中之源自c-myc基因產物之多肽蛋白質標籤。myc標籤之肽序列為：N-EQKLISEEDL-C。
當GLK及PKC-θ蛋白用允許螢光能量由一個螢光探針轉移至另一個的不同之相容性螢光探針標記時，在GLK結合於(亦即以物理方式締合於)PKC-θ蛋白時發生螢光能量轉移。第一螢光探針具有較低激發波長，且第二螢光探針具有較高激發波長。第一螢光探針之發射波長與該較高激發波長重疊，且因此將激發第二螢光探針且導致在較高波長下發射。若測試化合物干擾GLK結合於PKC-θ，則不會出現螢光能量轉移，且不會出現較高波長之螢光發射。
本文所用縮寫的全名如下：復發性風濕症(PMRA)；佛 波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)；周邊血液白血球(PBL)；生發中心激酶(GCK)類激酶(GLK)。
本發明係關於發現GLK在TCR信號傳導級聯中之作用。已發現GLK為直接連接SLP-76至PKC-θ之信號傳導之激酶。
智人生發中心激酶相關蛋白激酶(GLK)之胺基酸序列為SEQ ID NO：1，且核苷酸序列為SEQ ID NO：2。褐家鼠(Rattus norvegicus)有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3(Map4k3)之胺基酸序列為SEQ ID NO：3，且核苷酸序列為SEQ ID NO：4。蛋白激酶C θ(人類)之胺基酸序列為SEQ ID NO：5且核苷酸序列為SEQ ID NO：6。小家鼠(Mus musculus)蛋白激酶C θ之胺基酸序列為SEQ ID NO：7且核苷酸序列為SEQ ID NO：8。
篩檢化合物之方法
基於蛋白質之分析： 放射性/非放射性活體外激酶分析
放射性活體外激酶分析：重組GLK蛋白與10 μCi[γ-32 P]ATP、4 μg髓鞘鹼性蛋白(MPB)及500 μM冷ATP於35 μl激酶緩衝液中在室溫培育40分鐘。藉由12% SDS-page分離樣品；且藉由Typhoon掃描器定量併入受質中之放射性標記之磷酸酯。
非放射性活體外激酶分析：非放射性活體外激酶分析係在96孔白色Proxiplate(PerkinElmer,Boston,MA)中以100 μl總體積進行。為測定在GLK激酶反應後產生之ADP量，重組GLK蛋白(2 μg；自大腸桿菌或經桿狀病毒感染之Sf9 昆蟲細胞分離)與10 μg MPB及2 μM ATP於25 μl激酶緩衝液中在室溫培育40分鐘。添加ADP-GloTM 試劑(25 μl；Promega)。在培育40分鐘後，添加激酶偵測試劑(50 μl)且培育30分鐘。由EnVision多標記讀取器(PerkinElmer life Science)測量發光強度。為測定在GLK激酶反應後所消耗之ATP量，重組GLK蛋白(0.2-1 μg)與10 μg MPB及2 μM ATP於25 μl激酶緩衝液中在室溫培育40分鐘。添加ATP-GloTM 試劑(25 μl；Promega)，培育10分鐘。由EnVision多標記讀取器(PerkinElmer life Science)測量發光強度。
基於細胞之分析： 藉由IL-17A ELISA或NF-κB活性報導體分析來測定使用穩定的經GLK轉染之細胞進行的藥物篩檢。
建立穩定的經GLK轉染之細胞：使用Neon轉染系統(Invitrogen Corporation)，將GLK質體及p-NF-κB-Luc-潮黴素質體轉染至Jurkat細胞內。為選擇穩定的經GLK轉染之細胞，在含有新黴素之RPMI-1640中培養GLK轉染之細胞至少2週。
IL-17A酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)。在RPMI培養基(200 μl)中培育穩定的經GLK轉染之Jurkat細胞(在96孔盤中每孔106 個)72小時。藉由人類IL-17A ELISA(PeproTech)測定上清液中之IL-17A含量。
螢光素酶報導體分析之NF-κB活性：將106 個穩定的經GLK轉染之Jurkat細胞再懸浮於60 μl RPMI培養基加60 μl溶解/螢光素酶緩衝液(Promega)中。數據表示螢火蟲螢光 素酶活性之平均值，誤差條為S.D.。
Transwell遷移及侵襲分析：Transwell遷移分析係使用接種於未塗佈之頂部腔室(24孔培養插入板(insert)；孔徑8 μm；Corning Costar)中且培養16小時的1×105 個細胞。侵襲分析係使用在塗佈基質膠之頂部腔室(BD Bioscience)上且培育24-48小時的1×105 個細胞。用棉簽到去保留於transwell上側之未侵襲細胞。藉由4%三聚甲醛快速固定在培養插入板過濾器下側上之細胞10分鐘，且接著用1%結晶紫染色20分鐘。在光學顯微鏡下對在過濾器下側上之細胞數進行計數。結果表示為每10個領域之遷移或侵襲性細胞的數目。
創口癒合分析(細胞遷移)：用載體(無轉殖基因之空白載體)、pCIneo-GLK(具有GLK轉殖基因之質體)或shRNA-GLK(具有GLK轉殖基因之shRNA的質體)轉染人類肺癌H1299細胞。應使此等細胞單層完全匯合。用p200吸液管尖端製造兩個平行的刮痕創口。使用相差顯微術觀測創口。在0至24小時過程內，以規律的時間間隔獲取在創口相交處側面之兩個區域的影像。
蛋白質-蛋白質相互作用分析： 螢光共振能量轉移(FRET)分析及放大發光親近均質分析(ALPHA；PerkinElmer)。
螢光共振能量轉移(FRET)分析：用CFP-GLK及YFP-PKC-θ質體轉染HEK293T細胞，且24小時後使用EnSpire 2300多標記讀取器(Perkin Elmer)測定螢光強度。在432 nm 下激發CFP；量測所得在485 nm下發射之螢光強度。在485 nm下激發YFP；量測所得在540 nm下發射之螢光強度。在432 nm下激發FRET信號；量測所得在540 nm下發射之螢光強度。
放大發光親近均質分析(amplified luminescent proximity homogeneous assay，ALPHA)：AlphaScreen結合分析係在384孔白色Proxiplate(PerkinElmer,Boston,MA)中以20 μl總體積進行。AlphaScreen Flag偵測套組係來自PerkinElmer Life Science。AlphaScreen供體珠粒係以塗佈Flag之形式提供，且使受體珠粒與抗-Myc抗體接合。在384孔培養盤(5微升/孔)中將經純化Flag-GLK加Myc-PKC-θ或Flag-SLP-76加Myc-GLK混合在一起。若使用HEK293T轉染株，則每孔添加0.2 μg溶胞物。添加受體珠粒(5微升/孔)且培育30分鐘。隨後添加供體珠粒(5微升/孔)且培育3小時。由EnVision多標記讀取器(PerkinElmer life Science)測定ALPHA信號。供體及受體珠粒之最終濃度為20 μg/ml。所有稀釋均在HEPES緩衝液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% Tween-20、0.5 mM DTT)中進行。
發現GLK過度表現與癌症及轉移相關。該GLK介導之癌症及轉移不涉及哺乳動物雷帕黴素標的(mTOR)。本發明係關於以下發現：GLK-PKC-θ-IKK-NFκB-IL-17信號傳導路徑適用作癌症預後生物標記及GLK介導之疾病之治療標的。
在一個態樣中，本發明係關於一種用於鑑別供治療生發 中心激酶(GCK)類激酶(GLK)介導之疾病之治療劑的方法。該方法包含偵測由測試化合物進行之對GLK介導之信號傳導的調節，其中該偵測步驟包含：a)在測試化合物存在下培養表現GLK之細胞，其中該調節係藉由量測GLK轉錄物或蛋白質之表現量、所產生之IL-17A之量或NF-κB之活性來偵測；或b)在測試化合物存在下，使GLK蛋白在ATP存在下與其受質反應，其中該調節係藉由量測所產生之ADP之量、所消耗之ATP之量及/或磷酸化之受質之量來偵測；或c)在測試化合物存在下培養表現GLK之癌細胞，其中該調節係藉由量測該等癌細胞之遷移/侵襲/創口癒合來偵測；或d)在測試化合物存在下使GLK蛋白與其受質蛋白相互作用，其中該調節係藉由量測GLK與受質蛋白之間的相互作用來偵測；及e)將在測試化合物存在下之該調節與對照相比較，鑑別用於治療GLK介導之疾病的治療劑。GLK與受質蛋白(諸如PKC-θ蛋白)之間的相互作用可藉由使用螢光共振能量轉移(FRET)分析或放大發光親近均質分析來量測。
在前述步驟d)中，受質可包含PKC-θ蛋白，且該等GLK及PKC-θ蛋白經不同之相容性螢光探針標記，一個探針之螢光激發及發射波長高於另一個探針，且該經調節之締合藉由較高螢光發射波長下之變化來偵測。
ATP可為非放射性ATP或可用放射性同位素標記。GLK蛋白與受質之相互作用可在細胞內或在活體外於試管中發生。GLK介導之疾病可選自由自體免疫疾病、發炎性疾 病、癌症及癌症轉移組成之群。受質可選自由PKC-θ蛋白及髓鞘鹼性蛋白(MBP)組成之群。測試化合物可選自由RNAi分子、微RNA、反義分子及小有機分子組成之群。表現GLK之細胞可包含表現GLK之T細胞，及/或表現GLK之癌細胞可包含表現GLK之肺癌細胞。表現GLK之細胞可包含過度表現GLK之細胞，諸如過度表現GLK之T細胞，及/或表現GLK之癌細胞可包含過度表現GLK之癌細胞，諸如過度表現GLK之肺癌細胞。
自體免疫疾病可選自以下不同疾病：全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、成人發作型史迪爾氏病(adult-onset Still's disease)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、僵直性脊椎炎、視神經脊髓炎、自體免疫性腦脊髓炎及禿髮症。癌症可選自以下不同疾病：肺癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、乳癌及肝癌。在本發明之一個實施例中，該癌症為一類GLK蛋白介導之癌症且與哺乳動物雷帕黴素標的(mTOR)蛋白質無關(或不涉及)。
在另一個態樣中，本發明係關於一種用於偵測生發中心激酶(GCK)類激酶(GLK)所介導之疾病之存在及/或嚴重程度的方法。偵測GLK介導之疾病之存在及/或嚴重程度可包含測定癌症(諸如肺癌)之預後。該方法包含：a)自懷疑患有GLK介導之疾病或癌症之個體獲得包含T細胞或癌細胞之樣品；b)量測T細胞中或癌細胞中GCK類激酶(GLK)之表現量；及c)測定GLK介導之疾病之存在及/或嚴重程度； 其中與對照中GLK之表現量相比，T細胞中或癌細胞中GLK表現量之增加為個體有發展或患上GLK介導之疾病之風險或有癌症復發及/或轉移風險的指示。該測定步驟可包含測定癌症之預後。在本發明之一個實施例中，癌細胞中GLK表現量之增加與哺乳動物雷帕黴素標的(mTOR)蛋白質無關。
該量測步驟可包含量測T細胞中GLK蛋白之表現量，及/或藉由免疫墨點分析、流動式細胞測量術分析及/或免疫組織化學進行。或者，該量測步驟可包含量測GLK轉錄物之表現量，其可進一步包含針對管家基因校正所量測之GLK轉錄物之表現量，以獲得經校正之GLK轉錄物表現量。
實例
不意欲限制本發明之範疇，下文給出了本發明實施例之例示性儀器、裝置、方法及其相關結果。應注意，為方便讀者，在實例中可使用標題或副標題，其決不應限制本發明之範疇。此外，本文提出並揭示了某些理論；然而無論其對抑或不對，其決不應限制本發明之範疇，只要本發明在不考慮任何特定理論或操作方案之情況下可根據本發明進行實踐即可。
