JP2014520555A - Glk介在疾患の治療薬同定方法、および、glk介在疾患判定方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図6
Description
一般に、本明細書中で使用される用語は、本発明の文脈において、また、各々の用語が使われる特定の文脈において、従来技術における通常の意味を持つものである。本発明を記載するために用いる特定の用語は、明細書において検討され、本発明の説明に関わる実務家に付加的な手引きを提供するものである。便宜上、特定の用語を強調することもあり、たとえば、イタリックおよび/または引用符を使うこともある。強調する場合でも、それが強調されるにせよされないにせよ、同じ文脈において係る用語の範囲および意味の上で影響が無く、用語の範囲および意味は同じである。同じ事項を、異なる複数の方法で記載することもあることが理解されよう。従って、ここで検討されるあらゆる用語の1つ以上につき、代替的な用語や同義語が用いられてもよく、あるいは、用語がここで詳細に述べられまたは検討されたか否かにより、特殊な意味がこめられてもよい。特定の用語に対しての同義語が、提供される。1つ以上の同義語の詳説は、別の同義語の使用を排除しない。ここで検討されるあらゆる用語の用例を含む本明細書全体での用例の使用は、例示目的のみであり、本発明またはここで例示した全ての用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書中の所与の各種実施形態に限定されるものではない。
(タンパクベースのアッセイ:放射性/非放射性インビトロ・キナーゼ・アッセイ)
放射性インビトロ・キナーゼ・アッセイ:組み換え型GLKタンパクを、10μCiの[γ−32P]ATP、4μgのミエリン塩基性タンパク(MPB:myelin basic protein)、および35μlのキナーゼ緩衝液中500μMのコールドATPと共に、室温で40分培養した。12%SDS−pageによってサンプルを分離し、放射標識されたリン酸塩の基質への移入を、タイフーン級スキャナーによって定量した。
a)試験化合物の存在下でGLK発現細胞を培養するステップであって、前記変調は、GLK転写産物もしくはGLKタンパクの発現レベル、生産されるIL−17Aの量またはNF−κBの活性を測定することにより検出される細胞培養ステップ。
b)試験化合物の存在下で、GLKタンパクをこれらの基質とATPの存在で反応させる反応ステップであって、前記変調は、生産されるADPの量、消費されるATPの量および/またはリン酸化される基質の量を測定することにより検出される反応ステップ。
c)試験化合物の存在下でGLK発現癌細胞を培養する癌細胞培養ステップであって、前記変調が、前記癌細胞の転位/浸潤/創傷治癒を測定することにより検出される癌細胞培養ステップ。
d)試験化合物の存在下でGLKタンパクをこれらの基質タンパクと相互作用させる相互作用ステップであって、前記変調は、GLKタンパクと基質タンパクとの間の相互作用を測定することにより検出される相互作用ステップ。
e)試験化合物の存在下で前記変調を対照と比較して、GLK介在疾患を処理する治療薬を同定する、比較ステップ。
本発明の一実施形態では、癌細胞中のGLKの発現レベルの増加は、哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)タンパクとは無関係である。
(GLK欠損マウス)
GLKノックアウト(クローンRRO270)による129マウス胎生期ステム細胞クローンをEUCOMMから購入し、これを、台湾のゲノム医学国家研究計画におけるトランスジェニック・マウス・モデル・コアにおいて、C57BL/6の尾胞に注入して、キメラマウスを生成した。全ての動物実験は、国立衛生研究所でIACUCに承認されたプロトコルに従って遂行された。
米国リウマチ学会基準に基づき、全身性エリテマトーデス(SLE:systemic lupus erythematosus)と診断される49人の患者につき、研究を行った。全ての患者は、台中退役軍人総合病院(TVGH:Taichung Veterans General Hospital)のアレルギー・免疫学・リウマチ学部門に付託された。35人の健康な個人が、対照者として登録された。この研究は、TVGHの治験審査委員会に承認され、書面にした告知に基づく同意を全ての個人から得た。
抗マウスCD3ε(145−2C11)および抗ヒトCD3ε(OKT3)が、プロテインA−セファロースクロマトグラフィーによりマウス腹水から精製された。GLK、HPK1、p−Erk(T202/Y204)、Erk、p−SLP−76(S376)およびSLP−76に対する抗体が、個々のペプチドでウサギに免疫性を与えることによって生成された。抗p−PKC−θ(T538)抗体および抗p−PKC−θ(S695)抗体は、アップステートバイオテクノロジー社から入手した。抗PKC−θ(C−19)抗体、抗p−PKC−θ(S676)抗体、抗Vav1(D−7)抗体、抗Vav2(E−12)抗体および抗Vav3(K−19)抗体は、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社から入手した。抗Flag(M2)抗体、抗Myc抗体、抗HA抗体および抗チューブリン抗体は、SIGMA社から入手した。抗p−IKK(S181)抗体、抗p−PDK1(S214)抗体、抗IKK抗体および抗PDK1抗体は、セルシグナリング社から入手した。細胞内染色用の抗p−PKC−θ(T538)(19/PKC)抗体は、BDファ−ミンゲン社から入手した。抗p−mTOR抗体および抗mTOR抗体は、アブカム社から入手した。
