JP2014520555A - Ｇｌｋ介在疾患の治療薬同定方法、および、ｇｌｋ介在疾患判定方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ）介在疾患を治療する治療薬を同定する方法を開示するものであり、試験化合物によりＧＬＫシグナル伝達の変調を検出する方法を開示する。また、本発明は、自己免疫性疾患または癌について、その存在または重症度を検出する方法を開示する。
【選択図】図６

Description

本発明は一般に、自己免疫および癌に関し、さらに詳細には、自己免疫変調およびＰＫＣ／ＮＦ−κＢシグナル伝達、並びに腫瘍転移に関する。

ＮＦ−κＢは、細胞生存、成長および増殖に貢献する遺伝子を調節する主要な転写因子である。Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合は、感染に対する寄主防御ならびに炎症、癌および自己免疫の進行に寄与するＮＦ−κＢ活性化を引き起こす。ＰＫＣ−θは、ＩＫＫ−ＮＦ−κＢ活性化およびＴ細胞機能に重要な役割を果たす。ＴＣＲ刺激におけるＰＫＣ−θ活性化に、アダプタＳＬＰ−７６が必要になる。しかしながら、ＳＬＰ−７６からＰＫＣ−θへのシグナル伝達およびＰＫＣ−θを活性化するダイレクトキナーゼについては、依然として不明な点がある。したがって、ＴＣＲ誘発ＮＦ−κＢ活性化の最も重要な疑問点は、ＳＬＰ−７６とＰＫＣ−θとの間のかなめ線を同定することである。

ＰＫＣ−θの活性化には、Ｔ５３８でのリン酸化が必要である。キナーゼＰＤＫ１はＰＫＣ−θと相互作用するので、Ｔ５３８でのＰＫＣ−θのリン酸化はＰＤＫ１欠損Ｔ細胞では不完全である。したがって、ＰＤＫ１がＴ５３８でＰＫＣ−θを直接リン酸化することが提唱されているが、ＰＤＫ１が直接にＰＫＣ−θをインビトロでリン酸化することが明らかに証明されたわけではない。さらに、ＰＤＫ１がＴＣＲシグナル伝達でなくＣＤ２８のみにより活性化されることが観測されており、ＰＤＫ１がＴＣＲシグナル伝達により誘発されるＰＫＣ−θ活性化のためのダイレクトキナーゼであるという可能性はさらに除外される。したがって、Ｔ細胞の活性化中に直接にＰＫＣ−θを活性化するキナーゼは、依然としてその定義が難しい。

ＧＣＫ（Ｇｅｒｍｉｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｋｉｎａｓｅ）類似キナーゼ（ＧＬＫ（ＧＣＫ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ）；ＭＡＰ４Ｋ３ともいう）は、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ４Ｋ）の構成メンバーであり、Ｓｔｅ２０類似セリン／トレオニンキナーゼのサブファミリーである。ＧＬＫは、保護されたＮ末端キナーゼドメインと、保護されたＣ末端シトロン相同ドメインと、中央の数個のプロリンリッチなモティーフとを含んでいる。Ｊｎｋリン酸化は、ストレス刺激に応じ、ＭＥＫＫ１およびＭＫＫ４／ＳＥＫ１を介してＧＬＫによって誘発される。また、ＧＬＫは、アミノ酸処理後、上皮細胞系列中のｍＴＯＲ下流エフェクターＳ６Ｋ１および４Ｅ−ＢＰ１の活性化を介して、細胞発育を調節する。しかしながら、ＧＬＫの調節機構および生理的役割については、未知な部分が多い。

したがって、ＧＬＫの調節と関連した前述の欠損および機能不全、特にＴＣＲシグナル伝達プロセス中のＧＬＫの生理的役割と関連した前述の欠損および機能不全を扱うためには、従来技術には未着手の課題が存在する。

本発明の一態様は、胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ）が介在した疾患を治療するための治療薬を同定する方法に関する。

前記方法は、ＧＬＫが介在したシグナル伝達の変調を、試験化合物により検出する検出ステップを含み、この検出ステップは、以下のステップ、ａ）試験化合物の存在下でＧＬＫ発現細胞を培養するステップであって、前記変調は、ＧＬＫ転写産物またはＧＬＫタンパクの発現レベル、生産されるＩＬ−１７Ａ（ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ−１７Ａ）の量またはＮＦ−κＢの活性を測定することにより検出される、前記細胞培養ステップ、またはｂ）試験化合物の存在下で、ＧＬＫタンパクをこれらの基質とＡＴＰの存在で反応させる反応ステップであって、前記変調は、生産されるＡＤＰの量、消費されるＡＴＰの量および／またはリン酸化される基質の量を測定することにより検出される、前記反応ステップ、またはｃ）試験化合物の存在下でＧＬＫ発現癌細胞を培養する癌細胞培養ステップであって、前記変調が、前記癌細胞の転位／浸潤／創傷治癒を測定することにより検出される、前記癌細胞培養ステップ、またはｄ）試験化合物の存在下でＧＬＫタンパクをこれらの基質タンパクと相互作用させる相互作用ステップであって、前記変調は、ＧＬＫタンパクと基質タンパクとの間の相互作用を測定することにより検出される、前記相互作用ステップ、および、ｅ）試験化合物の存在下で前記変調を対照と比較して、ＧＬＫ介在疾患を治癒する治療薬を同定する、比較ステップを含む。

本発明の別の態様は、胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ）介在疾患の存在および／または重症度を検出する方法に関する。ＧＬＫ介在疾患の存在および／または重症度の検出は、癌の予後を判定するステップを含んでもよい。前記方法は、以下のステップ、ａ）ＧＬＫ介在疾患または癌を有すると疑われる被験者から、Ｔ細胞または癌細胞を備えるサンプルを採取する採取ステップと、ｂ）Ｔ細胞または癌細胞中のＧＣＫ類似キナーゼ（ＧＬＫ）の発現レベルを測定する測定ステップと、ｃ）ＧＬＫ介在疾患の存在および／または重症度を判定する判定ステップを含み、Ｔ細胞または癌細胞中のＧＬＫ発現レベルの、対照中のＧＬＫの発現レベルと比較した増加分は、被験者が、ＧＬＫ介在疾患を進展または保有するリスクを有している、または癌の再発および／または転移のリスクを有していることを示している、前記判定ステップと、を含む。前記判定ステップは、癌の予後を判定するステップを含んでもよい。

上記およびその他の態様は、以下の図面を参照して説明する好適な実施形態の以下の説明から明らかになるが、本開示の趣旨および新しいコンセプトの範囲から逸脱することなく変更および修正を行ってもよい。

添付の図面は、本発明の１つ以上の実施形態を例示し、詳細な説明と共に、本発明の原理を説明する役目を果たすものである。実施形態においては全図面を通し、可能な限り、同じ参照符号を同じまたは類似の要素を指示するために用いるものとする。