I. GLK藉由活化T細胞中之PKC-θ來控制自體免疫性及NF-κB信號傳導 方法及材料
GLK缺乏之小鼠。 GLK基因剔除之129小鼠胚胎幹細胞 純系(純系RRO270)係購自EUCOMM且在臺灣之基因體醫學國家型科技計畫(National Research Program for Genomic Medicine)之基因轉殖小鼠模型核心實驗室(Transgenic Mouse Model Core)被注射至C57BL/6胚胞中，產生嵌合小鼠。所有動物實驗均在國家衛生研究院(National Health Research Institutes)根據由IACUC批准之方案進行。
患者及健康對照。 對49個基於美國風濕病學會(American College of Rheumatology)準則而診斷為患有全身性紅斑狼瘡(SLE)之患者進行研究。讓所有患者到臺中榮民總醫院(Taichung Veterans General Hospital，TVGH)之過敏、免疫學及風濕病學部門。登記35個健康個體作為對照。該研究獲TVGH之人體試驗審查委員會(Institutional Review Board)批准，且自所有患者獲得書面知情同意書。
抗體、質體及經純化蛋白質。 藉由蛋白質A-瓊脂糖凝膠層析法自小鼠腹水純化出抗小鼠CD3ε(145-2C11)及抗人類CD3ε抗體(OKT3)。藉由用不同胜肽注射兔子來產生抗GLK、HPK1、p-Erk(T202/Y204)、Erk、p-SLP-76(S376)及SLP-76之抗體。抗-p-PKC-θ(T538)及抗-p-PKC-θ(S695)抗體係來自Upstate Biotechnology,Inc。抗-PKC-θ(C-19)、抗-p-PKC-θ(S676)、抗-Vav1(D-7)、抗-Vav2(E-12)及抗-Vav3(K-19)抗體係來自Santa Cruz Biotechnology,Inc。抗-Flag(M2)、抗-Myc、抗-HA及抗微管蛋白抗體係來自SIGMA。抗-p-IKK(S181)、抗-p-PDK1(S214)、抗-IKK及抗-PDK1抗體係來自Cell Signaling。用於細胞內染 色之抗-p-PKC-θ(T538)(19/PKC)抗體係來自BD Pharmingen。抗-p-mTOR及抗-mTOR抗體係來自Abcam。
GLK、無活性GLK突變體(KD)及Flag-SLP-76之表現質體如先前所述。藉由將個別cDNA分別次選殖至pCMV6-AC-Myc、pCMV6-AC-HA及pCMV6-AC-GFP載體(OriGene Technologies)中來構築標記Myc之PKC-θ、標記HA之GLK及標記GFP之GLK。由國家型干擾性核醣核酸核心實驗室(National RNAi Core Facility)建立shRNA質體。NF-κB報導體質體(pNF-κB-Luc)及校正之質體(pRL-TK)係購自Promega。
對於活體外結合分析，分別自Flag-GLK轉染及Flag-SLP-76轉染之HEK293T細胞中分離並純化出GLK及SLP-76蛋白，隨後進行Flag胜肽溶離。經純化的由Sf9昆蟲細胞中之桿狀病毒表現之重組GST-PKC-θ係購自SignalChem。
短暫轉染及T細胞活化。 對於短暫轉染分析，使用Neon轉染系統(Invitrogen Corp.)轉染細胞。有關個別細胞株或原生細胞之具體設定如下：對於JurkatT及J14細胞株，1420 V、30毫秒之持續時間及1個脈衝；對於EL4細胞，1080 V、50毫秒之持續時間及1個脈衝；對於原生T細胞，2000 V、20毫秒之持續時間及2個脈衝。為誘導T細胞活化，在37℃下用5 μg/ml抗-CD3抗體刺激J-TAg及EL4細胞指定時間。為誘導原生T細胞活化，用3 μg/ml抗-CD3-生物素(500A2；eBioscience)加3 μg/ml抗生蛋白鏈菌素(SIGMA)刺激3×106 個經純化T細胞。
活體外激酶分析。 使用抗-Flag之瓊脂糖珠粒，由未經刺激或經抗-CD3刺激之Jurkat T或J-14細胞溶胞物(80 μg)使Flag-GLK免疫沈澱。將抗-Flag之免疫沈澱物用溶解緩衝液洗滌三次並用激酶緩衝液洗滌一次，或使其經歷Flag肽溶離以純化Flag-GLK。在室溫下用35 μl含500 μM冷ATP、4 μg髓鞘鹼性蛋白及有或無10 μCi[γ-32 P]ATP之激酶緩衝液培育抗-Flag-GLK珠粒或經純化Flag-GLK達40分鐘。藉由SDS-PAGE分離樣品。藉由免疫墨點分析或藉由Typhoon掃描器(GE)定量受質中放射性標記之磷酸酯之併入來偵測受質之磷酸化。
流動式細胞測量術分析。 用PMA加離子黴素刺激細胞2小時，且再用Golgi-stop處理2小時。收集細胞，用冷PBS洗滌且於冰上用指定抗體染色30分鐘。對於臨床樣品分析，在無任何其他刺激下，立即用Golgi-stop處理PBL，且接著在室溫下用抗-表面標記染色。對於細胞內染色，將PBL於200 μl Cytofix/Cytoperm緩衝液(BD Biosciences)中滲透2小時且用Perm-Wash緩衝液洗滌，且接著用抗體(1：50稀釋液)培育2小時。使用以下抗體進行染色：抗-mCD3-APC(145-2C11)、抗-mCD3-FITC(145-2C11)、抗-Foxp3-PE(150D)、抗-IFNγ-FITC(XMG1.2)、抗-IL-4-PE(11B11)及抗-IL-17A-PE(TC11-18H10.1)抗體係購自BioLegend；且抗-mCD4-太平洋藍(RM4-5)、抗-hCD3-PECy7(SK7)及抗-hCD19-PE(SJ25C1)抗體係購自BD Pharmingen。使用FACSCanto II流動式細胞儀(BD Biosciences)收集數據且藉由FlowJo軟體進行分析。
活體內T細胞介導之免疫反應及EAE之誘發。 各實驗中所用之小鼠為6至10週齡的性別匹配之同窩出生仔鼠。如先前所述量測來自經免疫小鼠之抗原特異性(KLH)抗體、TH 1及TH 2細胞激素之產生。如所述誘發EAE。
活體外T細胞分化分析。 自小鼠之淋巴結純化出CD4+ CD25- 細胞。在塗有抗-CD3(2 μg/ml)及抗-CD28(3 μg/ml)抗體之48孔培養盤中，在500 μl培養基中培養細胞(2.5×105 個)。對於Treg 分化，細胞係於含有10 ng/ml IL-2、10 ng/ml TGF-β、2.5 μg/ml抗-IL4及2.5 μg/ml抗-IFN-γ抗體之培養基中培養。對於TH 17分化，細胞係於含有20 ng/mlIL-6、5 ng/ml TGF-β、50 ng/ml IL-23、5 μg/ml抗-IL4及5 μg/ml抗-IFN-γ抗體之培養基中培養。對於TH 1分化，細胞係於含有5 ng/ml IL-12及1 μg/ml抗-IL4抗體之培養基中培養。對於TH 2分化，細胞係於含有10 ng/ml IL-4及1 μg/ml抗-IFNγ抗體之培養基中培養。
活體外抑制分析。 自小鼠之脾臟及淋巴結負選擇小鼠CD4+ T細胞。在第二輪純化中，使用磁耦合抗小鼠CD25抗體自CD4+ T細胞分離CD4+ CD25+ T(Treg )細胞。將Treg 細胞添加至CD3+ T細胞(最終濃度為每500 μl含2×105 個細胞)，且接著用抗-CD3抗體刺激72小時。
統計方法。 藉由史都登氏t試驗法(Student's t-test)測定P 值。對於獲自臨床樣品之數據的分析，最初採用皮爾遜相關性(r)。採用臨床樣品之流動式細胞測量術數據的簡單線 性回歸來顯示表現GLK之T細胞之百分比與SLE患者之SLEDAI之間的統計上顯著之相關性。
結果： GLK直接磷酸化且活化PKC-θ
藉由Jurkat T細胞中GLK過度表現或GLK siRNA基因表現阻斷，隨後抗-CD3刺激來研究GLK在TCR信號傳導中之作用(圖1a及圖6)。Jurkat T細胞中抗-CD3誘導之NF-κB活性及IKK磷酸化(而非Erk或mTOR活化)受GLK siRNA或GLK之激酶死亡(KD)突變體抑制且藉由GLK過度表現而增強(圖1a及圖7a、b)。此外，在1分鐘時TCR信號傳導誘導GLK激酶活性且在30分鐘時達峰值(圖7c)。此等發現表明GLK與TCR誘導之NF-κB活化有關。因為SLP-76調控Erk與IKK路徑，所以SLP-76不可能為GLK之標的。因此檢查GLK對PKC-θ活化之作用，PKC-θ為TCR信號傳導中IKK-NF-κB上游及SLP-76下游之一種關鍵調控蛋白。PKC-θ磷酸化受GLK調控(圖7d)；因此，檢查GLK是否藉由靶向PKC-θ來活化IKK-NF-κB路徑。在抗-CD3刺激時，PKC-θ siRNA基因表現阻斷可消除GLK誘導之NF-κB活化(圖7e)，從而表明GLK靶向PKC-θ以誘導NF-κB活化。
為解決在T細胞信號傳導期間GLK是否可直接磷酸化且活化PKC-θ，使用共免疫沈澱分析來研究在TCR信號傳導期間GLK是否與PKC-θ相互作用。CD3刺激可誘導原生T細胞中內源性GLK與PKC-θ之間的相互作用，且GLK-PKC-θ相互作用伴隨有PKC-θ活化(圖1b)。使用HEK293T、Jurkat 及EL4細胞株亦觀測到類似結果(圖8a-c)。在活體外使用經純化GLK及PKC-θ蛋白之結合分析進一步證實了GLK與PKC-θ之間的直接相互作用(圖1c)。為測定GLK使PKC-θ磷酸化之位點，檢查PKC-θ在T538、S676及S6954 處之磷酸化，其為PKC-θ之三個主要磷酸化位點。T538磷酸化對於PKC-θ激酶活化及隨後之NF-κB活化最為關鍵。使用免疫沈澱之Flag-GLK及Myc-PKC-θ進行活體外激酶分析顯示，GLK使PKC-θ在T538處而非在S676或S695處磷酸化(圖1d)。
在使用經純化GLK及PKC-θ蛋白之活體外激酶分析中，PKC-θ-T538被GLK直接磷酸化(圖1e)。當一起考量時，結果表明在TCR信號傳導期間GLK與PKC-θ直接相互作用且使PKC-θ在T538處磷酸化。
SLP-76為GLK之直接上游調控蛋白
SLP-76為T細胞中之關鍵骨架蛋白且為TCR誘導之PKC-θ-IKK活化所需2 。要求知道在TCR信號傳導中SLP-76是否為GLK之直接上游調控蛋白。CD3刺激誘導了原生T細胞中內源性GLK與SLP-76之間的相互作用(圖2a)。SLP-76-GLK相互作用先於GLK-PKC-θ相互作用及PKC-θ活化。使用Jurkat及HEK293T細胞亦觀測到類似結果(圖9a-c)。此外，SLP-76與GLK之間的相互作用係經由酪胺酸磷酸化介導(圖9d)。使用經純化GLK及SLP-76進行活體外結合分析證實了該兩種蛋白質之間的直接相互作用(圖2b)。接著，研究SLP-76是否為GLK活化所需。在SLP-76缺乏之J14細 胞(圖2c)及SLP-76 shRNA轉染之Jurkat細胞(圖2d)中使藉由CD3刺激所誘導之GLK激酶活性消除。先前之報告證實Vav1與SLP-76相關且與PKC-θ移位有關，表明Vav1可控制PKC-θ活化。因此，研究Vav1是否調控GLK活化。然而，TCR誘導之GLK激酶活化不受Vav1 shRNA基因表現阻斷影響(圖9)。此等資料排除了在TCR信號傳導中GLK激酶活化之調控中Vav1之涉及。由於另一種MAP4K，亦即HPK1，亦由SLP-76活化且又藉由誘導SLP-76-S376磷酸化來負調控SLP-76活化，故需要知道GLK是否與SLP-76之負反饋調控有關。SLP-76-S376磷酸化僅由HPK1而非由GLK誘導(圖2e)，從而表明GLK不會發生反饋以負調控SLP-76。此等研究結果表明SLP-76在TCR信號傳導期間與GLK直接相互作用且活化GLK。