過渡的導入アッセイのため、ネオン移入システム(インビトロジェン社)を使って細胞を導入した。個々の細胞系または一次細胞の具体的な設定は、以下の通りである:ジャーカットT細胞およびJ14細胞系では、1420V、継続時間30ミリ秒、1パルス;EL4細胞では、1080V、継続時間50ミリ秒、1パルス;プライマリーT細胞では、2000V、継続時間20ミリ秒、2パルス。T細胞活性化を誘発するため、J−TAgおよびEL4細胞を、抗CD3抗体5μg/mlを用いて、示した時間、37℃で刺激した。プライマリーT細胞活性化を誘発するため、3×106個の精製T細胞を、抗CD3−ビオチン(500A2;eバイオサイエンス社)3μg/mlおよびストレプトアビジン(シグマ社)3μg/mlを用いて刺激した。
抗Flagアガロースビーズを用いて、刺激されないまたは抗CD3刺激を行ったジャーカットT細胞またはJ−14細胞の溶解物(80μg)から、Flag−GLKを免疫沈降した。抗Flag免疫沈降物を、細胞溶解緩衝液により3回洗浄した後、さらにキナーゼ緩衝液により1回洗浄し、または、Flag−GLKの精製用のFlagペプチド溶出液にさらした。抗Flag−GLKビーズまたは精製Flag−GLKを、キナーゼ緩衝液35μl中[γ−32P]ATP10μCiの存在下または不存在下で、コールドATP500μM、ミエリン塩基性タンパク4μgと共に、40分室温で培養した。サンプルを、SDS−PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により分離した。免疫ブロット分析によって、基質のリン酸化を検出した。または、放射標識されたリン酸塩の基質への導入により検出した。これをタイフーン級スキャナー(GE)によって定量した。
PMAとイオノマイシンで細胞を2時間刺激し、ゴルジストップ(登録商標)でさらに2時間処理した。細胞を採取し、コ−ルドPBSで洗浄し、その後、示された抗体で、氷上で30分染色した。臨床のサンプル分析のため、別の刺激なしでPBLを直ちにゴルジストップで処理し、その後、室温で、抗表面マーカで染色した。細胞内染色のため、PBLを、サイトフィクス/サイトパーム緩衝液(BDバイオサイエンス)200μl中で2時間透過処理し、パームウォッシュ緩衝液で洗浄し、その後、抗体(1:50希釈物)中で2時間培養した。以下の抗体を染色に用いた:抗mCD3−APC(145−2C11)抗体、抗mCD3−FITC(145−2C11)抗体、抗Foxp3−PE(150D)抗体、抗IFNγ−FITC(XMG1.2)抗体、抗IL−4−PE(11B11)抗体および抗IL1−17A−PE(TC11−18H10.1)抗体を、バイオレジェンド社から購入した。抗mCD4−パシフィックブルー(RM4−5)抗体、抗hCD3−PECy7(SK7)抗体、および、抗hCD19−PE(SJ25C1)抗体を、BDファーミンゲン社から購入した。FACSCantoIIフローサイトメーター(BDバイオサイエンス)を用いてデータを収集し、FlowJoソフトウェアを用いて分析を行った。
各々の実験に使われるマウスは、6〜10週齢の性が一致する同腹子であった。免疫性を与えられたマウスからの抗原特異的な(KLH)抗体、TH1およびTH2サイトカインの生産は、前記の通り測定された。EAEの誘起は、前記のよう行われた。
CD4+CD25-細胞を、マウスのリンパ節から精製した。細胞(2.5×105)を、抗CD3(2μg/ml)抗体および抗CD28(3μg/ml)抗体と共に、コーティングした48個のウェルのプレート内の500μl培地中で培養した。Treg分化のため、細胞を、10ng/mlのIL−2、10ng/mlのTGF−β抗体、2.5μg/mlの抗IL4抗体、および2.5μg/mlの抗IFN−γ抗体を含む培地で培養した。TH17分化のため、細胞を、20ng/mlのIL−6、5ng/mlのTGF−β、50ng/mlのIL−23、5μg/mlの抗IL4抗体および5μg/mlの抗IFN−γ抗体を含む培地で培養した。TH1分化のため、細胞を、5ng/mlのIL−12および1μg/mlの抗IL4抗体を含む培地中で培養した。TH2分化のため、細胞を、10ng/mlのIL−4および1μg/mlの抗IFN−γ抗体を含む培地中で培養した。
マウスCD4+T細胞を、マウスの脾臓およびリンパ節からネガティブに選択した。精製の第2ラウンドでは、マウスCD25に対して磁力結合型抗体を用いて、CD4+CD25+T(Treg)細胞を、CD4+T細胞から分離した。Treg細胞を、CD3+T細胞(終末濃度は2x105個の細胞/500μl)に加え、その後、抗CD3抗体で72時間刺激した。
P値を、スチューデントのt検定によって判定した。臨床サンプルに由来するデータの分析のため、ピアソン相関(r)を最初に使用した。臨床サンプルのフロー・サイトメトリー・データに対する単回帰を用いて、GLK発現T細胞のパーセンテージとSLE患者のSLEDAIとの間に統計学的に高い相関が示された。
・GLKは、直接にPKC−θをリン酸化して活性化する。
我々は、ジャーカットT細胞中のGLK過剰発現またはGLK siRNAノックダウンに続いて抗CD3刺激を行うことにより、TCRシグナル伝達におけるGLKの役割を研究した(図1aおよび図6)。ジャーカットT細胞における抗CD3−誘発NF−κB活性およびIKKリン酸化(ErkまたはmTOR活性はない)は、GLK siRNAまたはGLKのキナーゼデッド(KD)変異によって抑制され、また、GLK過剰発現により促進された(図1aおよび図7a,b)。さらに、GLKキナーゼ活性は、1分でTCRシグナル伝達によって誘発され、30分でピークに達した(図7c)。これらの発見は、GLKがTCR−誘発NF−κB活性化に関与することを示唆するものである。SLP−76がErkおよびIKK経路の両方を調節するため、SLP−76は、GLKの標的ではないと考えられていた。したがって、我々は、PKC−θの活性化に対するGLKの効果の試験を行い、TCRシグナル伝達において、IKK−NF−κBの上流側およびSLP−76の下流側で重要な調節因子であることを試験した。PKC−θリン酸化は、GLKによって調節されるため、我々は、PKC−θをターゲットとすることにより、GLがKIKK−NF−κB経路を活性化したかどうかの試験を行った(図7d)。PKC−θ siRNAノックダウンは、抗CD3刺激によるGLK−誘発NF−κBの活性化を無効化するので、GLKがPKC−θを標的とすることでNF−κB活性化を誘発することが示された(図7e)。
