TWI506136B

TWI506136B - 具有代謝蔗糖能力之重組細菌

Info

Publication number: TWI506136B
Application number: TW100140651A
Authority: TW
Inventors: Dyk Tina K Van
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2010-12-06
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2015-11-01
Also published as: WO2012078311A1; CN103620026A; SG189204A1; US8129170B1; EP2649179A1; AU2011338840B2; TW201224142A; KR20130125785A; ES2552317T3; BR112013012563A2; EP2649179B1; AU2011338840A1

Description

具有代謝蔗糖能力之重組細菌

本發明係關於微生物學及分子生物學領域。更具體而言，本發明提供具有使用蔗糖作為碳源之能力的重組細菌，以及利用該等重組細菌製造如甘油及甘油衍生產物等產物之方法。

許多商業上有用的微生物使用葡萄糖作為其主要碳水化合物來源。然而，為了製造商業上所欲產物而研發利用葡萄糖的微生物之缺點在於葡萄糖的高成本。於微生物製造系統中，利用蔗糖及含有蔗糖與其他糖類之混合原料作為碳水化合物來源，會因為這些物質通常容易以低價取得而在商業上更為理想。

當可利用存在於混合原料中的任何蔗糖時，生產用微生物可更有效發揮功能。因此，當生產用微生物不具備有效利用蔗糖作為主要碳源之能力時，其並不能有效地操作。舉例而言，細菌細胞典地具有糖類利用的偏好，其中以葡萄糖為最佳。在含糖類混合物之人工培養基中，葡萄糖典型上比其他糖類更早被全部代謝。此外，許多細菌缺乏利用蔗糖的能力。舉例而言，少於50%的大腸桿菌(E. coli )菌株具有利用蔗糖的能力。因此，當生產用微生物無法利用蔗糖作為碳水化合物來源時，最好能設計改造(engineer)該微生物以使其可利用蔗糖。

曾有人發表藉由插入蔗糖利用基因以使經改造之重組細菌可利用蔗糖。舉例而言，Livshits等人(美國專利第6,960,455號)揭示使用含有編碼蔗糖利用之代謝路徑基因的大腸桿菌菌株製造胺基酸。此外，Olson等人(Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:1031-1040,2007)揭示攜帶負責蔗糖降解之基因的大腸桿菌菌株，其使用蔗糖作為碳源製造L-酪胺酸或L-苯丙胺酸。然而，對於經改造為可利用新的蔗糖利用基因以利用蔗糖，且具有改善的蔗糖利用能力之細菌菌株仍有需求。此外，對於能使用蔗糖作為碳源而製造甘油及甘油衍生產物的細菌菌株也有需求。

在一實施例中，本發明提供一種重組細菌，其在基因組中或在至少一重組構築體上包含：

(a)　一核苷酸序列，其編碼一具有蔗糖轉運子活性之多胜肽，當基於一Clustal V比對法與SEQ ID NO:24所示之胺基酸序列比對時，該多胜肽具有至少95%的序列同一性(identity)；及

(b)　一核苷酸序列，其編碼具有蔗糖水解酶活性之多胜肽，當基於一Clustal V比對法與SEQ ID NO:26所示之胺基酸序列比對時，該多胜肽具有至少95%的序列同一性；

其中(a)及(b)各自可操作地連接至相同或相異的啟動子，且其中該重組細菌能代謝蔗糖。

在一實施例中，該重組細菌製造1,3-丙二醇、甘油及/或3-羥基丙酸。

在另一實施例中，本發明提供一種由蔗糖製造甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥基丙酸之方法，包含：

a)　在蔗糖存在下，培養本文所述之製造1,3-丙二醇、甘油及/或3-羥基丙酸之重組細菌；以及

b)　視需要回收所製造之甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥基丙酸。

序列摘述

下列序列符合37 C.F.R. 1.821 1.825(「含核苷酸序列及/或胺基酸序列揭露內容之專利申請案要件-序列規則」(“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))並符合世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(2009)及EPO及PCT序列表要件(Rules 5.2及49.5(a bis)，及管理指南208節與附錄C)。核苷酸及胺基酸序列資料所使用之符號及格式係符合37 C.F.R. §1.822所定之規則。

SEQ ID NO:51為質體pSYCO101之核苷酸序列。

SEQ ID NO:52為質體pSYCO103之核苷酸序列。

SEQ ID NO:53為質體pSYCO106之核苷酸序列。

SEQ ID NO:54為質體pSYCO109之核苷酸序列。

SEQ ID NO:55為質體pSYCO400/AGRO之核苷酸序列。

SEQ ID NO:56至61為用於本文實例所用引子的核苷酸序列。

本文中所示各參考資料之揭示內容以其全文併入本文作為參考。

如本文中及後附之申請專利範圍所使用者，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數指涉，除非上下文另有明確指明。因此，舉例而言，對於「一細胞」之指涉包括一或多種細胞及本領域具有通常知識者所知之均等物等等。

在本發明之上下文中係使用數種術語及縮寫。以下提供其定義。

「開放讀碼框架(open reading frame)」被縮寫為「ORF」。

「聚合酶連鎖反應」被縮寫為「PCR」。

「美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)」被縮寫為「ATCC」。

術語「製造甘油之重組細菌」係指一種經遺傳工程改造而能製造甘油及/或甘油衍生產物之細菌。

術語「具有蔗糖轉運子活性之多胜肽」係指一種能媒介蔗糖轉運至微生物細胞中之多胜肽。

術語「具有果糖激酶活性之多胜肽」係指一種多胜肽，其具有催化D-果糖+ATP轉化成果糖-磷酸酯+ADP之能力。典型的果糖激酶為EC 2.7.1.4。具有某些將果糖磷酸化能力的酶，無論該活性是不是其主要的活性，皆可被稱為果糖激酶。用於編碼果糖激酶之基因及具有果糖激酶活性之蛋白質的縮寫包括例如「Frk 」、「scrK 」、「cscK 」、「FK 」、及「KHK 」。於農桿菌及變種鏈球菌中，果糖激酶係由scrK 基因所編碼；且在某些大腸桿菌菌株中係由cscK 基因所編碼。

術語「具有蔗糖水解酶活性之多胜肽」係指一種具有催化蔗糖水解而產生葡萄糖及果糖之能力的多胜肽。此類多胜肽通常被稱為「轉化酶」或「β-果呋喃糖苷酶」。

術語「甘油衍生物」及「甘油衍生產物」在本文中可交替使用，並表示一種由甘油或在包含甘油之路徑中所合成之化合物。此類產物之實例包括3-羥基丙酸、甲基乙二醛、1,2-丙二醇及1,3-丙二醇。

術語「微生物產物」係指一種經由微生物製造之產物，即微生物代謝一物質之結果。該產物可經由微生物自然產生，或該微生物可經遺傳工程改造而製造該產物。

術語「磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統」、「PTS系統」及「PTS」在本文中可交替使用，並表示磷酸烯醇丙酮酸依賴性糖攝取系統。

術語「磷酸載體蛋白質HPr」及「PtsH」係指在大腸桿菌中經由ptsH 編碼之磷酸載體蛋白質。術語「磷酸烯醇丙酮酸-蛋白質磷酸轉移酶」及「PtsI」係指在大腸桿菌中經由ptsI 編碼之磷酸轉移酶，其為EC 2.7.3.9。術語「葡萄糖特異性IIA成分」及「Crr」係指在大腸桿菌中經由crr 編碼之酶，標示為EC 2.7.1.69。PtsH、PtsI及Crr包含PTS系統。

術語「PTS欠缺」係指一種在其天然狀態並不含PTS系統之微生物，或指一種其已經由去活化PTS基因而將該PTS系統去活化之微生物。

術語「甘油-3-磷酸酯去氫酶」及「G3PDH」係指一種負責催化二羥丙酮磷酸(DHAP)轉化成為甘油3-磷酸酯(G3P)之酶活性的多胜肽。在活體內，G3PDH可為NAD或NADP依賴性。當具體提及輔因子特異性甘油-3-磷酸酯去氫酶時，將使用術語「NAD-依賴性甘油-3-磷酸酯去氫酶」及「NADP-依賴性甘油-3-磷酸酯去氫酶」。由於一般NAD-依賴性及NADP-依賴性甘油-3-磷酸酯去氫酶能交替使用NAD及NADP(例如藉由gpsA 所編碼之酶)，術語NAD-依賴性及NADP依賴性-甘油-3-磷酸酯去氫酶將被交替使用。該NAD-依賴性酶(EC 1.1.1.8)係經由例如包括GPD1 ，本文中亦稱為DAR1 (編碼序列示於SEQ ID NO:1；經編碼蛋白質序列示於SEQ ID NO:2)，或GPD2 (編碼序列示於SEQ ID NO:3；經編碼蛋白質序列示於SEQ ID NO:4)，或GPD3 等數種基因編碼。舉例而言，NADP依賴性酶(EC 1.1.1.94)係經由gpsA 編碼。

術語「甘油-3-磷酸酶」、「sn-甘油3-磷酸酶」、「D,L-甘油磷酸酶」及「G3P磷酸酶」係指一種具有能催化甘油-3-磷酸酯及水轉化成甘油及無機磷酸鹽之酶活性的多胜肽。G3P磷酸酶係由例如GPP1 (編碼序列示於SEQ ID NO:5；經編碼蛋白質序列示於SEQ ID NO:6)，或GPP2 (編碼序列示於SEQ ID NO:7；經編碼蛋白質序列示於SEQ ID NO:8)所編碼。

術語「甘油脫水酶」或「脫水酶」係指一種具有能催化甘油分子轉化成產物3-羥基丙醛(3-HPA)之酶活性的多胜肽。

就本發明之目的而言，脫水酶包括各自具有甘油及1,2丙二醇之較佳受質的甘油脫水酶(E.C. 4.2.1.30)及二醇脫水酶(E.C. 4.2.1.28)。脫水酶之基因尤其已在克留氏肺炎桿菌、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii )、巴斯德氏芽胞梭菌(Clostridium pasteurianum )、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium )、產酸克留氏菌(Klebsiella oxytoca )及羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri )等中被鑑定出來。在各情況中，脫水酶係由三個次單元組成：大或「α」次單元、中或「β」次單元及小或「γ」次單元。這些基因亦記載於例如Daniel等人(FEMS Microbiol. Rev. 22 ,553(1999))及Toraya與Mori(J. Biol. Chem. 274 ,3372(1999))所發表之文獻中。編碼甘油脫水酶的大或「α」(阿伐)次單元之基因包括dhaB1 (編碼序列示於SEQ ID NO:9，經編碼蛋白質序列示於SEQ ID NO:10)、gldA 及dhaB ；編碼中或「β」(貝他)次單元之基因包括dhaB2 (編碼序列示於SEQ ID NO:11，經編碼蛋白質序列示於SEQ ID NO:12)、gldB 及dhaC ；編碼小或「γ」(伽瑪)次單元之基因包括dhaB3 (編碼序列示於SEQ ID NO:13，經編碼蛋白質序列示於SEQ ID NO:14)、gldC 及dhaE 。編碼二醇脫水酶之大或「α」次單元的其他基因包括pduC 及pddA ；編碼中或「β」次單元的其他基因包括pduD 及pddB ；而編碼小或「γ」次單元的其他基因包括pduE 及pddC 。