GLK控制活體內T細胞介導之免疫反應
為研究GLK在活體內之作用，產生GLK缺乏之小鼠(圖11a、b)。在GLK缺乏之小鼠中T細胞發育正常(圖11c-e)。在原生T細胞中研究GLK缺乏對TCR信號傳導之作用。與先前之觀測(圖1)一致，在CD3(圖3a)或CD3-CD28協同刺激(圖3b)時，在GLK缺乏之T細胞中PKC-θ及IKK之磷酸化消除。相比之下，Erk及PDK1活化不受GLK缺乏影響(圖3b)。Lck、LAT及PLCγ1之磷酸化以及Ca2+ 信號傳導亦未受影響(圖11f及圖8c)。由於NF-κB信號傳導調控T細胞增殖，故亦使用[3 H]胸苷併入及CFSE染料稀釋分析來研究GLK對T細胞增殖之作用。GLK之缺乏顯著阻斷了由CD3 刺激而非由PMA加離子黴素刺激所誘導之T細胞增殖(圖3d、e；圖11g)。因為PMA及離子黴素繞過近端的TCR信號傳導，所以此結果表明GLK活性係由TCR近端信號傳導複合物誘導。GLK缺乏之T細胞之細胞增殖減少，此外由異位表現之GLK可恢復其細胞增殖(圖3f)。此等數據證實GLK對於T細胞增殖很重要。
接著研究GLK是否在活體內T細胞介導之免疫反應中起重要作用。使用礬作為佐劑，用匙孔螺血氰蛋白(KLH)(一種T細胞依賴性抗原)使野生型及GLK缺乏之小鼠免疫。KLH再刺激之後，來自經KLH免疫之GLK缺乏之小鼠的T細胞顯示出增殖減低(圖4a)。此外，在來自GLK缺乏之小鼠的經KLH再刺激之脾T細胞中，包括干擾素-γ(IFN-γ)、介白素2(IL-2)及IL-4之細胞激素的含量亦顯著降低(圖4b)，從而表明活體內T細胞活化削弱。在GLK缺乏之小鼠中，一次及二次免疫之後血清中抗原特異性抗體之產生亦大大減少(圖4c、d)。此等結果表明GLK為發動免疫反應及抗體產生所需。
GLK缺乏之小鼠對自體免疫性具有抗性
實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)主要由產生IL-17之CD4+ T淋巴細胞(TH 17)介導11 。PKC-θ缺乏致使EAE及TH 17反應改善。因為GLK使PKC-θ活化，所以藉由使用實驗性自體免疫性腦脊髓炎模型來研究GLK在TH 17介導之自體免疫疾病中之作用。GLK缺乏之小鼠幾乎不顯示任何症狀，而其野生型同窩出生仔畜則發展嚴重實驗性自體免疫性腦 脊髓炎(圖4e)。在GLK缺乏之小鼠中，第14天時經免疫小鼠之腦及脊髓中之浸潤性淋巴細胞中TH 17細胞之百分比顯著較低(圖4f)。另外，在GLK缺乏之小鼠中，血清中IL-17之效價亦顯著較低(圖4g)。為研究GLK缺乏之小鼠中TH 17反應缺乏是否為T細胞固有之效應，測定GLK缺乏之未處理T細胞之活體外TH 17分化潛能。一貫地，TH 17細胞以及TH 1及TH 2細胞之活體外分化因GLK缺乏而減少(圖4h及圖12)。活體外Treg 分化不受GLK缺乏影響(圖12)；然而，GLK缺乏之Treg 細胞呈現出較高的活體外抑制活性(圖4i)。此等結果表明，活體內GLK缺乏會保護小鼠免於發展TH 17介導之自體免疫疾病。在GLK缺乏之T細胞中，有缺陷的TCR信號傳導及TH 17分化以及增強之Treg 功能可在GLK缺乏之小鼠之抗性中起關鍵作用。
人類SLE中GLK誘導之PKC-θ活化
TH 17介導之發炎亦在人類自體免疫疾病全身性紅斑狼瘡(SLE)中起重要作用。因為在GLK缺乏之小鼠中自體免疫誘導及TH 17反應減弱且GLK使PKC-θ-IKK路徑活化，所以研究GLK-PKC-θ-IKK-IL-17級聯是否與人類SLE有關。檢查自49個SLE患者及35個配對之健康對照分離之周邊血液白血球(PBL)中之GLK表現及PKC-θ-IKK活化(圖13a)。流動式細胞測量術分析顯示，自SLE患者新近分離之PBL中表現GLK之T細胞(而非B細胞)之百分比顯著增加(圖5a)。表現GLK之T細胞之百分比與SLE疾病活動指數(SLEDAI)相關(圖5b；皮爾遜相關係數：r=0.773)。值得注意的是， 與GLK在正常範圍內之患者(r=0.451；表1)相比較，三分之一(16/49)的GLK表現型(GLK+ )T細胞百分比高(21%)之SLE患者顯示出較高的相關性(r=0.807；圖5c，表1)。在SLE患者中GLK蛋白之表現量亦增加(圖5d)。此等結果表明，對於30%之患者而言，GLK過度表現與SLE發病有關。表1顯示不同SLE患者子集中SLEDAI與GLK+ T細胞百分比之間之相關性的比較。
對於患SLE且GLK+ T細胞少(<21%)之人員，經調整之回歸相關係數為r2 =0.177，P 值=0.008503。
接著研究在來自SLE患者之T細胞中GLK過度表現是否誘導PKC-θ-IKK活化。磷酸化PKC-θ或磷酸化IKK陽性T細胞之百分比隨來自SLE患者之T細胞中之GLK表現而增加且共染色(圖5e)。類似地，免疫墨點分析顯示在SLE患者中PKC-θ-IKK活化之誘導(圖5d)。此等數據表明，GLK使來自SLE患者之T細胞中之PKC-θ活化。在SLE患者之血清中IL-17(而非TNF或IL-6)之含量提高(圖8b)。此等結果表明，在狼瘡患者中，T細胞中之GLK過度表現驅動自體免疫發病。因此，GLK藉由直接活化T細胞中之PKC-θ而成為 自體免疫疾病之重要正調控蛋白。
討論
本研究之關鍵研究結果為鑑別出GLK為在TCR信號傳導期間使PKC-θ在T538處直接磷酸化之激酶。PKC-θ在活化環內殘基T538處之磷酸化對於T細胞中NF-κB活化至關重要4 。GLK誘導之PKC-θ-IKK磷酸化與PDK1活化及CD28協同刺激無關，表明GLK獨立於PDK1活化起作用。此等資料明確表明，在TCR信號傳導中GLK為PKC-θ之直接上游激酶。
由活體外T細胞分化分析得到之結果進一步表明，GLK在T輔助細胞分化中起固有且積極的作用。GLK調控T輔助細胞分化之機制仍未知。然而，TH 1、TH 2及TH 17之活體外分化均因GLK缺乏而降低，表明GLK可經由一種常見機制(例如增強TCR信號傳導或IL-2產生)而非調控不同T輔助細胞分化路徑之不同細胞激素信號傳導路徑來調控T輔助細胞分化。
GLK之活體內作用之研究證實，GLK為最佳T細胞免疫反應及抗體產生所需。在GLK缺乏之小鼠中，諸如IL-2、IFN-γ(一種TH 1細胞激素)及IL-4(一種TH 2細胞激素)之T細胞分泌之細胞激素減少以及在一次及二次免疫之後抗原特異性抗體產生之減少與PKC-θ缺乏之T細胞中所報導之缺陷類似。GLK缺乏之小鼠對EAE誘發之抗性及降低之TH 17反應亦與PKC-θ缺乏之小鼠之表型一致。在GLK缺乏之小鼠中胸腺自然Treg 之數目未受影響。然而，在PKC-θ缺 乏、CARMA1缺乏、BCL10缺乏或IKK2突變型小鼠中，由於PKC-θ-NF-κB信號傳導削弱，使得Treg 數目減少。PKC-θ可藉由諸如CD28、CD4、CD8、LFA-1刺激或ER壓力信號傳導之多個信號傳導路徑活化。在Treg 發育期間PKC-θ-NF-κB信號傳導如何活化仍不清楚。資料表明，GLK藉由使T538殘基而非其他已知之磷酸化位點(諸如S676及S695)磷酸化來活化PKC-θ。GLK可能不是唯一的PKC-θ活化激酶。因此，在Treg 中PKC-θ-CARMA1-BCL10-IKK2仍可能由其他激酶活化，從而在GLK缺乏之小鼠中產生正常數目之Treg 。儘管在GLK缺乏之小鼠中Treg 數目未受影響，但Treg 活性因GLK缺乏而增強。PKC-θ在Treg 介導之抑制中起負面作用。當一起考量時，GLK在調控TH 1、TH 2、TH 17及Treg 細胞中之作用基本上與PKC-θ之作用一致，從而支持如下觀點：在TCR信號傳導中GLK可能為PKC-θ之唯一活化劑。
在此研究中，亦報導GLK表現在SLE患者之周邊血液T細胞中得到誘導且與疾病嚴重程度呈正相關。自SLE患者分離之GLK過度表現之T細胞亦呈現PKC-θ-IKK活化增加，表明GLK-PKC-θ-IKK路徑之活化可控制SLE發病。這一點首次證實了在SLE患者之T細胞中之GLK過度表現及PKC-θ-IKK過度活化。SLE患者中血清IL-17之增多與先前報導一致。與在血清IL-17與SLEDAI之間的相關性(皮爾遜相關係數：r=0.41)相比較，GLK與SLEDAI之間的相關性(r=0.773)高得多且更顯著。當一起考量時，該等研究結果 表明，GLK在自體免疫發病中起重要作用且可充當SLE進展之新穎診斷性生物標記；另外，GLK及其下游PKC-θ-IKK信號傳導之抑制可提供針對SLE之新穎治療策略。
II. T細胞中之GLK過度表現作為類風濕性關節炎之新穎生物標記
先前的研究證實，GLK經由活化T細胞中之蛋白激酶C-θ(PKC-θ)-NF-κB激酶抑制劑(IKK)-NF-κB信號傳導路徑來控制自體免疫性(Chuang等人(2011)「The kinase GLK controls autoimmunity and NF-κB signaling by activating the kinase PKC-θ in T cells」.Nat Immunol .12(11)：1113-1118，該文獻以引用的方式併入本文中)。來自全身性紅斑狼瘡(SLE)患者之T細胞呈現GLK過度表現，此與疾病嚴重程度高度相關；然而，GLK在RA中之作用仍然未知。
膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)為一種廣泛研究的動物模型，其發展類似RA之破壞性發炎性滑膜炎。PKC-θ缺乏之小鼠呈現對CIA之減弱反應[14]。IKK-β抑制為關節炎動物模型中骨及軟骨破壞之有效治療。因為PKC-θ及IKK在發炎、性關節炎中起關鍵作用，所以吾等使用經膠原蛋白免疫之小鼠及來自人類RA患者之臨床樣品研究上游激酶GLK在RA發病中之潛在作用。
材料及方法
參與者。 30個滿足美國風濕病學會1987年修正之RA準則的患者。24個健康志願者用作健康對照。自8個骨關節炎(OA)患者及8個RA患者獲得滑膜組織及滑液。此研究方 案獲臺中榮民總醫院之臨床研究倫理委員會(Ethics Committee of Clinical Research)批准。
疾病活動度。 使用紅血球沈降速率(ESR)、C反應蛋白(CRP)之血清含量及28處關節疾病活動度評分(DAS28)評估RA疾病活動度。
GLK缺乏之小鼠。 在臺灣之基因體醫學國家研究計畫之基因轉殖鼠核心實驗室將來自歐洲條件性小鼠突變計劃(European Conditional Mouse Mutagenesis Project)之GLK缺乏之129小鼠胚胎幹細胞純系(RRO270)注射至小鼠品系C57BL/6之胚胞中以產生嵌合小鼠。使GLK缺乏之小鼠回交C57BL/6背景品系歷經9代。所有動物試驗均根據臺灣之國家衛生研究院之實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准之方案進行。