SLP−76は、T細胞中の重要な骨格タンパク質であり、TCR−誘発PKC−θ−IKKの活性化に必要である。我々は、SLP−76がTCRシグナル伝達中のGLKの直接の上流側調節因子であったかどうかを問うた。CD3刺激は、プライマリーT細胞中の内因性GLKとSLP−76との間の相互作用を誘発した(図2a)。SLP−76−GLK相互作用は、GLK−PKC−θ相互作用およびPKC−θ活性化に先行した。同様の結果が、ジャーカットおよびHEK293T細胞を用いて観測された(図9a〜c)。さらに、SLP−76とGLKとの間の相互作用は、チロシンリン酸化を通して介在された(図9d)。精製GLKおよびSLP−76を使ったインビトロでの結合アッセイでは、これらの2つのタンパクの間の直接の相互作用が実証された(図2b)。次に、SLP−76がGLKの活性化に必要か否かにつき、我々は調べた。CD3刺激によって誘発したGLKキナーゼ活性は、SLP−76−欠損J14細胞(図2c)およびSLP−76 shRNAトランスフェクションジャーカット細胞(図2d)では無効化されていた。過去の報告によれば、Vav1がSLP−76と関連しPKC−θ転位に関連することが示されており、Vav1がPKC−θ活性化を制御することが示唆される。したがって、Vav1がGLK活性化を調節したか否かを、我々は調べた。しかしながら、TCR誘発GLKキナーゼ活性化は、Vav1 shRNAノックダウンによっては、影響を受けなかった(図9)。これらのデータは、TCRシグナル伝達中、GLKキナーゼ活性化の調節におけるVav1の関与を排除するものだった。また、別のMAP4K、すなわち、HPK1についても、SLP−76によって活性化し、次いで、SLP−76−S376リン酸化を誘発することにより、このSLP−76活性化を負に調整したため、SLP−76の負のフィードバック調節にGLKが役割を果たしているか否かにつき、我々は検討を行った。SLP−76−S376リン酸化は、HPK1のみにより誘発され、GLKには誘発されなかった(図2e)事実は、GLKはSLP−76を負に調整するためのフィードバックに関与しないことを示唆するものである。これらの発見は、TCRシグナル伝達中、SLP−76は直接に相互作用しGLKを活性化することを示すものである。
インビボにおけるGLKの役割を研究するため、我々は、GLK欠損マウスを生成した(図11a,b)。T細胞は、GLK欠損マウス中、正常に発育した(図11c−e)。プライマリーT細胞中において、TCRシグナル伝達のGLK欠損の効果を研究した。我々の過去の観測(図1)と合致した点としては、CD3(図3a)またはCD3−CD28共同刺激(図3b)では、GLK欠損T細胞中、PKC−θおよびIKKのリン酸化が無効化されていたことが挙げられる。これとは対照的に、ErkおよびPDK1活性化は、GLK欠損(図3b)に影響を受けなかった。
実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE:experimental autoimmune encephalomyelitis)は主に、IL−17−生成CD4+Tリンパ球(TH17)が介在する。PKC−θ欠損により、EAEおよびTH17応答が改善された。GLKがPKC−θを活性化したため、我々は次に、実験的な自己免疫性脳脊髄炎モデルを使うことにより、TH17が介在した自己免疫性疾患におけるGLKの役割を研究した。GLK欠損マウスは、症状をほとんど示さなかったが、その野性型腹子は、激しい実験的自己免疫性脳脊髄炎を増長させた(図4e)。免疫性を与えられて14日目のマウスの脳および脊髄の中の、浸潤性リンパ球中におけるTH17細胞のパーセンテージは、GLK欠損マウスでは、非常に低かった(図4f)。さらに、血清中のIL−17の滴定量は、GLK欠損マウスでは、非常に低かった(図4g)。GLK欠損マウスにおけるTH17応答の欠陥がT細胞固有の効果であるか否かを調べるため、我々は、GLK欠損未感作T細胞のインビトロTH17分化能を測定した。一貫して、TH1およびTH2細胞に加えてTH17細胞のインビトロ分化は、GLK欠損によって低減された(図4hおよび図12)。インビトロTreg分化は、GLK欠損によって影響を受けなかった(図12)が、GLK欠損Treg細胞は、インビトロでより高い活性抑圧を示した(図4i)。これらの結果は、インビボのGLK欠損は、TH17が介在した自己免疫性疾患の進展からマウスを保護することを示す。欠損TCRシグナル伝達およびTH17分化は、GLK欠損T細胞中に増加したTreg機能と共に、GLK欠損マウス耐性に対して、重要な役割を果たすことができる。
ヒト自己免疫性疾患全身性エリテマトーデス(SLE)において、TH17の介在した炎症は重要な役割を果たしている。GLK欠損マウスにおいて、自己免疫誘起およびTH17応答が低減し、GLKがPKC−θ−IKK経路を活性化しているため、我々は、GLK−PKC−θ−IKK−IL−17カスケードがヒトSLEに関与するか否かを研究した。我々は、SLE患者49人および35人の対になる健常対照者から分離された末梢血白血球(PBL)中におけるGLK発現およびPKC−θ−IKK活性化を検討した(図13a)。フローサイトメトリー分析によれば、SLE患者の新たに分離されたPBLからの、B細胞でなく、GLK発現T細胞の、パーセンテージが大きく増加したことが示された(図5a)。GLK発現T細胞のパーセンテージは、SLE疾患活動性度指数(SLEDAI)と相関した(図5b;ピアソン相関係数:r=0.773)。特に、GLK表現(GLK+)T細胞が高パーセンテージ(≧21%)のSLE患者の3分の1(16/49)は、GLKが通常範囲の患者と比較して(r=0.451;表1)、より高い相関を示した(r=0.807、図5c、表1)。また、SLE患者のGLKタンパク発現の量は増加した(図5d)。これらの結果は、GLK過剰発現が、30%の患者のSLE発病に関与したことを示唆するものである。表1は、SLEDAIとSLE患者の別々の部分集合から得たGLK+T細胞のパーセンテージとの間の相関の比較を示す。