甘油及二醇脫水酶會受到甘油及某些其他受質所引發的機制性自殺去活化作用(Daniel等人，FEMS Microbiol. Rev. 22 ,553(1999))。術語「脫水酶再活化因子」係指負責再活化脫水酶活性的該等蛋白質。術語「脫水酶再活化活性」、「再活化脫水酶活性」及「再生脫水酶活性」可交替使用，並表示將不能催化反應之脫水酶轉化成能催化反應者的現象，或表示抑制脫水酶去活化的現象或在活體內延長脫水酶有用之半生期的現象。兩種蛋白質已被鑑定涉及作為脫水酶再活化因子(詳見例如美國專利第6,013,494號及其參考文獻；Daniel等人，同前文；Toraya及Mori,J. Biol. Chem. 274 ,3372(1999)；以及Tobimatsu等人，J. Bacteriol. 181 ,4110(1999))。編碼前述蛋白質之一的基因包括例如orfZ 、dhaB4 、gdrA 、pduG 及ddrA 。編碼前述兩種蛋白質之第二者的基因包括例如orfX 、orf2b 、gdrB 、pduH 及ddrB 。

術語「1,3-丙二醇氧化還原酶」、「1,3-丙二醇去氫酶」及「DhaT」於本文可交替使用，並表示具有能催化3-HPA與1,3-丙二醇之相互轉換之酶活性的多胜肽，只要編碼此活性之該基因被發現於其天然(即野生型)狀態係物理性或轉錄性連接至脫水酶；舉例而言，在源自克留氏肺炎桿菌之dhaT 的情況中，該基因被發現於dha 調控子中。編碼1,3-丙二醇氧化還原酶之基因包括但不限於源自克留氏肺炎桿菌、弗氏檸檬酸桿菌及巴斯德氏芽胞梭菌之dhaT 。這些基因各別編碼屬於第三型醇去氫酶家族之多胜肽，其呈現一保留性鐵結合模體(motif)，且具有3-HPA與1,3-丙二醇之NAD⁺ /NADH連鎖互變的傾向(Johnson及Lin,J. Bacteriol. 169 ,2050(1987)；Daniel等人，J. Bacteriol. 177 ,2151(1995)；及Leurs等人，FEMS Microbiol. Lett. 154 ,337(1997))。具有相似物性之酶已由短毛乳酸桿菌(Lactobacillus brevis )及布氏乳酸桿菌(Lactobacillus buchneri )中分離出來(Veigada Dunha及Foster，Appl. Environ. Microbiol. 58 ,2005(1992))。

術語「dha 調控子」係指一組相關的聚核苷酸或開放讀碼框架，其編碼具有各種生物活性之多胜肽，包括但不限於脫水酶活性、再活化活性及1,3-丙二醇氧化還原酶。典型上，dha 調控子包含開放讀碼框架dhaR 、orfY 、dhaT 、orfX 、orfW 、dhaB1 、dhaB2 、dhaB3 及orfZ ，如美國專利第7,371,558中所述。

術語「醛去氫酶」及「Ald」係指一種催化醛轉化成羧酸之多胜肽。醛去氫酶可使用一種氧化還原輔因子，例如NAD、NADP、FAD或PQQ。典型的醛去氫酶為EC 1.2.1.3(NAD-依賴性)；EC 1.2.1.4(NADP-依賴性)；EC 1.2.99.3(PQQ-依賴性)；或EC 1.2.99.7(FAD依賴性)。NADP-依賴性醛去氫酶之實例為AldB(SEQ ID NO:16)，其由大腸桿菌基因aldB(編碼序列示於SEQ ID NO:15)所編碼。NAD-依賴性醛去氫酶之實例包括AldA(SEQ ID NO:18)，其由大腸桿菌基因aldA (編碼序列示於SEQ ID NO:17)所編碼；以及AldH(SEQ ID NO:20)，其由大腸桿菌基因aldH (編碼序列示於SEQ ID NO:19)所編碼。

術語「葡萄糖激酶」及「Glk」於本文可交替使用，且意指一種催化D-葡萄糖+ATP轉化成葡萄糖6-磷酸酯+ADP之蛋白質。典型的葡萄糖激酶為EC 2.7.1.2。葡萄糖激酶在大腸桿菌中係由glk 所編碼。

術語「磷酸烯醇丙酮酸羧基酶」及「Ppc」於本文可交替使用，且意指一種催化磷酸烯醇丙酮酸+H₂ O+CO₂ 轉化成磷酸酯+草醯乙酸之蛋白質。典型的磷酸烯醇丙酮酸羧基酶為EC 4.1.1.31。磷酸烯醇丙酮酸羧基酶在大腸桿菌中係由ppc 所編碼。

術語「甘油醛-3-磷酸去氫酶」及「GapA」於本文可交替使用，且意指一種具有能催化甘油醛-3-磷酸酯+磷酸酯+NAD⁺ 轉化成3-磷酸-D-甘油醯基-磷酸酯+NADH+H⁺ 之催化活性的蛋白質。典型的甘油醛-3-磷酸去氫酶為EC 1.2.1.12。甘油醛-3-磷酸去氫酶在大腸桿菌中係由gapA 所編碼。

術語「有氧呼吸調控蛋白」及「ArcA」於本文可交替使用，且意指一種球狀調控蛋白質。該有氧呼吸調控蛋白在大腸桿菌中係由arcA 所編碼。

術語「甲基乙二醛合成酶」及「MgsA」於本文可交替使用，且意指一種具有能催化二羥基丙酮磷酸轉化成甲基乙二醛+磷酸酯之催化活性的蛋白質。典型的甲基乙二醛合成酶為EC 4.2.3.3。甲基乙二醛合成酶在大腸桿菌中係由mgsA 編碼。

術語「磷酸葡萄糖酸脫水酶」及「Edd」於本文可交替使用，且意指一種具有能催化6-磷酸-葡萄糖酸酯轉化成2-酮-3-去氧-6-磷酸-葡萄糖酸酯+H₂ O之催化活性的蛋白質。典型的磷酸葡萄糖酸脫水酶為EC 4.2.1.12。磷酸葡萄糖酸脫水酶在大腸桿菌中係由edd 編碼。

術語「YciK」係指一種推定的酶，其經由轉譯偶合至btuR 的yciK 所編碼，其為在大腸桿菌中編碼鈷胺素(Cob(I)alamin)腺苷轉移酶的基因。

術語「鈷胺素腺苷轉移酶」係指一種能自ATP轉移去氧腺苷基部分至經還原的類咕(corrinoid)的酶。典型的鈷胺素腺苷轉移酶為EC 2.5.1.17。鈷胺素腺苷轉移酶在大腸桿菌中係由基因「btuR 」所編碼、在鼠傷寒沙門桿菌中係由「cobA 」所編碼，而在脫氮假單孢桿菌(Pseudomonas denitrificans )中係由「cobO 」所編碼。

術語「半乳糖-質子共同轉運子(symporter)」及「GalP」於本文可交替使用，並表示一種具有能由細胞周質運送糖及質子至細胞質之催化活性的蛋白質。D-葡萄糖為GalP之較佳受質。半乳糖-質子共同轉運子在大腸桿菌中係由galP 編碼(編碼序列示於SEQ ID NO:21，經編碼蛋白質序列示於SEQ ID NO:22)。

術語「非特異性催化活性」係指該多胜肽具有能催化3 HPA及1,3-丙二醇相互轉換之催化活性，且明確地排除1,3-丙二醇氧化還原酶。典型地，這些酶為醇去氫酶。此等酶可利用NAD+/NADH以外的輔因子，包括但不限於黃素類(flavin)，例如FAD或FMN。已發現一種非特異性醇去氫酶(yqhD )之基因係被例如內源性編碼及功能性表現於大腸桿菌K-12菌株中。

術語「1.6長GI啟動子」、「1.20短/長GI啟動子」及「1.5長GI啟動子」係指含有源自變鉛青鏈黴菌(Streptomyces lividans )葡萄糖異構酶基因之啟動子的多核苷酸或片段，如美國專利第7,132,527號所述者。相較於野生株變鉛青鏈黴菌葡萄糖異構酶基因啟動子，這些啟動子片段包括降低其活性之突變。

術語「功能」及「酶功能」於本文可交替使用，並表示在發生特定化學反應上改變速率而本身不因該反應而消耗的酶之催化活性。可理解的是，此活性可適用於平衡狀態下之反應，其中產物或受質之製造可在適當條件下完成。

術語「多胜肽」及「蛋白質」於本文可交替使用。

術語「碳受質」及「碳源」於本文可交替使用，並表示能被本文所述重組細菌代謝之碳源，特別是包含蔗糖之碳源。該碳源另可包含其他單醣類、雙醣類、寡醣；或多醣。

術語「宿主細胞」及「宿主細菌」於本文可交替使用，並表示能夠接受外源或異源基因，且能夠表現這些基因以製造活性基因產物之細菌。

如本文所使用之術語「生產用微生物」係指微生物，包括但不限於經重組者，其可用於製造特定產物，例如1,3-丙二醇、甘油、3-羥基丙酸、多元不飽和脂肪酸及其類似物。

如本文中所使用，「核酸」意指多核苷酸，且包含去氧核糖苷酸或核糖核苷酸鹼基之單股或雙股之聚合物。核酸亦包含片段及經修飾之核苷酸。因此，術語「多核苷酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」或「核酸片段」於本文可交替使用，並表示單股或雙股之RNA或DNA之聚合物，視需要含有合成、非天然或經修改之核苷酸鹼基。核苷酸(通常以其5’-單磷酸酯形式存在)係以如下之單一字母命名：「A」用於腺苷酸或去氧腺苷酸(各用於RNA或DNA)，「C」用於胞苷酸或去氧胞苷酸，「G」用於鳥苷酸或去氧鳥苷酸，「U」用於尿苷酸，「T」用於去氧胸苷酸，「R」用於嘌呤類(A或G)，「Y」用於嘧啶類(C或T)，「K」用於G或T，「H」用於A或C或T，「I」用於肌苷，而「N」用於任何核苷酸。

多核苷酸可為一種單股或雙股RNA或DNA之聚合物，其視需要含有合成、非天然或經修改之核苷酸鹼基。以DNA之聚合物形式存在之多核苷酸可由一或多段cDNA、基因組DNA、合成DNA或其混合物所組成。

「基因」係指表現一特定蛋白質之核酸片段，且其可單獨表示編碼區域或可包括在編碼序列之前(5'非編碼序列)及之後(3'非編碼序列)的調控序列。「天然基因」係指發現於自然界且具有其特有調控序列的基因。「嵌合基因」係指非天然基因的任何基因，包含並非一起發現於自然界之調控及編碼序列。因此，嵌合基因可包含不同來源所衍生之調控序列及編碼序列，或相同來源但以不同於自然界所發現之方式排列所衍生之調控序列及編碼序列。「內源基因」係指在有機體基因組之天然位置中之天然基因。「外源」基因係指一種經由基因轉殖被導入有機體宿主之基因。外源基因可包含插入非天然有機體之基因、導入天然宿主內新位置之基因或嵌合基因。