図１は、Ｔ５３８でＧＬＫがＰＫＣ−θに直接に相互作用し、リン酸化する様子を示す図である。（ａ）は、ＧＬＫ ｓｉＲＮＡまたはＧＬＫをコードしたプラスミドを導入されたジャーカットＴ細胞中における、ＮＦ−κＢレポーターに対するルシフェラーゼ活性アッセイを示す。エラーバーは、３組のサンプルの標準偏差（ｓ．ｄ．）である。（ｂ）は、ＣＤ３刺激作用後のマウスプライマリーＴ細胞の溶解物中の内因性ＧＬＫのＰＫＣ−θとの共同免疫沈降（ＩＰ）を示す。ＮＳは標準的な血清のこと。ＩＢは免疫ブロットのこと。（ｃ）は、精製Ｆｌａｇ−ＧＬＫおよびＧＳＴ−ＰＫＣ−θタンパクに対するインビトロ結合アッセイを示す。ｐｐｔは沈降のことである。（ｄ）は、導入後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞から分離されたＦｌａｇ−ＧＬＫおよびＭｙｃ−ＰＫＣθを（基質として）用いて行ったインビトロ・キナーゼ・アッセイにおけるＧＬＫ発現およびＧＬＫ誘発ＰＫＣ−θリン酸化の免疫ブロット分析を示す。ジャーカット細胞の溶解物中のＰＫＣ−θの免疫ブロット分析は、コントロールバンド（右の２本のレーン）として示される。（ｅ）は、精製Ｆｌａｇ−ＧＬＫおよびＧＳＴ−ＰＫＣ−θタンパクを用いた、インビトロ・キナーゼ・アッセイにおけるＧＬＫ発現およびＧＬＫ誘発ＰＫＣ−θリン酸化の免疫ブロット分析を示す。データは、３つの別々の実験を表している。 図２は、ＳＬＰ−７６がＧＬＫの直接の上流側調節因子であることを示す図である。（ａ）は、ＣＤ３刺激作用後のマウスプライマリーＴ細胞の溶解物中内因性ＧＬＫのＳＬＰ−７６またはＰＫＣ−θとの共同免疫沈降を示す。（ｂ）は、精製Ｆｌａｇ−ＧＬＫおよびＦｌａｇ−ＳＬＰ−７６タンパクに対するインビトロ結合アッセイを示す。（ｃ，ｄ）は、空ベクターまたはＧＬＫをコードしたプラスミドを導入され、ＳＬＰ−７６ ｓｈＲＮＡ（ｄ）の有無にかかわらず、その後、抗ＣＤ３抗体で処理または未処理のＪ１４細胞（ｃ）またはジャーカットＴ細胞（ｄ）の溶解物中のＦｌａｇ−ＧＬＫのインビトロ・キナーゼ・アッセイを示す。（ｅ）は、空ベクター、ＳＬＰ−７６をコードしたプラスミド、または、ＧＬＫもしくはＨＰＫ１をコードしたプラスミドを導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物中における、ＳＬＰ−７６ Ｓ３７６のリン酸化の免疫ブロット分析を示す。矢印は、ＳＬＰ−７６ Ｓ３７６のリン酸化を示す。データは、３つの別々の実験を表している。 図３は、ＧＬＫ欠損プライマリーＴ細胞は、ＰＫＣ−θ−ＩＫＫ活性化およびＴ細胞増殖が不完全であることを示す図である。（ａ，ｂ）は、ＣＤ３刺激作用の後（ａ）、またはＣＤ３とＣＤ２８刺激作用の後（ｂ）、精製Ｔ細胞の溶解物中におけるＧＬＫ、ｐ−ＰＫＣ−θ、ＰＫＣ−θ、ＩＫＫ、ｐ−Ｅｒｋ、Ｅｒｋ、ｐ−ＰＤＫ１、ＰＤＫ１およびチューブリンの免疫ブロット分析を示す。（ｃ）は、抗ＣＤ３抗体の後にイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）で刺激した精製マウスＴ細胞中のカルシウム指示薬Ｆｌｕｏ−４のフローサイトメトリーを示す。（ｄ，ｅ）は、野生型マウスまたはＧＬＫ欠損マウスから分離したＣＤ３⁺Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体またはＰＭＡと、イオノマイシンとを加えて７２時間処理した、［³Ｈ］チミジン移入アッセイ（ｄ）およびＣＦＳＥプロファイル（ｅ）を示す。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより解析した増殖指数（平均＋／−標準誤差）を示す。（ｆ）は、空ベクター（ｐＣＭＶ−ＧＦＰ）またはＧＦＰ−ＧＬＫを導入された野生型およびＧＬＫ−欠損のＴ細胞中における［³Ｈ］チミジン移入アッセイを示す。ＷＴは野生型を指し、ＧＬＫ−ＫＯはＧＬＫ−欠損マウスを指す。データは、３つの別々の実験を表している（エラーバー（ｄ，ｆ）、標準誤差）。 図４は、インビボのＧＬＫ−欠損マウス中でＴ細胞に依存する免疫応答が損なわれていることを示す図である。（ａ，ｂ）は、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）−免疫性付与マウスから分離し、インビトロで３日間、ＫＬＨにより再刺激したＫＬＨ−再刺激リンパ節細胞の培養液上清中におけるＣＦＳＥ希釈アッセイ（ａ）、ならびに、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４のＥＬＩＳＡアッセイ（ｂ）を示す。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより解析した増殖指数（平均）を示す。（ｃ，ｄ）は、第１の免疫化の１４日後（ｃ）または第２の免疫化の７日後（ｄ）のマウスの血清中におけるニトロフェノール特異抗体（ＮＰ特異的Ａｂ）生産のＥＬＩＳＡアッセイを示す。ｎ＝６である。（ｅ）は、ＧＬＫ欠損マウス中およびＢ６バックグラウンドのＦ５の野性型同腹子におけるＥＡＥ誘起（約９７％）を示す。マウスの臨床のスコア（１−５）を示す。ｎ＝７。（ｆ）は、１４日目のＭＯＧ免疫マウスの脳および脊髄から採取した浸透型Ｔ_H１７細胞（ＣＤ４５依存性）のフローサイトメトリーを示す。（ｇ）は、ＭＯＧ免疫マウスの血清中におけるＩＬ−１７レベルのＥＬＩＳＡアッセイを示す。ｎ＝６である。（ｈ）は、インビトロで識別したＴ_H１７細胞におけるＩＬ−１７生産ＣＤ４Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。（ｉ）は、Ｔ_reg細胞と抗ＣＤ３コーティングビーズとを３：１（左）または９：１（右）の割合で培養したＴ細胞に対応するＣＦＳＥ希釈物として提供された、野生型またはＧＬＫ欠損Ｔ_reg細胞による（細胞質色素ＣＦＳＥで標識化された）ＣＤ３⁺Ｔ細胞の抑制を示す。データは、３つ（パネルｂ、ｅ、ｆ、ｈ）または２つ（パネルａ、ｃ、ｄ、ｇ、ｉ）の別々の実験からの平均＋／−標準誤差で示される。＊Ｐ値＜０．０５。＊＊Ｐ値＜０．００１。 図５は、ＧＬＫ発現およびＰＫＣ−θ−Ｔ５３８リン酸化が、ＳＬＥ患者からのＴ細胞中に誘発されることを示す図である。（ａ）は、４９人のＳＬＥ患者および３５の健常対照者（ＨＣ：ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）のＰＢＬからのＧＬＫ発現（ＧＬＫ⁺）リンパ球のフローサイトメトリー分析を示す。ＳＬＥ患者（ＳＬＥＤＡＩ（ＳＬＥ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）＝２０）からの結果を、代表として示す。（ｂ）は、全てのＳＬＥ患者からのＧＬＫ発現Ｔ細胞のパーセンテージと、ＳＬＥＤＡＩとの間における正の相関および大きな回帰を示す（ピアソン相関係数：ｒ＝０．７７３；単回帰：Ｙ＝−０．８８６＋０．３９０１Ｘ、回帰相関係数：調整Ｒ２＝０．５９７、Ｐ値＝１．０８×１０−１７）。（ｃ）は、高いＧＬＫ⁺パーセンテージ（≧２１％）のＳＬＥ患者からのＧＬＫ⁺Ｔ細胞のパーセンテージと、ＳＬＥＤＡＩとの間の高い相関および大きな回帰を示す（ｎ＝１６；ピアソン相関係数：ｒ＝０．８０７；単回帰：Ｙ＝５．２０８５＋０．２７５７Ｘ、回帰相関係数：調整Ｒ²＝０．６２６、Ｐ値＝０．０００１５９）。（ｄ）は、ランダムに選んだ５人のＳＬＥ患者および５人の健常対照者から採取したＰＢＬの溶解物中におけるＧＬＫ、ｐ−ＰＫＣ−θ、ｐ−ＩＫＫおよびチューブリンの免疫ブロット分析を示す。各々の患者のＳＬＥＤＡＩをパネル下方に示す。チューブリンに対する補正のための相対的な倍率の変更を、パネルの最下部に示す。（ｅ）は、代表的なＳＬＥ患者および健常対照者のＰＢＬから採取した、リン酸−ＰＫＣ−θまたはリン酸−ＩＫＫが陽性の（ＣＤ３依存性）細胞のフローサイトメトリーを示す（パネルａ参照）。データは、少なくとも３つの別々の実験を表している（ｄ，ｅ）。 図６は、ＴＣＲシグナル伝達中にＧＬＫに誘発されるＰＫＣ−θ／ＮＦ−κＢ活性化を表す図である。ＴＣＲ結合の後、活性化ＬｃｋがＴＣＲ錯体に補充されて、ＣＤ３の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）をリン酸化し、Ｚａｐ７０の補充および活性化が実現される。Ｚａｐ７０活性化は、近接ＳＬＰ−７６シグナリング錯体の構築を誘発する。ＳＬＰ−７６は、直接にＧＬＫと相互作用し、ＧＬＫキナーゼの活性化に必要である。活性化ＧＬＫは、Ｔ５３８で直接に相互作用しＰＫＣ−θをリン酸化することにより、ＰＫＣ−θ膜トランスロケーションおよびキナーゼ活性化が実現される。次いで、活性化ＰＫＣ−θが、ＩＫＫ／ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードの活性化を誘発する。癌細胞では、ＧＬＫは、ＰＫＣ／ＮＦ−κＢシグナル伝達を通して転位／浸潤／転移を誘発し、あるいはＰＫＣから独立したシグナル伝達を誘発する。 図７は、ＧＬＫがＴＣＲ刺激作用によりＴ細胞中のＮＦ−ｋＢ活性化を誘発することを示す図である。（ａ）は、ベクター、または、ＧＬＫもしくはＧＬＫ（ＫＤ）変異を発現しているジャーカットＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で１５分処理した溶解物中におけるＧＬＫ、ｐ−ＩＫＫ、ＩＫＫ、ｐ−Ｅｒｋ、Ｅｒｋ、ｐ−ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲおよびチューブリンの免疫ブロット分析を示す。（ｂ）の左側は、ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α）刺激の後に、空ベクターまたはＧＬＫ ｓｉＲＮＡが導入されたジャーカット細胞のＮＦ−κＢリポーターアッセイを示す。右側は、抗ＣＤ３刺激の後、空ベクター、ＧＬＫをコードしたプラスミドまたはＧＬＫ ｓｉＲＮＡを導入されたジャーカットＴ細胞の溶解物中におけるＧＬＫおよびチューブリンの免疫ブロット分析を示す。（ｃ）は、抗ＣＤ３抗体で刺激されたＦｌａｇ−ＧＬＫ発現Ｊ−ＴＡｇ Ｔ細胞から分離されたＧＬＫのインビトロ・キナーゼ・アッセイを示す。矢印はＧＬＫ自動リン酸化を指す。ＩＰは免疫沈降を指す。ＩＢは免疫ブロットを指す。（ｄ）は、３０分間のＣＤ３刺激後、ＧＬＫ、ＧＬＫ（ＫＤ）変異をコードしたプラスミドが導入されたＪ−ＴＡｇ Ｔ細胞の溶解物中における、ＧＬＫ、ｐ−ＰＫＣ−θ、ＰＫＣ−θ、およびチューブリンの免疫ブロット分析を示す。（ｅ）は、空ベクター、ＧＬＫ、ＧＬＫ、若しくはＰＫＣ−θ ｓｉＲＮＡを単独でコードしたプラスミド、または、ＰＫＣ−θ ｓｉＲＮＡを加えたＧＬＫをコードしたプラスミドが導入されたジャーカットＴ細胞のＮＦ−κＢリポーターアッセイを示す。抗ＣＤ３抗体の有無にかかわらず、これら細胞を２時間刺激した。データは、３つの別々の実験を表している。＊Ｐ値＜０．０５。＊＊Ｐ値＜０．００１。パネル（ｂ）および（ｅ）のエラーバーは、三組のサンプルの標準偏差（ｓ．ｄ．）で与えられる。データは、少なくとも３つの別々の実験を表している。 図８は、ＧＬＫがＰＫＣ−θと相互作用することを示す図である。（ａ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して、空ベクターまたはＧＬＫをコードしたプラスミドを導入し、さらにＰＫＣ−θをコードしたプラスミドを共に導入したもの、または導入していないものである、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物中におけるＧＬＫおよびＰＫＣ−θの共同免疫沈降（ＩＰ）、ならびに、免疫ブロット（ＩＢ）分析を示す。（ｂ，ｃ）のうち、パネル上方は、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体で刺激された、Ｆｌａｇ−ＧＬＫ発現Ｊ−ＴＡｇ（ｂ）またはＥＬ４（ｃ）Ｔ細胞の溶解物中における、Ｆｌａｇ−ＧＬＫおよび内因性ＰＫＣ−θの共同免疫沈降を示す。パネル下方は、プレ免疫沈降サンプル中におけるＧＬＫ、ｐ−ＰＫＣ−θ、ＰＫＣ−θおよびチューブリンの免疫ブロット分析を示す。データは、少なくとも３つの別々の実験を表している。 図９は、ＧＬＫとＳＬＰ−７６との間の相互作用が、チロシンリン酸化を介在して行われることを示す図である。（ａ）は、空ベクターまたはＳＬＰ−７６をコードしたプラスミドと共に、ＧＬＫをコードしたプラスミドが導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物中におけるＧＬＫおよびＳＬＰ−７６の共同免疫沈降（ＩＰ）および免疫ブロット（ＩＢ）分析を示す。（ｂ）は、抗ＣＤ３抗体で刺激された、Ｆｌａｇ−ＳＬＰ−７６過剰発現Ｊ−ＴＡｇ Ｔ細胞の溶解物中における、ＳＬＰ−７６およびＧＬＫの共同免疫沈降を示す。（ｃ）は、Ｆｌａｇ−ＧＬＫを導入されたＪ−ＴＡｇ Ｔ細胞中における、抗ＣＤ３に誘発されたＳＬＰ−７６／ＧＬＫ／ＰＫＣ−θ相互作用の共同免疫沈降を示す。（ｄ）は、ＳＬＰ−７６をコードしたプラスミドと共に、空ベクターまたはＧＬＫをコードしたプラスミドを導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物中における、ＧＬＫおよびＳＬＰ−７６の共同免疫沈降を示す。細胞は、チロシンホスファターゼ阻害剤パーバナジン酸もしくはセリン／スレニオンホスファターゼ阻害剤オカダ酸と共に、または抜きで、前処理されている。データは、少なくとも３つの別々の実験を表している。 図１０は、Ｖａｖ１がＴＣＲ−誘発ＧＬＫ活性化に必要ではないことを示す図である。抗ＣＤ３抗体の存在下または不存在下で３０分刺激したＶａｖ１ ｓｈＲＮＡノックダウンジャーカットＴ細胞（ｓｈＶａｖ１ ａ−ｃ）から分離されたＦｌａｇ−ＧＬＫのインビトロ・キナーゼ・アッセイを示す。基質としてＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いている。データは、少なくとも３つの別々の実験を表している。 図１１は、ＧＬＫ欠損マウスではＴ細胞進行が標準的であることを示す図である。（ａ）は、遺伝子−トラップベクターの構造を示す。β−ｇｅｏは、β−ガラクトシダーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子による融合を示す。ＳＡは、スプライス受容体を示す。数の記入されたボックスは、ＧＬＫの配列情報を示す。点線矢印は、ＰＣＲ用プライマーを示す。（ｂ）は、マウステイルからのゲノムＤＮＡ中のＧＬＫ野生型および変異対立遺伝子のＰＣＲ分析を示す。ＰＣＲ産物の中で、高いバンド（１４００ｂｐ）のものは、野性型（ＷＴ）の対立遺伝子を示し、低いバンド（１０００ｂｐ）は、ＧＬＫ変異対立遺伝子を示す。（ｃ）は野生型およびＧＬＫ−欠損（ＧＬＫ−ＫＯ）マウスの胸腺、（ｄ）は脾臓、（ｅ）はリンパ節からの、Ｔリンパ球のフローサイトメトリー分析を示す。データは、平均＋／−標準誤差を提示している。（ｆ）は、抗ＣＤ３−ビオチンおよびストレプトアビジンで刺激したマウスＴ細胞の溶解物中における、ＧＬＫ、ｐ−ＰＬＣγ１、ｐ−Ｌｃｋ、Ｌｃｋおよびチューブリンの免疫ブロット分析を示す。（ｇ）は、精製Ｔ細胞中におけるＴ細胞増殖のＣＦＳＥ希釈アッセイを示す。また、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析された増殖指数（平均＋／−標準誤差）も示す。データは、少なくとも３つの別々の実験を表している（ｂ−ｇ）。 図１２は、Ｔ_H１およびＴ_H２の分化は、ＧＬＫ欠損によって損なわれることを示す図である。ＩＦＮ−γ生成ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＩＬ−４生成ＣＤ４⁺Ｔ細胞およびＦｏｘｐ３−陽性ＣＤ４⁺Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。データは、平均＋／−標準誤差で示される。データは、少なくとも３つの別々の実験を表している。 図１３は、血清ＩＬ−１７のレベルがＳＬＥ患者で増加することを示す図である。（ａ）は、ＳＬＥ患者およびペアを組まれた健常対照者のプロファイルを示す。データは、平均＋／−標準偏差で示される。（ｂ）は、ＳＬＥ患者および健常対照者（ＨＣ）の血清中のＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）のＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図１４は、ＧＬＫ−欠損マウス中のＣＩＡ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）の誘起がそこなわれたことを示す図である。（Ａ）は、ＧＬＫ欠損型マウスと野性型（ＷＴ）マウスとの間で疾患進行を比較する平均臨床のスコア＋／−標準誤差を示す。動物の記録は、コラーゲン免疫化の後、週に１度行われた。ｎ＝５である。（Ｂ）は、第２の免疫化の７日後に得た後部関節を示す。（Ｃ）は、免疫化の７日後のＧＬＫ−欠損マウスおよびＷＴマウスからの血清のＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）レベルを判定するためのＥＬＩＳＡアッセイを示す。（ＤおよびＥ）は、第２の免疫化の７日後のマウスからの血清のＩＬ−６レベル（Ｄ）およびＩＬ−１７Ａレベル（Ｅ）をＥＬＩＳＡアッセイにより判定した結果を示す。＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。 図１５は、ＲＡ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）患者からの末梢血Ｔ細胞中のＧＬＫタンパクおよびｍＲＮＡレベルが増加することを示す図である。（Ａ）は、ランダムにサンプルした５人のＲＡ患者および２人の健常対照者（ＨＣ）から採取した精製末梢血Ｔ細胞中のＧＬＫおよびリン酸化ＰＫＣ−θ（ｐ−ＰＫＣ−θ）の免疫ブロッティング分析を示す。ＧＡＰＤＨに対して補正されたＧＬＫの相対的な倍率変更は、パネルの下部に示される。（Ｂ）は、１１人のＲＡ患者と５人のＨＣとの間のＧＬＫ発現レベルの比較を示す。データは、ＧＡＰＤＨに対して補正されたＧＬＫの相対的な倍率変更として示される。ｐ＝０．０４７である。（Ｃ）は、１２人のＲＡ患者および１３人のＨＣの精製末梢血Ｔ細胞中における、ＧＬＫメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルを示す。データは、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（ＰＰＩＡ）ｍＲＮＡ転写物に対するＧＬＫの割合として表される。エラーバーは、平均（標準誤差）の標準誤差を示す。ｐ＝０．００２９である。 図１６は、滑液からのＴ細胞およびＲＡ患者の滑膜組織中におけるＧＬＫの過剰発現を示す図である。（Ａ）は、代表的なＲＡ患者およびＯＡ患者から採取した滑液白血球中におけるＧＬＫおよびｐ−ＰＫＣ−θの免疫ブロッティング分析を示す。（Ｂ）は、代表的なＲＡ患者およびＯＡ患者の滑液中におけるＧＬＫポジティブなＣＤ３依存性Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。（Ｃ）は、２人のＲＡ患者および２人のＯＡ患者の滑膜組織中の抗ＧＬＫ（青色）および抗ＣＤ３（茶色の）に対する免疫組織化学染色を示す。矢印は、ＧＬＫ発現Ｔ細胞を表す。 図１７は、ＲＡ患者の滑液および末梢血からのＴ細胞中のＧＬＫ、ＰＫＣ−θおよびＣＤ３の共通局在性を示す図である。（Ａ）は、ＴＣＳ ＳＰ５（ライカ）共焦点システムによる、ＲＡ患者およびＯＡ患者の滑液Ｔ細胞中のＧＬＫ、ＰＫＣ−θおよびＣＤ３の共焦点顕微鏡検査を示す。（Ｂ）は、ＴＣＳ ＳＰ５（ライカ）共焦点システムによる、ＲＡ患者およびＨＣの末梢血Ｔ細胞中のＧＬＫ、ＰＫＣ−θおよびＣＤ３の共焦点顕微鏡検査を示す。 図１８は、ＲＡ患者の末梢血Ｔ細胞中における炎症サイトカインレベルの増加およびＧＬＫ、ｐ−ＰＫＣ−θおよびｐ−ＩＫＫの共存を示す図である。ＲＡ患者および健常対照者における（Ａ）ＴＮＦ−α、（Ｂ）ＩＬ−６、および（Ｃ）ＴＧＦ−βの血清レベルを、ＥＬＩＳＡアッセイにより判定した。（Ｄ）は、代表的なＲＡ患者および健常対照者（ＨＣ）の末梢血白血球から採取したＧＬＫ／ｐ−ＰＫＣ−θ／ｐ−ＩＫＫ陽性細胞のフローサイトメトリー分析を示す。ＣＤ３陽性Ｔ細胞は、ゲート設定された後、フローサイトメトリーで分析された。（Ｅ）は、ＣＤ３にゲートされたＴ細胞中のＧＬＫ発現を３０人のＲＡ患者と２４人のＨＣとの間の比較を示す。エラーバーは、平均９５％の信頼区間を示す。＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。 図１９は、ＲＡ疾患活動性とＧＬＫ発現Ｔ細胞頻度との相関を示す図である。（Ａ）〜（Ｄ）は、以下の間の正の相関および大きな回帰を示す。（Ａ）圧痛関節数（ＴＪＣ：ｔｅｎｄｅｒ ｊｏｉｎｔ ｃｏｕｎｔ）とＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度との間（ピアソンの相関係数：ｒ＝０．５００；単純な直線的な回帰：Ｙ＝０．２７４Ｘ−０．４０２（ｐ＝０．００５））。（Ｂ）赤血球沈降速度（ＥＳＲ：ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）とＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度との間（ピアソンの相関係数：ｒ＝０．４００；単純な直線的な回帰：Ｙ＝１．１１３Ｘ＋９．６０２（ｐ＝０．００３））。（Ｃ）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ：Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）とＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度との間（ピアソンの相関係数：ｒ＝０．３３０；単純な直線的な回帰：Ｙ＝０．０５９Ｘ−０．２７１、ｐ＝０．０１５）。（Ｄ）ＤＡＳ２８（２８−ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）と全てのＲＡ患者からのＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度との間（ピアソンの相関係数：ｒ＝０．６０６；単純な直線的な回帰：Ｙ＝０．０６５Ｘ＋３．５７５、ｐ＝０．００５）。（Ｅ）は、ＤＡＳ２８と３０人の患者のうちの２６人からのＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度との間の相関および大きな回帰を示す（ピアソンの相関係数：ｒ＝０．７１３；単純な直線的な回帰：Ｙ＝０．０６１Ｘ＋３．６１５８、ｐ＝０．００００６３９）。 図２０は、成人発症型スティル病（ＡＯＳＤ：Ａｄｕｌｔ−Ｏｎｓｅｔ Ｓｔｉｌｌ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）をもつ患者および健常対照者（ＨＣ）からのＴ細胞中のＧＬＫ発現レベルを示す図である。（Ａ）は、１人のＡＯＳＤ患者の末梢血から得られた、ＣＤ３⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の細胞内ＧＬＫ生産のフローサイトメトリー輪郭プロットの代表的な例を示し、（Ｂ）は、１人の健常対照者から得られた、それらの代表的な例を示す。（Ｃ）は、２４人の対象のＡＯＳＤ患者および１２人のＨＣから得られた、循環ＧＬＫ発現ＣＤ３⁺Ｔ細胞（Ｃ）の頻度を示す。（Ｄ）は、ＧＬＫ転写産物の相対的発現レベルをＡＯＳＤ患者とＨＣとの間で比較して示す。（Ｅ）は、ＡＯＳＤ患者およびＨＣからの末梢血Ｔ細胞の溶解物中における、ＧＬＫ発現の免疫ブロット分析を示す。（Ｆ）は、ＧＬＫタンパクの相対的な発現レベルをＡＯＳＤ患者とＨＣ（Ｆ）との間で比較して示す。横棒は、中央値を示す。＊Ｐ値は、マン−ホイットニーＵ試験によって判定された。 図２１は、成人発症型スティル病（ＡＯＳＤ）をもつ対象患者および健常対照者（ＨＣ）からのＩＬ−１β（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＬ−１７Ａ（Ｃ）およびＴＮＦ−α（Ｄ）を含む炎症性サイトカインの血清レベルを比較して示す図である。横棒は、中央値を示す。＊Ｐ−値は、マン−ホイットニーＵ試験によって判定された。 図２２は、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度と、成人発症型スティル病をもつ２４人の患者から採取した以下の（Ａ）〜（Ｈ）との間の相関を示す。（Ａ）疾患活動性スコア；（Ｂ）血清フェリチンレベルを含む活動性パラメータ；（Ｃ）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル；（Ｄ）可溶性のインターロイキン２レセプターレベル；ならびに（Ｅ）ＩＬ−１β、（Ｆ）ＩＬ−６、（Ｇ）ＴＮＦ−α、および（Ｈ）ＩＬ−１７Ａを含むサイトカインの血清レベル。相関係数（γ）およびｐ値は、非母数のスピアマンの順位相関試験によって得られた。 図２３は、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞、ＧＬＫタンパクの発現レベル、および転写産物のレベルの変化、ならびに、有効な治療後の１２人のＡＯＳＤ患者における可溶性インターロイキン２レセプター（ｓＩＬ−２Ｒ：ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の血清レベルの変化を示す図である。データは、平均＋／−標準誤差で示される。＊ｐ＜０．００５、ウイルコクソンの符号順位検定によって処理前に対して判定される。 図２４は、自己免疫性疾患を有する患者からのＴ細胞中のＧＬＫ過剰発現を示す図である。強直性脊椎炎（ＡＳ：ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、シェーグレン症候群（ＳＳ：Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脱毛症、成人発症型スティル病（ＡＯＳＤ：ａｄｕｌｔ ｏｎｓｅｔ Ｓｔｉｌｌ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）および神経脊髄炎（ＮＭＯ：ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｏｐｌｉｔｉｃａ）の患者から採取した精製Ｔ細胞の溶解物中のＧＬＫおよびＧＡＰＤＨの免疫ブロッティング分析を示す。ＨＣは、健常対照者を指す。 図２５は、グレーブス病の患者からのＴ細胞中のＧＬＫ過剰発現を示す図である。（ａ）は、グレーブス病（Ｇｄ：Ｇｒａｖｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）患者および健常対照者（ＨＣ）からの精製Ｔ細胞の溶解物中のＧＬＫおよびＧＡＰＤＨの免疫ブロッティング分析を示す。（ｂ）は、ＨＣ（ｎ＝３）とＧｄ（ｎ＝７）との間の相対的なＧＬＫ発現を現す定量ＰＣＲ法を示す。 図２６は、グレーブス病患者においてＧＬＫポジティブなＴ細胞の増加するパーセンテージを示す図である。グレーブス病（Ｇｄ）および健常対照者（ＨＣ）による被験者の末梢血からのＧＬＫ発現Ｔリンパ球のフローサイトメトリー分析を示す。 図２７は、大部分のＧＬＫ−過剰発現Ｔ細胞は、ＩＬ−１７生成細胞であることを示す図である。（ａ）は、ＳＬＥ患者および健常対照者の血清ＩＬ−１７レベルを判定するためのＥＬＩＳＡアッセイを示す。（ｂ）は、代表的なＳＬＥ患者（ＳＬＥＤＡＩ＝１２）の末梢血からのＧＬＫ／ＩＬ−１７−ダブル陽性Ｔ細胞（ＣＤ３依存性）のフローサイトメトリー分析を示す。（ｃ）は、ＨＣおよびＳＬＥ患者からのＴ細胞（ＣＤ３依存性）中、または、Ｔ細胞部分集合（各個に依存性）中のＧＬＫ／ＩＬ−１７−ダブル陽性細胞のパーセンテージを示す。（ｄ）は、ダブルネガティブＴ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、またはＣＤ８陽性Ｔ細胞にゲートをかけた後、ＳＬＥ患者のＰＢＬからのＧＬＫ／ＩＬ−１７−ダブル陽性細胞をフローサイトメトリーによって分析した結果を示す。異なる部分集合中のＧＬＫ／ＩＬ−１７−ダブル陽性細胞のパーセンテージが示されている。 図２８は、Ｌｃｋ−ＧＬＫトランスジェニック（Ｔｇ）マウスは、自発的に自己免疫性疾患を進行させることを示す図である。（ａ）は、Ｌｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスのフェノタイプを示す。大部分のＬｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスは、弱い尾部および後肢を示している。高いＧＬＫ発現を有するＬｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスは、１３週齢で死亡した。Ｌｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスは、白内障および盲目を引き起こした。（ｂ）および（ｃ）は、Ｌｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスの血清自己抗体をＥＬＩＳＡアッセイにより検出した結果を示す。抗核抗体は、ＳＬＥを示す。リウマチ因子は、ＲＡを示す。 図２９は、Ｌｃｋ−ＧＬＫトランスジェニック（Ｔｇ）マウスがＩＬ−１７Ａレベルの増加を示すことを示す図である。（ａ）は、マウス（５週齢）の血清サイトカインをＥＬＩＳＡアッセイ（ｎ＝８）により測定した結果を示す。（ｂ）は、プールＬｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスからの周辺Ｔ細胞中におけるＧＬＫおよびＩＬ−１７ＡのｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ（ｎ＝６）を用いるタクマンプローブにより判定した結果を示す。 図３０は、非小細胞肺臓癌腫中のＧＬＫ過剰発現を示す図である。それぞれ、肺癌の患者からの肺臓組織中のＧＬＫ、ｐ−ＩＫＫ、ｐ−ｍＴＯＲの免疫ブロッティング分析を示す。ｎ＝２０である。Ｔ：腫瘍部分。Ｎ：正規の部分。 図３１は、食道癌中のＧＬＫ過剰発現を示す図である。それぞれ、患者からの食道癌腫サンプル中のＧＬＫの免疫ブロッティング分析を示す。ｎ＝３１である。Ｔ：腫瘍部分。Ｎ：正常部分。 図３２は、膵臓の導管腺癌中のＧＬＫ過剰発現を示す図である。正常な膵臓および膵臓の導管腺癌（ＰＤＡ：Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｄｕｃｔａｌ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）に対するＧＬＫ染色を行っている。（Ａ）は正常な膵臓、（Ｂ）はグレード１ＰＤＡ、（Ｃ）はグレード２ＰＤＡ、および（Ｄ）はグレード３ＰＤＡを代表する画像であり、パラフィン包埋された組織から得られる。当初の倍率：２０倍。 図３３は、肝細胞癌中のＧＬＫ過剰発現を示す図である。正常肝および肝細胞癌へのＧＬＫ染色を行っている。（Ａ）は正常肝、（Ｂ）はグレード１の肝細胞癌、（Ｃ）はグレード３の肝細胞癌を表す画像であり、（Ｄ）は（Ｃ）の拡大画像である。当初の倍率：２０倍。 図３４は、乳癌中のＧＬＫ過剰発現を示す図である。正常胸部および乳癌に対するＧＬＫ染色を行っている。（Ａ）は正常な胸、（Ｂ）はグレード２のステージＴ２Ｎ０Ｍ０乳癌、（Ｃ）はグレード２のステージＴ２Ｎ１Ｍ０乳癌を表す画像である。当初の倍率：２０倍。 図３５は、膠芽細胞腫中のＧＬＫ過剰発現を示す図である。正常な脳組織中、ヒト膠芽細胞腫（グレードＩＩ〜ＩＶ）中、および、２つの脳腫瘍細胞株（Ｕ−８７ＭＧおよびＴ９８Ｇ）中のＧＬＫタンパク発現の免疫ブロッティング分析を行っている。 図３６は、非小細胞肺癌患者のＧＬＫタンパク発現が高いと、再発が早いことが予想されることを示す図である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ：ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者の中において、ＧＬＫタンパクレベルが高い（ＧＬＫ−高）と、再発も早くなるという相関が得られた。 図３７は、ＧＬＫ過剰発現が、自発的な浸潤を増加させることを明らかにする図である。Ｈ１２９９細胞は、２４時間で、ベクター（パネル上側）、ＧＬＫ（パネル中央）またはｓｈＲＮＡ−ＧＬＫ（パネル下側）を過渡的に導入された。導入の後、これらの細胞は、トランスウェルアッセイによって試験された。１０％−１０％の血清は、自発的な浸潤を示す。０％−１０％の血清は、血清−誘発性の浸潤を示す。 図３８は、ＧＬＫの過剰発現が細胞転位（創傷治癒）を促進することを示す図である。Ｈ１２９９細胞が、示されたプラスミドを導入され、コンフルエントするまで培養される。ｐ２００ピペット先端で細胞単層を直線でこそいで「創傷」を生成し、細胞増殖培養液で細胞を洗浄することにより創傷のデブリを除去した。図に記載した培養時間の後、位相差顕微鏡の画像を得た。 図３９は、ＢＬ２１大腸菌（Ｈｉｓ−ＧＬＫ−ＫＤ）から、または、Ｓｆ９昆虫細胞（ＧＳＴ−ＧＬＫ）中のかん状ウイルスから分離されたＧＬＫキナーゼドメイン（ＧＬＫ−ＫＤ：ＧＬＫ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ）組み換え型タンパクについて、ＡＴＰ−ＧＬＯ（商標）キナーゼキット（ａ）、ＡＤＰ−ＧＬＯ（商標）キナーゼキット（ｂ）、または放射性キナーゼアッセイ（ｃ）を用いてインビトロでキナーゼアッセイを行った結果を示す図である。 図４０は、ＧＬＫとＰＫＣ−θとの間の相互作用を示す図である。（ａ）は過渡的に導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＣＦＰ−ＧＬＫとＹＦＰ−ＰＫＣθとの間の直接相互作用のＦＲＥＴ（Ｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）分析を示す。（ｂ）は増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法（ＡＬＰＨＡ：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）により測定された、過渡トランスフェクションＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物中におけるＦｌａｇ−ＧＬＫとＭｙｃ−ＰＫＣ−θとの間の相互作用のシグナルを示す。