關節炎之誘發及評分。 如先前所述在野生型(WT)或GLK缺乏之小鼠中誘發膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)(Campbell等人(2000)「Collagen-induced arthritis in C57 BL/6(H-2b)mice：new insights into an important disease model of rheumatoid arthritis」Eur J Immunol .30(6)：1568-1575)。在12週齡時(第0天)，將含有雞II型雞膠原蛋白/弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)乳化物(MD BioSciences,Zurich,Switzerland)之總共100 μl乳液經皮內注射至小鼠尾根部。在第21天，經腹膜內重複相同注射。接著，使用以下臨床評分來評價WT或GLK缺乏之小鼠之臨床病徵， 其中1=足趾腫脹，2=紅斑，3=爪/踝腫脹，4=功能喪失。
血清細胞激素之測定。 使用ELISA根據製造商之說明書(eBiosciences,San Diego,California,USA)測定WT或GLK缺乏之小鼠及RA患者中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-17A之血清含量。
試劑及抗體。 藉由用個別肽對兔進行免疫來產生針對GLK之抗體。將抗-p-PKC-θ(T538)抗體(Upstate Biotechnology,Lake Placid,New York,USA)用於西方墨點法。將抗-PKC-θ抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,California,USA)用於細胞內染色。將抗-hCD3-PECy7(SK7；BD Pharmingen,San Diego,California,USA)、抗-p-PKCθ T538(19/PKC；BD Pharmingen,San Diego,California,USA)及抗-p-IKK(2681S)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,California,USA)抗體用於流動式細胞測量術分析。將TaqMan探針及引子集(Applied Biosystems,Foster City,California,USA)用於GLK mRNA偵測。
西方墨點分析及流動式細胞測量術分析。 對於免疫墨點分析，如先前所述對滑膜白血球及經純化周邊血液T細胞之樣品進行(Chuang等人(2011)「The kinase GLK controls autoimmunity and NF-κB signaling by activating the kinase PKC-θ in T cells」.Nat Immunol .12(11)：1113-1118，該文獻以引用的方式併入本文中)。亦如先前所述進行周邊血液及滑液之流動式細胞測量術分析。
免疫組織化學。 在RA及OA患者中對滑膜上之GLK進行免疫染色。煮沸經石蠟包埋之組織10分鐘且用水洗滌2分鐘。接著用過氧化氫酶阻滯劑(Thermo Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)預培育切片1小時且在4℃下用抗-CD3抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,California,USA)加抗-GLK抗體培育隔夜。用LVB1ue/LVRed(MultiVision Polymer Detection System,Thermo Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)產生顏色。
統計分析。 使用社會科學應用統計軟體包(Statistical Package for the Social Sciences，SPSS)13.0版軟體(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)進行統計分析。使用史都登氏t試驗法進行連續變數之間的比較。使用皮爾遜氏相關性測定各變數之間的相關性。使用簡單線性回歸來研究在RA患者中表現GLK之T細胞之頻率與DAS28之間的相關性。
結果 GLK缺乏之小鼠中膠原蛋白誘發之關節炎的發展削弱
先前已證實，在GLK缺乏之小鼠中T細胞介導之免疫反應削弱(Chuang等人，Nat Immunol .2011；12(11)：1113-1118，該文獻以引用的方式併入本文中)。為研究GLK對發炎性關節炎之貢獻，使用CIA模型來研究野生型(WT)及GLK缺乏之小鼠中自體免疫反應之誘導。WT小鼠發展嚴重CIA，而GLK缺乏之小鼠顯示出症狀之急劇減輕(圖 14A、B)。發炎性細胞激素在CIA發展期間被誘導。發現與WT小鼠相比，在經膠原蛋白免疫的GLK缺乏之小鼠中IL-1β、IL-6及IL-17A之血清含量顯著降低(圖15 C-E)。此等結果表明GLK為發炎性關節炎所需。
RA患者之人口統計數據及臨床特徵
為研究來自RA患者之T細胞中GLK含量是否增加，登記30個RA患者(66.7%為女性，平均年齡：50.3±15.7歲)及24個健康對照(62.5%為女性，平均年齡：33.4±8.3)(表2)。表2顯示類風濕性關節炎(RA)患者及健康對照(HC)之人口統計數據、臨床表現及實驗室研究結果# 。
來自RA患者之經純化周邊血液T細胞中GLK表現增加
藉由西方墨點法所測定，來自RA患者之經純化周邊血液T細胞中GLK之蛋白質含量增加(圖15A)。來自RA患者之經純化T細胞中的GLK表現量顯著高於健康對照中之情形(1.3±0.8對0.4±0.4，p =0.047，圖15B)。此外，相比健康對照，RA患者中經純化周邊血液T細胞中GLK mRNA含量亦顯著較高(12.3±18.5對1.0±1.2，p =0.029，圖15C)。因為GLK活化PKC-θ，所以研究GLK誘導之PKC-θ活化是否與RA有關。在來自RA患者之周邊T細胞中PKC-θ活化亦增強(圖15A)。
來自RA滑液及滑膜組織之T細胞中GLK表現增加
接著研究GLK是否亦於來自人類RA患者之滑膜微環境之T細胞中表現。藉由西方墨點法測定，來自RA患者之滑液白血球中GLK表現及PKC-θ活化增強(圖16A)。藉由流動式細胞測量術分析測定，在來自RA患者之滑液中表現GLK之CD3+ T細胞之頻率比OA患者中之頻率高得多(圖 16B)。在RA及OA患者之滑膜組織中進行抗-GLK(藍色)及抗-CD3(棕色)之免疫組織化學染色。如圖16C中所示，在來自RA患者之滑膜組織中表現GLK之T細胞增加，但在來自OA患者之滑膜組織中幾乎不能偵測到。
來自滑液及周邊血液之T細胞中GLK、PKC-θ及CD3之共定位分析
共焦顯微術顯示在來自RA患者之滑液(圖17A)與周邊血液(圖17B)的T細胞中GLK與PKC-θ及CD3共定位，表明GLK在T細胞膜上與活性PKC-θ相互作用。
表現GLK之T細胞頻率與RA疾病活動度之相關性
在RA患者中血清TNF-α(27.6±42.4對5.4±13.9 pg/ml，p =0.019)及IL-17A(14.2±12.1對7.5±4.4 pg/ml，p =0.015)含 量高於健康對照中之含量，但TGF-β(6.5±5.14對5.2±7.6 pg/ml，p =0.5)含量並非如此(圖18A-C)。流動式細胞測量術分析顯示，RA患者中表現GLK、磷酸化PKC-θ陽性及磷酸化IKK陽性周邊血液T細胞之頻率較大(圖18D)。表現GLK之周邊血液T細胞之頻率在RA患者中顯著高於在健康對照中(18.4±7.6對10.5±5.0，p <0.001，圖18E)。此外，在RA患者中此等表現GLK之T細胞亦表現磷酸化PKC-θ及IKK。此等數據表明，GLK-PKC-θ-IKK級聯與人類RA之發病有關。在RA患者中表現GLK之T細胞之頻率與壓痛關節計數(r=0.500，p =0.005，圖19A)、紅血球沈降速率(ESR；r=0.400，p =0.003，圖19B)、C反應蛋白(CRP；r=0.330，p =0.015，圖19C)或28處關節之疾病病活動度評分(DAS28；r=0.606，p =0.0005，圖19D)相關(表3)。在移除4個在簡單線性回歸中顯示高殘差(模數>1)之離群值之後，剩餘86%(26/30)之RA患者顯示出表現GLK之T細胞之頻率與DAS28之間甚至更高之相關性(r=0.712，p =0.0000639，圖19E)。此等結果表明，GLK信號傳導在RA之發病中起重要作用。表3顯示所登記之個體中RA疾病活動度與表現GLK之T細胞頻率之間的皮爾遜氏相關性。
在此研究中，發現GLK在來自RA患者之周邊血液及滑膜組織之T細胞中過度表現。GLK缺乏使小鼠中CIA之發展減弱。此外，表現GLK之T細胞之頻率與RA疾病嚴重程度顯著相關，表明GLK促進RA發病。結果表明，GLK為一種新穎診斷性生物標記且為治療方案之潛在標的。
在過去的幾年中，已考慮到在RA中p38MAPK對於誘發及維持Th1/Th17所介導之慢性炎症的關鍵作用；但在早期試驗中抑制p38MAPK未提供顯著益處。GLK為一種於不同人類組織中廣泛表現之絲胺酸/蘇胺酸激酶且為MAPK信號傳導之上游激酶。近來的研究證實，GLK藉由使PKC-θ直接磷酸化且活化來誘導IKK-NF-κB路徑。使用EAE及CIA模型進行之研究及先前的報導顯示，GLK缺乏與PKC-θ缺乏之小鼠皆呈現較少的Th1/Th17介導之自體免疫反應，表明GLK信號傳導可控制自體免疫性。在來自RA患者之周邊血液及滑液的T細胞中GLK與PKC-θ共定位。此外，大部分表現GLK之T細胞為PKC-θ/IKK活化之細胞。據吾人所知，本研究首次報導了T細胞中之GLK過度表現及PKC-θ/IKK超活化為RA患者之新穎生物標記。此外，GLK陽性T細胞之頻率與RA疾病活動度呈正相關，表明GLK-PKC-θ-IKK路徑在RA之發病中起關鍵作用。
NF-κB路徑之上調對於基質降解酶之合成很關鍵，會在RA中引起骨侵蝕，而抑制IKK可防止骨及軟骨破壞。在T細胞株中抗-CD3誘導之NF-κB活化亦藉由GLK過度表現而增強且受GLK siRNA抑制，表明在RA中抑制GLK可減輕發炎。已報導在RA患者中調控性T細胞(Treg)之功能受損，而抑制PKC-θ可恢復RA患者之有缺陷的Treg活性。GLK缺乏之小鼠顯示Treg介導之抑制功能增強。因此，GLK-PKC-θ路徑負調控Treg功能。當一起考量時，在RA患者中拮抗GLK可能減少T細胞介導之免疫反應且加強Treg介導 之抑制功能，表明GLK為有前景的RA治療標的。
此研究具有一些侷限。首先，其設計為橫斷性設計，使其難以評估藥理學治療對GLK表現之影響。先前的報導已顯示，糖皮質激素抑制PKC-θ信號傳導且TNF-α抑制劑降低受NF-κB調控之基因表現。儘管免疫抑制劑可減少RA患者之T細胞中GLK、PKC-θ IKK或NF-κB之表現，但在至少86%之RA患者中GLK含量仍顯著較高且與疾病活動度相關。其次，GLK在骨破壞及軟骨損傷之發病中之作用仍難以捉摸。然而，結果證實在RA患者中GLK與關節發炎之間存在關聯。
結果表明，GLK在RA之發病中起關鍵作用且為疾病嚴重程度之潛在診斷性生物標記。另外，抑制GLK及其下游PKC-θ-IKK信號傳導可為RA提供新穎治療策略。
III.在成人發作型史迪爾氏病中生發中心激酶(GCK)類激酶(GLK/MAP4K3)表現增加且可充當活性標記
經顯示，GLK之表現增強與全身性紅斑狼瘡(SLE)患者之疾病嚴重程度一致。研究GLK在成人發作型史迪爾氏病(AOSD)之發病中之作用，其與SLE共有一些類似之臨床特徵。