我々の研究の重要な発見は、GLKが、TCRシグナル伝達中にT538でPKC−θを直接にリン酸化するキナーゼとして、認定されたことである。活性化ループ内の残留物T538におけるPKC−θリン酸化は、T細胞中のNF−κB活性化にとって必須である。GLK誘発PKC−θ−IKKリン酸化は、PDK1活性化およびCD28の相互刺激に関係無く、これは、GLK機能がPDK1活性化とは無関係であることを示唆する。これらのデータは、GLKが、TCRシグナル伝達中にPKC−θのすぐ上流側のキナーゼとして機能することを明示するものである。
我々の過去の研究では、GLKが、T細胞中のプロテインキナーゼC−θ(PKC−θ)−NF−κBキナーゼの阻害剤(IKK)−NF−κBのシグナル伝達経路を活性化することにより、自己免疫を制御することを実証した(Chuangほか(2011)、「The kinase GLK controls autoimmunity and NF−κB signaling by activating the kinase PKC−θ in T cells」 Nat Immunol,12(11):1113−1118,この文献の全体が、参照事項として本願に包含される)。全身性エリテマトーデス(SLE)患者からのT細胞は、疾患重症度によく相関するGLK過剰発現を示すが、RA中のGLKの役割は解っていない。
(参加者)
米国リウマチ学会で1987年に修正されたRAの基準を満たす30人の患者を登録した。24人の健康な志願者が、健常対照者の役目を果たした。8人の骨関節炎(OA:osteoarthritis)および8人のRA患者からの滑膜組織および滑液を得た。この研究プロトコルは、台中退役軍人総合病院の臨床調査倫理委員会で承認されたものである。
赤血球沈降速度(ESR)、C反応性タンパク質(CRP)、および28関節疾患活動性スコア(DAS28)の血清レベルを、RA疾患活動性を評価するために使用した。
台湾ゲノム医学国立研究プログラムのトランスジェニック・マウス・モデル・コアにおいて、欧州条件変異マウス作成プログラムからのGLK欠損(RRO270)を有する129マウス胎生期ステム細胞クローンを、マウスラインCB57L/6から尾胞に注入して、キメラマウスを発生させた。GLK欠損マウスを、C57BL/6バックグラウンドで、9世代にわたって戻し交配した。全ての動物実験は、台湾国立衛生研究所の動物実験委員会によって承認されたプロトコルで行われた。
従来説明されているように、ワイドタイプ(WT)またはGLK欠損マウスに、コラーゲン誘発関節炎(CIA)を誘発させた(Campbellほか(2000)「Collagen−induced arthritis in C57BL/6(H−2b)mice:new insights into an important disease model of rheumatoid arthritis」 Eur J Immunol.30(6):1568−1575)。12週齢(0日)のマウスに対し、ニワトリ型IIニワトリコラーゲン/フロインド完全アジュバント乳化物(MDバイオサイエンス社、スイス国チューリッヒ)を含む合計100μlのエマルションを、尾部のベースに皮内注射した。同様の注射を、21日に腹膜内に繰り返した。次いで、以下の臨床のスコアを使い、WTまたはGLK欠損マウス中の疾患の臨床結果を示した:1=指の腫れ、2=紅斑、3=足/踝の腫れ4=機能損失。
WTまたはGLK欠損マウスおよびRA患者のTNF−α、IL−1β、IL−6およびIL−17Aの血清レベルを、製造業者(eバイオサイエンス社、サンディエゴ、カリフォルニア、米国)のインストラクションに従い、ELISAを使って測定した。
GLK抗体は、個々のペプチドでウサギに免疫性を与えることによって生成されている。ウェスタンブロッティングには、抗p−PKC−θ(T538)抗体(アップステートバイオテクノロジー社、レークプラシッド、ニューヨーク、米国)を用いた。細胞内染色には、抗PKC−θ抗体(サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア、米国)を用いた。フローサイトメトリー分析には、抗hCD3−PECy7(SK7;BDファーミンゲン社、サンディエゴ、カリフォルニア、米国)抗体、抗p−PKCβE T538(19/PKC;BDファーミンゲン社、サンディエゴ、カリフォルニア、米国)抗体、および抗p−IKK(2681S)(サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア、米国)抗体を用いた。GLK mRNA検出には、タックマンプローブおよびプライマーセット(アプライドバイオシステム社、フォスター、カリフォルニア、米国)を用いた。
免疫ブロッティング分析に対し、滑液白血球および精製末梢血T細胞のサンプリングを、過去の文献に基づいて行った(Chuangほか(2011)「The kinase GLK controls autoimmunity and NF−κB signaling by activating the kinase PKC−θ in T cells」.Nat Immunol.12(11):1113−1118、この文献の全体が、参照事項として本願に包含される)。また、前述のように、末梢血および滑液のフローサイトメトリー分析を行った。
RA患者およびOA患者の滑膜について、GLKの免疫染色を行った。パラフィンで包埋した組織を10分間沸騰し、2分間水で洗浄した。次いで、切片を、予め水素ペルオキシダーゼブロック(サーモサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ、米国)で1時間培養し、その後、抗CD3抗体(サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア、米国)および抗GLK抗体と共に、4℃で1晩培養した。LVBlue/LVRed(マルチビジョンポリマー検知システム、サーモサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ、米国)を用いて染色を行った。