［定義］
一般に、本明細書中で使用される用語は、本発明の文脈において、また、各々の用語が使われる特定の文脈において、従来技術における通常の意味を持つものである。本発明を記載するために用いる特定の用語は、明細書において検討され、本発明の説明に関わる実務家に付加的な手引きを提供するものである。便宜上、特定の用語を強調することもあり、たとえば、イタリックおよび／または引用符を使うこともある。強調する場合でも、それが強調されるにせよされないにせよ、同じ文脈において係る用語の範囲および意味の上で影響が無く、用語の範囲および意味は同じである。同じ事項を、異なる複数の方法で記載することもあることが理解されよう。従って、ここで検討されるあらゆる用語の１つ以上につき、代替的な用語や同義語が用いられてもよく、あるいは、用語がここで詳細に述べられまたは検討されたか否かにより、特殊な意味がこめられてもよい。特定の用語に対しての同義語が、提供される。１つ以上の同義語の詳説は、別の同義語の使用を排除しない。ここで検討されるあらゆる用語の用例を含む本明細書全体での用例の使用は、例示目的のみであり、本発明またはここで例示した全ての用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書中の所与の各種実施形態に限定されるものではない。

特に言及しない限り、ここに使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有するものである。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書を照合するものとする。

ここで用いられる例では、「ほぼ」、「およそ」、または「約」の語は、一般に、所与の値または範囲の２０パーセント以内を指し、好ましくは１０パーセント以内を指し、さらに好ましくは５パーセント以内を指すものとする。ここで与えられる数量は、近似値であり、「ほぼ」、「およそ」、または「約」の語は、明確に述べられていない場合にも推論できることを意味するものである。

文脈によっては、用語「対照」は、健康で正常なサンプルまたは細胞を意味する場合もあり、また、試験化合物がない場合に成し遂げられる試験を参照する場合もある。患者被験者のＴ細胞から得られる測定結果は、健康で正常な被験者のＴ細胞から得た対照の測定結果と比較される。患者の癌細胞から得られる測定結果は、同じ患者または健康な正常な被験者の、非腫瘍組織サンプルからの非癌正常細胞から得られる対照の測定結果と比較される。

用語「ＧＬＫシグナル伝達」は、ＧＬＫの介在したシグナル伝達、すなわちＧＬＫ−ＰＫＣ−θ−ＩＫＫ−ＮＦ−κＢ−ＩＬ１７Ａシグナル伝達を意味するものである。

ＦＬＡＧ−タグまたはＦＬＡＧオクタペプチドは、ポリペチド・タンパク・タグであり、組換えＤＮＡ技術を用いるタンパクに加えてもよい。ＦＬＡＧ−タグは、抗体による認識を必要とする多くの異なるアッセイに使われてもよい。ＦＬＡＧ−タグのペプチドシーケンスは、Ｎ−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−Ｃである。ｍｙｃタグは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子産物に由来するポリペチド・タンパク・タグであり、組換えＤＮＡ技術を用いるタンパクに加えてもよい。ｍｙｃ−タグのペプチドシーケンスは、Ｎ−ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ−Ｃである。

ＧＬＫタンパクおよびＰＫＣ−θタンパクが、一方の蛍光プローブから別の蛍光プローブへの蛍光エネルギーの移動を可能にするような、それぞれ異なるエネルギーを有し、かつ、互換性を持つ蛍光プローブによって標識される場合、ＧＬＫがＰＫＣ−θタンパクに結合する際（すなわち物理的に関連する際）に蛍光エネルギー移動が生じる。第１の蛍光プローブの励起波長は低く、第２の蛍光プローブの励起波長は高い。第１の蛍光プローブの発光波長は、より高い励起波長と重なるので、第２の蛍光プローブを励起し、より高い波長での発光を引き起こす。試験化合物が、ＰＫＣ−θに結合するＧＬＫを妨げる場合には、蛍光プローブのエネルギー伝達は生じず、より高い波長での蛍光発光は生じない。

ここで用いられる略記号のフルネームは、次の通りである。回帰性リウマチ（ＰＭＲＡ：ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）；ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ：ｐｈｏｒｂｏｌ−１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ−１３−ａｃｅｔａｔｅ）；末梢血白血球（ＰＢＬ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）；胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ：Ｇｅｒｍｉｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｋｉｎａｓｅ（ＧＣＫ）−Ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ）。

本発明は、ＴＣＲシグナル伝達カスケードにおけるＧＬＫの役割を発見したことに関する。ＧＬＫは、ＳＬＰ−７６からＰＫＣ−θへのシグナル伝達をリンクするキナーゼを表すことが見いだされた。

ヒト胚中心キナーゼに関連したプロテインキナーゼ（ＧＬＫ）のアミノ酸配列は、配列番号１であり、そのヌクレオチド配列は、配列番号２である。ラット分裂促進因子−活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ３（Ｍａｐ４ｋ３：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）のアミノ酸配列は、配列番号３であり、そのヌクレオチド配列は、配列番号４である。プロテインキナーゼＣ、シータ（ヒト）のアミノ酸配列は、配列番号５であり、そのヌクレオチド配列は配列番号６である。マウスプロテインキナーゼＣ、シータのアミノ酸配列は、配列番号７であり、そのヌクレオチド配列は配列番号８である。

［化合物をスクリーニングする方法］
（タンパクベースのアッセイ：放射性／非放射性インビトロ・キナーゼ・アッセイ）
放射性インビトロ・キナーゼ・アッセイ：組み換え型ＧＬＫタンパクを、１０μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ、４μｇのミエリン塩基性タンパク（ＭＰＢ：ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、および３５μｌのキナーゼ緩衝液中５００μＭのコールドＡＴＰと共に、室温で４０分培養した。１２％ＳＤＳ−ｐａｇｅによってサンプルを分離し、放射標識されたリン酸塩の基質への移入を、タイフーン級スキャナーによって定量した。

非放射性インビトロ・キナーゼ・アッセイ：非放射性インビトロ・キナーゼ・アッセイは、ウェル９６個、全体積１００μｌの白色プロキシプレート（パーキンエルマー社、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて実施された。ＧＬＫキナーゼ反応の後に生成するＡＤＰのレベルを判定するため、組み換え型ＧＬＫタンパク（２μｇ；大腸菌またはかん状ウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞から分離された）を、キナーゼ緩衝液２５μｌ中のＭＰＢ１０μｇおよびＡＴＰ２μＭと共に４０分間室温で培養した。これにＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）試薬（２５μｌ；プロメガ社）を加えた。４０分の培養後、キナーゼ検出試薬（５０μｌ）を加え、さらに３０分間培養した。エンビジョン・マルチラベル・リーダー（パーキンエルマー・ライフ・サイエンス社）によって、輝度を測定した。ＧＬＫキナーゼ反応の後に消費されるＡＴＰのレベルを判定するため、組み換え型ＧＬＫタンパク（０．２〜１μｇ）を、キナーゼ緩衝液２５μｌ中のＭＰＢ１０μｇおよびＡＴＰ２μＭと共に、４０分室温で培養した。これにＡＤＰ−Ｇｌｏ（商標）試薬（２５μｌ；プロメガ社）を加え、さらに１０分培養した。エンビジョン・マルチラベル・リーダー（パーキンエルマー・ライフ・サイエンス社）によって、輝度を測定した。

細胞ベースのアッセイ：ＩＬ−１７Ａ ＥＬＩＳＡまたはＮＦ−κＢ活性リポーターアッセイにより判定される安定ＧＬＫトランスフェクション細胞を用いた薬剤スクリーニングである。

安定ＧＬＫトランスフェクション細胞の作製：ネオン移入システム（インビトロジェン社）を用いて、ジャーカット細胞にＧＬＫプラスミドおよびｐ−ＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ−ハイグロマイシンプラスミドを導入した。安定ＧＬＫトランスフェクション細胞を選択するため、ＧＬＫトランスフェクション細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０を含有するネオマイシン中で少なくとも２週間培養した。

ＩＬ−１７Ａ酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：安定ＧＬＫトランスフェクションジャーカット細胞（９６ウェルディッシュのウェル毎に１０６個）を、ＲＰＭＩ培地（２００μｌ）中で７２時間培養した。上澄み中のＩＬ−１７Ａのレベルを、ヒトＩＬ−１７Ａ ＥＬＩＳＡ（ペプロテック）を用いて判定した。

ルシフェラーゼリポーターアッセイのＮＦ−κＢ活性：１０６個の安定ＧＬＫトランスフェクションジャーカット細胞を、６０μｌの細胞溶解／ルシフェラーゼ緩衝（プロメガ社）を加えた６０μｌのＲＰＭＩ培地中で、再懸濁した。データは、標準偏差の．エラーバーと共に、ホタルルシフェラーゼ活性の平均を示している。

トランスウェル移動および浸潤アッセイ：トランスウェル移動アッセイでは、非コーティング・トップチャンバ（２４ウェルのインサート；細孔径８μｍ；コーニングコスター社）に配置され、１６時間培養された１×１０⁵個の細胞を用いた。浸潤アッセイでは、マトリゲルコーティングしたトップチャンバ（ＢＤバイオサイエンス社）上に配置され、２４〜４８時間培養された１×１０⁵個の細胞を用いた。トランスウェルの上側に残留した非浸潤細胞を綿スワブでこそぎ落とした。インサートフィルターの下側の細胞を、４％のパラホルムアルデヒドによって１０分で高速に固定した後、１％クリスタルバイオレットで２０分染色した。光学顕微鏡下でインサートフィルター下側の細胞の数を計数した。その結果を、１０個のフィールド毎の移動細胞または浸潤細胞の数として表した。

創傷治癒アッセイ（細胞転位）：ヒト肺癌Ｈ１２９９細胞に、ベクター（導入遺伝子のない空状態）、ｐＣＩｎｅｏ−ＧＬＫ（ＧＬＫ導入遺伝子を有するプラスミド）またはｓｈＲＮＡ−ＧＬＫ（ＧＬＫ導入遺伝子のｓｈＲＮＡを有するプラスミド）を導入した。これらの細胞単層はコンフルエントされた。ｐ２００ピペットの先端を用いて２本の平行な掠り傷を形成した。位相差顕微鏡を用いて、この傷を観測した。創傷の交点の側面に位置する両側の領域で、０〜２４時間の過程中に定期的な間隔で撮像を行った。

タンパク−タンパク相互作用アッセイ：蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイおよび増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ；パーキンエルマー社）である。

蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイ：ＣＦＰ−ＧＬＫおよびＹＦＰ−ＰＫＣ−θプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、２４時間後の蛍光強度を、エンスパイア２３００マルチラベルリーダー（パーキンエルマー社）を用いて判定した。ＣＦＰを４３２ｎｍで励起し、得られた４８５ｎｍで発光する蛍光強度を測定した。ＹＦＰを４８５ｎｍで励起し、得られた５４０ｎｍで発光する蛍光強度を測定した。ＦＲＥＴシグナルを４３２ｎｍで励起し、得られた５４０ｎｍで発光する蛍光強度を測定した。

増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）：アルファスクリーン・結合アッセイを、全体積２０μｌで、ウェル３８４個の白色プロキシプレート（パーキンエルマー社、米国マサチューセッツ州ボストン）内で行った。アルファスクリーンＦｌａｇ検出キットは、パーキンエルマー・ライフ・サイエンス社から入手可能である。アルファスクリーン・ドナービーズはＦｌａｇとして供給され、アクセプタービーズは抗Ｍｙｃ抗体に結合される。精製Ｆｌａｇ−ＧＬＫとｍｙｃ−ＰＫＣθ、またはＦｌａｇ−ＳＬＰ−７６とｍｙｃ−ＧＬＫとを、ウェル３８４個のプレート（５μｌ／ウェル）中で混合した。ＨＥＫ２９３Ｔ形質転換体を用いる場合には、ウェル毎に０．２μｇの溶解物を加えた。アクセプタービーズ（５μｌ／ウェル）を加えて３０分培養した。その後、ドナービーズ（５μｌ／ウェル）を加え、３時間培養した。ＡＬＰＨＡシグナルを、エンビジョン・マルチラベル・リーダー（パーキンエルマー・ライフ・サイエンス社）によって判定した。ドナービーズおよびアクセプタービーズの最終濃度は、２０μｇ／ｍｌであった。全ての希釈物はＨＥＰＥＳ緩衝液中で生産した（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５ｍＭ ＤＴＴ）。