術語「天然核苷酸序列」係指在常態下發現於宿主微生物之核苷酸序列。

術語「非天然核苷酸序列」係指在非常態下發現於宿主微生物之核苷酸序列。

術語「天然多胜肽」係指在常態下發現於宿主微生物之多胜肽。

術語「非天然多胜肽」係指在非常態下發現於宿主微生物之多胜肽。

術語「編碼(encoding)」及「編碼(coding)」於本文可交替使用，並表示基因經由轉錄及轉譯機制而製造胺基酸序列的過程。

術語「編碼序列」係指編碼一特定胺基酸序列之核苷酸序列。

「適當調控序列」係指位於編碼序列之上游(5'非編碼序列)、其中或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，且其影響轉錄、RNA處理或安定性或相關編碼序列之轉譯。調控序列可包括啟動子、增強子、靜默子(silencer)、5’未轉譯前導序列(例如介於轉錄起始位與轉譯起始密碼子之間)、插入子、多腺苷酸化識別序列、RNA處理區、效應子(effector)結合區及莖-環結構。

術語「表現匣(expression cassette)」係指一DNA片段，其包含經選定基因之編碼序列及該編碼序列之前(5'非編碼序列)及之後(3'非編碼序列)的調控序列，其為該經選定基因產物之表現所需。因此，表現匣典型上具有下列組成：1)一啟動子序列；2)一編碼序列(即ORF)及3)一3'未轉譯區域(例如終止子(terminator))，其在真核細胞中通常含有多腺苷酸化區。表現匣通常被包含於載體內以促進選殖及轉形。不同有機體，包括細菌、酵母菌及真菌，只要各宿主使用正確的調控序列，皆可以不同表現匣轉形。

「轉形」係指轉殖核酸分子進入宿主有機體，以造成遺傳上穩定之遺傳性。核酸分子可為例如一種自主複製之質體，或其可整合至宿主有機體之基因組。以核酸片段轉形之宿主有機體可被稱為「重組」或「轉形」有機體或「轉形體」。「安定的轉形」係指轉殖核酸片段進入宿主有機體之基因組內，包括細胞核及胞器基因組兩者，以造成遺傳上穩定之遺傳性。相較之下，「暫時轉形」則係指轉殖核酸片段進入宿主有機體之細胞核或含DNA之胞器，在未整合或非穩定遺傳性的情形下造成基因表現。

「密碼子退化」係指在遺傳密碼中允許核苷酸序列變化而不影響編碼多胜肽之胺基酸序列的性質。通常知識者可知，使用核苷酸密碼子之特定宿主細胞呈現「密碼子偏好」以具體指定特定胺基酸。因此，當合成用於在宿主細胞內改良表現的基因時，希望能設計基因以讓密碼子使用之頻率接近宿主細胞偏好密碼子使用之頻率。

術語「其功能相當的次片段」及「功能相當之次片段」於本文可交替使用。這些術語係指經分離核酸片段之一部分或次序列，其中改變基因表現或產生某些表現型之能力被保留，無論該片段或次片段是否編碼活性酶。無論是否編碼活性酶，嵌合基因皆可在相對於啟動子序列之正義(sense)或反義(antisense)方向上藉由連接核酸片段或其次片段而設計成用於抑制。

術語「保留區域(conserved domain)」或「模體」意指一組胺基酸，其於沿著演化上相關蛋白質之排列序列的特定位置上具有保留。儘管位於其他位置之胺基酸在同源蛋白質之間可變化，但在特定位置高度保留之胺基酸代表在蛋白質之結構、安定性或活性上為必要的胺基酸。

術語「實質上相似」及「實質上對應」於本文可交替使用。其表示在核酸片段中一或多個核苷酸鹼基上之變化並不影響該核酸片段調控基因表現或製造某些表現型之能力。這些術語亦指對本發明核酸片段之修飾，例如刪除或插入一或多個核苷酸，其相對於原始未修飾的片段實質上並不改變所產生之核酸片段的功能性質。因此，具有通常知識者可知，本發明不僅包含特定例示之序列。此外，具有通常知識者可知，本發明所包含之實質上相似的核酸序列亦可由其與本文所例示之序列或本文所揭示之核苷酸序列之任何部分的雜交能力所界定(在中度嚴格條件下，例如0.5X SSC(標準檸檬酸鈉)、0.1% SDS(十二基硫酸鈉)、60℃)，且其功能上相當於本文所揭示之任何核酸序列。可調整嚴格條件以篩選中度相似片段，例如來自疏遠關係之有機體之同源序列，及篩選高度相似片段，例如來自密切相關有機體之複製功能酶的基因。雜交後洗滌決定嚴格條件。

術語「選擇性雜交」包括在嚴格雜交條件下，將核酸序列雜交至一特定核酸標的序列，其可偵測程度比其雜交至非標的核酸序列及雜交至實質上排除之非標的核酸更高(例如至少超過背景值2倍)。選擇性雜交序列是指兩種核苷酸序列，其中一核苷酸序列之一互補體典型上對於另一核苷酸序列具有約至少80%的序列同一性或90%的序列同一性，至多且包含100%的序列同一性(即完全互補)。

術語「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」包括其中探針可選擇性雜交至其標的序列的條件。探針典型上為單股核酸序列，其互補於欲被偵測的核酸序列。探針係「可雜交」至欲被偵測的核酸序列。一般而言，探針長度少於約1000個核苷酸，且視需要而定，長度可少於500個核苷酸。

雜交法已被充分界定。典型上，探針及樣本在允許核酸雜交之條件下進行混合。此包含在無機或有機鹽存在下且於適當濃度及溫度條件下使探針及樣本接觸。視需要可添加分離促進劑(chaotropic agent)。核酸雜交適於各種分析形式。一種最適者為三明治分析形式。三明治型分析之主要成分為一固體支撐物。該固體支撐物已吸附或共價偶合固定化核酸探針，其未被標示且互補於序列之一部分。

嚴格條件具有序列依賴性且將依不同情形而不同。藉由控制雜交及/或洗滌條件之嚴格性，可鑑定100%互補於探針(同源探測)的標的序列。或者可調整嚴格條件以容許在序列中的一些失配(mismatch)，以便偵測較低的同一性(異源探測)。

典型上，嚴格條件為pH 7.0至8.3，鹽濃度小於約1.5 M之Na離子，典型上約0.01至1.0 M之Na離子濃度(或其他鹽類)，且用於短探針(例如10至50個核苷酸)之溫度為至少約30℃，而用於長探針(例如多於50個核苷酸)之溫度為至少約60℃。嚴格條件亦可藉由添加去安定劑達成，例如甲醯胺。例示性低度嚴格條件包括在30至35%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS(十二基硫酸鈉)之緩衝溶液於37℃的雜交，並在1X至2X SSC(20X SSC=3.0 M NaCl/0.3 M三檸檬酸鈉)中於50至55℃進行洗滌。例示性中度嚴格條件包括在40至45%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS於37℃的雜交，並在0.5X至1X SSC中於55至60℃進行洗滌。例示性高度嚴格條件包括於50%甲醯胺、1 M NaCl、1% SDS於37℃的雜交，並在0.1X SSC中於60至65℃進行洗滌。

特異性典型上與雜交後洗滌有關，決定性的因子為離子強度及最終清洗溶液之溫度。就DNA-DNA雜交而言，熱熔點(T_m )可藉由Meinkoth等人所提出之方程式Anal. Biochem. 138:267-284(1984): T_m =81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(% form)-500/L估計之；其中M為單價陽離子之莫耳濃度，%GC為鳥苷及胞苷核苷酸於DNA之百分比，% form為甲醯胺於雜交溶液之百分比，以及L為鹼基對中雜交之長度。T_m 為50%之互補標的序列與完全配對探針雜交之溫度(於定義的離子強度及pH)。每1%之失配會使T_m 減少約1℃；因此，可調整T_m 、雜交及/或洗滌條件以與所欲同一性之序列雜交。舉例而言，若欲尋求90%同一性的序列，則T_m 可減少10℃。一般而言，嚴格條件係選定在所定義的離子強度及pH低於特定序列及其互補體之T_m 約5℃者。然而，極度嚴格條件可在低於T_m 的1、2、3或4℃利用雜交及/或洗滌；中度嚴格條件可在低於T_m 的6、7、8、9或10℃利用雜交及/或洗滌；低度嚴格條件可在低於T_m 的11、12、13、14、15或20℃利用雜交及/或洗滌。使用此方程式、雜交及洗滌組成物及理想T_m ，具有通常知識者可了解雜交嚴格度及/或洗滌溶液的變換是固有地被描述的。若所欲失配程度造成T_m 低於45℃(水溶液)或32℃(甲醯胺溶液)，則較佳係增加SSC濃度俾利使用較高溫度。核酸雜交之完整說明可見於Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I,Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,New York(1993)；及Current Protocols in Molecular Biology ,Chapter 2,Ausubel等人，Eds.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1995)。雜交及/或洗滌條件可被施用至少10、30、60、90、120或240分鐘。

於核酸或多胜肽序列的上下文中，「序列同一性」或「同一性」係指，當於一特定比對視窗中作最大相關性排列時，兩序列中的核酸鹼基或胺基酸殘基為相同。

如此，「序列同一性之百分比」係指藉由於比對視窗中比較兩個最適化排列序列所決定的值，其中，對於兩序列之最適化排列而言，相較於參考序列(不包含添加或刪除者)，比較視窗中之多核苷酸或多胜肽序列之部分可包含添加或刪除者(即間隙(gaps))。百分比係經由以下方式計算：決定在該位置上相同核酸鹼基或胺基酸殘基同時出現於兩序列中的位置數目，以獲得相配位置的數目；將相配位置的數目除以比較視窗中位置之總數；並將此結果乘以100而獲得序列同一性之百分比。序列同一性百分比有用的實例包括但不限於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或50%至100%之任何整數百分比。這些同一性可使用本文所述之任一種程式測定。

可使用各種設計用來偵測同源序列的比較方法測定序列排列及同一性或相似性百分比計算，包括但不限於LASERGENE生物資訊學計算套組之MegAlign^TM 程式(DNASTAR Inc.,Madison,WI)。在本說明書之上下文中，將可理解當使用序列分析軟體進行分析時，分析結果將基於所參照之程式的「預設值(default value)」，除另有指明。如本文所使用，「預設值」意指當第一次設定時原本即載入於軟體的任何一組數值或參數。

「Clustal V比對法」對應於標示為Clustal V之比對法(揭示於Higgins及Sharp,CABIOS. 5:151-153(1989);Higgins,D.G.等人，Comput. Appl. Biosci. 8 :189-191(1992))，並見於LASERGENE生物資訊學計算套組之MegAlign^TM 軟體(DNASTAR Inc.,Madison,WI)。就多重排列而言，該預設值相當於GAP PENALTY=10及GAP LENGTH PENALTY=10。使用Clustal V方法進行配對排列及蛋白質序列同一性百分比之計算的預設參數為KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5及DIAGONALS SAVED=5。對於核酸而言，這些參數為KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4及DIAGONALS SAVED=4。於使用Clustal V程式進行序列排列後，藉由檢視在相同程式中之「序列間距」表即可獲得「同一性百分比」。

「Clustal W比對法」對應於標示為Clustal W之比對法(揭示於Higgins及Sharp，同前文；Higgins,D.G.等人，同前文)，並見於LASERGENE生物資訊學計算套組之MegAlign^TM v6.1程式(DNASTAR Inc.,Madison,WI)。用於多重排列之預設參數相當於GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.2、Delay Divergen Seqs(%)=30、DNA Transition Weight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet Series、DNA Weight Matrix=IUB。於使用Clustal W程式進行序列排列後，藉由檢視在相同程式中之「序列間距」表即可獲得「同一性百分比」。