方法
患者及健康對照。 登記24個滿足山口(Yamaguchi)準則之患有活動期未治療之AOSD的連續患者(15個女性及9個男性，平均年齡±SD為33.3±9.9歲)。排除有感染、惡性病或其他風濕性疾病之患者。根據Pouchot等人所述之準則 評估各AOSD患者之疾病活動度評分(範圍為0至12)。在初始測定循環之表現GLK之T細胞及Th17相關細胞激素的含量之後，所有AOSD患者均接受皮質類固醇及非類固醇消炎藥物(NSAID)。所用改善疾病之抗風濕藥物(disease-modifying anti-rheumatic drug，DMARD)為甲胺喋呤(20個患者)、羥氯喹(18個患者)、柳氮磺胺吡啶(8個患者)及硫唑嘌呤(3個患者)。12個沒有風濕性疾病之年齡匹配的健康志願者(8個女性及4個男性，平均年齡為32.4±8.2歲)充當正常對照。使用無內毒素之肝素化真空管(KABI-ET；Chromogenix,Antwerp,Belgium)收集周邊血液以避免在取樣與培養之間的時間間隔期間產生細胞激素。臺中榮民總醫院之臨床研究倫理委員會批准了此研究(第C10130號)且根據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)自所有參與者獲得書面同意書。
使用流動式細胞測量術分析來定量循環之表現GLK之T細胞。 根據一項近期研究中所述之技術，使用流動式細胞測量術分析來定量循環之表現GLK之T細胞。藉由用個別肽使兔免疫來產生GLK之抗體。簡言之，收集周邊血液單核細胞(PBMC)，用冷PBS洗滌且於冰上用指定抗體染色30分鐘。接著在無任何其他刺激之情況下用Golgi-stop(10 μg/ml布雷菲德菌素A(BrefeldinA),Sigma,Germany)處理PBMC，且接著在室溫下用抗-CD3-別藻藍蛋白[APC]-Cy7(BD Pharmingen)、抗-CD4-太平洋藍(pacidic blue)(BD Pharmingen)及抗-CD8-多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)花青苷 5.5(Cy5.5)(BD Pharmingen)染色。對於細胞內染色，使PBMC在200 μl Cytofix/Cytoperm緩衝液(BD Biosciences)中滲透2小時且用Perm-Wash緩衝液洗滌。在黑暗中在室溫下用100 μl試劑2，即皂素(Beckman Coulter,USA)培育集結粒5分鐘。用0.1% BSA-PBS洗滌樣品兩次且在黑暗中在室溫下用結合PE之GLK特異性mAb(eBiosciences,USA)培育30分鐘。在黑暗中在室溫下使用同型對照IgG1-PE(eBiosciences,USA)進行GLK染色。染色之後，洗滌細胞且立即使用流動式細胞測量術(Beckman Coulter,USA)進行分析。基於前散射及尺寸分散特性對淋巴細胞進行閘控，且分析至少10,000個CD3+ 細胞。使用FACSCanto II流動式細胞儀(BD Biosciences)收集數據且藉由FlowJo軟體進行分析。
用於GLK表現之西方墨點法。 對於免疫墨點分析，如近期的研究中所述對經純化T細胞之樣品進行。對於GLK，在電泳緩衝液(25 mM Tris、192 mM甘胺酸、0.1% SDS)中於6至8% SDS-PAGE上部分分離反應混合物(來自各組實驗之等量細胞提取物)。在90 V下跑膠30分鐘，接著在130 V下進行跑膠，直至藍色染料前沿到達底部。用Trans-Blot SD半乾電泳轉印槽(BIO-RAD,USA)在21 V下經1小時將凝膠在轉印緩衝液(50 mM Tris、384 mM甘胺酸、20%甲醇)中轉印至聚偏二氟乙烯薄膜(PVDF)。在室溫下用含5% BSA之TBST(150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.1% Tween-20)阻斷薄膜1小時，接著用抗-GLK(1：1000) 探查，該抗-GLK係在4℃下藉由用適當肽及抗-β-微管蛋白(1：1000 T4026，Sigma,USA)使兔免疫隔夜而產生。用TBST洗滌薄膜約3次，隨後在室溫下用結合過氧化酶之二級抗體(1：6000)培育1小時。用TBST洗滌抗體反應之薄膜3次，且使用以新穎MegaCam 810科學級CCD攝影機(UVP,LLC,CA,USA)曝光之增強型Immobilon西方化學發光HRP受質(enhanced Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate)(WBKLS0500,Millipore,USA)操作。針對β-微管蛋白校正GLK蛋白之相對表現量，且相對於對照來表示各值。
用於GLK表現之定量PCR(qPCR)。 使用Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare Biosciences,Sweden)密度梯度離心立即自靜脈血分離PBMC。藉由異硫氰酸胍方法自PBMC獲得總細胞RNA，且藉由分光光度測定法在260 nm下進行定量。根據標準程序，用200U Moloney鼠類白血病病毒反轉錄酶(Fermentas,Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)對2.5 μg RNA等分試樣進行反轉錄。藉由TaqMan PCR核心試劑套組(Applied Biosystems,USA)中提供之qPCR分析來測定GLK mRNA表現量。自Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)獲得對GLK及內部對照甘油醛-3-磷酸酯去氫酶(GAPDH)具有特異性之引子。藉由解離曲線圖評估PCR產物之純度。為使GLK之mRNA含量標準化，亦並行測定各樣品之管家基因GAPDH之轉錄物含量。用比較閾值循環(Ct)法計算GLK之相對表現量且藉由2-△△Ct 進行評 價，△△Ct=專利品(CtGLK基因 -CtGAPDH )-對照(CtGLK基因 -CtGAPDH )之平均值。
測定可溶性IL-2受體(sIL-2R)以及Th17相關細胞激素之血清含量。 使用ELISA套組(Cellfree；Endogen Inc,MA,USA)測定血清sIL-2R含量。根據製造商之說明書(eBiosciences,San Diego,CA,USA)，使用酶聯結免疫吸附劑分析來測定AOSD患者及健康對照中IL-1β、IL-6、IL-17A及TNF-α之血清含量。
統計分析。 結果以平均值±SD或中值呈現(四分位數範圍)。將非參數克拉斯卡-瓦立斯測試(nonparametric Kruskal-Wallis test)用於循環之表現GLK之T細胞的頻率、GLK轉錄物及蛋白質之表現量以及Th17相關細胞激素之血清含量的組間比較。當此測試顯示顯著差異時，則使用曼-惠特尼U測試(Mann-Whitney U test)測定精確p值。使用非參數斯皮爾曼氏秩相關性測試(nonparametric Spearman's rank correlation test)計算相關係數。採用威爾科克森符號秩測試(Wilcoxon signed rank test)比較在有效療法之後隨訪期間AOSD患者中循環之表現GLK之T細胞的含量及GLK之表現量。為進行比較，採用威爾科克森符號秩測試。可能性小於0.05被視為顯著的。
結果 AOSD患者之臨床特徵
如表4中所示，所有24個患活動期未治療之AOSD的患者每天具有峰熱(39℃)。其他常見表現包括易消退的紅疹 (20個，83.3%)、喉嚨痛(17個，70.8%)及關節炎(15個，62.5%)。分別在10個(41.7%)及6個(25.0%)患者中注意到淋巴腺病及肝脾腫大。AOSD患者與健康對照之間在進入此研究時之年齡或女性比例方面並無顯著差異。表4顯示成人發作型史迪爾氏病(AOSD)患者及健康對照(HC)之人口統計數據及臨床特徵# 。
肝臟功能障礙定義為丙胺酸胺基轉移酶(ALT)含量≧40 IU/L；CRP：C反應蛋白；sIL-2R：可溶性介白素-2受體。
AOSD患者中循環之表現GLK之T細胞的頻率增加
1個活動期AOSD患者及1個健康對照之周邊血液CD3+ T細胞、CD4+ T細胞及CD8+ T細胞中GLK表現之流動式細胞測量術等高線圖的代表性實例分別示於圖20A-B中。在活動期AOSD患者中觀測到的循環之表現GLK之CD3+ T細胞之中值頻率(中值=31.85%，四分位數[IQ]範圍為21.21%至48.84%)顯著高於健康對照中(中值=8.93%，IQ範圍為6.81%至12.08%；p<0.001，圖20C)。
AOSD患者中GLK轉錄物及蛋白質之表現增加
如圖20D中所示，在活動期AOSD患者中觀測到的GLK轉錄物之相對表現之增加倍數(中值=2.35，IQ範圍為1.66至3.88)顯著高於健康對照中(中值=0.92，IQ範圍為0.63至1.37；p<0.001)。類似地，藉由西方墨點法測定，活動期AOSD患者之經純化T細胞之溶胞物中GLK的表現增加(圖20E)。活動期AOSD患者中GLK蛋白之相對表現量(中值=1.74，IQ範圍為1.47至2.95)顯著高於對照中者(中值=0.66，IQ範圍為0.54至0.94；p<0.001，圖20F)。
AOSD患者中Th17相關細胞激素之血清含量增加
如圖21中所示，活動期AOSD患者中血清IL-6(中值=474.81，IQ範圍為156.42至987.55)、IL-17A(中值=306.80，IQ範圍為152.17至503.70)及TNF-α(中值 =51.85，IQ範圍為23.63至65.93)之中值含量顯著高於健康對照中者(對於IL-6，中值=85.78，IQ範圍為31.13至189.98，p<0.001；對於IL-17A，中值=70.90，IQ範圍51.42至124.53，p<0.001；且對於TNF-α，中值=24.66，IQ範圍為10.50至37.76，p<0.01)。然而，在AOSD患者與HC之間，血清IL-1β含量並無顯著差異。
AOSD患者中GLK表現與疾病活動度以及細胞激素之間的相關性
AOSD：成人發作型史迪爾氏病；CRP：C反應蛋白；sIL-2R：可溶性介白素-2受體；IL-1β：介白素-1β；IL-6：介白素-6；IL-17A：介白素-17A；TNF-α：腫瘤壞死因子-α。*p<0.05、**p<0.005、***p<0.001係藉由非參數斯皮爾曼氏秩相關性測試獲得。
如表5中所示，在AOSD患者中，循環之表現GLK之CD3+ T細胞之頻率與反映T細胞活化之包括臨床活動度評分、CRP含量、鐵蛋白含量及血清sIL-2R含量在內的疾病活動度呈正相關。類似地，在AOSD患者中GLK蛋白及轉錄物之相對表現量與臨床活動度評分及sIL-2R含量呈正相關。在Th17相關細胞激素中，GLK表現量與IL-6及IL-17A之血清含量呈正相關。然而，在AOSD患者中GLK表現與臨床表現無顯著相關性(數據未圖示)。表5顯示在24個AOSD患者中循環之表現GLK之T細胞之頻率、GLK蛋白以及GLK轉錄物之相對表現量與疾病活動度參數以及Th17相關細胞激素之間的相關性。
有效療法之後AOSD患者中GLK表現量之變化