ＧＬＫ過剰発現は、癌および転移と関連し、このＧＬＫの介在した癌および転移は、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）とは関係がないことが見出された。本発明は、癌予後バイオマーカおよびＧＬＫ介在疾患治療の標的として有用な、ＧＬＫ−ＰＫＣ−θ−ＩＫＫ−ＮＦκＢ−ＩＬ−１７シグナル伝達経路の発見に関する。

１つの態様では、本発明は、胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ）介在疾患を治療する治療薬を同定する方法に関する。上記方法は、試験化合物によってＧＬＫの介在したシグナル伝達の変調を検出するステップを備え、係るステップは、以下のａ）〜ｄ）のいずれかと、ｅ）とを有する。
ａ）試験化合物の存在下でＧＬＫ発現細胞を培養するステップであって、前記変調は、ＧＬＫ転写産物もしくはＧＬＫタンパクの発現レベル、生産されるＩＬ−１７Ａの量またはＮＦ−κＢの活性を測定することにより検出される細胞培養ステップ。
ｂ）試験化合物の存在下で、ＧＬＫタンパクをこれらの基質とＡＴＰの存在で反応させる反応ステップであって、前記変調は、生産されるＡＤＰの量、消費されるＡＴＰの量および／またはリン酸化される基質の量を測定することにより検出される反応ステップ。
ｃ）試験化合物の存在下でＧＬＫ発現癌細胞を培養する癌細胞培養ステップであって、前記変調が、前記癌細胞の転位／浸潤／創傷治癒を測定することにより検出される癌細胞培養ステップ。
ｄ）試験化合物の存在下でＧＬＫタンパクをこれらの基質タンパクと相互作用させる相互作用ステップであって、前記変調は、ＧＬＫタンパクと基質タンパクとの間の相互作用を測定することにより検出される相互作用ステップ。
ｅ）試験化合物の存在下で前記変調を対照と比較して、ＧＬＫ介在疾患を処理する治療薬を同定する、比較ステップ。

ＧＬＫタンパクと基質タンパク（ＰＫＣ−θタンパク等）との間の相互作用は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイまたは増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイを用いて測定してもよい。

上記ステップｄ）では、基質はＰＫＣ−θタンパクを含んでもよく、ＧＬＫタンパクおよびＰＫＣ−θタンパクが、互換性を持つ異なる蛍光プローブで標識される。そのうち一方の蛍光プローブは、蛍光励起し、他方の蛍光プローブよりも高い発光波長を備える。前記変調との関連性は、より高い蛍光発光波長における変化により検出される。

ＡＴＰは、非放射性でもよいし、ラジオアイソトープで標識されてもよい。ＧＬＫタンパクと基質との相互作用は、細胞内に、または試験管中にインビトロで、生じることもできる。ＧＬＫ介在疾患は、自己免疫性疾患と、炎症性疾患と、癌と、癌転移とからなる群より選択されてもよい。基質は、ＰＫＣ−θタンパクと、ミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）とからなる群より選択されてもよい。試験化合物は、ＲＮＡｉ分子と、ｍｉｃｒｏＲＮＡと、アンチセンス分子と、小有機分子とからなる群より選択されてもよい。ＧＬＫ発現細胞は、ＧＬＫ発現Ｔ細胞を含んでもよく、および／またはＧＬＫ発現癌細胞は、ＧＬＫ発現肺癌細胞を含んでもよい。ＧＬＫ発現細胞は、ＧＬＫ−過剰発現Ｔ細胞等のＧＬＫ−過剰発現細胞を含んでもよく、および／または、ＧＬＫ発現癌細胞は、ＧＬＫ−過剰発現肺癌細胞等のＧＬＫ−過剰発現癌細胞を含んでもよい。

自己免疫性疾患は、全身性エリテマトーデスと、慢性関節リウマチと、成人発症型スティル病と、グレーブス病と、シェーグレン症候群と、強直性脊椎炎と、神経脊髄炎と、自己免疫性脳脊髄炎と、脱毛症とからなる群より選択されてもよい。癌は、肺癌と、食道癌と、膠芽細胞腫と、膵臓癌と、乳癌と、肝癌とからなる群より選択されてもよい。本発明の一実施形態では、癌は、一種のＧＬＫタンパク介在癌であり、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）タンパクから独立したものである（または無関係である）。

別の態様では、本発明は、胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ）介在疾患の存在および／または重症度を検出する方法に関する。ＧＬＫ介在疾患の存在および／または重症度を検出するステップは、肺癌等の癌の予後を判定するステップを備えてもよい。前記方法は、以下のステップ、ａ）ＧＬＫ介在疾患または癌を有すると疑われる被験者から、Ｔ細胞または癌細胞を備えるサンプルを採取する採取ステップと、ｂ）Ｔ細胞または癌細胞中のＧＣＫ類似キナーゼ（ＧＬＫ）の発現レベルを測定する測定ステップと、ｃ）ＧＬＫ介在疾患の存在および／または重症度を判定する判定ステップとを含み、対照中のＧＬＫの発現レベルと比較したときにおけるＴ細胞または癌細胞中のＧＬＫ発現レベルの増加分は、被験者がＧＬＫ介在疾患を発症または保有するリスクを有している、または癌の再発および／または転移のリスクを有していることを示している。前記判定ステップは、癌の予後を判定するステップを備えていてもよい。

前記測定ステップは、Ｔ細胞中のＧＬＫタンパクの発現レベルを測定するステップを含んでいてもよく、免疫ブロッティング分析、フローサイトメトリー分析、および／または免疫組織化学によって行われる。あるいは、測定ステップは、ＧＬＫ転写産物の発現レベルを測定するステップを含んでいてもよく、このステップはさらに、測定されたＧＬＫ転写産物の発現レベルをハウスキーピング遺伝子に対して補正して、ＧＬＫ転写産物の補正された発現レベルを得ることを含んでいてもよい。
本発明の一実施形態では、癌細胞中のＧＬＫの発現レベルの増加は、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）タンパクとは無関係である。

本発明の範囲を限定する意図なしで、本発明の実施形態に従った例示的な機器、装置、方法およびそれらの関連した結果が下記に与えられる。読者の便宜のため、タイトルまたはサブタイトルを実施例で使っているが、これは本発明の範囲を決して限定するものではないことが注記される。さらに、特定の理論がここに提案され開示されるが、それが正しいか誤りかに関係なく、本発明が行われる限り、あらゆる特定の理論または作用の方式にかかわらず、本発明の範囲は限定されない。

Ｉ．ＧＬＫは、Ｔ細胞中のＰＫＣ−θを活性化することにより自己免疫およびＮＦ−κＢシグナル伝達を制御する。

［方法および材料］
（ＧＬＫ欠損マウス）
ＧＬＫノックアウト（クローンＲＲＯ２７０）による１２９マウス胎生期ステム細胞クローンをＥＵＣＯＭＭから購入し、これを、台湾のゲノム医学国家研究計画におけるトランスジェニック・マウス・モデル・コアにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６の尾胞に注入して、キメラマウスを生成した。全ての動物実験は、国立衛生研究所でＩＡＣＵＣに承認されたプロトコルに従って遂行された。

（患者および健常対照者）
米国リウマチ学会基準に基づき、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）と診断される４９人の患者につき、研究を行った。全ての患者は、台中退役軍人総合病院（ＴＶＧＨ：Ｔａｉｃｈｕｎｇ Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）のアレルギー・免疫学・リウマチ学部門に付託された。３５人の健康な個人が、対照者として登録された。この研究は、ＴＶＧＨの治験審査委員会に承認され、書面にした告知に基づく同意を全ての個人から得た。

（抗体、プラスミドおよび精製タンパク）
抗マウスＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）および抗ヒトＣＤ３ε（ＯＫＴ３）が、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーによりマウス腹水から精製された。ＧＬＫ、ＨＰＫ１、ｐ−Ｅｒｋ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、Ｅｒｋ、ｐ−ＳＬＰ−７６（Ｓ３７６）およびＳＬＰ−７６に対する抗体が、個々のペプチドでウサギに免疫性を与えることによって生成された。抗ｐ−ＰＫＣ−θ（Ｔ５３８）抗体および抗ｐ−ＰＫＣ−θ（Ｓ６９５）抗体は、アップステートバイオテクノロジー社から入手した。抗ＰＫＣ−θ（Ｃ−１９）抗体、抗ｐ−ＰＫＣ−θ（Ｓ６７６）抗体、抗Ｖａｖ１（Ｄ−７）抗体、抗Ｖａｖ２（Ｅ−１２）抗体および抗Ｖａｖ３（Ｋ−１９）抗体は、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社から入手した。抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体、抗Ｍｙｃ抗体、抗ＨＡ抗体および抗チューブリン抗体は、ＳＩＧＭＡ社から入手した。抗ｐ−ＩＫＫ（Ｓ１８１）抗体、抗ｐ−ＰＤＫ１（Ｓ２１４）抗体、抗ＩＫＫ抗体および抗ＰＤＫ１抗体は、セルシグナリング社から入手した。細胞内染色用の抗ｐ−ＰＫＣ−θ（Ｔ５３８）（１９／ＰＫＣ）抗体は、ＢＤファ−ミンゲン社から入手した。抗ｐ−ｍＴＯＲ抗体および抗ｍＴＯＲ抗体は、アブカム社から入手した。

ＧＬＫ、ＧＬＫキナーゼデッド（ＫＤ：ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）変異およびＦｌａｇ−ＳＬＰ−７６に対する発現プラスミドは、前述の通りである。ＭｙｃタグＰＫＣ−θ、ＨＡタグＧＬＫおよびＧＦＰタグＧＬＫは、個々の相補ＤＮＡを、ｐＣＭＶ６−ＡＣ−Ｍｙｃ、ｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＨＡ、およびｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰ（オリジーンテクノロジー社）にそれぞれサブクローニングすることにより構築された。ｓｈＲＮＡプラスミドは、国立ＲＮＡｉコア設備によって作られた。ＮＦ−κＢリポータープラスミド（ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ）および標準化されたプラスミド（ｐＲＬ−Ｔｋ）をプロメガ社から購入した。

インビトロでの結合アッセイのため、Ｆｌａｇ−ＧＬＫトランスフェクションＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＦｌａｇ−ＳＬＰ−７６トランスフェクションＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、精製ＧＬＫおよびＳＬＰ−７６をそれぞれ分離し、その後、Ｆｌａｇペプチド溶出を行った。Ｓｆ９昆虫細胞中のかん状ウイルスから発現される精製組み換え型ＧＳＴ−ＰＫＣ−θを、シグナルケム社より購入した。

（過渡的導入およびＴ細胞活性化）
過渡的導入アッセイのため、ネオン移入システム（インビトロジェン社）を使って細胞を導入した。個々の細胞系または一次細胞の具体的な設定は、以下の通りである：ジャーカットＴ細胞およびＪ１４細胞系では、１４２０Ｖ、継続時間３０ミリ秒、１パルス；ＥＬ４細胞では、１０８０Ｖ、継続時間５０ミリ秒、１パルス；プライマリーＴ細胞では、２０００Ｖ、継続時間２０ミリ秒、２パルス。Ｔ細胞活性化を誘発するため、Ｊ−ＴＡｇおよびＥＬ４細胞を、抗ＣＤ３抗体５μｇ／ｍｌを用いて、示した時間、３７℃で刺激した。プライマリーＴ細胞活性化を誘発するため、３×１０⁶個の精製Ｔ細胞を、抗ＣＤ３−ビオチン（５００Ａ２；ｅバイオサイエンス社）３μｇ／ｍｌおよびストレプトアビジン（シグマ社）３μｇ／ｍｌを用いて刺激した。

（インビトロ・キナーゼ・アッセイ）
抗Ｆｌａｇアガロースビーズを用いて、刺激されないまたは抗ＣＤ３刺激を行ったジャーカットＴ細胞またはＪ−１４細胞の溶解物（８０μｇ）から、Ｆｌａｇ−ＧＬＫを免疫沈降した。抗Ｆｌａｇ免疫沈降物を、細胞溶解緩衝液により３回洗浄した後、さらにキナーゼ緩衝液により１回洗浄し、または、Ｆｌａｇ−ＧＬＫの精製用のＦｌａｇペプチド溶出液にさらした。抗Ｆｌａｇ−ＧＬＫビーズまたは精製Ｆｌａｇ−ＧＬＫを、キナーゼ緩衝液３５μｌ中［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ１０μＣｉの存在下または不存在下で、コールドＡＴＰ５００μＭ、ミエリン塩基性タンパク４μｇと共に、４０分室温で培養した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により分離した。免疫ブロット分析によって、基質のリン酸化を検出した。または、放射標識されたリン酸塩の基質への導入により検出した。これをタイフーン級スキャナー（ＧＥ）によって定量した。

（フローサイトメトリー分析）
ＰＭＡとイオノマイシンで細胞を２時間刺激し、ゴルジストップ（登録商標）でさらに２時間処理した。細胞を採取し、コ−ルドＰＢＳで洗浄し、その後、示された抗体で、氷上で３０分染色した。臨床のサンプル分析のため、別の刺激なしでＰＢＬを直ちにゴルジストップで処理し、その後、室温で、抗表面マーカで染色した。細胞内染色のため、ＰＢＬを、サイトフィクス／サイトパーム緩衝液（ＢＤバイオサイエンス）２００μｌ中で２時間透過処理し、パームウォッシュ緩衝液で洗浄し、その後、抗体（１：５０希釈物）中で２時間培養した。以下の抗体を染色に用いた：抗ｍＣＤ３−ＡＰＣ（１４５−２Ｃ１１）抗体、抗ｍＣＤ３−ＦＩＴＣ（１４５−２Ｃ１１）抗体、抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥ（１５０Ｄ）抗体、抗ＩＦＮγ−ＦＩＴＣ（ＸＭＧ１．２）抗体、抗ＩＬ−４−ＰＥ（１１Ｂ１１）抗体および抗ＩＬ１−１７Ａ−ＰＥ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０．１）抗体を、バイオレジェンド社から購入した。抗ｍＣＤ４−パシフィックブルー（ＲＭ４−５）抗体、抗ｈＣＤ３−ＰＥＣｙ７（ＳＫ７）抗体、および、抗ｈＣＤ１９−ＰＥ（ＳＪ２５Ｃ１）抗体を、ＢＤファーミンゲン社から購入した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス）を用いてデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を行った。

（インビボＴ細胞介在の免疫応答およびＥＡＥの誘起）
各々の実験に使われるマウスは、６〜１０週齢の性が一致する同腹子であった。免疫性を与えられたマウスからの抗原特異的な（ＫＬＨ）抗体、ＴＨ¹およびＴＨ²サイトカインの生産は、前記の通り測定された。ＥＡＥの誘起は、前記のよう行われた。

（インビトロＴ細胞分化アッセイ）
ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-細胞を、マウスのリンパ節から精製した。細胞（２．５×１０⁵）を、抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）抗体および抗ＣＤ２８（３μｇ／ｍｌ）抗体と共に、コーティングした４８個のウェルのプレート内の５００μｌ培地中で培養した。Ｔｒｅｇ分化のため、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β抗体、２．５μｇ／ｍｌの抗ＩＬ４抗体、および２．５μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γ抗体を含む培地で培養した。ＴＨ１７分化のため、細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２３、５μｇ／ｍｌの抗ＩＬ４抗体および５μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γ抗体を含む培地で培養した。ＴＨ１分化のため、細胞を、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２および１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ４抗体を含む培地中で培養した。ＴＨ２分化のため、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４および１μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γ抗体を含む培地中で培養した。

（インビトロ抑制アッセイ）
マウスＣＤ４⁺Ｔ細胞を、マウスの脾臓およびリンパ節からネガティブに選択した。精製の第２ラウンドでは、マウスＣＤ２５に対して磁力結合型抗体を用いて、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を、ＣＤ４⁺Ｔ細胞から分離した。Ｔｒｅｇ細胞を、ＣＤ３⁺Ｔ細胞（終末濃度は２ｘ１０５個の細胞／５００μｌ）に加え、その後、抗ＣＤ３抗体で７２時間刺激した。

（統計的方法）
Ｐ値を、スチューデントのｔ検定によって判定した。臨床サンプルに由来するデータの分析のため、ピアソン相関（ｒ）を最初に使用した。臨床サンプルのフロー・サイトメトリー・データに対する単回帰を用いて、ＧＬＫ発現Ｔ細胞のパーセンテージとＳＬＥ患者のＳＬＥＤＡＩとの間に統計学的に高い相関が示された。

［結果］
・ＧＬＫは、直接にＰＫＣ−θをリン酸化して活性化する。
我々は、ジャーカットＴ細胞中のＧＬＫ過剰発現またはＧＬＫ ｓｉＲＮＡノックダウンに続いて抗ＣＤ３刺激を行うことにより、ＴＣＲシグナル伝達におけるＧＬＫの役割を研究した（図１ａおよび図６）。ジャーカットＴ細胞における抗ＣＤ３−誘発ＮＦ−κＢ活性およびＩＫＫリン酸化（ＥｒｋまたはｍＴＯＲ活性はない）は、ＧＬＫ ｓｉＲＮＡまたはＧＬＫのキナーゼデッド（ＫＤ）変異によって抑制され、また、ＧＬＫ過剰発現により促進された（図１ａおよび図７ａ，ｂ）。さらに、ＧＬＫキナーゼ活性は、１分でＴＣＲシグナル伝達によって誘発され、３０分でピークに達した（図７ｃ）。これらの発見は、ＧＬＫがＴＣＲ−誘発ＮＦ−κＢ活性化に関与することを示唆するものである。ＳＬＰ−７６がＥｒｋおよびＩＫＫ経路の両方を調節するため、ＳＬＰ−７６は、ＧＬＫの標的ではないと考えられていた。したがって、我々は、ＰＫＣ−θの活性化に対するＧＬＫの効果の試験を行い、ＴＣＲシグナル伝達において、ＩＫＫ−ＮＦ−κＢの上流側およびＳＬＰ−７６の下流側で重要な調節因子であることを試験した。ＰＫＣ−θリン酸化は、ＧＬＫによって調節されるため、我々は、ＰＫＣ−θをターゲットとすることにより、ＧＬがＫＩＫＫ−ＮＦ−κＢ経路を活性化したかどうかの試験を行った（図７ｄ）。ＰＫＣ−θ ｓｉＲＮＡノックダウンは、抗ＣＤ３刺激によるＧＬＫ−誘発ＮＦ−κＢの活性化を無効化するので、ＧＬＫがＰＫＣ−θを標的とすることでＮＦ−κＢ活性化を誘発することが示された（図７ｅ）。