「BLASTN比對法」為國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)所提供用來使用預設參數以比對核苷酸序列之演算法。

具有通常知識者可瞭解，許多程度的序列同一性可用於自其他品種鑑定多胜肽，其中此種多胜肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比之有用實例包括但不限於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或由50%至100%之任何整數百分比。的確，任何由50%至100%之整數胺基酸同一性皆可用於描述本發明，例如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。此外，此經單離之核苷酸片段的任何全長或部分互補體也值得注意。

如此，本發明不僅僅包含本文揭示之特定例示核苷酸序列。舉例而言，本發明亦包含反應遺傳密碼退化現象之基因序列的改變。又，本技術領域中已熟知，會造成在特定位置上化學上均等之胺基酸的產生，但不會影響所編碼的蛋白質之功能性質的基因改變是很常見的。本文中討論的取代被定義為下列五個群組之一者的改變：

1.　小的脂肪族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.　極性、帶負電殘基及其醯胺類：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.　極性、帶正電殘基：His、Arg、Lys；

4.　大的脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及

5.　大的芳香族殘基：Phe、Tyr、Trp。

如此，胺基酸丙胺酸(疏水性胺基酸)之密碼子可被編碼其他較不疏水性的殘基(例如甘胺酸)或更為疏水性的殘基(例如纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)之密碼子所取代。相似地，造成一個帶負電殘基取代另一者的變化(例如以天門冬胺酸取代麩胺酸)或一個帶正電殘基取代另一者的變化(例如以離胺酸取代精胺酸)亦可被預期可用來製造功能相當的產物。於許多情形中，造成蛋白質分子之N-終端及C-終端部分的改變的核苷酸變化亦被預期不會改變蛋白質活性。

每一種被提出的修飾皆為本技術領域的常規技術，如同測定經編碼產物之生物活性的保持狀態一般。此外，具有通常知識者可知，本發明所包含之實質上相似序列亦由其於嚴格條件下雜交的能力而定義，如前文所定義。

本發明較佳的實質上相似核酸片段為一核酸片段，其核苷酸序列至少70%相同於本文所描述之核酸片段的核苷酸序列。更佳的核酸片段為至少90%相同於本文所描述之核酸片段的核苷酸序列。最佳者為核酸片段係至少95%相同於本文所描述之核酸片段之核苷酸序列者。

胺基酸或核苷酸序列之一「實質部分」為包含充足之多胜肽之胺基酸序列或基因之核苷酸序列的部分，其可利於藉由具有通常知識者之序列的人工評估，或藉由使用例如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul,S.F.等人，J. Mol. Biol., 215:403-410(1993))之演算法的電腦自動化序列比對及鑑定，而推定地鑑定該多胜肽或基因。一般而言，為了推定地鑑定一多胜肽或核酸序列是否與已知蛋白質或基因同源，十個或更多的鄰接胺基酸或三十個或更多的核苷酸之序列是必要的。再者，關於核苷酸序列，含20至30個鄰接核苷酸之基因特異性寡核苷酸探針可使用於基因鑑定之序列依賴性方法(例如南方雜交)及單離(例如在細菌菌落或噬菌體溶菌斑之原位雜交)。此外，可使用12至15個鹼基的短寡核苷酸作為PCR的增幅引子，以便獲得包含該引子之特定核酸片段。因此，核苷酸序列之「實質部分」包含特異性地鑑定及/或單離包含此序列之核酸片段的足夠序列。本說明書教示此完整的胺基酸及編碼特定蛋白質之核苷酸序列。了解本文記載之序列的通常知識者，現可使用所揭示序列之全部或實質部分於該等通常知識者所知的目的。

術語「互補」描述兩核苷酸鹼基序列的關係，當其以反平行定向排列時，兩核苷酸鹼基序列能夠形成華森-克里克鹼基配對(Watson-Crick base-pairing)。舉例而言，就DNA而言，腺苷能夠與胸嘧啶進行鹼基配對，而胞苷能夠與鳥嘌呤進行鹼基配對。因此，本發明可使用經單離之核酸分子，其互補於附隨之序列表及說明書中所記載之完整序列，亦可使用與其實質上相似的核酸序列。

術語「經單離」係指由至少一與其天然結合之成分單離之多胜肽或核苷酸序列。

「啟動子」係指一種能調控編碼序列或功能性RNA表現的DNA序列。啟動子序列由近端及較遠端的上游基因元件(element)所組成，而後者通常稱為增強子。因此，「增強子」為一種可刺激啟動子活性之DNA序列，且可為啟動子之固有基因元件或被插入的異源性基因元件，用以增強啟動子之組織特異性。啟動子可為其整體衍生自天然基因，或由衍生自於自然界發現的不同啟動子之不同基因元件所構成，或甚至包含合成的DNA段。具有通常知識者可了解，不同啟動子可於不同組織或細胞種類、或於不同發展階段或對不同環境條件反應而引導基因表現。可更進一步體認的是，由於大部分情形中調控序列之明確邊界尚未被完全界定，故一些變異的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。引起基因於大部分時間在大部分細胞種類中表現的啟動子通常被稱為「組成型啟動子(constitutive promoters)」。

「3’非編碼序列」、「轉錄終止子」及「終止序列」於本文可交替使用，且表示位於編碼序列下游之DNA序列，包括多腺苷酸化識別序列及其他編碼能夠影響mRNA處理或基因表現之調控訊號的序列。多腺苷酸化訊號之特徵通常在於影響多腺苷酸束添加到mRNA前驅物的3’端。

術語「可操作地連結」係指核酸序列於單一核酸片段之關聯性，以使其中一者的功能受另一者影響。舉例而言，當啟動子能影響一編碼序列之表現時(即編碼序列係於啟動子之轉錄控制)，該啟動子係可操作地連結至該編碼序列。編碼序列可藉由正義或反義定向而被可操作地連結至調控序列。在另一實例中，本發明之互補RNA區可被可操作地直接或間接連結5’至目標mRNA、或3’至目標mRNA、或於目標mRNA中、或第一互補區為5’且其互補體為3’至目標mRNA。

本文使用之標準重組DNA及分子選殖技術為此項技藝中所熟知，且較充分地記載於Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor,NY(1989)。轉形方法為該等具有通常知識者所熟知並描述於下文。

「PCR」或「聚合酶連鎖反應」為一種大量合成特定DNA片段之技術，且由一系列重複循環步驟所構成(Perkin Elmer Cetus Instruments,Norwalk,CT)。典型地，將雙股DNA加熱變性，將兩個與目標片段之3’邊界互補之引子於低溫黏合，然後於中溫進行延長。一組包含此等三個連續步驟者被稱為一個「循環」。

「質體」或「載體」為一個通常帶有非此細胞必要代謝部分基因的染色體外基因元件，且通常以環形雙股DNA片段的形式存在。此種基因元件可為單股或雙股DNA或RNA之直線或環形的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其可衍生自任何來源，其中許多核苷酸序列已被結合或重組為一種能夠將表現匣導入至細胞中的獨特構築體。

術語「基因上的改變」係指經由基因工程、轉形及/或突變來改變遺傳物質之過程。

術語「重組」係指序列之兩個原本分離的片段的人工重組，例如藉由化學合成或藉由以基因工程技術達成核酸經單離片段的操作。「重組」亦可指細胞或載體，其已藉由導入異源性核酸而被修飾，或衍生自經修飾之細胞的細胞，但未包含經自然發生現象而改變的細胞或載體(例如自發突變、自然轉形、自然轉導、自然轉位)，例如無人為蓄意介入之現象。

術語「重組構築體」、「表現構築體」、「嵌合構築體」、「構築體」及「重組DNA構築體」於本文可交替使用。重組構築體包含核酸片段之人工組合，例如於自然界中未被一起發現的調控及編碼序列。舉例而言，重組構築體可包含衍生自不同來源的調控序列及編碼序列，或衍生自相同來源但以不同於自然界所發現的方式排列的調控序列及編碼序列。此種構築體可單獨使用或可與載體結合使用。若有使用載體，則載體之選擇會取決於用以轉形宿主細胞之方法，如具有通常知識者所熟知。舉例而言，可使用質體載體。具有通常知識者非常清楚必須存於載體之基因元件，其為成功地轉形、篩選及增殖包含本發明任一種經單離的核酸片段所需。具有通常知識者亦體認到不同的獨立轉形事件可能造成表現之不同程度及態樣(Jones等人，EMBO J. 4:2411-2418(1985);De Almeida等人，Mol. Gen. Genetics 218:78-86(1989))，因此可能必須篩選多個事件以便獲得呈現所欲表現量及態樣之品系。此種篩選可藉由DNA之南方分析、mRNA表現之北方分析、蛋白質表現之免疫墨漬分析或表現型分析等方法達成。

如本文所使用者，術語「表現」係指功能終產物之生產(例如mRNA或蛋白質[無論是前驅物或成熟物])。

術語「導入」意指將核酸(例如表現構築體)或蛋白質提供至細胞中。導入一詞包括將核酸併入真核或原核細胞中，其中該核酸可被併入細胞之基因組，且包括暫時提供核酸或蛋白質至細胞。導入一詞包括安定或暫時的轉形方法，也包括性交聯。因此，當討論到將核酸片段(例如重組構築體/表現構築體)插入細胞時，「導入」意指「轉染」或「轉形」或「轉導」，且包括將核酸片段併入真核或原核細胞中，其中該核酸片段可被併入細胞之基因組(例如染色體、質體、原質體(plastid)或粒線體DNA)、被轉化成自主性複製子(replicon)或暫時地被表現(例如轉染的mRNA)。

術語「同源」係指具有相似催化功能之共同演化來源的蛋白質或多胜肽。本發明可包括藉由重組技術產生同源蛋白質之細菌。

本文所揭示者為經改造以藉由來自螢光假單胞菌(P. fluorescens )的新穎蔗糖利用基因而利用蔗糖之重組細菌。具體而言，本文所述之重組細菌於其基因組中或至少一重組構築體上包含：一核苷酸序列，其編碼一具有蔗糖轉運子活性之多胜肽，當基於一Clustal V比對法與一SEQ ID NO:24所示之胺基酸序列比對時，該多胜肽具有至少95%的序列同一性；以及一核苷酸序列，其編碼一具有蔗糖水解酶活性之多胜肽，當基於一Clustal V比對法與一SEQ ID NO:26所示之胺基酸序列比對時，該多胜肽具有至少95%的序列同一性。該等核苷酸序列各自可操作地連接至相同或相異的啟動子。在某些實施例中，該等重組細菌能夠代謝蔗糖以製造甘油及/或甘油衍生產物。

適用於構築本文揭示之重組細菌的宿主細菌包括但不限於以下菌屬之有機體：艾氏菌屬、鏈球菌屬、農桿菌屬、芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬、乳酸桿菌屬、芽胞梭菌屬、葡萄桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克留氏菌屬、產氣桿菌屬、甲基桿菌屬、沙門氏菌屬、鏈黴菌屬及假單胞菌屬。

在一實施例中，宿主細菌係選自以下菌屬：艾氏菌屬、克留氏菌屬、檸檬酸桿菌屬及產氣桿菌屬。

在另一實施例中，宿主細菌為大腸桿菌。

在某些實施例中，宿主細菌為PTS欠缺。在此等實施例中，宿主細菌之天然狀態為PTS欠缺，或可透過如下文所述之PTS基因去活化作用而成為PTS欠缺。

於生產用微生物中，有時需要將糖的運送和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的使用去連結，用以磷酸化被運輸的糖。