12個AOSD患者可用於在活動期與在症狀緩解期進行之檢查。如圖22中所示，在有效療法之後，在AOSD患者中循環之表現GLK之T細胞的含量及GLK蛋白以及轉錄物之相對表現量顯著降低(平均值±SEM分別為45.77±5.58對20.11±2.53；3.01±0.49對0.93±0.17；及3.45±0.56對1.21±0.38，所有均為p<0.005)，並行發生臨床症狀緩解及血清sIL-2R含量降低(747.8±131.8 pg/ml對229.1±38.5 pg/ml，p<0.005)。
此研究首次研究證實了相對於健康對照，在活動期AOSD患者中存在GLK過度表現。細胞內信號傳導分子之流動式細胞測量術分析之出現大大增加了研究異質細胞群體中之單個細胞之機會。在目前的研究中，包括CD4及 CD8子集在內之CD3+ T細胞表明在活動期AOSD患者中GLK表現增加。結果亦顯示在AOSD患者中，循環之表現GLK之T細胞之頻率顯著提高，此與疾病活動度(包括臨床活動度評分及血清鐵蛋白含量)相關。此外，在AOSD患者中發現，GLK產生隨疾病症狀緩解而並行減少。此等關於AOSD患者之數據與顯示在SLE患者中循環之表現GLK之T細胞的含量提高與活動度指數相關的近期研究之結果類似，從而表明GLK過度表現在AOSD發病中起重要作用，且因此為此疾病之潛在活性標記。然而，應實施有極大前瞻性之研究以確證本文呈現之研究結果。
為驗證AOSD患者中GLK在蛋白質及轉錄物層面上之表現，在來自患活動期未治療AOSD之患者之周邊血液淋巴細胞中進行針對GLK表現之西方墨點法及qPCR。經證實，在AOSD患者中GLK蛋白及轉錄物之相對表現量顯著高於HC中。此外，該研究中循環之表現GLK之T細胞的頻率與GLK蛋白之表現量之間的正相關性與先前研究之研究結果一致，顯示對於量測MAPK信號傳導狀態，細胞內流動式細胞測量術與西方墨點法為等效的分析。另外，在AOSD患者中GLK蛋白以及轉錄物之表現量與臨床活動度評分顯著相關。此等數據提供了在AOSD患者之T細胞中GLK過度表現之首個直接且可靠之證據。
累積的證據表明Th17細胞在AOSD與SLE之發病中起重要作用。IL-6與IL-1β協同作用以增強Th17細胞之分化及產生。Th17細胞可分泌IL-17，此為一種藉由誘導促炎性細 胞激素及趨化因子表現來參與組織發炎之多效性細胞激素。近期的研究顯示，GLK缺乏之小鼠能抵抗EAE發展且顯示出減少之Th17反應。來自活體外T細胞分化分析之結果亦表明GLK在Th17細胞分化中起積極作用。在本發明研究中，結果揭示Th17相關細胞激素(IL-6及IL-17A)之血清含量提高，此與AOSD患者之T細胞中GLK之表現量相關。數據亦支持了先前研究結果，顯示MAPK路徑在Th17細胞功能之調控中起重要作用且IL-17產生係由MAPK依賴性機制介導。另外，在伏格特-小柳-原田症候群(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)中，抑制MAPK可抑制IL-17產生，且減弱Th17介導之自體免疫疾病EAE。此等觀測表明GLK過度表現或MAPK信號傳導可參與Th17相關細胞激素之產生。然而，仍存在一種可能性，即GLK上調可表示發炎為偶發現象，而非AOSD發病中之初始事件。
AOSD患者之縱向隨訪顯示在有效療法之後，循環之表現GLK之T細胞的含量以及GLK蛋白及轉錄物之表現量顯著降低，並行發生臨床症狀緩解及發炎性參數降低(圖23)。該等結果支持了以下假設：諸如MAP2K(MKK3或MKK6)及MAP3K(轉型生長因子活化激酶1，TAK1)之處於更上游的MAPK信號傳導路徑之抑制劑可為風濕性疾病之有前景之治療模式。作為上游MAP激酶，GLK亦可被靶向，由此藉由廣泛抑制下游MAPK或若干p38同功異型物而提供一種潛在治療策略。此外，相較於諸如p38MAPK之下游分子，上游信號傳導分子可為較佳標的，阻斷該等分子 可導致相當大的毒性作用。
儘管一些研究已報導在AOSD中IL-1β含量提高及IL-1β受體拮抗劑(阿那白滯素(anakinra))對於治療發炎性疾病之實質益處，但該等結果顯示AOSD患者與健康志願者之間在IL-β含量方面並無顯著差異。
結果揭示，GLK過度表現伴隨Th17相關細胞激素含量遞增可能與AOSD之發病有關。所得數據為支持GLK過度表現與一系列發炎性疾病之間的關聯增加了證據。結果亦顯示GLK表現量與AOSD之疾病活動度呈正相關，表明GLK可為新穎活性生物標記及潛在治療標的。
IV.作為診斷性生物標記之GLK
除SLE患者之外，來自七種其他自體免疫疾病之患者樣品亦顯示在周邊血液T細胞中GLK表現之顯著增強(表6，圖24-26)。如上所揭示，GLK表現與RA及AOSD之疾病嚴重程度相關。在來自RA患者之滑膜組織中偵測到過度表現GLK之T細胞。
數據顯示，在SLE患者中過度表現GLK之周邊血液T細胞皆為產生IL-17之細胞(圖27)。為研究GLK在自體免疫性之發病中之調控作用，進一步產生T細胞特異性GLK轉殖基因(Tg)小鼠，命名為Lck-GLK。Lck-GLK Tg小鼠隨血清IL-17及SLE/類風濕性關節炎自體抗體增加而自發地發展多種自體免疫疾病(圖28及29)。Lck-GLK Tg小鼠呈現出類風濕性關節炎及多發性硬化症之表型。T細胞中之IL-17轉 錄係由轉殖基因GLK誘導(圖29)。LCK-GLK Tg小鼠之此等結果表明，GLK-PKCθ-IKK-IL-17軸之活化促進自體免疫疾病。
因此，GLK為多種自體免疫疾病之診斷性生物標記及治療標的，該等自體免疫疾病包括全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、成人發作型史迪爾氏病、葛瑞夫茲氏病、休格連氏症候群、視神經脊髓炎、僵直性脊椎炎及禿髮症。
因為GLK誘導NF-kB活化，此與腫瘤形成有關，所以對癌瘤樣品中之GLK表現進行研究。近期的數據顯示，在人類非小細胞肺癌(NSCLC)、食道癌、神經膠母細胞瘤、胰臟導管腺癌、乳癌及肝癌中GLK之表現顯著增強(圖30-35)。在NSCLC中IKK活化增強，但mTOR不然(圖30)。此等數據表明GLK經由非mTOR依賴性路徑促進腫瘤形成。此外，在NSCLC患者中，腫瘤部分中之GLK過度表現與早期復發(亦即遠端轉移)高度相關(P =0.009；圖36)。數據顯示GLK之過度表現誘發腫瘤形成及腫瘤轉移(圖37)。因此，GLK為諸如肺癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、乳癌及肝癌之多種癌症之新穎生物標記及治療標的。
當一起考量時，數據表明GLK為自體免疫發炎性疾病及癌症之新穎生物標記及治療標的。GLK抑制劑之未來發展可用作細胞過度表現GLK之自體免疫發炎性疾病/癌症患者之治療劑。
結果 1. GLK為多種自體免疫疾病之新穎生物標記
除SLE、類風濕性關節炎及成人發作型史迪爾氏病患者之T細胞中GLK過度表現之外，GLK過度表現亦見於休格連氏症候群、視神經脊髓炎、僵直性脊椎炎及禿髮症之T細胞中(圖24)。亦發現藉由流動式細胞測量術、免疫墨點及定量聚合酶鏈反應(qPCR)所測定，GLK於未經藥物處理之格雷氏病(Grave's disease，GD)患者以及接受部分抗甲狀腺治療但仍處於甲狀腺毒性狀態之患者的T細胞中過度表現(圖25及26)。在來自GD患者之T細胞中GLK蛋白含量及mRNA含量增加(圖25)。結果表明，GLK之過度表現促進自體免疫疾病之發病及嚴重程度且為自體免疫疾病之新穎生物標記。表6顯示GLK介導之自體免疫疾病及癌症。
2. GLK誘導T細胞中之IL-17產生
為研究自體免疫性之發病中GLK之調控作用，使用T細胞特異性啟動子Lck進一步產生T細胞特異性GLK轉殖基因(Tg)小鼠。Lck-GLK Tg小鼠隨血清自體抗體及血清IL-17特異性增加而自發地發展多種自體免疫疾病(圖27-29)。此等研究結果表明，GLK-PKCθ-IKK-IL-17軸之活化促進自體免疫疾病。表現高含量GLK轉殖基因之Lck-GLK Tg小鼠(8週齡)顯示對血清IL-17A含量之劇烈誘導作用。IL-17A mRNA含量藉由轉殖基因GLK而增加(圖29)。此等結果進 一步確證了有關GLK正調控T細胞中之IL-17A產生的SLE患者之數據。
3.在多種類型之癌症中GLK過度表現.
與來自肺癌患者之正常部分相比，其腫瘤部分中之GLK蛋白含量增加(85.7%)。與來自食道癌患者之正常部分相比，其腫瘤部分中之GLK蛋白含量增加(58%)。GLK亦於神經膠母細胞瘤、胰臟癌、乳癌及肝癌中過度表現。
本發明之例示性實施例的以上描述已僅出於說明及描述之目的提供，且不意欲為詳盡的或將本發明侷限於所揭示之.精確形式。依據以上教示，許多修改及變化係可能的。
圖1顯示GLK與PKC-θ在T538處直接相互作用且使其磷酸化。(a )在用GLK siRNA或編碼GLK之質體轉染之Jurkat T細胞中NF-κB報導體分析之螢光素酶活性。誤差條為一式三份樣品之標準差(s.d.)。(b )在CD3刺激之後，小鼠原 生T細胞之溶胞物中內源性GLK與PKC-θ之共免疫沈澱(IP)。NS為正常血清。IB為免疫墨點。(c )經純化Flag-GLK及GST-PKC-θ蛋白之活體外結合分析。ppt為沈澱。(d )使用自經轉染之HEK293T細胞分離之Flag-GLK及Myc-PKC-θ(作為受質)之活體外激酶分析中GLK表現及GLK誘導之PKC-θ磷酸化之免疫墨點分析。Jurkat細胞之溶胞物中PKC-θ之免疫墨點分析被顯示為對照色帶(右邊兩個泳道)。(e )使用經純化Flag-GLK及GST-PKC-θ蛋白之活體外激酶分析中GLK表現及GLK誘導之PKC-θ磷酸化之免疫墨點分析。數據表示三個獨立實驗。
圖2顯示SLP-76為GLK之直接上游調控劑。(a)在CD3刺激之後，小鼠原生T細胞之溶胞物中內源性GLK與SLP-76或PKC-θ之共免疫沈澱。(b )經純化Flag-GLK及Flag-SLP-76蛋白之活體外結合分析。(c 、d )用空白載體或在有或無SLP-76 shRNA之情況下用編碼GLK之質體轉染(d)，接著不作處理或用抗-CD3抗體處理之J14細胞(c)或Jurkat T細胞(d)之溶胞物中Flag-GLK之活體外激酶分析。(e )用空白載體或編碼SLP-76之質體加編碼GLK或HPK1之質體轉染之HEK293T細胞之溶胞物中SLP-76 S376磷酸化之免疫墨點分析。箭頭為SLP-76 S376之磷酸化。數據表示三個獨立實驗。
圖3顯示GLK缺乏之原生T細胞在PKC-θ-IKK活化及T細胞增殖方面有缺陷。(a 、b )在CD3(a)或CD3加CD28(b)刺激之後，經純化T細胞之溶胞物中GLK、p-PKC-θ、PKC- θ、IKK、p-Erk、Erk、p-PDK1、PDK1及微管蛋白之免疫墨點分析。(c )在用抗-CD3抗體且接著用離子黴素(Iono)刺激之經純化小鼠T細胞中鈣指示劑Fluo-4之流動式細胞測量術。(d 、e )自用抗-CD3抗-體或PMA加離子黴素處理72小時之野生型或GLK缺乏之小鼠分離的CD3+ T細胞之[3 H]胸苷併入分析(d )及CFSE型態(e )。顯示了藉由FlowJo軟體所分析之增殖指數(平均值±s.e.m)。(f )在用空白載體(pCMV-GFP)或GFP-GLK轉染之野生型及GLK缺乏之T細胞中之[3 H]胸苷併入分析。WT為野生型；GLK-KO為GLK缺乏之小鼠。數據表示三個獨立實驗(誤差條(d 、f )，s.e.m.)。