Ｔ細胞シグナル伝達中に、ＧＬＫが直接にＰＫＣ−θをリン酸化・活性化できるか否かを調べるため、共同免疫沈降アッセイを用いてＴＣＲシグナル伝達中にＧＬＫがＰＫＣ−θと相互作用したか否かを、我々は調べた。ＣＤ３刺激は、プライマリーＴ細胞中で、内因性ＧＬＫとＰＫＣ−θとの間の相互作用を誘発し、ＧＬＫ−ＰＫＣθ相互作用は、ＰＫＣ−θ活性化を伴発した（図１ｂ）。ＨＥＫ２９３Ｔ、ジャーカットおよびＥＬ４細胞系を用いた時も、同様の結果が観測された（図８ａ〜ｃ）。精製ＧＬＫタンパクおよびＰＫＣ−θタンパクの結合アッセイを用いて、ＧＬＫとＰＫＣ−θとの間の直接の相互作用が、インビトロでさらに実証された（図１ｃ）。ＧＬＫによってＰＫＣ−θリン酸化の部位を判定するため、我々は、ＰＫＣ−θの３つ主要なリン酸化部位であるＴ５３８、Ｓ６７６およびＳ６９５４でＰＫＣ−θリン酸化の試験を行った。Ｔ５３８リン酸化は、ＰＫＣ−θキナーゼ活性化およびそれ以降のＮＦ−κＢ活性化に最も重要なものである。免疫沈降Ｆｌａｇ−ＧＬＫおよびＭｙｃ−ＰＫＣ−θを用いたインビトロ・キナーゼ・アッセイでは、ＧＬＫは、Ｔ５３８でＰＫＣ−θをリン酸化したが、Ｓ６７６またはＳ６９５ではリン酸化しなかった（図１ｄ）。

精製ＧＬＫタンパクおよびＰＫＣ−θタンパクを用いたインビトロ・キナーゼ・アッセイでは、ＰＫＣ−θ−Ｔ５３８は、ＧＬＫによって直接にリン酸化された（図１ｅ）。これらを一緒に解釈すれば、我々の結果は、ＧＬＫは直接にＰＫＣ−θと相互作用し、ＴＣＲシグナル伝達中はＴ５３８でＰＫＣ−θをリン酸化することを示した。

・ＳＬＰ−７６は、ＧＬＫの直接の上流側調節因子である
ＳＬＰ−７６は、Ｔ細胞中の重要な骨格タンパク質であり、ＴＣＲ−誘発ＰＫＣ−θ−ＩＫＫの活性化に必要である。我々は、ＳＬＰ−７６がＴＣＲシグナル伝達中のＧＬＫの直接の上流側調節因子であったかどうかを問うた。ＣＤ３刺激は、プライマリーＴ細胞中の内因性ＧＬＫとＳＬＰ−７６との間の相互作用を誘発した（図２ａ）。ＳＬＰ−７６−ＧＬＫ相互作用は、ＧＬＫ−ＰＫＣ−θ相互作用およびＰＫＣ−θ活性化に先行した。同様の結果が、ジャーカットおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて観測された（図９ａ〜ｃ）。さらに、ＳＬＰ−７６とＧＬＫとの間の相互作用は、チロシンリン酸化を通して介在された（図９ｄ）。精製ＧＬＫおよびＳＬＰ−７６を使ったインビトロでの結合アッセイでは、これらの２つのタンパクの間の直接の相互作用が実証された（図２ｂ）。次に、ＳＬＰ−７６がＧＬＫの活性化に必要か否かにつき、我々は調べた。ＣＤ３刺激によって誘発したＧＬＫキナーゼ活性は、ＳＬＰ−７６−欠損Ｊ１４細胞（図２ｃ）およびＳＬＰ−７６ ｓｈＲＮＡトランスフェクションジャーカット細胞（図２ｄ）では無効化されていた。過去の報告によれば、Ｖａｖ１がＳＬＰ−７６と関連しＰＫＣ−θ転位に関連することが示されており、Ｖａｖ１がＰＫＣ−θ活性化を制御することが示唆される。したがって、Ｖａｖ１がＧＬＫ活性化を調節したか否かを、我々は調べた。しかしながら、ＴＣＲ誘発ＧＬＫキナーゼ活性化は、Ｖａｖ１ ｓｈＲＮＡノックダウンによっては、影響を受けなかった（図９）。これらのデータは、ＴＣＲシグナル伝達中、ＧＬＫキナーゼ活性化の調節におけるＶａｖ１の関与を排除するものだった。また、別のＭＡＰ４Ｋ、すなわち、ＨＰＫ１についても、ＳＬＰ−７６によって活性化し、次いで、ＳＬＰ−７６−Ｓ３７６リン酸化を誘発することにより、このＳＬＰ−７６活性化を負に調整したため、ＳＬＰ−７６の負のフィードバック調節にＧＬＫが役割を果たしているか否かにつき、我々は検討を行った。ＳＬＰ−７６−Ｓ３７６リン酸化は、ＨＰＫ１のみにより誘発され、ＧＬＫには誘発されなかった（図２ｅ）事実は、ＧＬＫはＳＬＰ−７６を負に調整するためのフィードバックに関与しないことを示唆するものである。これらの発見は、ＴＣＲシグナル伝達中、ＳＬＰ−７６は直接に相互作用しＧＬＫを活性化することを示すものである。

・ＧＬＫは、インビボにＴ細胞介在の免疫応答を制御する
インビボにおけるＧＬＫの役割を研究するため、我々は、ＧＬＫ欠損マウスを生成した（図１１ａ，ｂ）。Ｔ細胞は、ＧＬＫ欠損マウス中、正常に発育した（図１１ｃ−ｅ）。プライマリーＴ細胞中において、ＴＣＲシグナル伝達のＧＬＫ欠損の効果を研究した。我々の過去の観測（図１）と合致した点としては、ＣＤ３（図３ａ）またはＣＤ３−ＣＤ２８共同刺激（図３ｂ）では、ＧＬＫ欠損Ｔ細胞中、ＰＫＣ−θおよびＩＫＫのリン酸化が無効化されていたことが挙げられる。これとは対照的に、ＥｒｋおよびＰＤＫ１活性化は、ＧＬＫ欠損（図３ｂ）に影響を受けなかった。

また、Ｃａ２⁺シグナル伝達に加えて、Ｌｃｋ、ＬＡＴおよびＰＬＣγ１のリン酸化は影響を受けなかった（図１１ｆおよび図８ｃ）。ＮＦ−κＢシグナル伝達がＴ細胞増殖を調節することから、我々は、［³Ｈ］チミジン取込みおよびＣＦＳＥダイ希釈アッセイを用いて、Ｔ細胞増殖へのＧＬＫの効果を研究した。ＧＬＫ欠損が大いに阻害するＴ細胞増殖は、ＣＤ３刺激により誘発された増殖であり、ＰＭＡとイオノマイシン刺激によって誘発された増殖ではない（図３ｄ，ｅ、図１１ｇ）。ＰＭＡおよびイオノマイシンが近接ＴＣＲシグナル伝達をバイパスするので、この結果は、ＧＬＫ活性がＴＣＲ近接シグナリング錯体によって誘発されることを示唆している。さらに、ＧＬＫ欠損Ｔ細胞の細胞増殖の低下は、異所的に発現されたＧＬＫによって救われた（図３ｆ）。これらのデータは、ＧＬＫが、Ｔ細胞増殖にとって重要であることを実証するものである。

我々は次に、ＧＬＫがインビボにＴ細胞介在の免疫応答で重要な役割を果たすかどうかを調査した。我々は、ミョウバンをアジュバントとして用い、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ｔ細胞依存抗原で、野生型およびＧＬＫ−欠損マウスに免疫性を与えた。ＫＬＨ免疫性が付与されたＧＬＫ欠損マウスからのＴ細胞の増殖性は、ＫＬＨ再刺激の後、低下した（図４ａ）。さらに、ＧＬＫ欠損マウスからのＫＬＨ再刺激後の脾臓のＴ細胞におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）およびＩＬ−４を含むサイトカインのレベルは、非常に低減し（図４ｂ）、これは、インビボのＴ細胞活性化が損なわれたことを示唆する。また、ＧＬＫ欠損マウスにおいて、最初の免疫化および第２の免疫化後の血清中での抗原特異抗体の生成は、非常に低減された（図４ｃ，ｄ）。これらの結果は、ＧＬＫは、免疫応答および抗体産生の機能を搭載する必要があることを示している。

・ＧＬＫ欠損マウスは、自己免疫に耐性を示す。
実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）は主に、ＩＬ−１７−生成ＣＤ４⁺Ｔリンパ球（Ｔ_H１７）が介在する。ＰＫＣ−θ欠損により、ＥＡＥおよびＴ_H１７応答が改善された。ＧＬＫがＰＫＣ−θを活性化したため、我々は次に、実験的な自己免疫性脳脊髄炎モデルを使うことにより、ＴＨ１７が介在した自己免疫性疾患におけるＧＬＫの役割を研究した。ＧＬＫ欠損マウスは、症状をほとんど示さなかったが、その野性型腹子は、激しい実験的自己免疫性脳脊髄炎を増長させた（図４ｅ）。免疫性を与えられて１４日目のマウスの脳および脊髄の中の、浸潤性リンパ球中におけるＴＨ１７細胞のパーセンテージは、ＧＬＫ欠損マウスでは、非常に低かった（図４ｆ）。さらに、血清中のＩＬ−１７の滴定量は、ＧＬＫ欠損マウスでは、非常に低かった（図４ｇ）。ＧＬＫ欠損マウスにおけるＴＨ１７応答の欠陥がＴ細胞固有の効果であるか否かを調べるため、我々は、ＧＬＫ欠損未感作Ｔ細胞のインビトロＴＨ１７分化能を測定した。一貫して、ＴＨ１およびＴＨ２細胞に加えてＴＨ１７細胞のインビトロ分化は、ＧＬＫ欠損によって低減された（図４ｈおよび図１２）。インビトロＴｒｅｇ分化は、ＧＬＫ欠損によって影響を受けなかった（図１２）が、ＧＬＫ欠損Ｔｒｅｇ細胞は、インビトロでより高い活性抑圧を示した（図４ｉ）。これらの結果は、インビボのＧＬＫ欠損は、ＴＨ１７が介在した自己免疫性疾患の進展からマウスを保護することを示す。欠損ＴＣＲシグナル伝達およびＴＨ１７分化は、ＧＬＫ欠損Ｔ細胞中に増加したＴｒｅｇ機能と共に、ＧＬＫ欠損マウス耐性に対して、重要な役割を果たすことができる。

・ヒトＳＬＥ中におけるＧＬＫ誘発ＰＫＣ−θの活性化
ヒト自己免疫性疾患全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）において、ＴＨ１７の介在した炎症は重要な役割を果たしている。ＧＬＫ欠損マウスにおいて、自己免疫誘起およびＴＨ１７応答が低減し、ＧＬＫがＰＫＣ−θ−ＩＫＫ経路を活性化しているため、我々は、ＧＬＫ−ＰＫＣ−θ−ＩＫＫ−ＩＬ−１７カスケードがヒトＳＬＥに関与するか否かを研究した。我々は、ＳＬＥ患者４９人および３５人の対になる健常対照者から分離された末梢血白血球（ＰＢＬ）中におけるＧＬＫ発現およびＰＫＣ−θ−ＩＫＫ活性化を検討した（図１３ａ）。フローサイトメトリー分析によれば、ＳＬＥ患者の新たに分離されたＰＢＬからの、Ｂ細胞でなく、ＧＬＫ発現Ｔ細胞の、パーセンテージが大きく増加したことが示された（図５ａ）。ＧＬＫ発現Ｔ細胞のパーセンテージは、ＳＬＥ疾患活動性度指数（ＳＬＥＤＡＩ）と相関した（図５ｂ；ピアソン相関係数：ｒ＝０．７７３）。特に、ＧＬＫ表現（ＧＬＫ⁺）Ｔ細胞が高パーセンテージ（≧２１％）のＳＬＥ患者の３分の１（１６／４９）は、ＧＬＫが通常範囲の患者と比較して（ｒ＝０．４５１；表１）、より高い相関を示した（ｒ＝０．８０７、図５ｃ、表１）。また、ＳＬＥ患者のＧＬＫタンパク発現の量は増加した（図５ｄ）。これらの結果は、ＧＬＫ過剰発現が、３０％の患者のＳＬＥ発病に関与したことを示唆するものである。表１は、ＳＬＥＤＡＩとＳＬＥ患者の別々の部分集合から得たＧＬＫ⁺Ｔ細胞のパーセンテージとの間の相関の比較を示す。
ＳＬＥおよび低ＧＬＫ⁺Ｔ細胞をもつ人（＜２１％）に対し、調整された回帰相関係数は、ｒ２＝０．１７７、Ｐ値＝０．００８５０３。

我々は次に、ＳＬＥ患者からのＴ細胞におけるＧＬＫ過剰発現が、ＰＫＣ−θ−ＩＫＫ活性化を誘発したか否かにつき調べた。リン酸−ＰＫＣ−θまたはリン酸−ＩＫＫ陽性Ｔ細胞のパーセンテージは増加し、およびＳＬＥ患者からのＴ細胞中、ＧＬＫ発現と共に染色した（図５ｅ）。同様に、免疫ブロット分析は、ＳＬＥ患者におけるＰＫＣ−θ−ＩＫＫ活性化の誘起を示した（図５ｄ）。これらのデータは、ＧＬＫが、ＳＬＥ患者からのＴ細胞において、ＰＫＣ−θを活性化することを示唆するものである。ＴＮＦでなくＩＬ−６でもなく、ＩＬ−１７の力価が、ＳＬＥ患者の血清中に増加した（図８ｂ）。これらの結果は、Ｔ細胞中のＧＬＫ過剰発現が、狼瘡患者の自己免疫発病を促進することを示唆するものである。したがって、ＧＬＫは、Ｔ細胞中のＰＫＣ−θの直接活性化による自己免疫性疾患の重要な正調節因子である。

［検討］
我々の研究の重要な発見は、ＧＬＫが、ＴＣＲシグナル伝達中にＴ５３８でＰＫＣ−θを直接にリン酸化するキナーゼとして、認定されたことである。活性化ループ内の残留物Ｔ５３８におけるＰＫＣ−θリン酸化は、Ｔ細胞中のＮＦ−κＢ活性化にとって必須である。ＧＬＫ誘発ＰＫＣ−θ−ＩＫＫリン酸化は、ＰＤＫ１活性化およびＣＤ２８の相互刺激に関係無く、これは、ＧＬＫ機能がＰＤＫ１活性化とは無関係であることを示唆する。これらのデータは、ＧＬＫが、ＴＣＲシグナル伝達中にＰＫＣ−θのすぐ上流側のキナーゼとして機能することを明示するものである。

インビトロＴ細胞分化アッセイの結果は、ＧＬＫは、Ｔヘルパー細胞の分化に対して、固有のポジティブな役割を果たすことをさらに示している。ＧＬＫがＴヘルパー細胞分化を調節するメカニズムは、依然として解っていない。しかしながら、ＴＨ１、ＴＨ２およびＴＨ１７のインビトロ分化は全て、ＧＬＫ欠損によって低減し、これは、ＧＬＫが、別のＴヘルパー分化経路に対して別のサイトカインシグナル伝達経路を調節する代わりに、通常のメカニズム（例えば、ＴＣＲシグナル伝達またはＩＬ−２生成を増加）によりＴヘルパー細胞分化を調節してもよいことを示唆するものである。

ＧＬＫのインビボの役割についての我々の研究は、ＧＬＫが、最適のＴ細胞免疫応答および抗体産生に必要であることを実証するものである。ＧＬＫ欠損マウスへの最初の免疫化および第２の免疫化の後に生じた、抗原特異抗体生成の低減に加えて、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ（ＴＨ１サイトカイン）およびＩＬ−４（ＴＨ２サイトカイン）等のＴ細胞分泌サイトカインの減少は、ＰＫＣ−θ欠損Ｔ細胞に対して報告される欠損と同様である。また、ＥＡＥ誘起に対するＧＬＫ欠損マウスの耐性およびＴＨ１７応答の低下は、ＰＫＣ−θ欠損マウスの表現型に合致している。胸腺の天然Ｔｒｅｇの数は、ＧＬＫ欠損マウスでは影響を受けなかった。しかしながら、ＰＫＣ−θ−ＮＦ−κＢシグナル伝達が損なわれたことが原因で、ＰＫＣ−θ欠損マウス、ＣＡＲＭＡ１欠損マウス、ＢＣＬ１０欠損マウス、またはＩＫＫ２突然変異マウスのＴｒｅｇ数は低減する。ＰＫＣ−θは、例えばＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＬＦＡ−１の刺激または小胞体（ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）応力シグナル伝達等、様々なシグナル伝達経路によって、活性化が可能である。Ｔｒｅｇ発達中に、ＰＫＣ−θ−ＮＦ−κＢシグナル伝達がどのように活性化されるかは、依然として不明である。我々のデータによれば、ＧＬＫが、別の既知のリン酸化部位（例えばＳ６７６およびＳ６９５）でなく、Ｔ５３８残留物をリン酸化することにより、ＰＫＣ−θを活性化することが示される。おそらく、ＧＬＫは、キナーゼを活性化する唯一のＰＫＣ−θではない。したがって、ＰＫＣ−θ−ＣＡＲＭＡ１−ＢＣＬ１０−ＩＫＫ２の活性化は、Ｔｒｅｇ中の別のキナーゼによっても可能であるであろうと考えられ、ＧＬＫ欠損マウス中のＴｒｅｇの数を正常な値にすることができる。Ｔｒｅｇの数は、ＧＬＫ欠損マウスでは影響を受けなかったが、Ｔｒｅｇ活性は、ＧＬＫ欠損によって増加した。ＰＫＣ−θは、Ｔｒｅｇが介在した抑制に対して負の役割を有する。これらをまとめれば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７およびＴｒｅｇ細胞を調節することに対してのＧＬＫの役割は、ＰＫＣ−θの役割と実質的に合致し、これは、ＧＬＫはおそらくＴＣＲシグナル伝達に対してのＰＫＣ−θの唯一のアクティベーターであるという仮説を支持するものである。