術語「向下調控」係指減少或取消活性蛋白質的活性，此係相較於野生型蛋白質之活性。經由向下調控編碼於此類運輸中所需之蛋白質的一或多個內源基因之表現，可將PTS去活化(造成「PTS缺失」之有機體)。一般向下調控發生於當一或多個此等基因具有「瓦解」時，即於基因之一部份發生插入、刪除或目標突變，而造成完全的基因剔除(使基因自基因組刪除且無蛋白質被轉譯)或蛋白質已被轉譯因而其已具有插入、刪除、胺基酸取代或其他目標的突變。蛋白質內瓦解的位置可為例如於蛋白質之N-終端部位或於蛋白質之C-終端部位。相對於未被瓦解之蛋白質，經瓦解的蛋白質會有降低的活性，且可為無功能性。造成蛋白質低度或缺乏表現之向下調控亦可經由操作調控序列、轉錄及轉譯因子及/或訊號傳導路徑或經由正義、反義或RNAi技術等之使用而達成。

蔗糖轉運子多胜肽為能夠媒介蔗糖轉運至微生物細胞內之多胜肽。蔗糖轉運多胜肽為本領域中已知者，例如來自大腸桿菌野生型株EC3132之CscB多胜肽(示於SEQ ID NO:28)，其由cscB 基因所編碼(編碼序列示於SEQ ID NO:27)，如Jahreis等人所述(J. Bacteriol. 184:5307-5316,2002)。來自螢光假單胞菌Pf5 ATCCBAA-477之lacY 基因(編碼序列示於SEQ ID NO:23)編碼41%相似於已知大腸桿菌株EC3132之蔗糖轉運蛋白質CscB的多胜肽(示於SEQ ID NO:24)。然而，此多胜肽並無已知活性被證實。

在一實施例中，當基於BLASTN比對法與示於SEQ ID NO:23之核苷酸序列比對時，編碼具有蔗糖轉運子活性之多胜肽之核苷酸序列具有至少95%的序列同一性。

在另一實施例中，編碼具有蔗糖轉運子活性之多胜肽之核苷酸序列具有SEQ ID NO:23所示之核苷酸序列。

在一實施例中，當基於Clustal V比對法與示於SEQ ID NO:24之胺基酸序列比對時，具有蔗糖轉運子活性之多胜肽具有至少95%的序列同一性。

在另一實施例中，具有蔗糖轉運子活性之多胜肽具有SEQ ID NO:24所示之胺基酸序列。

具有蔗糖水解酶活性之多胜肽具有能夠催化蔗糖水解以製造果糖及葡萄糖之能力。具有蔗糖水解酶活性之多胜肽為已知者，且包括來自大腸桿菌野生株EC3132之CscA(示於SEQ ID NO:30)，其係由基因cscA所編碼(編碼序列示於SEQ ID NO:29)，如Jahreis等人所述(J. Bacteriol. 184:5307-5316,2002)。來自螢光假單胞菌Pf5 ATCCBAA-477之scrB基因(編碼序列示於SEQ ID NO:25)編碼47%相似於已知大腸桿菌株EC3132之蔗糖水解酶CscA的多胜肽(示於SEQ ID NO:26)。然而，此多胜肽並無已知活性被證實。

在一實施例中，當基於BLASTN比對法與示於SEQ ID NO:25之核苷酸序列比對時，編碼具有蔗糖水解酶活性之多胜肽之核苷酸序列具有至少95%的序列同一性。

在另一實施例中，編碼具有蔗糖水解酶活性之多胜肽之核苷酸序列具有示於SEQ ID NO:25之核苷酸序列。

在一實施例中，當基於Clustal V比對法與示於SEQ ID NO:26之胺基酸序列比對時，具有蔗糖水解酶活性之多胜肽具有至少95%的序列同一性。

在另一實施例中，具有蔗糖水解酶活性之多胜肽具有示於SEQ ID NO:26之胺基酸序列。

本文揭示之重組細菌於其基因組中或至少一重組構築體上可進一步包含編碼具有果糖激酶活性之多胜肽之核苷酸序列，以使該細菌能利用經蔗糖水解而製造的果糖。具有果糖激酶活性之多胜肽包括果糖激酶(代碼為EC 2.7.1.4)及各種具有果糖磷酸化活性之己糖激酶(EC 2.7.1.3及EC 2.7.1.1)。果糖磷酸化活性可由己糖激酶及己酮糖激酶所展現。表1列舉編碼來自各種微生物之多胜肽的代表性基因，其可用於構築本文揭示之重組細菌。具有通常知識者可知，亦可使用實質上相似於一種能夠磷酸化果糖之蛋白質(例如經表1所列基因所編碼者)之蛋白質。

在一實施例中，當基於Clustal V比對法與示於SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46之胺基酸序列相比對時，具有果糖激酶活性之多胜肽具有至少95%的序列同一性。

在另一實施例中，具有果糖激酶活性之多胜肽具有示於SEQ ID NO:40之胺基酸序列。

編碼具有蔗糖轉運子活性之多胜肽及具有蔗糖水解酶活性之多胜肽的基因之編碼序列可用於單離編碼來自相同或其他微生物種之同源多胜肽的核苷酸序列。舉例而言，可使用序列分析軟體(例如BLASTN)來搜尋公開可得之核酸序列資料庫以鑑定此等基因之同源物。此外，使用序列依賴性程序進行同源基因的單離為本領域中所熟知者。序列依賴性程序之實例包括但不限於藉由核酸增幅技術之各種用途所例示的核酸雜交法及DNA及RNA增幅法(例如聚合酶連鎖反應(PCR)，Mullis等人之美國專利第4,683,202號；接合酶連鎖反應(LCR)，Tabor,S.等人，Proc. Acad. Sci. USA 82,1074,1985)；或股轉位增幅(strand displacement amplification(SDA))，Walker等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ,89: 392,(1992))。舉例而言，編碼上述多胜肽之核苷酸序列可用於作為鑑定同源物之雜交探針。

具有通常知識者應明瞭，單離自其他來源之編碼此等多胜肽之基因亦可用於本文揭示之重組細菌。此外，由於密碼子退化現象，可對編碼此等多胜肽之核苷酸序列進行變化，而不會影響所編碼之多胜肽的胺基酸序列，且會製造實質上相似之蛋白質的胺基酸取代、刪除或添加也可被包括於所編碼的蛋白質中。

可使用PCR(參見例如美國專利第4,683,202號)及設計用來結合所欲序列之引子(例如本文之實施例1所述者)來單離編碼具有蔗糖轉運子活性之多胜肽及具有蔗糖水解酶活性之多胜肽之核苷酸序列。其他基因單離方法，例如藉由使用退化性引子或異源性探針雜交，乃為具有通常知識者所熟知。核苷酸序列亦可被化學合成或購自供應商，例如DNA2.0 Inc.(Menlo Park,CA)。

可使用具有通常知識者已知的眾多方法之一來進行多胜肽之表現。舉例而言，可將編碼上述多胜肽之核苷酸序列導入細菌內的至少一多套型質體，或藉由將此編碼序列之一或多套併入宿主基因組中。編碼多胜肽之核苷酸序列可被分別(例如於分離的質體上)或以任何組合(例如於單一質體上，如本文實例所述者)導入宿主細菌內。

於質體或於基因組中的經導入編碼區可由至少一高度活性啟動子所表現。經併入的編碼區可作為具有其本身啟動子之嵌合基因的一部分而被導入，或其可被併入一基因組本來就包含的高度活性啟動子附近，或於經高度表現的操縱子中。適合的啟動子包括但不限於CYC1 、HIS3 、GAL1 、GAL10 、ADH1 、PGK 、PHO5 、GAPDH 、ADC1 、TRP1 、URA3 、LEU2 、ENO 及lac 、ara 、tet 、trp 、lP _L 、lP _R 、T7 、tac 及trc (可用於大腸桿菌中表現)以及amy 、apr 、npr 啟動子及可用於芽胞桿菌中表現之各種噬菌體啟動子。啟動子亦可為變鉛青鏈黴菌葡萄糖異構酶啟動子或其變異體，如Payne等人所述者(美國專利第7,132,527號)。

在一實施例中，本文揭示之重組細菌能夠產生甘油。已知可於酵母菌及某些細菌、其他真菌及藻類中使用碳水化合物或糖類進行製備甘油之生物製程。細菌及酵母菌均透過糖解作用中的果糖-1,6-雙磷酸路徑來轉化葡萄糖或其他碳水化合物而製造甘油。於本文揭示之甘油生產方法中，可使用自然製造甘油之宿主細菌。此外，可將細菌改造以生產甘油及甘油衍生物。可透過甘油-3-磷酸去氫酶(G3PDH)及/或甘油-3-磷酸酶之酶活性表現而提供由各種受質製造甘油的能力，如美國專利第7,005,291號所述者。編碼此等可用於在宿主細菌中表現酶活性之蛋白質的基因係記載於美國專利第7,005,291號中。編碼具有甘油-3-磷酸去氫酶活性之多胜肽之基因的適當實例包括但不限於來自啤酒酵母菌之GPD1 (編碼序列示於SEQ ID NO:1，所編碼的蛋白質序列示於SEQ ID NO:2)及來自啤酒酵母菌之GPD2 (編碼序列示於SEQ ID NO:3，所編碼的蛋白質序列示於SEQ ID NO:4)。編碼具有甘油-3-磷酸酶活性之多胜肽之基因的適當實例包括但不限於來自啤酒酵母菌之GPP1 (編碼序列示於SEQ ID NO:5，所編碼的蛋白質序列示於SEQ ID NO:6)及來自啤酒酵母菌之GPP2 (編碼序列示於SEQ ID NO:7，所編碼的蛋白質序列示於SEQ ID NO:8)。

透過減少目標內源基因之表現可達到甘油生產增加。編碼甘油激酶及甘油去氫酶活性之內源基因的向下調控可進一步增進甘油生產，如美國專利第7,005,291號所述。藉由減少編碼甘油醛3-磷酸去氫酶之內源性基因的表現，可促進將碳導引至甘油，如美國專利第7,371,558號所述。藉由使用本領域中已知的任何方法均可完成向下調控，舉例而言，上述用於PTS系統之基因的向下調控之方法。

甘油提供一種可用產物之微生物生產的受質。此等產物之實例，即甘油衍生物，包括但不限於3-羥基丙酸、甲基乙二醛、1,2-丙二醇及1,3-丙二醇。

在另一實施例中，本文所揭示的重組細菌能夠生產1,3-丙二醇。甘油衍生物1,3-丙二醇為一種單體，其具有潛力可用於聚酯纖維生產及聚胺基甲酸酯及環形化合物之製造。1,3-丙二醇可藉由單一微生物製造，其係由非甘油或二羥基丙酮之碳受質的生物轉化所達成，如美國專利第5,686,276號所述。於此生物轉化中，甘油係製造自碳受質，如上所述。甘油被脫水酶轉化成中間物3-羥基丙醛，而脫水酶可被宿主細菌編碼或可經重組被導入宿主。脫水酶可為甘油脫水酶(E.C. 4.2.1.30)、二醇脫水酶(E.C. 4.2.1.28)或任何其他能夠催化此轉化的酶。編碼甘油脫水酶之「α」(阿伐)、「β」(貝他)、及「γ」(伽瑪)次單元之基因的適當實例分別包括但不限於dhaB1 (編碼序列示於SEQ ID NO:9)、dhaB2 (編碼序列示於SEQ ID NO:11)及dhaB3 (編碼序列示於SEQ ID NO:13)，均來自克留氏肺炎桿菌。可經1,3-丙二醇去氫酶(E.C. 1.1.1.202)或其他醇去氫酶催化3-羥基丙醛進一步轉化成1,3-丙二醇。編碼1,3-丙二醇去氫酶之基因之適當實例為來自克留氏肺炎桿菌之dhaT (編碼序列示於SEQ ID NO:47，所編碼的蛋白質序列示於SEQ ID NO:48)。