圖4顯示在GLK缺乏之小鼠中活體內T細胞依賴性免疫反應削弱。(a 、b )自KLH免疫小鼠分離且活體外用KLH再刺激3天的KLH再刺激之淋巴結細胞之培養物上清液中的CFSE稀釋度分析(a)以及IFN-γ、IL-2及IL-4之ELISA分析(b)。顯示了藉由FlowJo軟體分析之增殖指數(平均值)。(c 、d )在初次免疫之後14天(c)或二次免疫之後7天(d)，小鼠血清中硝基苯酚特異性抗體(NP特異性Ab)產生之ELISA分析，n=6。(e )在B6背景(約97%)中F5之GLK缺乏之小鼠及其野生型同窩出生仔鼠中之EAE誘發。顯示了小鼠之臨床評分(1至5)。n=7。(f )來自第14天之MOG免疫小鼠之腦及.脊髓之浸潤性TH 17細胞(經CD45閘控)之流動式細胞測量術。(g )MOG免疫小鼠之血清中IL-17含量之ELISA分析。n=6。(h )活體外分化之TH 17細胞中產生IL-17之CD4 T細胞 之流動式細胞測量術。(i )以3：1(左圖)或9：1(右圖)之比率用Treg 細胞加經抗-CD3塗佈之珠粒培養之反應性T細胞中，由野生型或GLK缺乏之Treg 細胞進行之CD3+ T細胞(用胞內染料CFSE標記)抑制，以CFSE稀釋度呈現。數據以來自三個(圖b 、e 、f 及h )或兩個(圖a 、c 、d 、g 及i )獨立實驗之平均值±s.e.m.形式呈現。*為P 值<0.05；**為P 值<0.001。
圖5顯示在來自SLE患者之T細胞中誘導GLK表現及PKC-θ-T538磷酸化。(a )來自49個SLE患者及35個健康對照(HC)之PBL中表現GLK(GLK+ )之淋巴細胞之流動式細胞測量術分析；來自SLE患者之結果(SLEDAI=20)作為代表顯示。(b )SLEDAI與來自所有SLE患者之表現GLK之T細胞之百分比之間的正相關性及顯著回歸(皮爾遜相關係數(Pearson correlation coefficient)：r=0.773；簡單線性回歸：Y=-0.886+0.3901X，回歸相關係數：經調整之R2 =0.597，P 值=1.08×10-17 )。(c )SLEDAI與來自具有高GLK+ 百分比(21%)之SLE患者之GLK+ T細胞之百分比之間的高相關性及顯著回歸。(n=16；皮爾遜相關係數：r=0.807；簡單線性回歸：Y=5.2085+0.2757X，回歸相關係數：經調整之R2 =0.626，P 值=0.000159)。(d )來自5個隨機取樣之SLE患者及5個健康對照之PBL的溶胞物中GLK、p-PKC-θ、p-IKK及微管蛋白之免疫墨點分析。各患者之SLEDAI示於圖下方。針對微管蛋白校正相對倍數變化且示於圖底部。(e )來自代表性SLE患者及健康對照之PBL中磷酸化-PKC-θ 或磷酸化-IKK陽性(經CD3閘控)細胞之流動式細胞測量術(參見圖a)。數據表示至少三個獨立實驗(d 、e )。
圖6顯示在TCR信號傳導期間GLK誘導之PKC-θ/NF-κB活化之圖解。在TCR連接反應之後，活化之Lck被募集至TCR複合物且使CD3之基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)磷酸化，從而引起Zap70募集及活化。Zap70活化可誘導近端SLP-76信號傳導複合物之組裝。SLP-76與GLK直接相互作用且為GLK激酶活化所需。活化之GLK與PKC-θ在T538處直接相互作用且使其磷酸化，從而引起PKC-θ膜轉位及激酶活化。活化之PKC-θ又誘導IKK/NF-κB信號傳導級聯之活化。在癌細胞中，GLK經由PKC/NF-κB信號傳導或非PKC依賴性信號傳導來誘導遷移/侵襲/轉移。
圖7顯示當TCR刺激時GLK會誘導T細胞中NF-κB活化。(a )用抗-CD3抗體刺激15分鐘之載體、GLK或GLK(KD)突變體表現型Jurkat T細胞之溶胞物中GLK、p-IKK、IKK、p-Erk、Erk、p-mTOR、mTOR及微管蛋白之免疫墨點分析。(b )在TNF-α刺激之後，用空白載體或GLK siRNA轉染之Jurkat細胞之NF-κB報導體分析(左圖)。在抗-CD3刺激之後，用空白載體、編碼GLK之質體或GLK siRNA轉染之Jurkat T細胞之溶胞物中GLK及微管蛋白之免疫墨點分析。(c )自用抗-CD3抗體刺激之表現Flag-GLK之J-TAg T細胞分離之GLK的活體外激酶分析。箭頭為GLK自體磷酸化。IP為免疫沈澱。IB為免疫墨點。(d )在CD3刺激30分鐘之後用編碼GLK或GLK(KD)突變體之質體轉染之J-TAg T 細胞之溶胞物中GLK、p-PKC-θ、PKC-θ及微管蛋白之免疫墨點分析。(e )用指定空白載體、編碼GLK之質體、單獨GLK或PKC-θ siRNA或用編碼GLK之質體加PKC-θ siRNA轉染之Jurkat T細胞的NF-κB報導體分析。在有或無抗-CD3抗體之情況下刺激細胞2小時。數據表示三個獨立實驗。*為P 值<0.05；**為P 值<0.001。圖(b )及(e )中之誤差條為一式三份樣品之標準差(s.d.)。數據表示至少三個獨立實驗。
圖8顯示GLK與PKC-θ相互作用。(a )用空白載體或者編碼GLK之質體加或不加編碼PKC-θ之質體轉染之HEK293T細胞之溶胞物中GLK及PKC-θ之共免疫沈澱(IP)及免疫墨點(IB)分析。(b 、c )用5 μg/ml抗-CD3抗體刺激之表現Flag-GLK之J-TAg(b)或EL4(c)T細胞之溶胞物中Flag-GLK及內源性PKC-θ之共免疫沈澱(上圖)。預免疫沈澱樣品中GLK、p-PKC-θ、PKC-θ及微管蛋白之免疫墨點分析(下圖)。數據表示至少三個獨立實驗。
圖9顯示經由酪胺酸磷酸化介導GLK與SLP-76之間的相互作用。(a )用空白載體或編碼SLP-76之質體加編碼GLK之質體轉染之HEK293T細胞之溶胞物中GLK及SLP-76之共免疫沈澱(IP)及免疫墨點(IB)分析。(b )用抗-CD3抗體刺激之過度表現Flag-SLP-76之J-TAg T細胞之溶胞物中SLP-76及GLK之共免疫沈澱。(c )用Flag-GLK轉染之J-TAg T細胞中抗-CD3誘導之SLP-76/GLK/PKC-θ相互作用之共免疫沈澱。(d )用編碼SLP-76之質體加空白載體或編碼GLK之質 體轉染之HEK293T細胞之溶胞物中GLK及SLP-76之共免疫沈澱。將細胞用/不用酪胺酸磷酸酶抑制劑過釩酸鹽或絲胺酸/蘇胺酸磷酸酶抑制劑岡田井酸(okadaic acid)預處理。數據表示至少三個獨立實驗。
圖10顯示TCR誘導之GLK活化不需要Vav1。自用或不用抗-CD3抗體刺激30分鐘之Vav1 shRNA基因表現阻斷之Jurkat T細胞(shVav1 a-c)分離之Flag-GLK的活體外激酶分析。MBP被用作受質。數據表示至少三個獨立實驗。
圖11顯示在GLK缺乏之小鼠中T細胞發育正常。(a )基因捕獲載體之結構。β-geo為與β-半乳糖苷酶及新黴素磷酸轉移酶基因之融合物；SA為剪接受體；具有數字之方框為GLK之外顯子；點線箭頭為PCR之引子。(b )來自小鼠尾巴之基因組DNA中GLK 野生型及突變體對偶基因之PCR分析。較高色帶(1400 bp)之PCR產物表示野生型(WT)對偶基因，且較低色帶(1000 bp)表示GLK突變體對偶基因。(c -e )來自野生型及GLK缺乏(GLK-KO)之小鼠之胸腺(c)、脾臟(d)及淋巴結(e)之T淋巴細胞的流動式細胞測量術分析。數據以平均值±s.e.m形式呈現。(f )用抗-CD3-生物素及抗生蛋白鏈菌素刺激之小鼠T細胞之溶胞物中GLK、p-PLCγ1、p-Lck、Lck及微管蛋白之免疫墨點分析。(g )經純化T細胞中T細胞增殖之CFSE稀釋度分析。亦顯示了藉由FlowJo軟體分析之增殖指數(平均值±s.e.m)。數據表示至少三個獨立實驗(b 至g )。
圖12顯示TH 1及TH 2之分化藉由GLK缺乏而削弱。產生 IFN-γ、產生IL-4及Foxp3陽性CD4+ T細胞之流動式細胞測量術。數據以平均值±s.e.m形式呈現。數據表示至少三個獨立實驗。
圖13顯示在SLE患者中血清IL-17含量增加。(a)SLE患者及配對健康對照之型態。數據以平均值±s.d形式呈現。(b)SLE患者及健康對照(HC)之血清中IL-17、TNF-α及IL-6之ELISA分析。
圖14顯示在GLK缺乏之小鼠中CIA之誘導削弱。(A)平均臨床評分±SEM，比較了GLK缺乏之小鼠與野生型(WT)小鼠之間的疾病發展。在膠原蛋白免疫之後，每週對動物評分一次。n=5。(B)二次免疫之後第7天獲得後腿關節。(C)藉由ELISA分析來測定免疫之後第7天來自GLK缺乏之小鼠及WT小鼠之血清IL-1β含量。(D及E)藉由ELISA分析來測定二次免疫之後第7天來自小鼠之血清IL-6(D)及IL-17A(E)含量。*為p <0.05；**為p <0.01。
圖15顯示來自RA患者之周邊血液T細胞中之GLK蛋白及mRNA含量增加。(A)來自5個隨機取樣之RA患者及兩個健康對照(HC)之經純化周邊血液T細胞中GLK及磷酸化PKC-θ(p-PKC-θ)之免疫墨點分析。針對GAPDH校正GLK之相對倍數變化且示於圖底部。(B)11個RA患者與5個HC之間GLK表現量之比較。數據以針對GAPDH進行校正之GLK之相對倍數變化形式呈現。p =0.047。(C)12個RA患者及13個HC之經純化周邊血液T細胞中GLK信使RNA(mRNA)之含量。數據表示為GLK與肽基脯胺醯異構酶A(PPIA) mRNA轉錄物之比率。誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。p =0.0029。
圖16顯示來自RA患者之滑液及滑膜組織之T細胞中GLK之過度表現。(A)來自代表性RA及OA患者之滑液白血球中GLK及p-PKC-θ之免疫墨點分析。(B)代表性RA及OA患者之滑液中經CD3閘控之GLK陽性T細胞之流動式細胞測量術分析。(C)兩個RA及兩個OA患者之滑膜組織中抗-GLK(藍色)及抗-CD3(棕色)之免疫組織化學染色。箭頭表示表現GLK之T細胞。
圖17顯示來自RA患者之滑液及周邊血液之T細胞中GLK、PKC-θ及CD3之共定位分析。(A)藉由TCS SP5(LEICA)共焦系統進行的RA及OA患者之滑液T細胞中GLK、PKC-θ及CD3之共焦顯微術。(B)藉由TCS SP5(LEICA)共焦系統進行的RA患者及HC之周邊血液T細胞中GLK、PKC-θ及CD3之共焦顯微術。
圖18顯示RA患者之周邊血液T細胞中GLK、p-PKC-θ及p-IKK之發炎性細胞激素含量及共存性增加。藉由ELISA分析來測定RA患者及健康對照中(A)TNF-α、(B)IL-6及(C)TGF-β之血清含量。(D)來自代表性RA患者及健康對照(HC)之周邊血液白血球之GLK/p-PKC-θ/p-IKK陽性細胞之流動式細胞測量術分析。對CD3陽性T細胞閘控且接著藉由流動式細胞測量術進行分析。(E)30個RA患者與24個HC之間經CD3閘控之T細胞中GLK表現之比較。誤差條表示平均值之95%信賴區間。*為p <0.05；**為p <0.01。
圖19顯示表現GLK之T細胞頻率與RA疾病活動度之相關性。顯示了來自所有RA患者之以下之正相關性及顯著回歸：(A)壓痛關節計數(TJC)與表現GLK之T細胞之頻率之間(皮爾遜氏相關係數：r=0.500；簡單線性回歸：Y=0.274X-0.402，p=0.005)；(B)紅血球沈降速率(ESR)與表現GLK之T細胞之頻率之間(皮爾遜氏相關係數：r=0.400；簡單線性回歸：Y=1.113X+9.602，p=0.003)；(C)C反應蛋白(CRP)與表現GLK之T細胞之頻率之間(皮爾遜氏相關係數：r=0.330；簡單線性回歸：Y=0.059X-0.271，p =0.015)；(D)DAS28與表現GLK之T細胞之頻率之間(皮爾遜氏相關係數：r=0.606；簡單線性回歸：Y=0.065X+3.575，p=0.005)。(E)來自30個患者中之26個之DAS28與表現GLK之T細胞之頻率之間的相關性及顯著回歸(皮爾遜氏相關係數：r=0.713；簡單線性回歸：Y=0.061X+3.6158，p=0.0000639)。