また、この研究では、ＳＬＥ患者の末梢血Ｔ細胞中でＧＬＫ発現が誘発され、これは疾患重症度と正に相関したことを、我々は報告するものである。また、ＳＬＥ患者から分離されるＧＬＫ過剰発現によるＴ細胞は、ＰＫＣ−θ−ＩＫＫ活性化の上昇を示し、これは、ＧＬＫ−ＰＫＣ−θ−ＩＫＫ経路の活性化は、ＳＬＥ発症を制御することを示唆するものである。これは、ＳＬＥ患者のＴ細胞中のＧＬＫ過剰発現およびＰＫＣ−θ−ＩＫＫ過反応を最初に例証するものである。ＳＬＥ患者中の血清ＩＬ−１７の上昇は、過去の報告にも合致している。血清ＩＬ−１７とＳＬＥＤＡＩとの間の相関と比較すると（ピアソン相関係数：ｒ＝０．４１）、ＧＬＫとＳＬＥＤＡＩ（ｒ＝０．７７３）との間の相関は、非常に高く、また顕著である。これらをまとめれば、我々の発見は、ＧＬＫが、自己免疫発病学で重要な役割を果たし、ＳＬＥの進行についての新しい診断バイオマーカとしての役目を果たすことができることを示し、さらに、ＧＬＫおよびその下流ＰＫＣ−θ−ＩＫＫシグナル伝達の抑制が、新しい治療の戦略をＳＬＥに対して提供することができることを示している。

ＩＩ．慢性関節リウマチの新しいバイオマーカとしてのＴ細胞中のＧＬＫ過剰発現
我々の過去の研究では、ＧＬＫが、Ｔ細胞中のプロテインキナーゼＣ−θ（ＰＫＣ−θ）−ＮＦ−κＢキナーゼの阻害剤（ＩＫＫ）−ＮＦ−κＢのシグナル伝達経路を活性化することにより、自己免疫を制御することを実証した（Ｃｈｕａｎｇほか（２０１１）、「Ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ＧＬＫ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ＮＦ−κＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＣ−θ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ」 Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２（１１）：１１１３−１１１８，この文献の全体が、参照事項として本願に包含される）。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者からのＴ細胞は、疾患重症度によく相関するＧＬＫ過剰発現を示すが、ＲＡ中のＧＬＫの役割は解っていない。

コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）は、破壊性炎症性の関節滑膜炎類似ＲＡを発達させる、広く研究された動物モデルである。ＰＫＣ−θ欠損マウスは、応答の低下をＣＩＡ［１４］に示す。ＩＫＫ−β抑制は、関節炎動物モデル中の骨および軟骨の破壊に有効な処理である。ＰＫＣ−θおよびＩＫＫが炎症性関節炎に重要な役割を果たすため、我々は、コラーゲン免疫性付与マウスおよびヒトＲＡ患者からの臨床のサンプルを用いて、ＲＡ発病に対する上流側キナーゼＧＬＫの役割可能性を調べた。

［材料および方法］
（参加者）
米国リウマチ学会で１９８７年に修正されたＲＡの基準を満たす３０人の患者を登録した。２４人の健康な志願者が、健常対照者の役目を果たした。８人の骨関節炎（ＯＡ：ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および８人のＲＡ患者からの滑膜組織および滑液を得た。この研究プロトコルは、台中退役軍人総合病院の臨床調査倫理委員会で承認されたものである。

（疾患活動性）
赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、および２８関節疾患活動性スコア（ＤＡＳ２８）の血清レベルを、ＲＡ疾患活動性を評価するために使用した。

（ＧＬＫ欠損マウス）
台湾ゲノム医学国立研究プログラムのトランスジェニック・マウス・モデル・コアにおいて、欧州条件変異マウス作成プログラムからのＧＬＫ欠損（ＲＲＯ２７０）を有する１２９マウス胎生期ステム細胞クローンを、マウスラインＣＢ５７Ｌ／６から尾胞に注入して、キメラマウスを発生させた。ＧＬＫ欠損マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで、９世代にわたって戻し交配した。全ての動物実験は、台湾国立衛生研究所の動物実験委員会によって承認されたプロトコルで行われた。

（関節炎の誘起およびスコアリング）
従来説明されているように、ワイドタイプ（ＷＴ）またはＧＬＫ欠損マウスに、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を誘発させた（Ｃａｍｐｂｅｌｌほか（２０００）「Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）ｍｉｃｅ：ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ」 Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（６）：１５６８−１５７５）。１２週齢（０日）のマウスに対し、ニワトリ型ＩＩニワトリコラーゲン／フロインド完全アジュバント乳化物（ＭＤバイオサイエンス社、スイス国チューリッヒ）を含む合計１００μｌのエマルションを、尾部のベースに皮内注射した。同様の注射を、２１日に腹膜内に繰り返した。次いで、以下の臨床のスコアを使い、ＷＴまたはＧＬＫ欠損マウス中の疾患の臨床結果を示した：１＝指の腫れ、２＝紅斑、３＝足／踝の腫れ４＝機能損失。

（血清サイトカインの定量）
ＷＴまたはＧＬＫ欠損マウスおよびＲＡ患者のＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１７Ａの血清レベルを、製造業者（ｅバイオサイエンス社、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）のインストラクションに従い、ＥＬＩＳＡを使って測定した。

（試薬と抗体）
ＧＬＫ抗体は、個々のペプチドでウサギに免疫性を与えることによって生成されている。ウェスタンブロッティングには、抗ｐ−ＰＫＣ−θ（Ｔ５３８）抗体（アップステートバイオテクノロジー社、レークプラシッド、ニューヨーク、米国）を用いた。細胞内染色には、抗ＰＫＣ−θ抗体（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア、米国）を用いた。フローサイトメトリー分析には、抗ｈＣＤ３−ＰＥＣｙ７（ＳＫ７；ＢＤファーミンゲン社、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）抗体、抗ｐ−ＰＫＣβＥ Ｔ５３８（１９／ＰＫＣ；ＢＤファーミンゲン社、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）抗体、および抗ｐ−ＩＫＫ（２６８１Ｓ）（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア、米国）抗体を用いた。ＧＬＫ ｍＲＮＡ検出には、タックマンプローブおよびプライマーセット（アプライドバイオシステム社、フォスター、カリフォルニア、米国）を用いた。

（ウェスタンブロット解析およびフローサイトメトリー分析）
免疫ブロッティング分析に対し、滑液白血球および精製末梢血Ｔ細胞のサンプリングを、過去の文献に基づいて行った（Ｃｈｕａｎｇほか（２０１１）「Ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ＧＬＫ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ＮＦ−κＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＣ−θ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ」．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１１）：１１１３−１１１８、この文献の全体が、参照事項として本願に包含される）。また、前述のように、末梢血および滑液のフローサイトメトリー分析を行った。

（免疫組織化学）
ＲＡ患者およびＯＡ患者の滑膜について、ＧＬＫの免疫染色を行った。パラフィンで包埋した組織を１０分間沸騰し、２分間水で洗浄した。次いで、切片を、予め水素ペルオキシダーゼブロック（サーモサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）で１時間培養し、その後、抗ＣＤ３抗体（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア、米国）および抗ＧＬＫ抗体と共に、４℃で１晩培養した。ＬＶＢｌｕｅ／ＬＶＲｅｄ（マルチビジョンポリマー検知システム、サーモサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）を用いて染色を行った。

（統計的分析）
社会科学用統計学パッケージ（ＳＰＳＳ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｏｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）バージョン１３．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ社、シカゴ、イリノイ、米国）を、統計的分析に用いた。連続する変数の比較には、スチューデントのｔ検定を用いた。変数間の相関を判定するためにはピアソンの相関を用いた。ＲＡ患者のＧＬＫ発現Ｔ細胞とＤＡＳ２８の頻度との間の相関を調べるため、単回帰を用いた。

［結果］
・ＧＬＫ欠損マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎の発育低下
ＧＬＫ欠損マウスでは、Ｔ細胞介在の免疫応答が低下することを、我々は以前に実証した（Ｃｈｕａｎｇほか、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１２（１１）：１１１３−１１１８、この文献の全体が、参照事項として本願に包含される）。炎症性関節炎へのＧＬＫの寄与を調べるため、我々は、ＣＩＡモデルを使い、野生型（ＷＴ）マウスおよびＧＬＫ欠損マウスの自己免疫応答の誘起を研究した。ＷＴマウスは、重いＣＩＡを進行させた一方、ＧＬＫ欠損マウスは、症状を急激に低減させた（図１４Ａ、Ｂ）。炎症性サイトカインは、ＣＩＡ進行中に誘発される。コラーゲン−免疫付与ＧＬＫ欠損マウスのＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１７Ａの血清レベルは、ＷＴマウスと比較して著しく低減したことを、我々は見いだした（図１５Ｃ−Ｅ）。ＧＬＫが炎症性の関節炎に必要であることが、これらの結果から示唆される。

・ＲＡ患者の人口統計学的データおよび臨床の特徴
ＲＡ患者からのＴ細胞中で、ＧＬＫレベルが上昇したか否かを調べるため、ＲＡ患者３０人（女性６６．７％（平均年齢：５０．３＋／−１５．７歳）および健常対照者２４人（女性６２．５％（平均年齢：３３．４＋／−８．３歳）を登録した（表２）。表２は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者および健常対照者（ＨＣ）の人口統計学的データ、臨床の発現および検査所見を示す。

・ＲＡ患者からの精製末梢血Ｔ細胞中におけるＧＬＫ発現の上昇
ウェスタンブロッティングによれば、ＲＡ患者からの精製末梢血Ｔ細胞中で、ＧＬＫのタンパク質レベルが上昇している（図１５Ａ）。ＲＡ患者からの精製Ｔ細胞中のＧＬＫ発現レベルは、健常対照者のＧＬＫ発現レベルに比べて、著しく高かった（１．３＋／−０．８対０．４＋／−０．４、ｐ＝０．０４７、図１５Ｂ）。さらに、ＲＡ患者において、精製末梢血Ｔ細胞中のＧＬＫ ｍＲＮＡレベルは、健常対照者と比較して非常に高かった（１２．３＋／−１８．５対１．０＋／−１．２、ｐ＝０．０２９、図１５Ｃ）。ＧＬＫがＰＫＣ−θを活性化するため、ＧＬＫ誘発ＰＫＣ−θ活性化がＲＡに関与しているか否かにつき、我々は研究した。また、ＰＫＣ−θ活性化は、ＲＡ患者からの末梢Ｔ細胞内で増加した（図１５Ａ）。
＃値は、患者の平均＋／−標準偏差または人数（％）。
スチューデントのｔ検定によって判定されるＨＣ対ＲＡ患者の＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。
ＲＦ：リウマチ因子（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ）；ＣＣＰ：環状シトルリン化ペプチド（ｃｙｃｌｉｃ ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）；ＤＡＳ２８：２８関節疾患活動性スコア；ＥＳＲ：赤血球沈降速度；ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質；ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）；ＮＡ：適用なし。

・ＲＡ滑液および滑膜組織からのＴ細胞中におけるＧＬＫ発現の増加
次に、我々は、ＧＬＫが、ヒトＲＡ患者の滑液の微小環境からのＴ細胞中で発現されたか否かにつき、研究を行った。ウェスタンブロッティングによれば、ＲＡ患者からの滑液白血球中において、ＧＬＫ発現およびＰＫＣ−θ活性化が増加した（図１６Ａ）。フローサイトメトリー分析によれば、ＲＡ患者からの滑液中のＧＬＫ発現ＣＤ３⁺Ｔ細胞の頻度は、ＯＡ患者のそれと比べて非常により高かった（図１６Ｂ）。ＲＡ患者およびＯＡ患者の滑膜組織に対して、抗ＧＬＫ（ブルー）および抗ＣＤ３（茶色）免疫組織化学染色を行った。図１６Ｃに例示されるように、ＧＬＫ発現Ｔ細胞は、ＲＡ患者からの滑膜組織中で増加したが、ＯＡ患者からの滑膜組織では、わずかにしか検出されなかった。

・滑液および末梢血からのＴ細胞中におけるＧＬＫ、ＰＫＣ−θおよびＣＤ３の共局在性
共焦点顕微鏡検査の結果、ＲＡ患者の滑液（図１７Ａ）および末梢血（図１７Ｂ）の両方からのＴ細胞中で、ＰＫＣ−θおよびＣＤ３と共に、ＧＬＫが相互局所化されていることが示された。これにより、ＧＬＫはＴ細胞膜上で活性ＰＫＣ−θと相互作用することが示唆された。

・ＲＡ疾患活動性によるＧＬＫ発現Ｔ細胞頻度の相関
ＲＡ患者の血清ＴＮＦ−α（２７．６＋／−４２．４対５．４＋／−１３．９ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１９）およびＩＬ−１７Ａ（１４．２＋／−１２．１対７．５＋／−４．４ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１５）のレベルは、健常対照者のレベルより高かったが、ＴＧＦ−β（６．５＋／−５．１４対５．２＋／−７．６ ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．５）はそうではなかった（図１８Ａ−Ｃ）。フローサイトメトリーの分析によれば、ＲＡ患者の末梢血Ｔ細では、ＧＬＫ発現、リン酸−ＰＫＣ−θ陽性、およびリン酸−ＩＫＫ陽性胞の頻度が、より大きかった（図１８Ｄ）。ＲＡ患者のＧＬＫ発現末梢血Ｔ細胞の頻度は、健常対照者に比べて非常に高かった（１８．４＋／−７．６対１０．５＋／−５．０、ｐ＜０．００１、図１８Ｅ）。さらに、ＲＡ患者では、ＧＬＫ発現Ｔ細胞は、リン酸化ＰＫＣ−θおよびＩＫＫを発現した。これらのデータによれば、ＧＬＫ−ＰＫＣ−θ−ＩＫＫカスケードは、ヒトＲＡの発病に関与していることが示唆される。

ＲＡ患者において、ＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度は、以下のものと相関していた：圧痛関節数（ｒ＝０．５００、ｐ＝０．００５、図１９Ａ）；赤血球沈降速度（ＥＳＲ；ｒ＝０．４００、ｐ＝０．００３、図１９Ｂ）；Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ；ｒ＝０．３３０、ｐ＝０．０１５、図１９Ｃ）；又は、２８−関節疾患活動性スコア（ＤＡＳ２８；ｒ＝０．６０６、ｐ＝０．０００５、図１９Ｄ）（表３）。単回帰において高い剰余（モジュラス＞１）を示した４つの外れ値を除去した後、残りのＲＡ患者の８６パーセント（３０のうちの２６）は、ＧＬＫ発現Ｔ細胞頻度とＤＡＳ２８との間でより高い相関を示した（ｒ＝０．７１２、ｐ＝０．００００６３９、図１９Ｅ）。これらの結果によれば、ＧＬＫシグナル伝達は、ＲＡの発病に重要な役割を果たすことが示唆される。表３は、登録された被験者のＲＡ疾患活動性とＧＬＫ発現Ｔ細胞頻度との間のピアソン相関を示す。
ＲＡ：慢性関節リウマチ；ＧＬＫ：ＧＣＫ−類似キナーゼ；ＴＪＣ：圧痛関節数；ＳＪＣ：腫脹関節数；ＤＡＳ２８：２８関節疾患活動性スコア；ＥＳＲ：赤血球沈降速度；ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質。

この研究では、ＲＡ患者からの末梢血のＴ細胞および滑膜組織中にＧＬＫが過剰発現していることを、我々は見いだした。ＧＬＫ欠損は、マウスのＣＩＡの進行を遅らせた。さらに、ＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度は、ＲＡ疾患重症度と非常に相関しており、ＧＬＫがＲＡの発病に寄与していることが示された。この結果は、ＧＬＫは新しい診断バイオマーカであり、治療計画に対する潜在的な標的であるということを示唆している。

ここ何年かの間、ｐ３８ＭＡＰＫは、ＲＡにおけるＴｈ１／Ｔｈ１７介在慢性炎症の誘起および維持に重要であると考えられていたが、ｐ３８ＭＡＰＫの抑制は、初期試験では顕著な成果を提供していない。ＧＬＫは、広く様々な人体組織の中に発現されるセリン／トレオニンキナーゼであり、また、ＭＡＰＫシグナル伝達の上流側キナーゼである。我々の最近の研究では、ＧＬＫが、ＰＫＣ−θを直接にリン酸化し活性化することにより、ＩＫＫ−ＮＦ−κＢ経路を誘発することが実証されている。ＥＡＥおよびＣＩＡモデルを用いた我々の研究および過去の報告では、ＧＬＫ欠損マウスとＰＫＣ−θ欠損マウスの両方ともに、Ｔｈ１／Ｔｈ１７が介在した自己免疫応答が低く示されており、これは、ＧＬＫシグナル伝達が自己免疫を制御することを示唆するものである。ＲＡ患者の末梢血および滑液からのＴ細胞中で、ＧＬＫはＰＫＣ−θと共に相互局在化した。さらに、ＧＬＫ発現Ｔ細胞の大部分は、ＰＫＣ−θ／ＩＫＫ活性化された細胞であった。我々の知るところ、本研究は、Ｔ細胞中におけるＧＬＫ過剰発現およびＰＫＣ−θ／ＩＫＫ過反応が、ＲＡ患者用の新しいバイオマーカになるという、最初の報告である。さらに、ＧＬＫ陽性Ｔ細胞の頻度は、ＲＡ疾患活動性と正に相関し、これは、ＧＬＫ−ＰＫＣ−θ−ＩＫＫ経路が、ＲＡの発病学の中に重要な役割を果たしていることを示すものである。