社会科学用統計学パッケージ(SPSS:Statistical Package for the Social Sciences)バージョン13.0ソフトウェア(SPSS社、シカゴ、イリノイ、米国)を、統計的分析に用いた。連続する変数の比較には、スチューデントのt検定を用いた。変数間の相関を判定するためにはピアソンの相関を用いた。RA患者のGLK発現T細胞とDAS28の頻度との間の相関を調べるため、単回帰を用いた。
・GLK欠損マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎の発育低下
GLK欠損マウスでは、T細胞介在の免疫応答が低下することを、我々は以前に実証した(Chuangほか、Nat Immunol.2011;12(11):1113−1118、この文献の全体が、参照事項として本願に包含される)。炎症性関節炎へのGLKの寄与を調べるため、我々は、CIAモデルを使い、野生型(WT)マウスおよびGLK欠損マウスの自己免疫応答の誘起を研究した。WTマウスは、重いCIAを進行させた一方、GLK欠損マウスは、症状を急激に低減させた(図14A、B)。炎症性サイトカインは、CIA進行中に誘発される。コラーゲン−免疫付与GLK欠損マウスのIL−1β、IL−6およびIL−17Aの血清レベルは、WTマウスと比較して著しく低減したことを、我々は見いだした(図15C−E)。GLKが炎症性の関節炎に必要であることが、これらの結果から示唆される。
RA患者からのT細胞中で、GLKレベルが上昇したか否かを調べるため、RA患者30人(女性66.7%(平均年齢:50.3+/−15.7歳)および健常対照者24人(女性62.5%(平均年齢:33.4+/−8.3歳)を登録した(表2)。表2は、慢性関節リウマチ(RA)患者および健常対照者(HC)の人口統計学的データ、臨床の発現および検査所見を示す。
ウェスタンブロッティングによれば、RA患者からの精製末梢血T細胞中で、GLKのタンパク質レベルが上昇している(図15A)。RA患者からの精製T細胞中のGLK発現レベルは、健常対照者のGLK発現レベルに比べて、著しく高かった(1.3+/−0.8対0.4+/−0.4、p=0.047、図15B)。さらに、RA患者において、精製末梢血T細胞中のGLK mRNAレベルは、健常対照者と比較して非常に高かった(12.3+/−18.5対1.0+/−1.2、p=0.029、図15C)。GLKがPKC−θを活性化するため、GLK誘発PKC−θ活性化がRAに関与しているか否かにつき、我々は研究した。また、PKC−θ活性化は、RA患者からの末梢T細胞内で増加した(図15A)。
スチューデントのt検定によって判定されるHC対RA患者の*p<0.05、**p<0.001。
RF:リウマチ因子(rheumatoid factor);CCP:環状シトルリン化ペプチド(cyclic citrullinated peptide);DAS28:28関節疾患活動性スコア;ESR:赤血球沈降速度;CRP:C反応性タンパク質;TNF−α:腫瘍壊死因子−α(tumor necrosis factor−α);NA:適用なし。
次に、我々は、GLKが、ヒトRA患者の滑液の微小環境からのT細胞中で発現されたか否かにつき、研究を行った。ウェスタンブロッティングによれば、RA患者からの滑液白血球中において、GLK発現およびPKC−θ活性化が増加した(図16A)。フローサイトメトリー分析によれば、RA患者からの滑液中のGLK発現CD3+T細胞の頻度は、OA患者のそれと比べて非常により高かった(図16B)。RA患者およびOA患者の滑膜組織に対して、抗GLK(ブルー)および抗CD3(茶色)免疫組織化学染色を行った。図16Cに例示されるように、GLK発現T細胞は、RA患者からの滑膜組織中で増加したが、OA患者からの滑膜組織では、わずかにしか検出されなかった。
共焦点顕微鏡検査の結果、RA患者の滑液(図17A)および末梢血(図17B)の両方からのT細胞中で、PKC−θおよびCD3と共に、GLKが相互局所化されていることが示された。これにより、GLKはT細胞膜上で活性PKC−θと相互作用することが示唆された。
RA患者の血清TNF−α(27.6+/−42.4対5.4+/−13.9pg/ml、p=0.019)およびIL−17A(14.2+/−12.1対7.5+/−4.4pg/ml、p=0.015)のレベルは、健常対照者のレベルより高かったが、TGF−β(6.5+/−5.14対5.2+/−7.6 pg/ml、p=0.5)はそうではなかった(図18A−C)。フローサイトメトリーの分析によれば、RA患者の末梢血T細では、GLK発現、リン酸−PKC−θ陽性、およびリン酸−IKK陽性胞の頻度が、より大きかった(図18D)。RA患者のGLK発現末梢血T細胞の頻度は、健常対照者に比べて非常に高かった(18.4+/−7.6対10.5+/−5.0、p<0.001、図18E)。さらに、RA患者では、GLK発現T細胞は、リン酸化PKC−θおよびIKKを発現した。これらのデータによれば、GLK−PKC−θ−IKKカスケードは、ヒトRAの発病に関与していることが示唆される。
(被験者)