可將細菌重組改造以提供甘油及甘油衍生物1,3丙二醇更有效率之生產。舉例而言，美國專利第7,005,291號揭示轉形微生物及甘油及1,3-丙二醇之生產方法，其優點係衍生自表現甘油-3-磷酸去氫酶及甘油-3-磷酸磷酸酶之一或二者之外源性活性，而瓦解內源性活性甘油激酶及甘油去氫酶之一或二者。

美國專利第6,013,494號描述一種製造1,3-丙二醇之方法，其係使用包含外源性甘油-3-磷酸去氫酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、脫水酶及1,3-丙二醇氧化還原酶(例如dhaT )之單一微生物。美國專利第6,136,576號揭示一種生產1,3-丙二醇之方法，其包含重組微生物，該重組微生物進一步包含脫水酶及蛋白質X(後者經鑑定為脫水酶再活化因子胜肽)。

美國專利第6,514,733號描述一種製程之改良，其中係藉由非特異性催化活性(與dhaT 所編碼的1,3-丙二醇氧化還原酶有所區別)以將3-羥基丙醛轉化成1,3-丙二醇而獲得力價顯著增加(每公升之產物克數)。此外，美國專利第7,132,527號揭示可用於1,3-丙二醇之生產的載體及質體。

可經由對宿主細菌之進一步修飾而提昇1,3-丙二醇之生產，包括向下調控某些目標基因之表現及向上調控其他目標基因之表現，如美國專利第7,371,558號所述。為了在PTS欠缺之宿主中利用葡萄糖作為碳源，可增加葡萄糖激酶活性之表現。

其表現增加或被向上調控時，會增加1,3-丙二醇生產的額外基因，包括編碼以下所列者之基因：

‧　磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，一般指定為EC 4.1.1.31

‧　鈷胺素腺苷轉移酶，一般指定為EC 2.5.1.17

‧　非特異性催化活性係足以催化3HPA及1,3丙二醇之相互轉化者，且特別是排除1,3丙二醇氧化還原酶，通常此等酶為醇去氫酶

其表現減少或被向下調控時會增加1,3-丙二醇生產的基因包括編碼以下所列者之基因：

‧　有氧呼吸調控蛋白

‧　甲基乙二醛合成酶

‧　乙酸激酶

‧　磷酸轉乙醯酶

‧　醛去氫酶A

‧　醛去氫酶B

‧　磷酸丙糖異構酶

‧　磷酸葡萄糖酸脫水酶

在另一實施例中，本文揭示之重組細菌能夠生產3-羥基丙酸。3-羥基丙酸具有專門合成之效用且可利用化學工業中的已知手段而轉化成商業上重要的中間物，例如藉由脫水作用形成丙烯酸、藉由氧化作用形成丙二酸、藉由與醇類之酯化反應形成酯類以及藉由還原作用形成1,3-丙二醇。3-羥基丙酸由單一微生物自可發酵的碳源被生物性製造，如同記載於共同申請中及共有之美國專利申請案第12/815461號。於一代表性的生合成路徑中，碳受質被轉化成3-羥基丙醛，如上述1,3-丙二醇之生產者。3-羥基丙醛被醛去氫酶轉化成3-羥基丙酸。醛去氫酶之適當實例包括但不限於AldB(SEQ ID NO:16)，其係由大腸桿菌之基因aldB 所編碼(編碼序列示於SEQ ID NO:15)；AldA(SEQ ID NO:18)，其係由大腸桿菌之基因aldA 所編碼(編碼序列示於SEQ ID NO:17)；以及AldH(SEQ ID NO:20)，其係由大腸桿菌之基因aldH 所編碼(編碼序列示於SEQ ID NO:19)。

許多為了改善利用重組細菌生產1,3-丙二醇而進行的上述修飾以亦可用來改進3-羥基丙酸之生產。舉例而言，排除甘油激酶可防止甘油(經G3P磷酸酶作用而由G3P所形成)於ATP消耗下再轉化至G3P。又，排除甘油去氫酶(例如gldA )可防止甘油(經NAD依賴性甘油-3-磷酸去氫酶作用而由DHAP所形成)被轉化至二羥基丙酮。可對結構性基因進行突變以降低或改進催化活性之活性，或對調控性基因進行突變，包括啟動子區及核糖體結合處，進而調控催化活性之表現量。

向上調控或向下調控可經由眾多方法達成，其為具有通常知識者所知。可充分了解的是，基因之向上調控或向下調控係指存在於細胞中衍生自經該基因所編碼之蛋白質的活性量改變，其係相對於活性對照量，例如由對應之(或非經改變的)野生型基因所編碼的蛋白質之活性。

可向上調控參與酶路徑之特定基因以增加其編碼功能的活性。舉例而言，可將選定基因之額外套數導入宿主細胞之多套型質體上，例如pBR322。亦可將此種基因併入具適當調控序列之染色體內，而造成其編碼功能的活性增加。可修飾目標基因以使其受控於非天然啟動子或經改變之天然啟動子。可利用突變、刪除及/或取代而於活體內改變內源性啟動子。

或者，相對於特定活性量，亦可減少或排除某些基因的表現。向下調控(瓦解)基因之方法為具有通常知識者所知。

可藉由編碼區及/或調控(啟動子)區之刪除、插入或改變而發生向下調控。特定向下調控可經隨機突變後進行篩選或選擇而獲得，若基因序列為已知者，亦可利用具有通常知識者已知的分子生物學方法進行直接介入而達成特定向下調控。進行向下調控之特別有用方法(不排除其他方法)為改變啟動子強度。

此外，基因表現之向下調控可用於防止感興趣之蛋白質的表現或造成非功能性蛋白質之表現。其可藉由例如下列方式完成，1)刪除編碼區及/或調控(啟動子)區，2)將外源核酸序列插入編碼區及/調控(啟動子)區，及3)改變編碼區及/或調控(啟動子)區(例如改變DNA鹼基對)。特定瓦解可經隨機突變後進行篩選或選擇而獲得，若基因序列為已知者，亦可利用具有通常知識者已知的分子生物學方法進行直接介入而達成特定瓦解。一特別有用的方法為編碼區及/或調控(啟動子)區之顯著量刪除。

改變重組蛋白質表現之方法已為具有通常知識者所知，且部分被討論於：Baneyx,Curr. Opin. Biotechnol. (1999) 10:411;RoSS等人，J. Bacteriol. (1998) 180:5375;deHaseth等人，J. Bacteriol. (1998) 180:3019;Smolke與Keasling,Biotechnol. Bioeng. (2002) 80:762;Swartz,Curr. Opin. Biotech.(2001) 12:195；以及Ma等人，J. Bacteriol. (2002) 184:5733。

於代謝蔗糖以產製造包含甘油及甘油衍生物之微生物產物的基因表現上，含有必要改變的重組細菌，如上所述，可使用本領域所熟知之技術進行構築，其中一些乃例示於本文之實例中。

可使用適於選殖、轉形及表現在適當宿主微生物中，可賦予製造甘油及其衍生物而利用蔗糖能力的編碼區域之各種載體及轉形及表現匣，以達成本文所揭示之重組細菌的構築。適當載體為與所使用之細菌相容者。適當載體可衍生自例如細菌、病毒(例如噬菌體T7或M 13衍生噬菌體)、黏質體(cosmid)、酵母菌或植物。獲得及使用此載體之程序為具有通常知識者所知(Sambrook等人，見前文)。

用於在所欲宿主細菌中促使本發明編碼區域之表現的啟動控制區域或啟動子為數眾多，且為具有通常知識者所熟悉。幾乎所有能促使表現之啟動子皆適用於本發明。舉例而言，可使用列於前文之任何啟動子。

終止控制區域亦可衍生自較佳宿主之各種固有基因。視需要而定，終止位置並非必要；然而，最佳係包括終止位置。

為能有效表現本發明之多胜肽，編碼該多胜肽之核苷酸序列係經由起始密碼子可操作地連接至選定的表現控制區域，藉此使表現得以形成適當的信使RNA。

特別有用的載體為記載於美國專利第7,371,558號之pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106及pSYCO109，及記載於美國專利第7,524,660號之pSYCO400/AGRO。這些載體之必要基因元件係衍生自分離自克留氏肺炎桿菌及啤酒酵母菌之dha 調控子。各載體含有排列於三個個別操縱子之開放讀碼框架dhaB1 、dhaB2 、dhaB3 、dhaX (編碼序列示於SEQ ID NO:49；經編碼多胜肽序列示於SEQ ID NO:50)、orfX 、DAR1 及GPP2 。pSYCO101、pSYCO103、pSYCO106、pSYCO109及pSYCO400/AGRO之核苷酸序列分別示於SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54及SEQ ID NO:55。載體間之差異乃說明於下表[字首「p-」係指啟動子；包含於各「()」之開放讀碼框架代表操縱子之組成]：

pSYCO101(SEQ ID NO:51):

p-trc(Dar1_GPP2)於其他2路徑操縱子之相反方向，p-1.6長GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)，及p-1.6長GI(orfY_orfX_orfW)。

pSYCO103(SEQ ID NO:52):

p-trc(Dar1_GPP2)於其他2路徑操縱子之相同方向，p-1.5長GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)，及p-1.5長GI(orfY_orfX_orfW)。

pSYCO106(SEQ ID NO:53):

p-trc(Dar1_GPP2)於其他2路徑操縱子之相同方向，p-1.6長GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)，及p-1.6長GI(orfY_orfX_orfW)。

pSYCO109(SEQ ID NO:54):

p-trc(Dar1_GPP2)於其他2路徑操縱子之相同方向，p-1.6長GI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)，及p-1.6長GI(orfY_orfX)。

pSYCO400/AGRO(SEQ ID NO:55):

p-1.20短/長GI(scrK)於其他路徑操縱子之相反方向。

一旦適當之表現匣被構築，即可將其用於轉形適當之宿主細菌。可經由已知程序將含編碼區域之表現匣導入宿主細菌，例如藉由轉形(例如使用鈣穿透性細胞或電穿孔)或藉由使用重組噬菌體病毒之轉染(Sambrook等人，見前文)。表現匣可被維持於宿主細胞內之安定質體中。此外，經由使用具有通常知識者所知之載體及方法的同源或隨機重組，亦可將表現匣併入宿主細菌之基因組中。位置特異性重組系統亦可用於將表現匣併入基因組。

除了所例示之細胞外，亦可使用具有單一或多突變之細胞，該突變係特別設計用以增加製造包括甘油及/或其衍生物之微生物產物。可突變通常將碳原料轉向至非生產路徑或呈現明顯分解代謝產物抑制之細胞，以避免這些表現型的缺陷。