ＮＦ−κＢ経路のアップレギュレーションは、マトリックス分解酵素の合成に重要であり、これは、ＲＡにおける骨侵食を引き起こすが、ＩＫＫの抑制が骨および軟骨を破壊から保護する。また、抗ＣＤ３−誘発ＮＦ−κＢの活性化は、ＧＬＫ過剰発現によって増強され、Ｔ細胞系中のＧＬＫ ｓｉＲＮＡによって抑制される。これは、ＧＬＫを抑制することで、ＲＡにおける炎症を軽減することができることを示唆するものである。ＲＡ患者に関して、Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能の低下が報告されている一方、ＰＫＣ−θの抑制が、ＲＡ患者から欠損Ｔｒｅｇ活動性を回復させることも報告されている。ＧＬＫ欠損マウスは、Ｔｒｅｇ介在の抑制機能が増大されることを示している。したがって、ＧＬＫ−ＰＫＣ−θ経路は、Ｔｒｅｇ機能をネガティブに調節する。これらをまとめれば、ＲＡ患者中のＧＬＫを対立させることで、Ｔ細胞介在の免疫応答を低減でき、また、Ｔｒｅｇ介在抑制機能を増大させることができるので、ＧＬＫがＲＡに対して有望な治療の標的であることが示唆される。

この研究には、いくつかの制約がある。第１に、その設計は横断的であり、ＧＬＫ発現に関して、薬理治療の影響を評価することを困難なものにしている。過去の報告によれば、グルココルチコイドがＰＫＣ−θシグナル伝達を抑制すること、および、ＴＮＦ−α阻害剤がＮＦ−κＢ調節遺伝子形質発現を低減することが示された。ＲＡ患者のＴ細胞中のＧＬＫ、ＰＫＣ−θ、ＩＫＫまたはＮＦ−κＢの発現は、免疫抑制因子により低減されるが、ＧＬＫレベルは、まだ非常に高く、少なくとも８６％のＲＡ患者に疾患活動性で相関した。第２に、骨破壊および軟骨損傷の発病学におけるＧＬＫの役割は、さらに定義が難しい。それにもかかわらず、我々の結果は、ＲＡ患者に対して、ＧＬＫと関節炎症との間の関連を実証するものである。

我々の結果によれば、ＧＬＫがＲＡの発病に重要な役割を果たし、疾患重症度の潜在的な診断バイオマーカであることが示される。さらに、ＧＬＫおよびその下流ＰＫＣ−θ−ＩＫＫシグナル伝達の抑制は、新しい治療の戦略をＲＡに対して提供することができる。

ＩＩＩ．胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ／ＭＡＰ４Ｋ３）の発現は、成人発症型スティル病で増加し、活動性マーカとしての機能を果たすことができる

ＧＬＫの発現の強さは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の疾患重症度に対応していることが示された。我々は、成人発症型スティル病（ＡＯＳＤ）の発病におけるＧＬＫの役割を調べたが、これは、同様の臨床のいくつかの特性をＳＬＥと共有する。

［方法］
（被験者）
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ基準を満たす対象の未治療のＡＯＳＤをもつ２４人の継続的患者（女性１５人および男性９人、平均年齢＋／−ＳＤ、３３．３＋／−９．９年）を登録した。感染症、悪性腫瘍または別のリウマチ性疾患をもつ患者は排除した。各々のＡＯＳＤ患者の疾患活動性スコア（範囲０〜１２）を、Ｐｏｕｃｈｏｔほかによって記載される基準に従って評価した。循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞およびＴｈ１７関連サイトカインのレベルを初期定量した後、全てのＡＯＳＤ患者に対して、コルチコステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬薬剤（ＮＳＡＩＤ）を受容させた。使用された疾患修正抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ：Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉ−Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｒｕｇ）は、メトトレキセート（２０人の患者）、ヒドロキシクロロキン（１８人の患者）、スルファサラジン（８人の患者）およびアザチオプリン（３人の患者）であった。リウマチ性疾患を有しない１２人の年齢が整合する健康な志願者（８人の女性および４人の男性、平均年齢３２．４＋／−８．２年）が、正常対照者の役目を果たした。エンドトキシフリーなヘパリン化減圧チューブ（ＫＡＢＩ−ＥＴ；クロモジェニックス社、アントワープ、ベルギー）を用いて末梢血を採取し、試料採集と培養との間の合間でサイトカインが生成されることを回避した。台中退役軍人総合病院の臨床研究倫理委員会は、この研究を承認し（Ｎｏ．Ｃ１０１３０）、ヘルシンキ宣言によって全ての参加者から書面による同意を得た。

（フローサイトメトリー分析を用いた循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞の計量）
最近の研究に記載される技術に基づき、フローサイトメトリー分析を用いて、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞を定量した。ウサギに個々のペプチドで免疫性を与えることによって、ＧＬＫ抗体を生成した。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ）を採取し、コ−ルドＰＢＳで洗浄し、氷上で３０分間、示された抗体で染色した。次いで、ＰＢＭＣを、他の刺激なしで、ゴルジストップ（１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ、シグマ社、ドイツ）で処理し、その後、抗ＣＤ３−アロフィコシアニン［ＡＰＣ］−Ｃｙ７（ＢＤファーミンゲン社）、抗ＣＤ４−パシフィックブルー（ＢＤファーミンゲン社）、および抗ＣＤ８−ペリジニン・クロロフィル・タンパク（ＰｅｒＣＰ：Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）シアニン５．５（Ｃｙ５．５：ｃｙａｎｉｎ ５．５）（ＢＤファーミンゲン社）を用いて、室温で染色した。細胞内染色のために、ＰＢＭＣを、サイトフィクス／サイトパーム緩衝液（ＢＤバイオサイエンス）２００μｌの中で２時間透過処理し、パームウォッシュ緩衝液で洗浄した。ペレットを、１００μｌの試薬２、サポニン（ベックマンコールター社、米国）を用いて、室温暗所で５分間培養した。サンプルを、０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで二度洗浄し、ＰＥ接合ＧＬＫ特異ｍＡｂ（ｅバイオサイエンス社、米国）で３０分室温暗所において培養した。ＧＬＫ染色には、室温暗所で、アイソタイプコントロールＩｇＧ１−ＰＥ（ｅバイオサイエンス社、米国）を用いた。染色後、細胞を洗浄し、その後直ちに、フローサイトメトリー（ベックマンコールター社、米国）を使って分析した。前方性およびサイズ散乱性に基づいてリンパ球をゲートし、少なくとも１０，０００個のＣＤ３⁺細胞を分析した。データは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス）を使って収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。

（ＧＬＫ発現ウェスタンブロッティング）
免疫ブロッティング分析のため、我々の最近の研究論文に記載されているように、精製Ｔ細胞のサンプリングを行った。ＧＬＫについて、実験の各セットからの細胞抽出物と等量を混合した反応液を、泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）中で、６〜８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した。３０分、９０Ｖでゲルを泳動し、その後、青色素の前端が底に到達するまで１３０Ｖをかけた。トランスブロットＳＤセミドライ電気泳動的トランスファーセル（バイオラド社、米国）を用いて、ゲルを２１Ｖで１時間、転写バッファー（５０ｍＭトリス、３８４ｍＭグリシン、２０％メタノール）中の二フッ化ポリビニリデン膜（ＰＶＤＦ：Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）に転写した。

ＴＢＳＴ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）中で、５％のＢＳＡを用いて、膜を１時間室温でブロックした後、抗ＧＬＫ（１：１０００）で、４℃で１晩プローブ処理した。抗ＧＬＫは、適切なペプチドおよび抗β−チューブリン（１：１０００、Ｔ４０２６、シグマ社、米国）を用いてウサギに免疫性を与えることにより生成されたものである。膜をＴＢＳＴで約３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ接合された第２の抗体（１：６０００）と共に、１時間室温で培養した。抗体反応した膜を、ＴＢＳＴで３回洗浄し、増強イモビロン・ウェスタン・ケミルミネッセントＨＲＰサブストレート（ＷＢＫＬＳ０５００、ミリポア社、米国）を用いて処理を行い、新型メガカム８１０サイエンスグレードＣＣＤカメラ（ＵＶＰ、ＬＬＣ、ＣＡ、米国）で撮影した。β−チューブリンに対してＧＬＫタンパクの相対的な発現レベルを補正し、対照と相対的な値を示した。

（ＧＬＫ発現に対する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ））
フィコール−パック（商標）プラス（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、スウェーデン）を用いて、密度勾配遠心分離により、静脈の血液から分ＰＢＭＣを直接的に分離した。グアニジンイソチオシアネート方法によって、ＰＢＭＣから全細胞ＲＮＡを得て、２６０ｎｍの分光度測定により定量した。標準的な手順に従い、２００Ｕのモロニーマウス白血病ウィルス・リバース・トランスクリプターゼ（ファーメンタス、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社、米国）を用いて、ＲＮＡアリコート２．５μｇを逆転写した。タクマンＰＣＲコア試薬キット（アプライドバイオシステムズ社、米国）に供給されているｑＰＣＲアッセイによって、ＧＬＫ ｍＲＮＡ発現レベルを判定した。ＧＬＫおよび内部コントロールグリセリンアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ：Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に特異的なプライマーを、アプライドバイオシステムズ社（フォスター市、ＣＡ、米国）から入手した。解離曲線プロットによってＰＣＲ産物の純度を評価した。ＧＬＫのｍＲＮＡレベルを補正するために、各々のサンプルで並行して、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの転写産物レベルを判定した。ＧＬＫの相対的な発現レベルを、比較閾値サイクル（Ｃｔ）法で計算し、２^-△△Ctによって評価した（△△Ｃｔ＝患者（Ｃｔ_GLKgene−Ｃｔ_GAPDH）−対照者平均（Ｃｔ_GLKgene−Ｃｔ_GAPDH））。

（可溶性のＩＬ−２レセプター（ｓＩＬ−２Ｒ）およびＴｈ１７関連サイトカインの血清レベルの定量）
ＥＬＩＳＡキット（セルフリー；エンドジェン社、ＭＡ、米国）を使って、血清ｓＩＬ−２Ｒレベルを判定した。製造業者（ｅバイオサイエンス社、サンディエゴ、ＣＡ、米国）のマニュアルに従い、酵素結合抗体免疫吸着アッセイを用いて、ＡＯＳＤ患者および健常対照者におけるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦ−αの血清レベルを測定した。

［統計学的分析］
結果は、平均＋／−標準偏差または中央値（四分位数間領域）で示される。循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度、ＧＬＫ転写産物およびタンパクの発現レベル、ならびに、Ｔｈ１７関連サイトカインの血清レベルについて、それぞれの群間比較を行うために、非母数のクラスカル・ワリス検定を使用した。この検定が顕著な差を示した時は、マンホイットニーＵ検定を使用して、正確なｐ値を判定した。非母数のスピアマンの順位相関試験を使って、相関係数を計算した。有効な治療の後のＡＯＳＤ患者のフォローアップ中、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞のレベルとＧＬＫの発現レベルとを比較するため、ウイルコクソンの符号順位検定を用いた。その比較のためにウイルコクソンの符号順位検定を用いた。０．０５未満の確率のときは、顕著であるとみなされた。

［結果］
（ＡＯＳＤ患者の臨床の特性）
表４に示されるように、対象の未治療のＡＯＳＤを有する全ての２４人の患者は、日常的にスパイク熱（≧３９℃）を発症していた。別の通常の発現は、感知しにくい発疹（８３．３％、２０人）、咽頭炎（７０．８％、１７人）および関節炎（６２．５％、１５人）を含んでいた。リンパ節腫脹および肝脾腫大症は、それぞれ１０人（４１．７％）および６人（２５．０％）の患者で見られた。この研究の登録者の年齢や、ＡＯＳＤ患者と健常対照者との間の女性の割合には、顕著な差はなかった。表４は、成人発症型スティル病（ＡＯＳＤ）および健常対照者（ＨＣ）で患者の人口統計学的データおよび臨床の特性を示す。
データは、平均＋／−ＳＤまたは数（パーセンテージ）で表される；ＮＡ：適用なし。肝臓機能不全は、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ：Ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）レベル≧４０ＩＵ／Ｌであると定義される。ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質。ｓＩＬ−２Ｒ：可溶性のインターロイキン２レセプター。

（ＡＯＳＤ患者中の循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度増加）
対象のＡＯＳＤを有する患者１人および健常対照者１人の、末梢血ＣＤ３⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞およびＣＤ８⁺Ｔ細胞におけるＧＬＫ発現のフローサイトメトリー輪郭プロットの代表的な例が、それぞれ、図２０Ａおよび２０Ｂに示される。対象のＡＯＳＤの患者（中央値＝３１．８５％、四分位［ＩＱ］範囲２１．２１％〜４８．８４％）に観測された循環ＧＬＫ発現ＣＤ３⁺Ｔ細胞平均頻度は、健常対照者（中央値＝８．９３％、ＩＱ範囲６．８１％〜２．０８％；ｐ＜０．００１、図２０Ｃ）に比べて大変高かった。

（ＡＯＳＤ患者のＧＬＫ転写産物およびタンパクの発現増加）
図２０Ｄに示すように、健常対照者（中央値＝０．９２、ＩＱ範囲０．６３〜１．３７；ｐ＜０．００１）に比べて、対象のＡＯＳＤ患者（中央値＝２．３５、ＩＱ範囲１．６６〜３．８８）には、ＧＬＫ転写産物の相対的な発現における何倍もの増加が観測された。同様に、対象のＡＯＳＤ患者について、ウェスタンブロッティング（図２０Ｅ）によって判定される精製Ｔ細胞の溶解物中のＧＬＫの発現が増加した。対象のＡＯＳＤ患者におけるＧＬＫタンパクの相対的な発現レベル（中央値＝１．７４、ＩＱ範囲１．４７〜２．９５）は、対照者における発現レベル（中央値＝０．６６、ＩＱ範囲０．５４〜０．９４；ｐ＜０．００１、図２０Ｆ）に比べて著しく高かった。

（ＡＯＳＤ患者におけるＴｈ１７関連サイトカインの血清レベルの上昇）
図２１に示すように、対象のＡＯＳＤ患者は、血清ＩＬ−６（中央値＝４７４．８１、ＩＱ範囲１５６．４２〜９８７．５５）、ＩＬ−１７Ａ（中央値＝３０６．８０、ＩＱ範囲１５２．１７〜５０３．７０）、およびＴＮＦ−α（中央値＝５１．８５、ＩＱ範囲２３．６３〜６５．９３）について、非常に高い中央値レベルを有し、これは、健常対照者（ＩＬ−６は中央値＝８５．７８、ＩＱ範囲３１．１３〜１８９．９８、ｐ＜０．００１；ＩＬ−１７Ａは中央値＝７０．９０、ＩＱ範囲５１．４２〜１２４．５３、ｐ＜０．００１；ＴＮＦ−αは中央値＝２４．６６、ＩＱ範囲１０．５０〜３７．７６、ｐ＜０．０１）と比較して顕著であった。しかしながら、血清ＩＬ−１βレベルについては、ＡＯＳＤ患者とＨＣとの間で顕著な差はなかった。

（ＡＯＳＤ患者のサイトカインに加えてＧＬＫ発現と疾患活動性との間の相関）
ＡＯＳＤ：成人発症型スティル病；ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質；ｓＩＬ−２Ｒ：可溶性のインターロイキン２レセプター；ＩＬ−１β：インターロイキン−１β；ＩＬ−６：インターロイキン−６；ＩＬ−１７Ａ：インターロイキン−１７Ａ；ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子−α。
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１は、非母数のスピアマンの順位相関試験によって得られた。

表５に示すように、循環ＧＬＫ発現ＣＤ３⁺Ｔ細胞の頻度は、臨床の活動性スコア、ＣＲＰレベル、フェリチンレベルおよびｓＩＬ−２Ｒの血清レベルを含む疾患活動性と正に相関し、これは、ＡＯＳＤ患者のＴ細胞活性化を反映したものである。同様に、ＧＬＫタンパクおよび転写産物の相対的な発現レベルは、ＡＯＳＤ患者の臨床の活動性スコアおよびｓＩＬ−２Ｒレベルに対して正に相関した。Ｔｈ１７関連サイトカインの中では、ＧＬＫ発現レベルは、ＩＬ−６およびＩＬ−１７Ａの血清レベルと正に相関した。しかしながら、ＧＬＫ発現と我々のＡＯＳＤ患者の臨床発現との間に顕著な相関はなかった（データ図示せず）。表５は、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度が、ＧＬＫタンパクの相対的な発現レベル、ＧＬＫ転写産物および疾患活動性パラメータおよびＡＯＳＤをもつ２４人の患者のＴｈ１７関連サイトカインとの間で相関を有することを示す。

（有効な治療後のＡＯＳＤ患者におけるＧＬＫ発現レベルの変化）
１２人のＡＯＳＤ患者は、活性段階および寛解傾向段階の検査に利用可能であった。図２２に示すように、有効な治療後のＡＯＳＤ患者において、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞のレベルおよびＧＬＫタンパクの相対的な発現レベルに加えて転写産物が、著しく低減され（平均＋／−標準誤差、それぞれ、４５．７７＋／−５．５８対２０．１１＋／−２．５３；３．０１＋／−０．４９対０．９３＋／−０．１７；３．４５＋／−０．５６対１．２１＋／−０．３８、全てでｐ＜０．００５）、臨床の寛解傾向およびｓＩＬ−２Ｒの血清レベルの減少（７４７．８＋／−１３１．８ｐｇ／ｍｌ対２２９．１＋／−３８．５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００５）と、平行している。