Yamaguchi基準を満たす対象の未治療のAOSDをもつ24人の継続的患者(女性15人および男性9人、平均年齢+/−SD、33.3+/−9.9年)を登録した。感染症、悪性腫瘍または別のリウマチ性疾患をもつ患者は排除した。各々のAOSD患者の疾患活動性スコア(範囲0〜12)を、Pouchotほかによって記載される基準に従って評価した。循環GLK発現T細胞およびTh17関連サイトカインのレベルを初期定量した後、全てのAOSD患者に対して、コルチコステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬薬剤(NSAID)を受容させた。使用された疾患修正抗リウマチ薬剤(DMARD:Disease−Modifying Anti−Rheumatic Drug)は、メトトレキセート(20人の患者)、ヒドロキシクロロキン(18人の患者)、スルファサラジン(8人の患者)およびアザチオプリン(3人の患者)であった。リウマチ性疾患を有しない12人の年齢が整合する健康な志願者(8人の女性および4人の男性、平均年齢32.4+/−8.2年)が、正常対照者の役目を果たした。エンドトキシフリーなヘパリン化減圧チューブ(KABI−ET;クロモジェニックス社、アントワープ、ベルギー)を用いて末梢血を採取し、試料採集と培養との間の合間でサイトカインが生成されることを回避した。台中退役軍人総合病院の臨床研究倫理委員会は、この研究を承認し(No.C10130)、ヘルシンキ宣言によって全ての参加者から書面による同意を得た。
最近の研究に記載される技術に基づき、フローサイトメトリー分析を用いて、循環GLK発現T細胞を定量した。ウサギに個々のペプチドで免疫性を与えることによって、GLK抗体を生成した。簡潔には、末梢血単核細胞(PBMC:Peripheral Blood Mononuclear Cell)を採取し、コ−ルドPBSで洗浄し、氷上で30分間、示された抗体で染色した。次いで、PBMCを、他の刺激なしで、ゴルジストップ(10μg/mlのブレフェルジンA、シグマ社、ドイツ)で処理し、その後、抗CD3−アロフィコシアニン[APC]−Cy7(BDファーミンゲン社)、抗CD4−パシフィックブルー(BDファーミンゲン社)、および抗CD8−ペリジニン・クロロフィル・タンパク(PerCP:Peridinin Chlorophyll Protein)シアニン5.5(Cy5.5:cyanin 5.5)(BDファーミンゲン社)を用いて、室温で染色した。細胞内染色のために、PBMCを、サイトフィクス/サイトパーム緩衝液(BDバイオサイエンス)200μlの中で2時間透過処理し、パームウォッシュ緩衝液で洗浄した。ペレットを、100μlの試薬2、サポニン(ベックマンコールター社、米国)を用いて、室温暗所で5分間培養した。サンプルを、0.1%のBSA−PBSで二度洗浄し、PE接合GLK特異mAb(eバイオサイエンス社、米国)で30分室温暗所において培養した。GLK染色には、室温暗所で、アイソタイプコントロールIgG1−PE(eバイオサイエンス社、米国)を用いた。染色後、細胞を洗浄し、その後直ちに、フローサイトメトリー(ベックマンコールター社、米国)を使って分析した。前方性およびサイズ散乱性に基づいてリンパ球をゲートし、少なくとも10,000個のCD3+細胞を分析した。データは、FACSCantoIIフローサイトメーター(BDバイオサイエンス)を使って収集し、FlowJoソフトウェアによって分析した。
免疫ブロッティング分析のため、我々の最近の研究論文に記載されているように、精製T細胞のサンプリングを行った。GLKについて、実験の各セットからの細胞抽出物と等量を混合した反応液を、泳動バッファー(25mMトリス、192mMグリシン、0.1%SDS)中で、6〜8%SDS−PAGEで分画した。30分、90Vでゲルを泳動し、その後、青色素の前端が底に到達するまで130Vをかけた。トランスブロットSDセミドライ電気泳動的トランスファーセル(バイオラド社、米国)を用いて、ゲルを21Vで1時間、転写バッファー(50mMトリス、384mMグリシン、20%メタノール)中の二フッ化ポリビニリデン膜(PVDF:Polyvinylidene Difluoride)に転写した。
フィコール−パック(商標)プラス(GEヘルスケアバイオサイエンス社、スウェーデン)を用いて、密度勾配遠心分離により、静脈の血液から分PBMCを直接的に分離した。グアニジンイソチオシアネート方法によって、PBMCから全細胞RNAを得て、260nmの分光度測定により定量した。標準的な手順に従い、200Uのモロニーマウス白血病ウィルス・リバース・トランスクリプターゼ(ファーメンタス、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社、米国)を用いて、RNAアリコート2.5μgを逆転写した。タクマンPCRコア試薬キット(アプライドバイオシステムズ社、米国)に供給されているqPCRアッセイによって、GLK mRNA発現レベルを判定した。GLKおよび内部コントロールグリセリンアルデヒド−3−リン酸塩デヒドロゲナーゼ(GAPDH:Glyceraldehydes−3−Phosphate Dehydrogenase)に特異的なプライマーを、アプライドバイオシステムズ社(フォスター市、CA、米国)から入手した。解離曲線プロットによってPCR産物の純度を評価した。GLKのmRNAレベルを補正するために、各々のサンプルで並行して、ハウスキーピング遺伝子GAPDHの転写産物レベルを判定した。GLKの相対的な発現レベルを、比較閾値サイクル(Ct)法で計算し、2-△△Ctによって評価した(△△Ct=患者(CtGLKgene−CtGAPDH)−対照者平均(CtGLKgene−CtGAPDH))。
ELISAキット(セルフリー;エンドジェン社、MA、米国)を使って、血清sIL−2Rレベルを判定した。製造業者(eバイオサイエンス社、サンディエゴ、CA、米国)のマニュアルに従い、酵素結合抗体免疫吸着アッセイを用いて、AOSD患者および健常対照者におけるIL−1β、IL−6、IL−17AおよびTNF−αの血清レベルを測定した。
結果は、平均+/−標準偏差または中央値(四分位数間領域)で示される。循環GLK発現T細胞の頻度、GLK転写産物およびタンパクの発現レベル、ならびに、Th17関連サイトカインの血清レベルについて、それぞれの群間比較を行うために、非母数のクラスカル・ワリス検定を使用した。この検定が顕著な差を示した時は、マンホイットニーU検定を使用して、正確なp値を判定した。非母数のスピアマンの順位相関試験を使って、相関係数を計算した。有効な治療の後のAOSD患者のフォローアップ中、循環GLK発現T細胞のレベルとGLKの発現レベルとを比較するため、ウイルコクソンの符号順位検定を用いた。その比較のためにウイルコクソンの符号順位検定を用いた。0.05未満の確率のときは、顕著であるとみなされた。