圖20顯示來自成人發作型史迪爾氏病(AOSD)患者及健康對照(HC)之T細胞中之GLK表現量。自1個AOSD患者(A)及1個健康對照(B)之周邊血液獲得CD3+ T細胞、CD4+ T細胞及CD8+ T細胞中細胞內GLK產生之流動式細胞測量術等高線圖之代表性實例。自24個活動期AOSD患者及12個HC獲得循環之表現GLK之CD3+ T細胞的頻率(C)。AOSD患者與HC之間GLK轉錄物之相對表現量之比較(D)。來自AOSD患者及HC之周邊血液T細胞之溶胞物中GLK表現之免疫墨點分析(E)。活動期AOSD患者與HC之間GLK蛋白之 相對表現量之比較(F)。橫條表示中值。*P值係藉由曼-惠特尼U測試來測定。
圖21顯示來自患成人發作型史迪爾氏病(AOSD)之活動期患者及健康對照(HC)之包括IL-1β(A)、IL-6(B)、IL-17A(C)及TNF-α(D)之發炎性細胞激素之血清含量的比較。橫條表示中值。*P值係藉由曼-患特尼U測試來測定。
圖22顯示來自24個成人發作型史迪爾氏病患者之循環之表現GLK之T細胞的頻率與疾病活動度評分(A)及活動度參數之間的相關性，該等活動度參數包括血清鐵蛋白含量(B)、C反應蛋白(CRP)含量(C)及可溶性介白素-2受體含量(D)，以及包括IL-1β(E)、IL-6(F)、TNF-α(G)及IL-17A(H)之細胞激素之血清含量。藉由非參數斯皮爾曼氏秩相關性測試獲得相關係數(γ)及p值。
圖23顯示在有效療法之後12個AOSD患者中循環之表現GLK之T細胞含量、GLK蛋白以及轉錄物之表現量及可溶性介白素-2受體(sIL-2R)之血清含量之變化。數據以平均值±SEM形式呈現。*p<0.005(相對於治療之前)，藉由威爾科克森符號秩測試測定。
圖24顯示來自自體免疫疾病患者之T細胞中之GLK過度表現。來自僵直性脊椎炎(AS)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome，SS)、禿髮症、成人發作型史迪爾氏病(AOSD)及視神經脊髓炎(NMO)患者之經純化T細胞之溶胞物中GLK及GAPDH之免疫墨點分析。HC：健康對照。
圖25顯示來自格雷氏病患者之T細胞中之GLK過度表 現。a. 來自格雷氏病(GD)患者及健康對照(HC)之經純化T細胞之溶胞物中GLK及GAPDH之免疫墨點分析。b. 顯示HC(n=3)與GD(n=7)之間之相對GLK表現的定量聚合酶鏈反應。
圖26顯示格雷氏病患者中GLK陽性T細胞之增長百分比。來自患格雷氏病(GD)之個體及健康對照(HC)之周邊血液的表現GLK之T淋巴細胞的流動式細胞測量術分析。
圖27顯示大多數過度表現GLK之T細胞為產生IL-17之細胞。a. 藉由ELISA分析來測定SLE患者及健康對照之血清IL-17含量。b. 來自代表性SLE患者(SLEDAI=12)之周邊血液之GLK/IL-17雙陽性T細胞(經CD3閘控)的流動式細胞測量術分析。c. 來自HC及SLE患者之T細胞(經CD3閘控)中或T細胞子集(個別經閘控)中GLK/IL-17雙陽性細胞之百分比。d. 對雙陰性、CD4陽性或CD8陽性T細胞進行閘控，且接著藉由流動式細胞測量術分析來自SLE患者之PBL之GLK/IL-17雙陽性細胞。顯示了不同子集中GLK/IL-17雙陽性細胞之百分比。
圖28顯示Lck-GLK轉殖基因(Tg)小鼠自發地發展自體免疫疾病。a. Lck-GLK Tg小鼠之表型：大部分Lck-GLK Tg小鼠顯示虛弱之尾巴及後腿。GLK表現高之Lck-GLK Tg小鼠在13週齡時死亡。Lck-GLK Tg小鼠患上白內障及眼盲。b.及c.藉由ELISA分析來偵測Lck-GLK Tg小鼠之血清自體抗體。抗核抗體指示SLE。類風濕因子指示RA。
圖29顯示Lck-GLK轉殖基因(Tg)小鼠顯示出IL-17A含量 增加。a. 由ELISA分析來量測小鼠之血清細胞激素(5週齡)(n=8)。b. 藉由Taqman探針使用即時PCR測定來自Lck-GLK Tg小鼠組之周邊T細胞中GLK及IL-17A之mRNA含量(n=6)。
圖30顯示非小細胞肺癌中之GLK過度表現。來自肺癌患者之肺組織中GLK、p-IKK、p-mTOR的免疫墨點分析。n=20。T：腫瘤部分；N：正常部分。
圖31顯示食道癌中之GLK過度表現。來自患者之食道癌樣品中GLK之免疫墨點分析。n=31。T：腫瘤部分；N：正常部分。
圖32顯示胰臟導管腺癌中之GLK過度表現。在正常胰腺及胰臟導管腺癌(PDA)中進行GLK染色。(A)正常胰腺、(B)1級PDA、(C)2級PDA及(D)3級PDA之代表性影像均來自包埋石蠟之組織。原始放大倍數為×20。
圖33顯示肝細胞癌中之GLK過度表現。在正常肝臟及肝細胞癌中進行GLK染色。(A)正常肝臟、(B)1級肝細胞癌、(C)3級肝細胞癌及(D)(C)之放大影像之代表性影像。原始放大倍數為×20。
圖34顯示乳癌中之GLK過度表現。在正常乳房及乳癌中進行GLK染色。(A)正常乳房、(B)2級T2N0M0期乳癌、(C)2級T2N1M0期乳癌之代表性影像。原始放大倍數為×20。
圖35顯示神經膠母細胞瘤中之GLK過度表現。正常腦組織、人類神經膠母細胞瘤(II級至IV級)及兩種腦腫瘤細胞 株(U-87MG及T98G)中GLK蛋白表現之免疫墨點分析。
圖36顯示在非小細胞肺癌患者中GLK蛋白表現高可預示早期復發。在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中GLK蛋白含量高(GLK高)與早期復發相關。
圖37顯示GLK過度表現可增強自發性侵襲。用載體(上圖)、GLK(中圖)或shRNA-GLK(下圖)短暫轉染H1299細胞，保持24小時。轉染之後，藉由transwell分析來檢查此等細胞。10%至10%血清為自發性侵襲。0%至10%血清為血清誘導之侵襲。
圖38顯示GLK之過度表現可促進細胞遷移(創口癒合)。用指定質體轉染H1299細胞且培養直至匯合。用p200吸液管尖端以直線刮擦細胞單層產生「創口」且藉由用生長培養基洗滌細胞來移除創口之碎片。培育指定時間點之後，在相差顯微鏡(phase-contrast microscope)下獲得影像。
圖39顯示使用ATP-GLOTM 激酶套組(a)或ADP-GLOTM 激酶套組(b)或放射性激酶分析(c)對自BL21大腸桿菌(E.coli)(His-GLK-KD)或自Sf9昆蟲細胞中之桿狀病毒(GST-GLK)分離之GLK激酶結構域(GLK-KD)重組蛋白進行之活體外激酶分析。
圖40顯示GLK與PKC-θ之間的相互作用。(a)短暫轉染之HEK293T細胞中CFP-GLK與YFP-PKC-θ之間的直接相互作用之FRET分析。(b)藉由放大發光親近均質分析(ALPHA)測定的短暫轉染之HEK293T細胞之溶胞物中Flag-GLK與Myc-PKC-θ之間的相互作用之信號。
<110> 財團法人國家衛生研究院
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Claims (13)

  1. 一種用於鑑別治療生發中心激酶(Germinal Center Kinase GCK)樣激酶(GLK)介導之疾病之治療劑的方法，其包含偵測由測試劑所調節之GLK介導之信號傳導，其中該偵測步驟包含：a)在該測試劑存在下培養表現GLK之細胞；b)測量NF-κB之活性或所產生IL-17A之量；c)在該測試劑存在下，與對照相比較NF-κB之活性或所產生IL-17A之量；及d)當在該測試劑存在下NF-κB之活性或所產生IL-17A之量降低時，鑑別該劑為用於治療GLK介導之疾病的GLK介導之信號傳導的潛在抑制劑。
  2. 如請求項1之方法，其中該GLK介導之疾病係選自由自體免疫疾病、發炎疾病、癌症及癌症轉移組成之群。
  3. 如請求項1之方法，其中該測試劑係選自由小有機分子、RNAi分子、微RNA及反義分子組成之群。
  4. 如請求項1之方法，其中該等表現GLK之細胞係表現GLK之T細胞或表現GLK之癌細胞。
  5. 如請求項2之方法，其中該癌症為一類GLK蛋白介導之癌症且與哺乳動物雷帕黴素標的(mTOR)蛋白質無關。
  6. 如請求項2之方法，其中該自體免疫疾病係選自由以下組成之群：全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、成人發作型史帝爾氏病(adult-onset Still's disease)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、僵直性脊椎炎、視神經脊髓炎、自體免疫性腦脊髓炎及禿髮症。
  7. 如請求項2之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：肺癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌、乳癌及肝癌。
  8. 如請求項1之方法，其中該等表現GLK之細胞係過度表現GLK之細胞或過度表現GLK之癌細胞。
  9. 如請求項1之方法，進一步包含下列步驟：a)在該測試化合物存在下，使GLK蛋白在ATP存在下與其受質反應；b)測定所產生ADP之量、所消耗ATP之量及/或磷酸化受質之量；及c)在該測試劑存在下與對照相比較所產生ADP之量、所消耗ATP之量及/或磷酸化受質之量；d)當在該測試劑存在下所產生ADP之量、所消耗ATP之量及/或磷酸化受質之量降低時，進一步鑑別該劑為用於治療GLK介導之疾病的GLK介導之信號傳導的潛在抑制劑。
  10. 如請求項1之方法，進一步包含下列步驟：(i)在該測試劑存在下使GLK蛋白與其受質蛋白相互作用；(ii)測定該GLK與該受質蛋白之間的相互作用；及(iii)在該測試劑存在下，與對照相比較該相互作用；(iv)當在該測試劑存在下GLK蛋白與其受質蛋白之相 互作用降低時，進一步鑑別該劑為用於治療GLK介導之疾病的GLK介導之信號傳導的潛在抑制劑。
  11. 如請求項1之方法，進一步包含：測量GLK轉錄物或蛋白質之表現量；當GLK轉錄物或蛋白質之表現量降低時，進一步鑑別該劑為用於治療GLK介導之疾病的GLK介導之信號傳導的潛在抑制劑。
  12. 一種用於鑑別治療生發中心激酶(Germinal Center Kinase GCK)樣激酶(GLK)介導之疾病之治療劑的方法，其包含偵測由測試劑所調節之GLK介導之信號傳導，其中該偵測步驟包含：a)在該測試劑存在下使GLK蛋白與做為受質蛋白之PKC-θ蛋白相互作用；b)測量GLK與PKC-θ受質蛋白之間的相互作用；c)在該測試劑存在下，與對照相比較GLK與PKC-θ受質蛋白之間的相互作用；及d)當在該測試劑存在下GLK與PKC-θ受質蛋白之間的相互作用降低時，鑑別該劑為用於治療GLK介導之疾病的GLK介導之信號傳導的潛在抑制劑。
  13. 如請求項12之方法，其中該PKC-θ蛋白係用不同之相容性螢光探針標記，一個探針之螢光激發及發射波長高於另一探針，且該相互作用係藉由在較高螢光發射波長下之變化偵測。
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