產生突變之方法係為常見且為本領域所熟知。某些方法的概述係記載於美國專利第7,371,558號。使用輻射或化學藥劑以產生突變之特定方法在本領域中已清楚載於文獻中。可參見例如Thomas D. Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology ,Second Edition(1989) Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA，或Deshpande,Mukund V.,Appl. Biochem. Biotechnol. 36 ,227(1992)。

在發生突變誘發後，可利用各種方法選擇具有所欲表現型之突變體。隨機篩選最為常見，其中係根據是否具有製造所欲產物或中間物之能力選擇經突變誘發之細胞。或者，可將突變誘發的群落於選擇性培養基中生長(僅有具抗性之菌落可生長)以進行突變體之選擇性分離。突變體選擇之方法已高度發展且為工業微生物學領域中所熟知。詳見例如前述Brock之著述；DeMancilha等人，Food Chem. 14,313(1984)。

本發明之發酵培養基包含作為碳受質之蔗糖。亦可存在其他碳受質，例如葡萄糖及果糖。

除了碳受質外，適當的發酵培養基可含有例如適當的礦物質、鹽類、輔因子、緩衝劑及適於培養物生長及促進甘油及其衍生物(例如1,3丙二醇)之製造所需之催化路徑的其他成分，其為具有通常知識者所知。特別值得注意的是Co(II)鹽及/或維生素B₁₂ 或其在製造1,3丙二醇之前驅物。

腺苷鈷胺素(輔酶B₁₂ )為脫水酶活性之重要輔因子。在原核生物中已發現輔酶B₁₂ 之合成，其中某些原核生物能重新(de novo )合成該化合物，例如蟑螂艾氏菌、克留氏菌種、檸檬酸桿菌種及芽胞梭菌種，而其他原核生物則能進行部份反應。舉例而言，大腸桿菌並不能夠形成咕啉(corrin)環結構，但能催化鈷啉醇醯胺(cobinamide)轉化成為類咕啉(corrinoid)，並可導入5'去氧腺苷基。因此，本領域中已知一種輔酶B₁₂ 前驅物，例如維生素B₁₂ ，於大腸桿菌發酵期間必須被提供。維生素B₁₂ 可以恆定速率持續添加至大腸桿菌發酵物中，或分段添加以符合細胞群的產生，或可以單獨或多數食團添加物添加。

雖然維生素B₁₂ 被添加至本文所述之經轉形大腸桿菌，但可預期其他能進行維生素B₁₂ 重新生合成之細菌亦將為適當之生產用細胞，且添加維生素B₁₂ 至這些細菌並非必要。

典型上，細菌細胞係生長於25至40℃之含蔗糖適當培養基中。本文所使用之適當生長培養基的實例為一般商業上製備的培養基，例如Luria Bertani(LB)培養液、Sabouraud Dextrose(SD)培養液或酵母菌培養基(YM)培養液。亦可使用其它經定義或合成的生長培養基，且用於特殊細菌生長的適當培養基將為微生物學或發酵科學技術領域中具有通常知識者所知。已知直接或間接調控分解代謝產物抑制之藥劑的使用，例如環腺苷2':3'單磷酸酯，亦可併入反應培養基中。相似地，已知調控催化活性而導致1,3丙二醇製造增加之藥劑(例如甲基紫精(methyl viologen))的使用可與1,3-丙二醇生產用菌株搭配或作為其遺傳操作的一種替代方式。

用於發酵之適當pH範圍係介於pH 5.0至pH 9.0，其中pH 6.0至pH 8.0為典型的初始條件。

反應可根據重組細菌之需求而在有氧、無氧或厭氧條件下進行。可以限量或過量之碳(例如碳受質)進料進行饋料批次發酵。

批次發酵是一種常用的方法。標準的批次發酵為一種封閉系統，其中培養基組成物在發酵開始即設定，且在發酵期間並不會被人為變更。因此，在發酵開始時，培養基係接種所欲細菌，且發酵可在不添加任何東西至系統的情形下發生。然而，典型上「批次」發酵是有關成批添加碳源，且通常會嘗試控制因子，例如pH及氧氣濃度。在批次系統中，系統之代謝物及生質組成物會恆定改變一直到發酵停止的時間。在批次培養物中，細胞經由靜態遲滯期過渡至高生長對數期，最終並過渡至生長速率減緩或停止之靜止期。若未經處理，在靜止期之細胞最終將死亡。在對數期之細胞一般負責大量製造終產物或中間產物。

標準批次系統之變化型為饋料批次系統。饋料批次發酵製程亦適用於本文，且包含典型批次系統，差別在於發酵進行時係增量添加受質。當分解代謝產物之抑制傾向抑制細胞代謝，及當欲在培養基中具有限量受質時，可使用饋料批次系統。在饋料批次系統中測量實際受質濃度是有困難的，因此實際受質濃度是基於可測量因子之變化而進行估計，例如pH、溶氧及廢氣(例如CO₂ )分壓。批次及饋料批次發酵在本領域中頗為常見且為人所熟知，且其實例可見於前述Brock之著述。

連續發酵為一開放系統，其中一經定義的發酵培養基被連續添加至一生物反應器中，且等量的已使用培養基被同時移除以進行加工。連續發酵一般維持培養物於一固定高密度，其中細胞主要在對數期生長。

連續發酵容許會影響細胞生長或終產物濃度之一種因子或任何數量的因子進行調控。舉例而言，有一種方法可保持一限制性營養物，例如碳源或氮濃度於一固定比例，並使所有其他參數趨緩。在其他系統中，可連續不斷改變影響生長之數個因子，同時經由培養基之濁度量測的細胞濃度則保持不變。連續系統努力維持平穩態生長條件，因此培養基被抽除所造成的細胞損失必須與發酵中細胞的生長速率達成平衡。用於連續發酵製程之營養物及生長因子調控方法及用於最大化產物形成率之技術為工業微生物學領域中所熟知，且多種方法乃詳述於前文Brock之著述。

應了解本發明可使用批次、饋料批次或連續製程實施，且任何已知發酵模式均屬適當。此外，應了解細胞可被固定於受質上作為全體細胞催化劑，且接受用於製造甘油及甘油衍生物(例如1,3-丙二醇)之發酵條件。

在一實施例中，係提供用於自蔗糖製造甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥基丙酸之方法。該方法包含以下步驟：在蔗糖存在下培養上述重組細菌，及視需要回收經製造之甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥基丙酸。該產物可使用本領域已知之方法回收。舉例而言，可藉由離心、過濾、傾析及類似方法自發酵培養基中移除固體。然後，該產物可使用例如蒸餾、液體-液體萃取或膜分離之方法由已被處理以移除上述固體之發酵培養基中分離。

實例

於後述實例中將進一步定義本發明。應理解這些指出本發明較佳實施例之實例僅供說明。由上述說明及該等實例，本領域具有通常知識者可確定本發明之主要特徵，且在不超出本發明之精神與範圍的前提下可對本發明作各種改變及修飾，以使其適於各種用途及條件。

一般方法

實例中敘述之標準重組DNA及分子選殖技術為本領域所熟知，且記載於Sam brook,J.,Fritsch,E. F. and Maniatis,T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual ;Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)，及T. J. Silhavy,M. L. Bennan與L. W. Enquist,Experiments with Gene Fusions ,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)，及Ausubel,F. M.等人，Current Protocols in Molecular Biology ,pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience(1987)。

縮寫之意義如下：「sec」代表秒，「min」代表分鐘，「h」代表小時，「nm」代表奈米，「μL」代表微升，「mL」代表毫升，「L」代表升，「mM」代表毫莫耳濃度，「M」代表莫耳濃度，「g」代表克，「μg」代表微克，「bp」代表鹼基對，「kbp」代表千鹼基對，「rpm」代表每分鐘轉數，「ATCC」代表美國典型培養物保藏中心，Manassas,VA。

培養基及培養條件：

適用於細菌培養之維持及生長的材料和方法為本領域所熟知。適用於下列實例之技術可見於以下文獻：Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt,R. G. E. Murray,Ralph N. Costilow,Eugene W. Nester,Willis A. Wood,Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips,eds),American Society for Microbiology,Washington,DC.(1994))或Thomas D. Brock inBiotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology ,Second Edition,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1989)。除非另有指明，否則所述用於細菌細胞生長及維持之所有試劑、限制酶及材料均可得自Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks,MD)、Life Technologies(Rockville,MD)、New England Biolabs(Beverly,MA)或Sigma Chemical Company(St. LouiS,MO)。

LB(Luria Bertani)培養基每公升含有下列各者：Bacto-胰腖(10 g)、Bacto-酵母菌萃取物(5 g)及NaCl(10 g)。如下列實例所述添加補充物。所有添加物在其添加至培養基前需先消毒。

分子生物學技術：

限制酶消化、接合、轉形及瓊脂凝膠電泳法係根據下列文獻所述方式進行：Sambrook,J.等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。聚合酶連鎖反應(PCR)技術可見於White,B.,PCR Protocols: Current Methods and Applications ,Volume 15(1993),Humana Press Inc.,New York. NY。

實例1 含推定蔗糖代謝基因之重組大腸桿菌

本實例之目的在於構築一重組大腸桿菌菌株，其含有來自螢光假單胞菌Pf5(ATCCBAA-477)之推定蔗糖代謝基因，並具有由蔗糖製造1,3-丙二醇(PDO)之能力。

螢光假單胞菌Pf5基因lacY (SEQ ID NO:23)及scrB (SEQ ID NO:25)(其為相鄰基因)及Pf5基因lacY 上游之啟動子區域可使用高準度聚合酶(Phusion^TM Flash(Finnzymes Oy,Espoo,Finland))利用PCR增幅而獲得，其使用下列條件：98℃/10 sec；98℃/1 sec、63℃/30 sec及72℃/30 sec共30個循環；然後於72℃/5 min使用來自螢光假單胞菌Pf5之基因組DNA作為模版，且引子係示於SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57。

以Taq聚合酶於72℃、10 min，將一腺苷核苷酸(「A」)添加至3063 bp之PCR產物之3’端。依照製造供應商所提供之作法，將該PCR產物選殖入pBAD-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA)。以安比西林抗藥性篩選大腸桿菌TOP10菌株(Invitrogen)之轉形後，分離質體DNA。經由DNA序列分析法證實所插入之DNA之存在。將稱為「pBAD-TOPO Pf5 cscB&A 3-5」之一種質體轉形至大腸桿菌TTab pSYCO400/AGRO菌株中，以產生PDO2241菌株。亦將稱為「pBAD-TOPO ctl 3-8」之無插入DNA的對照質體轉形至大腸桿菌TTab pSYCO400/AGRO菌株，以產生PDO2242菌株。

大腸桿菌TTab pSYCO400/AGRO菌株為一種PTS欠缺型菌株，其係以下述方式構築。TTab菌株係經由TT aldA菌株剔除aldB 基因而產生，參見美國專利第7,371,558號(實例17)。簡言之，aldB 剔除之產生係先經由以pKD3質體(Datsenko and Wanner,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：6640 6645,2000)之FRT-CmR-FRT匣置換大腸桿菌MG1655菌株中1.5 kbp之aldB 編碼區域而達成。使用pKD3作為模版，以引子對SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59將置換匣增幅。引子SEQ ID NO:58含有同源於aldB 之5'-端之80 bp及同源於pKD3之20 bp。引子SEQ ID NO:59含有同源於aldB之3'-端之80 bp及同源於pKD3之20 bp。將PCR產物進行凝膠純化並電穿孔進入MG1655/pKD46全能細胞(美國專利第7,371,558號)。於具有12.5 mg/L氯黴素之LB盤中選擇重組菌株。使用引子對SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:61藉由PCR確認aldB 基因之剔除。野生株產生一1.5 kbp之PCR產物，而重組菌株產生一特徵為1.1 kbp之PCR產物。製備P1溶菌產物，並用其將突變移至TT aldA菌株，以形成TT aldAΔaldB::Cm菌株。以引子對SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:61之基因組PCR檢查氯黴素抗性選殖株，以確保突變存在。使用FLP重組酶(Datsenko and Wanner，見前文)將氯黴素抗性標記移除以產生TTab。然後以pSYCO400/AGRO(示於SEQ ID NO:55)將TTab菌株轉形，如美國專利第7,524,660號(實施例4)所載，以產生TTab pSYCO400/AGRO菌株。