(AOSD患者の臨床の特性)
表4に示されるように、対象の未治療のAOSDを有する全ての24人の患者は、日常的にスパイク熱(≧39℃)を発症していた。別の通常の発現は、感知しにくい発疹(83.3%、20人)、咽頭炎(70.8%、17人)および関節炎(62.5%、15人)を含んでいた。リンパ節腫脹および肝脾腫大症は、それぞれ10人(41.7%)および6人(25.0%)の患者で見られた。この研究の登録者の年齢や、AOSD患者と健常対照者との間の女性の割合には、顕著な差はなかった。表4は、成人発症型スティル病(AOSD)および健常対照者(HC)で患者の人口統計学的データおよび臨床の特性を示す。
対象のAOSDを有する患者1人および健常対照者1人の、末梢血CD3+T細胞、CD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるGLK発現のフローサイトメトリー輪郭プロットの代表的な例が、それぞれ、図20Aおよび20Bに示される。対象のAOSDの患者(中央値=31.85%、四分位[IQ]範囲21.21%〜48.84%)に観測された循環GLK発現CD3+T細胞平均頻度は、健常対照者(中央値=8.93%、IQ範囲6.81%〜2.08%;p<0.001、図20C)に比べて大変高かった。
図20Dに示すように、健常対照者(中央値=0.92、IQ範囲0.63〜1.37;p<0.001)に比べて、対象のAOSD患者(中央値=2.35、IQ範囲1.66〜3.88)には、GLK転写産物の相対的な発現における何倍もの増加が観測された。同様に、対象のAOSD患者について、ウェスタンブロッティング(図20E)によって判定される精製T細胞の溶解物中のGLKの発現が増加した。対象のAOSD患者におけるGLKタンパクの相対的な発現レベル(中央値=1.74、IQ範囲1.47〜2.95)は、対照者における発現レベル(中央値=0.66、IQ範囲0.54〜0.94;p<0.001、図20F)に比べて著しく高かった。
図21に示すように、対象のAOSD患者は、血清IL−6(中央値=474.81、IQ範囲156.42〜987.55)、IL−17A(中央値=306.80、IQ範囲152.17〜503.70)、およびTNF−α(中央値=51.85、IQ範囲23.63〜65.93)について、非常に高い中央値レベルを有し、これは、健常対照者(IL−6は中央値=85.78、IQ範囲31.13〜189.98、p<0.001;IL−17Aは中央値=70.90、IQ範囲51.42〜124.53、p<0.001;TNF−αは中央値=24.66、IQ範囲10.50〜37.76、p<0.01)と比較して顕著であった。しかしながら、血清IL−1βレベルについては、AOSD患者とHCとの間で顕著な差はなかった。
*p<0.05、**p<0.005、***p<0.001は、非母数のスピアマンの順位相関試験によって得られた。
12人のAOSD患者は、活性段階および寛解傾向段階の検査に利用可能であった。図22に示すように、有効な治療後のAOSD患者において、循環GLK発現T細胞のレベルおよびGLKタンパクの相対的な発現レベルに加えて転写産物が、著しく低減され(平均+/−標準誤差、それぞれ、45.77+/−5.58対20.11+/−2.53;3.01+/−0.49対0.93+/−0.17;3.45+/−0.56対1.21+/−0.38、全てでp<0.005)、臨床の寛解傾向およびsIL−2Rの血清レベルの減少(747.8+/−131.8pg/ml対229.1+/−38.5pg/ml、p<0.005)と、平行している。
SLE患者の他に、7人の付加的な自己免疫性疾患からの患者サンプルでは、末梢血T細胞のGLK発現が、劇的に増加したことが示された(表6、図24〜26)。上記で開示されるように、GLK発現は、RAおよびAOSDの疾患重症度と相関した。GLK過剰発現T細胞が、RA患者からの滑膜組織中で検出された。
1.GLKは、多様な自己免疫性疾患の新しいバイオマーカである
SLE、慢性関節リウマチおよび成人発症型スティル病患者のT細胞中におけるGLK過剰発現の他、シェーグレン症候群、神経脊髄炎、強直性脊椎炎および脱毛症のT細胞の中にも、GLK過剰発現は見いだされた(図24)。我々はまた、薬剤未感作なグレーブス病(GD)患者からのT細胞、および、部分的な抗甲状せん治療を受けたが未だ甲状腺中毒の状態にある患者からのT細胞中に、GLKが過剰発現したことを見いだした。これは、フローサイトメトリー、免疫ブロッティングおよび定量PCR法(qPCR)によって判定された(図25および26)。GLKタンパクレベルおよびmRNAレベルは、GD患者からのT細胞中で上昇した(図25)。我々の結果によれば、GLK過剰発現は、自己免疫性疾患の発病および重症度に寄与し、自己免疫性疾患の新しいバイオマーカであることが示唆される。表6は、GLKの介在した自己免疫性疾患および癌を示す。
自己免疫の発病におけるGLKの制御作用を研究するため、我々はさらに、T細胞に特異的な促進因子Lckを用いて、T細胞に特異的なGLKトランスジェニックの(Tg)マウスを生成した。血清自己抗体および血清IL−17の特異的な増加により、Lck−GLK Tgマウスは、自発的に多様な自己免疫性疾患を進展させた(図27〜29)。これらの発見は、GLK−PKCθ−IKK−IL−17軸の活性化は、自己免疫性疾患に寄与することを示唆する。高レベルのGLK遺伝子導入を発現するLck−GLK−Tgマウス(8週齢)は、血清IL−17Aレベルの急激な誘起を示した。IL−17A mRNAレベルは、トランスジェニックGLKによって上昇した(図29)。これらの結果によれば、GLKがT細胞中のIL−17A生成をプラスに調節するという、SLE患者の我々のデータをさらに裏付けることになる。
肺癌患者において正常な部分と比較して腫瘍部分中で、GLKタンパクレベルが上昇した(85.7%)。食道癌患者において正常な部分と比較して腫瘍部分中で、GLKタンパクレベルが上昇した(58%)。また、膠芽細胞腫、膵臓癌、乳癌および肝癌中においても、GLKが過剰発現した。