本研究は、健常対照者に比べて、対象のＡＯＳＤ患者でＧＬＫ過剰発現が生じていることを実証する最初の調査である。細胞内シグナリング分子のフローサイトメトリー分析が出現したことにより、不均質細胞群中で単一の細胞を研究する機会が一気に増えた。本研究では、ＣＤ４およびＣＤ８部分集合を含むＣＤ３⁺Ｔ細胞が、対象のＡＯＳＤをもつ患者におけるＧＬＫ発現の増大を実証する。また、我々の結果では、ＡＯＳＤ患者において、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞が非常に高い頻度で発生し、これは、臨床の活動性スコアや血清フェリチンレベルを含む疾患活動性と相関していることが示された。さらに、ＡＯＳＤ患者では、疾患寛解傾向に伴い平行にＧＬＫ生成も減少することが見いだされた。ＡＯＳＤ患者に関係しているこれらのデータは、ＳＬＥ患者の活性度指数と相関する循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞の高いレベルが示されている我々の最近の研究の結果と同様であり、これは、ＧＬＫ過剰発現はＡＯＳＤ発病に重要な役割を果たしており、したがってＡＯＳＤの潜在的な活動性マーカになり得ることを示唆するものである。しかしながら、ここに記載した発見を確認するためには、大規模な予測研究を行う必要がある。

ＡＯＳＤ患者中のタンパクおよび転写産物レベルでＧＬＫ発現を証明するため、対象の未治療のＡＯＳＤを有する我々の患者からの末梢血リンパ球に対して、ＧＬＫ発現ウェスタンブロッティングおよびｑＰＣＲを実施した。ＡＯＳＤ患者において、ＧＬＫタンパク質および転写産物の相対的な発現レベルは、ＨＣに比べて非常に高かったことを、我々は実証した。さらに、我々の研究において、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞の頻度と、ＧＬＫタンパク質の発現レベルとの間の正の相関は、過去の研究の発見に合致しており、このことは、細胞内フローサイトメトリーとウェスタンブロッティングとは共に、ＭＡＰＫシグナル伝達状態を測定する同様のアッセイであることを示している。さらに、転写産物と同様にＧＬＫタンパク質の発現レベルは、我々のＡＯＳＤ患者における臨床の活動性スコアと著しく相関した。これらのデータは、ＡＯＳＤ患者のＴ細胞においてＧＬＫ過剰発現の第一の直接的かつ確固とした証明を提供する。

証明の累積により、Ｔｈ１７細胞は、ＡＯＳＤおよびＳＬＥの両方の発病に対して重要な役割を果たすことが示される。ＩＬ−６は、ＩＬ−１βと相乗作用し、Ｔｈ１７細胞の分化および発生を促進する。Ｔｈ１７細胞は、多面的なサイトカイン、ＩＬ−１７を分泌することができ、これは、炎症誘発性のサイトカインおよびケモカインの発現を誘発することによって組織炎症に寄与する。我々の最近の研究では、ＧＬＫ欠損マウスは、ＥＡＥの進展に耐性を示し、Ｔｈ１７応答を低減させたことが示された。インビトロＴ細胞分化アッセイからの結果は、ＧＬＫが、Ｔｈ１７細胞分化にポジティブな役割を果たすことを示している。本研究での結果は、Ｔｈ１７関連サイトカイン、ＩＬ−６およびＩＬ−１７Ａの血清レベルが向上することを示し、これは、ＡＯＳＤ患者からのＴ細胞の中にＧＬＫの発現レベルと相関した。我々のデータも、過去の発見を支持し、ＭＡＰＫ経路は、Ｔｈ１７細胞機能の調節に重要な役割を果たし、かつ、ＩＬ−１７生成は、ＭＡＰＫに依存する機構が介在することを示している。さらに、ＭＡＰＫの抑制により、Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群におけるＩＬ−１７生成を抑制することができ、かつ、Ｔｈ１７介在自己免疫性疾患、ＥＡＥを低減できる。これらの観測によれば、ＧＬＫ過剰発現あるいはＭＡＰＫシグナル伝達が、Ｔｈ１７関連サイトカインの生成に寄与できることが示唆される。しかしながら、ＧＬＫアップレギュレーションは、ＡＯＳＤの発病の最初の現象よりむしろ炎症の随伴現象を代表する可能性が、まだ存在する。

我々は、ＡＯＳＤ患者に対する長期的なフォローアップを行い、循環ＧＬＫ発現Ｔ細胞のレベルだけでなく、ＧＬＫタンパク質および転写産物の発現レベルも著しく減少することを示し、これは、臨床の寛解傾向と平行的であり、また、有効な治療後の炎症性のパラメータの減少とも平行的である（図２３）。我々の結果は、さらに上流側のＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害剤、例えばＭＡＰ２Ｋ（ＭＫＫ３またはＭＫＫ６）およびＭＡＰ３Ｋ（形質転換成長因子活性化キナーゼ１、ＴＡＫ１）が、リウマチ性疾患に対する有望な治療の方法を与えることができるという仮説を支持するものである。上流側ＭＡＰキナーゼとしてのＧＬＫはまた、下流側ＭＡＰＫまたは数個のｐ３８アイソフォームを広く抑制することにより、潜在的な治療の戦略を目標とできる。さらに、抑制すると大きな毒作用を示すｐ３８ＭＡＰＫ等の下流側分子に比べて、上流側シグナル伝達分子は、良い標的とすることができる。

ＡＯＳＤのＩＬ−１βレベルが上昇し、ＩＬ−１βレセプターアンタゴニスト（アナキンラ）が炎症性疾患の治療に大きな助けとなるということを報告した研究があるが、我々の結果によれば、ＡＯＳＤ患者と健康体との間には、ＩＬ−１βレベルの顕著な差を示さなかった。

我々の結果は、Ｔｈ１７関連サイトカインのレベルを増加させることによるＧＬＫ過剰発現が、ＡＯＳＤの発症メカニズムに関与できることを、明らかにした。我々のデータは、ＧＬＫ過剰発現と炎症性疾患のリストとの間に関連があるということを支持する証拠に加えられる。また、我々の結果において、ＧＬＫ発現レベルは、ＡＯＳＤの疾患活動性と正に相関し、これは、ＧＬＫが、新しい活動性バイオマーカおよび潜在的な治療の標的として用いる事ができることを示している。

ＩＶ．ＧＬＫ診断バイオマーカ
ＳＬＥ患者の他に、７人の付加的な自己免疫性疾患からの患者サンプルでは、末梢血Ｔ細胞のＧＬＫ発現が、劇的に増加したことが示された（表６、図２４〜２６）。上記で開示されるように、ＧＬＫ発現は、ＲＡおよびＡＯＳＤの疾患重症度と相関した。ＧＬＫ過剰発現Ｔ細胞が、ＲＡ患者からの滑膜組織中で検出された。

我々のデータによれば、ＧＬＫ過剰発現末梢血Ｔ細胞が、ＳＬＥ患者中の全てのＩＬ−１７生成細胞であったことが示された（図２７）。自己免疫発病におけるＧＬＫの制御作用を研究するため、我々はさらに、Ｌｃｋ−ＧＬＫと呼ばれるＴ細胞特異ＧＬＫトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを生み出した。Ｌｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスは、多数の自己免疫性疾患を自発的に発達させ、血清ＩＬ−１７およびＳＬＥ／慢性関節リウマチ自己抗体が増加していた（図２８および２９）。Ｌｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスは、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症のフェノタイプを表した。Ｔ細胞中のＩＬ−１７転写は、トランスジェニックＧＬＫによって誘発された（図２９）。ＬＣＫ−ＧＬＫ Ｔｇマウスのこれらの結果によれば、ＧＬＫ−ＰＫＣθ−ＩＫＫ−ＩＬ−１７軸の活性化が、自己免疫性疾患に貢献することが示唆される。

したがって、ＧＬＫは、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、成人発症型スティル病、グレーブス病、シェーグレン症候群、神経脊髄炎、強直性脊椎炎および脱毛症を含む多数の自己免疫性疾患の診断バイオマーカおよび治療の標的となる。

腫瘍形成に関与するＮＦ−κＢ活性化をＧＬＫが誘発することから、我々は、癌腫サンプル中のＧＬＫ発現を研究した。我々の最近のデータによれば、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、食道癌、膠芽細胞腫、膵管腺癌、乳癌および肝癌中のＧＬＫ発現が著しく増加したことが示された（図３０〜３５）。ｍＴＯＲではなく、ＩＫＫの活性化が、ＮＳＣＬＣにおいて増大した（図３０）。これらのデータによれば、ＧＬＫが、ｍＴＯＲから独立した経路を通じて、腫瘍形成に寄与することが示唆される。さらに、腫瘍部分におけるＧＬＫ過剰発現は、ＮＳＣＬＣ患者では、早期の再発（すなわち末端の転移）とよく相関した（Ｐ＝０．００９；図３６）。我々のデータによれば、ＧＬＫ過剰発現が腫瘍形成および腫瘍転移を誘発したことが示された（図３７）。したがって、ＧＬＫは、多様な癌、例えば肺癌、食道癌、膠芽細胞腫、膵臓癌、乳癌および肝癌に対する新しいバイオマーカおよび治療の標的である。

これらをまとめれば、我々のデータによれば、ＧＬＫは、自己免疫炎症疾患および癌に対して、新しいバイオマーカおよび治療の標的であることが示された。細胞がＧＬＫを過剰発現させる自己免疫炎症性の疾患／癌の患者に対する治療法として、将来開発されるＧＬＫ阻害剤を用いることができるであろう。

［結論］
１．ＧＬＫは、多様な自己免疫性疾患の新しいバイオマーカである
ＳＬＥ、慢性関節リウマチおよび成人発症型スティル病患者のＴ細胞中におけるＧＬＫ過剰発現の他、シェーグレン症候群、神経脊髄炎、強直性脊椎炎および脱毛症のＴ細胞の中にも、ＧＬＫ過剰発現は見いだされた（図２４）。我々はまた、薬剤未感作なグレーブス病（ＧＤ）患者からのＴ細胞、および、部分的な抗甲状せん治療を受けたが未だ甲状腺中毒の状態にある患者からのＴ細胞中に、ＧＬＫが過剰発現したことを見いだした。これは、フローサイトメトリー、免疫ブロッティングおよび定量ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）によって判定された（図２５および２６）。ＧＬＫタンパクレベルおよびｍＲＮＡレベルは、ＧＤ患者からのＴ細胞中で上昇した（図２５）。我々の結果によれば、ＧＬＫ過剰発現は、自己免疫性疾患の発病および重症度に寄与し、自己免疫性疾患の新しいバイオマーカであることが示唆される。表６は、ＧＬＫの介在した自己免疫性疾患および癌を示す。

２． ＧＬＫは、Ｔ細胞中のＩＬ−１７生成を誘発する
自己免疫の発病におけるＧＬＫの制御作用を研究するため、我々はさらに、Ｔ細胞に特異的な促進因子Ｌｃｋを用いて、Ｔ細胞に特異的なＧＬＫトランスジェニックの（Ｔｇ）マウスを生成した。血清自己抗体および血清ＩＬ−１７の特異的な増加により、Ｌｃｋ−ＧＬＫ Ｔｇマウスは、自発的に多様な自己免疫性疾患を進展させた（図２７〜２９）。これらの発見は、ＧＬＫ−ＰＫＣθ−ＩＫＫ−ＩＬ−１７軸の活性化は、自己免疫性疾患に寄与することを示唆する。高レベルのＧＬＫ遺伝子導入を発現するＬｃｋ−ＧＬＫ−Ｔｇマウス（８週齢）は、血清ＩＬ−１７Ａレベルの急激な誘起を示した。ＩＬ−１７Ａ ｍＲＮＡレベルは、トランスジェニックＧＬＫによって上昇した（図２９）。これらの結果によれば、ＧＬＫがＴ細胞中のＩＬ−１７Ａ生成をプラスに調節するという、ＳＬＥ患者の我々のデータをさらに裏付けることになる。

３．多様なタイプの癌におけるＧＬＫ過剰発現
肺癌患者において正常な部分と比較して腫瘍部分中で、ＧＬＫタンパクレベルが上昇した（８５．７％）。食道癌患者において正常な部分と比較して腫瘍部分中で、ＧＬＫタンパクレベルが上昇した（５８％）。また、膠芽細胞腫、膵臓癌、乳癌および肝癌中においても、ＧＬＫが過剰発現した。

本発明の例示的な実施形態に関しての前述の説明は、例示および説明の目的にのみ提示されるものであり、本発明を網羅的とするものでもなければ、開示された形態に厳密に限定するものでもない。様々な変形および変更が、上記の教示を考慮した上で可能である。

Claims (20)

1. 胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ）介在疾患を治療する治療薬を同定する方法であって、
   前記方法は、試験化合物によって、前記ＧＬＫが介在したシグナル伝達の変調を検出する検出ステップを含み、前記検出ステップは、
   ａ）前記試験化合物の存在下でＧＬＫ発現細胞を培養する細胞培養ステップであって、前記変調は、ＧＬＫ転写産物もしくはＧＬＫタンパクの発現レベル、ＩＬ−１７Ａの生産量、または、ＮＦ−κＢの活性を測定することにより検出される細胞培養ステップ、
   ｂ）前記試験化合物の存在下で、ＧＬＫタンパクを基質およびＡＴＰと反応させる反応ステップであって、前記変調は、ＡＤＰの生産量、ＡＴＰの消費量、または、リン酸化される前記基質の量を測定することにより検出される反応ステップ、
   ｃ）前記試験化合物の存在下で、ＧＬＫ発現癌細胞を培養する癌細胞培養ステップであって、前記変調が、前記癌細胞の転位、浸潤、または、創傷治癒を測定することにより検出される癌細胞培養ステップ、および、
   ｄ）前記試験化合物の存在下でＧＬＫタンパクを基質タンパクと相互作用させる相互作用ステップであって、前記変調は、前記ＧＬＫタンパクと前記基質タンパクのとの相互作用を測定することにより検出される相互作用ステップ、
   のうちのいずれかと、
   ｅ）前記試験化合物の存在下の前記変調を対照と比較して、前記ＧＬＫ介在疾患を治療する治療薬を同定する比較ステップと、
   を含む治療薬同定方法。
2. 前記ＧＬＫ介在疾患は、自己免疫性疾患、炎症性疾患、癌、および癌転移からなる群より選択される請求項１に記載の治療薬同定方法。
3. 前記基質は、ＰＫＣ−θタンパク、およびミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）からなる群より選択される請求項１に記載の治療薬同定方法。
4. 前記試験化合物は、ＲＮＡｉ分子、マイクロＲＮＡ、アンチセンス分子、および小有機分子とからなる群より選択される請求項１に記載の治療薬同定方法。
5. 前記ＧＬＫ発現細胞は、ＧＬＫ発現Ｔ細胞を含み、
   前記ＧＬＫ発現癌細胞は、ＧＬＫ発現肺癌細胞を含む請求項１に記載の治療薬同定方法。
6. 前記癌は、ＧＬＫタンパク介在癌の型であり、哺乳類ラパマイシン標的タンパク（ｍＴＯＲ）から独立したものである請求項２に記載の治療薬同定方法。
7. 前記自己免疫性疾患は、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、成人発症型スティル病、グレーブス病、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、神経脊髄炎、自己免疫性脳脊髄炎、および脱毛症からなる群より選択される請求項２に記載の治療薬同定方法。
8. 前記癌は、肺癌、食道癌、膠芽細胞腫、膵臓癌、乳癌、および肝癌からなる群より選択される請求項２に記載の治療薬同定方法。
9. 前記ステップｄ）において、前記ＧＬＫタンパクと前記基質タンパクとの間の相互作用は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイまたは増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法を用いて測定される請求項１に記載の治療薬同定方法。
10. 前記ステップｄ）において、
    前記基質タンパクはＰＫＣ−θタンパクを含み、
    前記ＧＬＫタンパクおよび前記ＰＫＣ−θタンパクは、互換性を持つ異なる蛍光プローブで標識されており、そのうち一方の蛍光プローブは、他方のプローブよりも高い発光波長を有しており、
    前記変調の関連は、より高い蛍光発光波長の変化により検出される請求項１に記載の治療薬同定方法。
11. 胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）類似キナーゼ（ＧＬＫ）介在疾患の存在または重症度を判定する方法であって、
    ａ）ＧＬＫ介在疾患または癌を有すると疑われる被験者から、Ｔ細胞または癌細胞を含むサンプルを採取する採取ステップと、
    ｂ）前記Ｔ細胞または前記癌細胞中のＧＣＫ類似キナーゼ（ＧＬＫ）の発現レベルを測定する測定ステップと、
    ｃ）前記ＧＬＫ介在疾患の存在または重症度を判定する判定ステップと、
    を含み、
    前記被験者の前記Ｔ細胞または前記癌細胞中の前記ＧＬＫの発現レベルが、対照のＧＬＫの発現レベルと比較して増加していることは、前記被験者が、前記ＧＬＫ介在疾患を発症もしくは保有するリスクを有している、または、癌の再発もしくは転移のリスクを有していることを示しているＧＬＫ介在疾患判定方法。
12. 前記ＧＬＫの発現レベルの増加は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク（ｍＴＯＲ）から独立したものである請求項１１に記載のＧＬＫ介在疾患判定方法。
13. 前記測定ステップは、ＧＬＫタンパクの発現レベルを測定するステップを含む請求項１１に記載のＧＬＫ介在疾患判定方法。
14. 前記測定ステップは、免疫ブロッティング分析、フローサイトメトリー分析、または免疫組織化学によって行われる請求項１３に記載のＧＬＫ介在疾患判定方法。
15. 前記測定ステップは、ＧＬＫ転写産物の発現レベルを測定するステップを含む請求項１１に記載のＧＬＫ介在疾患判定方法。
16. 測定された前記ＧＬＫ転写産物の発現レベルをハウスキーピング遺伝子に対して補正し、前記ＧＬＫ転写産物の補正された発現レベルを得るステップをさらに含む請求項１５に記載のＧＬＫ介在疾患判定方法。
17. 前記ＧＬＫ介在疾患は、自己免疫性疾患、炎症性疾患、癌、および癌転移からなる群より選択される請求項１１に記載のＧＬＫ介在疾患判定方法。
18. 前記ＧＬＫ発現細胞は、ＧＬＫ過剰発現細胞を含み、または、
    前記ＧＬＫ発現癌細胞は、ＧＬＫ過剰発現癌細胞を含む、請求項１に記載の治療薬同定方法。
19. 前記ＡＴＰは非放射性である請求項１に記載の治療薬同定方法。
20. 前記ＧＬＫタンパクと前記基質タンパクとの相互作用は試験管内で生じるものである請求項１に記載の治療薬同定方法。