如引用文獻中所述，TTab菌株為大腸桿菌FM5菌株(ATCCNo. 53911)之衍生物，其含有下列修飾：剔除glpK 、gldA 、ptsHI 、crr 、edd 、arcA 、mgsA 、qor 、ackA 、pta 、aldA 及aldB 基因；向上調控galP 、glk 、btuR 、ppc 、及yqhD 基因；以及向下調控gapA 基因。

pSYCO400/AGRO質體含有編碼甘油製造路徑(DAR1 及GPP2 )之基因及編碼甘油脫水酶與相關再活化因子之基因(dhaB123 、dhaX 、orfX 、orfY )及編碼果糖激酶(scrK )之基因。

實例2 由蔗糖製造1,3-丙二醇

本實例之目的在闡述含有來自螢光假單胞菌Pf5(ATCCBAA-477)之推定的蔗糖代謝基因的大腸桿菌菌株能代謝蔗糖並製造1,3-丙二醇(PDO)及甘油。

於33℃，在補充有100 mg/L觀酶素及100 mg/L安比西林之L-Broth(Miller’s改質)(Teknova,Half Moon Bay,CA)中，隔夜生長實例1所述之大腸桿菌PDO2241及PDO2242菌株。這些培養物乃用於接種至補充有11 g/L蔗糖之MOPS最小培養基(Teknova,Half Moon Bay,CA)，其係置於振盪燒瓶中，而於550 nm量測得之之光學密度為0.01單位。添加維生素B12至培養基中至濃度為0.1 mg/L。培養物於34℃振盪(225 rpm)培養24小時，之後以高效液相層析法測定在培養液中之蔗糖、甘油及1,3-丙二醇(PDO)濃度。

使用Aminex HPX-87P管柱(Bio-Rad,Hercules,CA)，以蒸餾去離子水之等位(isocratic)移動相，於0.5 mL/min之流速及85℃之管柱溫度完成層析分離。參照以已知濃度溶解於MOPS最小培養基之商業上購得之純化合物所製備之標準曲線，以折射率檢測法定量經洗提之化合物。滯留時間為蔗糖12.2 min，1,3-丙二醇17.9 min，以及甘油23.6 min。

具有來自螢光假單胞菌Pf5之推定的蔗糖代謝基因的大腸桿菌PDO2241菌株代謝了培養基中的所有蔗糖(剩餘0 g/L)，並製造2.55 g/L的PDO及2.83 g/L的甘油。對照之PDO2242菌株在這些條件下不能代謝蔗糖(剩餘10.7 g/L)，並僅製造極微少的PDO(0.06 g/L)及甘油(0.01 g/L)。

實例3 含有推定的蔗糖代謝基因之重組大腸桿菌

本實例之目的在構築含有來自螢光假單胞菌Pf5之經選殖蔗糖代謝基因的重組大腸桿菌菌株。

將實例1所述之pBAD-TOPO Pf5 cScB&A3-5質體轉形至大腸桿菌FM5菌株(ATCC53911)中，以產生PDO2355菌株。未插入DNA之pBAD-TOPO ctl 3-8對照質體亦轉形至大腸桿菌FM5菌株中，以產生PDO2350菌株。

將大腸桿菌PDO2355及PDO2350菌株於37℃在含100 μg/mL安比西林之LB(Luria Bertani)培養基中隔夜生長。次日，將這些培養物於含有100 μg/mL安比西林之LB培養基中以1:50稀釋，並於37℃生長4小時。以含有10 g/L蔗糖之MOPS最小培養基(Teknova,Half Moon Bay,CA)對這些對數期之培養物在Bioscreen-C盤(設備及盤係購自Growth Curves USA,Piscataway NJ)之小孔中進行1：100稀釋。將三份培養物於37℃持續振盪生長。觀察光學密度。接種20小時後，PDO2355培養物之光學密度為0.584 +/- 0.004，而PDO2350培養物之光學密度為0.065 +/- 0.004。這些結果顯示對照菌株並不能以蔗糖作為唯一碳源的情形下生長，而表現螢光假單胞菌Pf5之lacY 及scrB 之菌株能在蔗糖作為唯一碳源的情形下生長。

<110>　杜邦股份有限公司

<120>　具有代謝蔗糖能力之重組細菌

<130>

<160>　61

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　1176

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　1

<210>　2

<211>　391

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　2

<210>　3

<211>　1323

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　3

<210>　4

<211>　440

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　4

<210>　5

<211>　816

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　5

<210>　6

<211>　271

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　6

<210>　7

<211>　753

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　7

<210>　8

<211>　250

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　8

<210>　9

<211>　1668

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(1668)

<400>　9

<210>　10

<211>　555

<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　10

<210>　11

<211>　585

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(585)

<400>　11

<210>　12

<211>　194

<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　12

<210>　13

<211>　426

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(426)

<400>　13

<210>　14

<211>　141

<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　14

<210>　15

<211>　1539

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(1539)

<400>　15

<210>　16

<211>　512

<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

<400>　16

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<211>　1440

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(1440)

<400>　17

<210>　18

<211>　479

<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

<400>　18

<210>　19

<211>　1488

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(1488)

<400>　19

<210>　21

<211>　1395

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<400>　21

<210>　22

<211>　464

<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

<400>　22

<210>　23

<211>　1290

<212>　DNA

<213>　Pseudomonas fluorescens

<400>　23

<210>　24

<211>　429

<212>　PRT

<213>　Pseudomonas fluorescens

<400>　24

<210>　25

<211>　1476

<212>　DNA

<213>　Pseudomonas fluorescens

<400>　25

<210>　26

<211>　491

<212>　PRT

<213>　Pseudomonas fluorescens

<400>　26

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<211>　1248

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<400>　27

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<211>　415

<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

<400>　28

<210>　29

<211>　1434

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<400>　29

<210>　30

<211>　477

<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

<400>　30

<210>　31

<211>　927

<212>　DNA

<213>　Agrobacterium tumefaciens

<400>　31

<210>　32

<211>　308

<212>　PRT

<213>　Agrobacterium tumefaciens

<400>　32

<210>　33

<211>　1404

<212>　DNA

<213>　Streptococcus mutans

<400>　33

<210>　34

<211>　293

<212>　PRT

<213>　Streptococcus mutans

<400>　34

<210>　35

<211>　915

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<400>　35

<210>　36

<211>　304

<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

<400>　36

<210>　37

<211>　924

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　37

<210>　38

<211>　307

<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　38

<210>　39

<211>　915

<212>　DNA

<213>　Escherichia coli

<400>　39

<210>　40

<211>　304

<212>　PRT

<213>　Escherichia coli

<400>　40

<210>　41

<211>　879

<212>　DNA

<213>　Enterococcus faecalis

<400>　41

<210>　42

<211>　292

<212>　PRT

<213>　Enterococcus faecalis

<400>　42

<210>　43

<211>　1458

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　43

<210>　44

<211>　485

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　44

<210>　45

<211>　1461

<212>　DNA

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　45

<210>　46

<211>　486

<212>　PRT

<213>　Saccharomyces cerevisiae

<400>　46

<210>　47

<211>　1164

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　47

<210>　48

<211>　387

<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　48

<210>　49

<211>　1824

<212>　DNA

<213>　Klebsiella pneumoniae

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(1824)

<400>　49

<210>　50

<211>　607

<212>　PRT

<213>　Klebsiella pneumoniae

<400>　50

<210>　51

<211>　13669

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　51

<210>　52

<211>　13543

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　52

<210>　53

<211>　13543

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　53

<210>　54

<211>　13402

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plamid

<400>　54

<210>　55

<211>　14443

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Plasmid

<400>　55

<210>　56

<211>　28

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　56

<210>　57

<211>　26

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　57

<210>　58

<211>　100

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　58

<210>　59

<211>　100

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　59

<210>　60

<211>　22

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　60

<210>　61

<211>　21

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　61

Claims

一種重組細菌，在其基因組中或在至少一重組構築體上包含：(a)一核苷酸序列，其編碼一具有蔗糖轉運子活性之多胜肽，當基於一Clustal V比對法與一SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列比對時，該多胜肽具有至少95%的序列同一性；以及(b)一核苷酸序列，其編碼一具有蔗糖水解酶活性之多胜肽，當基於一Clustal V比對法與一SEQ ID NO：26所示之胺基酸序列比對時，該多胜肽具有至少95%的序列同一性；其中(a)及(b)各自可操作地連接至相同或相異的啟動子；其中(a)及(b)各自：(i)係為一重組構築體；(ii)編碼有一包含非天然多胜肽之多胜肽；(iii)包含一外源基因；或(iv)係(i)、(ii)或(iii)的任一組合；且其中該重組細菌相較於缺少序列(a)與(b)的同等細菌，其具有改善的代謝蔗糖能力。
如請求項1所述之重組細菌，其中當基於BLASTN比對法與一SEQ ID NO：23所示之核苷酸序列比對時，該編碼具有蔗糖轉運子活性之多胜肽的核苷酸序列具有至少95%的序列同一性。
如請求項1所述之重組細菌，其中當基於BLASTN比對法與一SEQ ID NO：25所示之核苷酸序列比對時，該編碼具有蔗糖水解酶活性之多胜肽的核苷酸序列具有至少95%的序列同一性。
如請求項1至3中任一項所述之重組細菌，在其基因組中或在至少一重組構築體上進一步包含一編碼具有果糖激酶活性之多胜肽的核苷酸序列。
如請求項4所述之重組細菌，其中當基於該Clustal V比對法，相較於SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：46所示之胺基酸序列比對時，該具有果糖激酶活性之多胜肽具有至少95%的序列同一性。
如請求項4所述之重組細菌，其中該具有果糖激酶活性之多胜肽具有一SEQ ID NO：40所示之胺基酸序列。
如請求項1所述之重組細菌，其中該細菌係選自於由下列之屬所組成之群組：艾氏菌屬(Escherichia )、克留氏菌屬(Klebsiella )、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter )及產氣桿菌屬(Aerobacter )。
如請求項7所述之重組細菌，其中該細菌為大腸桿菌。
如請求項1所述之重組細菌，其中該重組細菌可製造1,3-丙二醇、甘油及/或3-羥基丙酸。
一種由蔗糖製造甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥基丙酸之方法，包含：a)在蔗糖存在下，培養請求項9所述之重組細菌；以及b)視需要回收所製造之甘油、1,3-丙二醇及/或3-羥基丙酸。
如請求項1所述之重組細菌，其中該核苷酸序列(a)、該核苷酸序列(b)、或該核苷酸序列(a)及(b)係異源的核苷酸序列。