Claims (20)
- 胚中心キナーゼ(GCK)類似キナーゼ(GLK)介在疾患を治療する治療薬を同定する方法であって、
前記方法は、試験化合物によって、前記GLKが介在したシグナル伝達の変調を検出する検出ステップを含み、前記検出ステップは、
a)前記試験化合物の存在下でGLK発現細胞を培養する細胞培養ステップであって、前記変調は、GLK転写産物もしくはGLKタンパクの発現レベル、IL−17Aの生産量、または、NF−κBの活性を測定することにより検出される細胞培養ステップ、
b)前記試験化合物の存在下で、GLKタンパクを基質およびATPと反応させる反応ステップであって、前記変調は、ADPの生産量、ATPの消費量、または、リン酸化される前記基質の量を測定することにより検出される反応ステップ、
c)前記試験化合物の存在下で、GLK発現癌細胞を培養する癌細胞培養ステップであって、前記変調が、前記癌細胞の転位、浸潤、または、創傷治癒を測定することにより検出される癌細胞培養ステップ、および、
d)前記試験化合物の存在下でGLKタンパクを基質タンパクと相互作用させる相互作用ステップであって、前記変調は、前記GLKタンパクと前記基質タンパクのとの相互作用を測定することにより検出される相互作用ステップ、
のうちのいずれかと、
e)前記試験化合物の存在下の前記変調を対照と比較して、前記GLK介在疾患を治療する治療薬を同定する比較ステップと、
を含む治療薬同定方法。 - 前記GLK介在疾患は、自己免疫性疾患、炎症性疾患、癌、および癌転移からなる群より選択される請求項1に記載の治療薬同定方法。
- 前記基質は、PKC−θタンパク、およびミエリン塩基性タンパク(MBP)からなる群より選択される請求項1に記載の治療薬同定方法。
- 前記試験化合物は、RNAi分子、マイクロRNA、アンチセンス分子、および小有機分子とからなる群より選択される請求項1に記載の治療薬同定方法。
- 前記GLK発現細胞は、GLK発現T細胞を含み、
前記GLK発現癌細胞は、GLK発現肺癌細胞を含む請求項1に記載の治療薬同定方法。 - 前記癌は、GLKタンパク介在癌の型であり、哺乳類ラパマイシン標的タンパク(mTOR)から独立したものである請求項2に記載の治療薬同定方法。
- 前記自己免疫性疾患は、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、成人発症型スティル病、グレーブス病、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、神経脊髄炎、自己免疫性脳脊髄炎、および脱毛症からなる群より選択される請求項2に記載の治療薬同定方法。
- 前記癌は、肺癌、食道癌、膠芽細胞腫、膵臓癌、乳癌、および肝癌からなる群より選択される請求項2に記載の治療薬同定方法。
- 前記ステップd)において、前記GLKタンパクと前記基質タンパクとの間の相互作用は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)アッセイまたは増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法を用いて測定される請求項1に記載の治療薬同定方法。
- 前記ステップd)において、
前記基質タンパクはPKC−θタンパクを含み、
前記GLKタンパクおよび前記PKC−θタンパクは、互換性を持つ異なる蛍光プローブで標識されており、そのうち一方の蛍光プローブは、他方のプローブよりも高い発光波長を有しており、
前記変調の関連は、より高い蛍光発光波長の変化により検出される請求項1に記載の治療薬同定方法。 - 胚中心キナーゼ(GCK)類似キナーゼ(GLK)介在疾患の存在または重症度を判定する方法であって、
a)GLK介在疾患または癌を有すると疑われる被験者から、T細胞または癌細胞を含むサンプルを採取する採取ステップと、
b)前記T細胞または前記癌細胞中のGCK類似キナーゼ(GLK)の発現レベルを測定する測定ステップと、
c)前記GLK介在疾患の存在または重症度を判定する判定ステップと、
を含み、
前記被験者の前記T細胞または前記癌細胞中の前記GLKの発現レベルが、対照のGLKの発現レベルと比較して増加していることは、前記被験者が、前記GLK介在疾患を発症もしくは保有するリスクを有している、または、癌の再発もしくは転移のリスクを有していることを示しているGLK介在疾患判定方法。 - 前記GLKの発現レベルの増加は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク(mTOR)から独立したものである請求項11に記載のGLK介在疾患判定方法。
- 前記測定ステップは、GLKタンパクの発現レベルを測定するステップを含む請求項11に記載のGLK介在疾患判定方法。
- 前記測定ステップは、免疫ブロッティング分析、フローサイトメトリー分析、または免疫組織化学によって行われる請求項13に記載のGLK介在疾患判定方法。
- 前記測定ステップは、GLK転写産物の発現レベルを測定するステップを含む請求項11に記載のGLK介在疾患判定方法。
- 測定された前記GLK転写産物の発現レベルをハウスキーピング遺伝子に対して補正し、前記GLK転写産物の補正された発現レベルを得るステップをさらに含む請求項15に記載のGLK介在疾患判定方法。
- 前記GLK介在疾患は、自己免疫性疾患、炎症性疾患、癌、および癌転移からなる群より選択される請求項11に記載のGLK介在疾患判定方法。
- 前記GLK発現細胞は、GLK過剰発現細胞を含み、または、
前記GLK発現癌細胞は、GLK過剰発現癌細胞を含む、請求項1に記載の治療薬同定方法。 - 前記ATPは非放射性である請求項1に記載の治療薬同定方法。
- 前記GLKタンパクと前記基質タンパクとの相互作用は試験管内で生じるものである請求項1に記載の治療薬同定方法。
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